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Behavior

मल्टी-लेयर कोर्टिकल सीए Published: June 13, 2017 doi: 10.3791/55579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Inscopix Inc.

Summary

यहां, हम बड़े पैमाने पर सीए 2 + इमेजिंग को सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन के साथ-साथ चूहों को स्वतंत्र रूप से चलने में कई कॉर्टिकल परतों में पेश करने की प्रक्रिया पेश करते हैं। सैकड़ों सक्रिय कोशिकाओं को एक लघु, सिर-घुड़सवार माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक साथ देखा जा सकता है जो एक प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच से जुड़ा होता है।

Abstract

विवो सर्किट और सेलुलर लेयर फंक्शनल इमेजिंग में क्रिया में मस्तिष्क को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण टूल है। दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ माउस कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के उच्च संकल्प इमेजिंग ने कॉर्टिकल संरचना, फ़ंक्शन और प्लास्टिसिटी में अनूठी अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, अध्ययनों के लिए उपलब्ध व्यवहार जटिलता को बहुत कम करने से इन अध्ययनों में निश्चित जानवरों के लिए सीमित है। इस पत्र में, हम चूहों को आज़ादी से व्यवहार करते हुए कई काउटेकल परतों में सेलुलर-रिज़ॉल के साथ पुरानी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। हम एक एकीकृत लघुकृत प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करते थे जो एक प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के साथ मिलकर कई दिनों में एक उपन्यास वस्तु अन्वेषण कार्य में लगे माउस के रूप में सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स के कई परतों पर सैकड़ों न्यूरॉन्स की कैल्शियम गतिशीलता को एक साथ कल्पना और रिकॉर्ड करते हैं। इस तकनीक को अन्य व्यवहारिक पी के लिए विभिन्न जानवरों के अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में अनुकूलित किया जा सकता हैaradigms।

Introduction

प्रेरक, इनाम, और व्यसन के मार्ग 4 , 5 से ध्यान देने योग्य, संवेदी धारणा और शीर्ष-नीचे संज्ञानात्मक नियंत्रण 1 , 2 , 3 से कई जटिल मानसिक और व्यवहारिक कार्यों में प्रांतस्था एक आवश्यक खिलाड़ी है। कई मानसिक और व्यवहार संबंधी विकारों की बेहतर नैदानिक ​​समझ विकसित करने के लिए कम्प्यूटेशनल प्रक्रियाओं को समझना एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है।

मनोचिकित्सक रोग केंद्र के कई मौजूदा सिद्धांतों में यह माना जाता है कि कॉर्टिकल न्यूरल सर्किट डिसफंक्शन या डिस्कोडेंशन में संज्ञानात्मक और व्यवहारिक असामान्यताएं आ सकती हैं जो कि सिज़ोफ्रेनिया 6 , ऑटिज्म 7 या जुनूनी-बाध्यकारी विकार 8 जैसी स्थितियों की पहचान हैं। इस प्रकार, सह से जनसंख्या स्तर की न्यूरल गतिविधि डेटा प्राप्त करनाएक साथ व्यवहार संबंधी जानकारी के उचित संदर्भ के भीतर rtical सर्किट बहुत महत्वपूर्ण है, और आदर्श रूप से विशिष्ट तंत्रिका सर्किट विच्छेदन के लिए विशिष्ट सेल प्रकारों पर लक्षित किया जा सकता है।

Implantable ढाल अपवर्तक इंडेक्स (जीआरआईएन) के साथ संयोजन में सूक्ष्मदर्शी सूक्ष्मदर्शी प्रांतस्था 14 , 15 , 16 सहित संभव मस्तिष्क क्षेत्रों 9 , 10 , 11 , 12 , 13 की विविधता से स्वतंत्र रूप से चलती परिस्थितियों के तहत न्यूरॉनल ensembles के लिए ऑप्टिकल पहुंच सक्षम है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों के साथ मिलकर एक मोबाइल माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करके एक ही सेलुलर आबादी के लगातार इमेजिंग की अनुमति मिलती है जिसमें सैकड़ों न्यूरॉन्स को कई मस्तिष्क क्षेत्रों में हफ्तों से लेकर सप्ताह तक शामिल किया जा सकता है, और हो सकता हैआनुवंशिक रूप से वायरल वेक्टर या ट्रांसजेनिक तकनीकों का उपयोग कर विशिष्ट सेल प्रकारों पर लक्षित।

जैसे कि कॉर्टेक्स विभिन्न कार्यों का समर्थन करने के लिए जाना जाता है और कॉर्टिकल लैमिना 17 , 18 , 1 9 के भीतर कोशिकाओं के स्थान के आधार पर विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से जुड़ जाता है, हम जागृत विषयों में जागरूकता के साथ-साथ बहु-स्तर की न्यूरल गतिविधि प्राप्त करने में रुचि रखते हैं। यहां हम दिखाते हैं कि प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोप 20 का इस्तेमाल करके प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के साथ, जो कि प्रांतस्था के बहु-परत दृश्य ( चित्रा 1 ) प्रदान करता है, का इस्तेमाल करते हुए, दिन के दौरान स्वतंत्र रूप से चूहों के व्यवहार में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले न्यूरॉन्स की सैकड़ों छवियों को प्रदर्शित करता है।

यहां प्रयोग किए जाने वाले प्रिज्म जांच दो अलग-अलग GRIN लेंस से बना है: एक प्रिज्म और बेलनाकार रिले लेंस ( चित्रा 1 )। माइक्रोस्कोप से प्रकाश ने फ्लोरोसेंटली लेबल को उत्तेजित किया हैजांच के चश्मे के हिस्से के क्यूबेटोन्यूज से परावर्तित होने के बाद, प्रिज्म जांच के इमेजिंग चेहरे के साथ स्थित कोशिकाओं। कोशिकाओं से उत्सर्जित प्रकाश भी चश्मे के क्यूबोटोजन को दर्शाता है, सूक्ष्मदर्शी के उद्देश्य से एकत्र किया जाता है और माइक्रोस्कोप में संवेदक तक पहुंचता है। इस प्रक्रिया में इस्तेमाल की जाने वाली प्रिज्म जांच को मानक स्टीरियोटेक्सिक उपकरण के साथ आसान उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है।

लघु कोशिकीय कोशिका के संकल्प के साथ न्यूरॉनल आबादी में कम-से-कम फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप 20 का पता लगाता है कि कैओ 2 + ट्रैक्टेन्शंस की क्षमता-विकसित सीओ 2 + -संवेदनशील आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ लेबल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम सीए 2 + इंडिकेटर को वायरल वेक्टर (एएवी 1। सीएएमकेआईएजीसीसीएमपी 6 एफ.पी.ई.एफ.40) में एन्कोडेड करते हैं, एक प्रिज्म जांच बिछाते हैं, सूक्ष्मदर्शी स्थापित करते हैं, और तब सोमाटोसेंसरी (एस 1 हिंद अंग) तंत्रिका गतिविधि डेटा एक जानवर से बेनकाबमुक्त अन्वेषण ( चित्रा 2 ) के दौरान उपन्यास वस्तु सतहों के लिए डी।

Protocol

पशु विषयों से संबंधित प्रक्रियाओं को लाइफसोर्स बायोमेडिकल सर्विसेज, नासा एम्स रिसर्च सेंटर, कैलिफ़ोर्निया में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. प्री-ऑपरेटिव तैयारी

  1. एक हॉट बीड स्टीरलाइज़र में शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं में इस्तेमाल होने वाले औजारों को निर्वहन करें और 70% इथेनॉल के साथ सर्जरी क्षेत्र को पोंछ लें। स्टीरियोटेक्सिक चरण पर रखे हीटिंग पैड को चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. Isoflurane (5% प्रेरण के लिए, और रखरखाव के लिए 1-2%, 0.6-0.8 एल / मिनट ओ 2 ) का उपयोग करके जानवरों को एनेस्थेटेज़ करें। संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए एक पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिवर्त की अनुपस्थिति की जांच करें।
  3. कान और दांत सलाखों के साथ फिट एक stereotaxic फ्रेम में जानवर माउंट।
  4. जानवरों की आँखों पर नेत्र आलमा डालें और उन्हें सूखने और तीव्र शल्य रोशनी से बचाने के लिए काले कागज के एक टुकड़े के साथ कवर करें।
  5. केटोप्रोफेन (2.5मिलीग्राम / किग्रा) या कारप्रोफेन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा)

2. वायरस इंजेक्शन सर्जरी

  1. आँखें और कानों के बीच खोपड़ी को छाँटना और त्वचा को निर्जलीकरण के साथ 3% वैकल्पिक स्वैब 70% इथेनॉल और बीटाडीन के साथ।
  2. खोपड़ी में एक चीरा बनाकर खोपड़ी को खोलें, आंखों के बीच से शुरू होने और बाँझ शल्य ब्लेड के साथ 1.5 सेमी रुस्ट्रोकौडाल का विस्तार करना। खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को खोलें, और कूच के स्वाबों और स्केलपेल का उपयोग करके वांछित इंजेक्शन साइट के आसपास पेरीओस्टेम हटा दें। बाँझ पीबीएस के साथ खोपड़ी कुल्ला। कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी साफ और पॉलिश करें
  3. खोपड़ी का स्तर, और एक मार्कर के साथ, वायरस इंजेक्शन के लिए stereotaxic निर्देशांक को चिह्नित करें। हाई-स्पीड माइक्रोड्रिल (लगभग 7,000-10,000 आरपीएम पर सेट) पर 0.5 एमएम बोरर का इस्तेमाल करना, खोपड़ी में एक छोटा छेद बनाना। ड्रिलिंग के दौरान मामूली दबाव लागू करें और हड्डी की धूल को साफ करें और बाँझ पीबीएस के साथ क्षेत्र को गीला कर लें, जब तक कि मस्तिष्क की सतह फिर से न हो जाएबैठ जाता। मस्तिष्क नम रखें जहां छेद ड्रिल किया गया है।
  4. माइक्रोसिरींज में वायरस को चुनने के लिए एक 26 जी सुई का उपयोग करें ( जैसे एएवी 1। सीएएमकेआईआईजीजीसीएएमपी 6 एफ.पी.ई.एफ.40) और फिर इसे इंजेक्शन के लिए 35 जी सुई के साथ बदलें। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के मैनिपुलेटर बांह को वायरस से भरा माइक्रोसेरिंग संलग्न करें।
  5. इंजेक्शन साइट छेद के करीब सिरिंज लाओ और सुई के कोण को समायोजित करें ताकि यह मस्तिष्क की सतह पर 90 ° कोण पर प्रवेश करे। सुई को कम करें जब तक कि यह पीआ मेटर को छूता और ड्यूरा के माध्यम से पियर्स को छूता है। जब तक वो वांछित गहराई (जेड) तक पहुंच न हो, तब तक 10 माइक्रोन / एस की वृद्धि में सुई को कम करना शुरू करें। स्टीरियोटेक्सिक बांह का उपयोग करके सुई स्थान को ठीक करें
  6. 25 एनएल / मिन में 250 एनएल वायरस लगाने के लिए माइक्रोसिरीज पंप को सेट करें
    1. महत्वपूर्ण कदम: क्योंकि इंजेक्शन लगाने के लिए वायरस की मात्रा टिटर और कमजोर पड़ने पर निर्भर करती है, इमेजिंग कोशिकाओं के लिए इष्टतम मात्रा और एकाग्रता मानदंड स्थापित करने के लिए,प्रयोग में
  7. यदि कुछ वायरस इंजेक्शन साइट से बाहर निकलते देखा जाता है, तो इंजेक्शन को रोकें और मस्तिष्क के ऊतकों को वायरस ड्रॉप को अवशोषित होने तक प्रतीक्षा करें। सुई को वापस लेने से पहले कुल मात्रा की इंजेक्शन के बाद 5-7 मिनट तक प्रतीक्षा करें। विषाणु मस्तिष्क की सतह से बाहर निकलना देखा जाता है, इस घटना में इंजेक्शन की दर को नियंत्रित करने में मदद करने के लिए वायरस समाधान में तेजी से हरे रंग के रंग भी जोड़ा जा सकता है।
  8. प्रांतस्था में कई परतों को लेबल करने के लिए, यदि आवश्यक हो तो कई इंजेक्शन का उपयोग करें। पहले वेंट्रल-सबसे साइट पर प्रारंभ करें, इंजेक्शन के बाद 5-7 मिनट के लिए प्रतीक्षा कर रहा है, और इंजेक्शन के लिए अगले सबसे पृष्ठीय बिंदु पर सुई खींच रहा है ( जैसे -1.0 मिमी एपी, 1.5 मिमी ± एमएल और 400 और 600 माइक्रोन डीवी)। सुई बाहर खींचने और stereotaxic सेटअप से इसे हटाने से पहले अंतिम इंजेक्शन के बाद 10 मिनट रुको।
  9. डबल बैरल सिरिंज से एक विवो बायोकॉम्प्रिजेंट पारदर्शी इलास्टोमर चिपकने वाला एक छोटी मात्रा मिलाएं (जैसे क्वाइक-एसएल) और इसके साथ खोपड़ी में छेद को कवर। इलास्टोमर चिपकने वाला की परत के ऊपर साइनोस्रीलेट चिपकने वाला और इसे ठीक करने दें।
  10. खोपड़ी को सीवन करें और जानवर को गर्म वसूली पिंजरे में संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दें जब तक कि यह चलने वाला नहीं है केटोप्रोफेन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) या कारप्रोफेन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) को अपने घर के पिंजरे में पशु वापस करने से पहले उपनगरीय तरीके से प्रशासन करना। सर्जरी साइट की रक्षा के लिए सिंगल हाउस पोस्ट सर्जरी विषयों और खुराक 24 एच बाद में दोहराएं।
  11. माइक्रोसिंजर को निकालने के बाद, भंडारण से पहले साफ करने के लिए आसुत जल के साथ 26 G और 35 G सुई दोनों 7-10 बार सुई।

3. प्रिज्म जांच इम्प्लांट सर्जरी

  1. 1-2 सप्ताह बाद वायरस इंजेक्शन, प्रिज्म जांच इम्प्लांट सर्जरी के लिए तैयार करें। 70% इथेनॉल में प्रिज्म जांच कीटाणुरहित करें और लेंस पेपर के साथ साफ करें। लेंस धारक उपकरण में प्रिज्म जांच डालें और पेचकश के साथ हेक्स पेंच को कस लें। आधार धारक में माइक्रोस्कोप सीट करें (दमैग्नेट इसे जगह में रखेंगे)।
  2. पूर्व-ऑपरेटिव तैयारी अनुभाग के तहत रेखांकित पशु तैयार करें।
  3. आंखों और कानों के बीच पशु के सिर को छाँटें और दाढ़ी और 70% इथेनॉल और बीटाडीन के वैकल्पिक झुंडों के साथ त्वचा कीटाणुरहित करें।
  4. बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा incising और खोपड़ी का पर्दाफाश त्वचा फ्लैप और अंतर्निहित periosteum निकालें। कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी सूखी और पॉलिश। निम्न चरणों के लिए तैयारी में स्वच्छ, सूखी, चौड़ी हड्डी नींव बनाने के लिए मांसपेशियों के आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए पर्याप्त उपाय सुनिश्चित करें।
  5. प्रत्यारोपण स्थिर और सुरक्षित बनाने के लिए contralateral गोलार्ध में प्रत्यारोपित खोपड़ी शिकंजा यह भी उपयोगी हो सकता है यदि धारा 5 में प्रायोगिक इमेजिंग सत्रों के लिए पशु तैयार करने के लिए जाग सिर फिक्सिंग के लिए एक हेडबार प्रत्यारोपण करना चुन सकता है।
  6. खोपड़ी का स्तर और एक मार्कर के साथ एपी और एमएल लेंस सम्मिलन के लिए समन्वय। एक microdrill पर एक 0.5 मिमी बोर का उपयोग एक दौर craniotomy खोलने, वें सुनिश्चित करनेई क्रैनिओटॉमी व्यास इस मामले में प्रिज्म व्यास यानी 1.0 मिमी से बड़ा है। धीरे-धीरे ड्रिल करें जबकि बाँझ पीबीएस के साथ खोपड़ी को फेंकने के लिए रुककर रुककर कपास झाड़ू के साथ निकाल दें। उत्पन्न होने वाली हड्डी की धूल को निकालें
    1. महत्वपूर्ण कदम: क्रैनीओटमी रखें जैसे कि जब प्रांतस्था में प्रिज्म डाली जाती है, तो इसके फ्लैट किनारे (इमेजिंग सतह) को वायरस इंजेक्शन साइट का सामना करना पड़ रहा है और यह 150-200 माइक्रोन त्रिज्या के भीतर है।
  7. खोपड़ी पूरी तरह से thinned पहले सही ड्रिलिंग बंद करो रक्त वाहिकाओं को पतला हड्डी के माध्यम से दिखाई देना चाहिए। ठीक 45 ° संदंश के साथ धीरे से हड्डी प्लग निकालें।
  8. # 5 संदंश के साथ ड्यूरा निकालें
    1. महत्वपूर्ण कदम: एक बार जब मस्तिष्क के ऊतकों को उजागर किया जाता है, तो ऊतक नम को हमेशा रखें। एक कपास झाड़ू को कुंडली पर बाँझ खारा में गिरा दिया। यह ऊतक पर भी दबाव बनाए रखेगा।
  9. मस्तिष्क के ऊतकों du में दबाव कम करने के लिएप्रिज्म जांच की अंगूठी प्रविष्टि, एक सम्मिलन पथ को समय से पहले बनाएं। स्टीरियोटैक्सिक तंत्र के इलेक्ट्रोड धारक हाथ में सीधे धार वाली विच्छेदन चाकू संलग्न करें और एक कोण पर stereotaxic तंत्र पर माउंट करें जैसे चाकू ब्लेड खोपड़ी के वक्रता (इस मामले में 10 डिग्री कोण) और एक विमान वायरस इंजेक्शन कॉलम के समानांतर
  10. सावधानी से इस मामले में क्रोनियोटमी के ऊपर की चाकू की स्थिति में अग्रस्थ माध्यमिक किनारे पर और ~ 200 सुक्ष्ममापी पार्श्व को पीछे से किनारे के किनारे के साथ विषाणु इंजेक्शन साइट ( चित्रा 1 ) के साथ स्थित है। शून्य को Z-axis से बाहर निकालना, जब चाकू की नोक पिया को छू लेती है और धीरे-धीरे (10 माइक्रोन / एस की वृद्धि में) उस गहराई तक कम करती है जहां पर प्रिज्म जांच डाली जाएगी। फिर प्रिज़्म के अग्रणी किनारे के लिए पथ बनाने के लिए बाद में चाकू 1 मिमी को स्थानांतरित करें। रोकथाम और किसी भी खून बह रहा है कि चीरा एक पूर्व बाँझ खारा लहसुन gelfoam का टुकड़ा के साथ बनाने के दौरान हो सकता है के लिए नियंत्रण।
  11. पिछले चरण में चाकू के रूप में एक ही कोण पर स्टीरियोटेक्सिक मैनिपुलेटर बांह को लेंस धारक (प्रिज्म जांच और माइक्रोस्कोप के साथ) संलग्न करें। प्रिज्म को संरेखित करें जैसे कि प्रिज्म का फ्लैट वाला हिस्सा चीरा पर है और वायरस इंजेक्शन कॉलम के समानांतर है। इस कदम के लिए stereotaxic हाथ की स्थिति के कुछ ठीक सुधार की आवश्यकता हो सकती है तेजी से परिणाम के लिए खोपड़ी के करीब रहकर संरेखण को समायोजित करें।
  12. एक बार चश्मे सही कोण पर होती है, मस्तिष्क की सतह से शुरू होने पर, इस जांच के लिए अंतिम चरण में मस्तिष्क में 10 माइक्रोन की बढ़ोतरी को 1.1 मिमी के लिए कम से कम किया जाता है। मस्तिष्क के ऊतक को प्रिज्म के चारों ओर विस्तारित किया जाएगा और किसी भी दबाव का निर्माण किया गया है जो दृश्यजीति के पीछे हैविमान पर और देखने के क्षेत्र को प्रभावित नहीं करेगा। USB3 पोर्ट के माध्यम से अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर पर माइक्रोस्कोप प्लग करें और एलईडी को चालू करके फ़ील्ड प्रतिदीप्ति कल्पना करें।
  13. एक 25 जी सुई का उपयोग करके इलास्टोमर चिपकने वाला एक बहुत पतली सुरक्षात्मक परत में क्रैनिओटमी में प्रिज्म के आसपास किसी भी उजागर ऊतक को कवर करें।
  14. इलास्टोमर चिपकने वाला ठीक होने के बाद (आमतौर पर ~ 3-5 मिनट में) लेंस को अंदर से चलने से रोकने के लिए, इलास्टोमर चिपकने वाली की परत पर प्रिज्म लेंस के कांच को जोड़ने के लिए कुछ साइनोस्रीलेट चिपकने वाला आवेदन लगाने के लिए 25 जी सुई का इस्तेमाल होता है कर्कशनिष्ठता बेहतर आसंजन के लिए प्रिज्म जांच कफ के किनारों को शामिल करें प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के शीर्ष चेहरे पर कोई चिपकने वाला न लगाएं। एक बार cyanoacrylate चिपकने वाला ठीक हो जाता है लेंस धारक को खोलना और ध्यान से माइक्रोस्कोप को हटा दें। फिर स्टेरिएटेक्सिक मैनिपुलेटर हाथ को धीरे-धीरे वापस ले लें, जिससे प्रिज्म जांच को सुरक्षित रूप से प्रत्यारोपित किया जा सके।
  15. दंत ऐक्रेलिक की एक परत लागू करें यासभी उजागर खोपड़ी सतह को कवर करने के लिए प्रत्यारोपण के आसपास cyanoacrylate चिपकने वाला, आसपास के प्रतिकारित मांसपेशियों के ऊतकों को छूने के लिए नहीं, लेकिन इस कपाल टोपी के साथ खोपड़ी के एक बड़े क्षेत्र को कवर करना बाद में बेसप्लेट अटैचमेंट में मदद करेगा। इम्प्लांट साइट के चारों ओर की त्वचा क्रेनियल कैप के आसपास अपने आप को चंगा करनी चाहिए।
    1. महत्वपूर्ण कदम: चिपकने वाला किसी भी आसपास की त्वचा या मांसपेशी ऊतक को छूने न दें, और कपाल टोपी में किसी भी त्वचा को न छूएं। ऐसा करने से त्वचा में जलन होती है, और इससे प्रत्यारोपण को अत्यधिक खरोंच और संभावित नुकसान हो सकता है।
  16. वैकल्पिक: यदि प्रायोगिक इमेजिंग सत्रों में प्राणियों की बेसप्लेट को माइक्रोस्कोप संलग्न करने और जानवरों को कुचलने के बजाय शल्यचिकित्सा करने के लिए एक जाग सिर-फिक्स्ड सेटअप का उपयोग करना चाहते हैं, पसंद का निश्चित सेटअप (इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित नहीं किया गया)
  17. एक सिलिकॉन से उत्प्रेरक और आधार मिलाएंई चिपकने वाला सिरिंज और प्रिज्म जांच कफ के अंदर इलास्टोमर की एक बूंद डालने के लिए जांच लेंस टॉप को कवर करने से निपटने के लिए किसी भी क्षति और धूल को रोकने के लिए।
  18. स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम से जानवर निकालें और एक गर्म चैम्बर में संज्ञाहरण से वसूली की अनुमति दें। केटोप्रोफेन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) या कारप्रोफेन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) का उपनगरों का प्रबंधन करें, और जानवरों को स्वच्छ घर के पिंजरे में लौटने के बाद एक बार यह चलने वाला है प्रत्यारोपण की रक्षा करने के लिए सभी प्रकार के घरों को एकमात्र घर और खुराक 24 एच बाद में दोहराएं।

4. लघु माइक्रोस्कोप स्थापना के लिए बेसप्लेट अनुलग्नक

  1. प्रिज्म जांच के आरोपण के एक सप्ताह से 10 दिनों के बाद, प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के माध्यम से ऊतक में वायरस की अभिव्यक्ति की जांच करें, और अगर खोपड़ी पर बेसप्लेट संलग्न हो, तो तैयारी सेल गतिविधि दिखाती है। माइक्रोस्कोप लाइव इमेजिंग के दौरान बेसप्लेट पर डॉक करेगा।
  2. बेसप्लेट अटैचमेंट के लिए पशु को तैयार करने के लिए पूर्व-ऑपरेटिव प्रक्रिया में उल्लिखित चरणों का पालन करें।
  3. प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच लेंस शीर्ष की सतह पर सिलिकॉन चिपकने वाली टोपी निकालें। लेंस जांच की सतह की जांच करें, और लेंस पेपर और 70% इथेनॉल के साथ धीरे-धीरे किसी भी मलबे को साफ करें ताकि इमेजिंग सतह साफ हो सके।
  4. अपने डीएक्यू बॉक्स में माइक्रोस्कोप प्लग करें और इसे पीसी पर यूएसबी 3 पोर्ट के माध्यम से कनेक्ट करें।
  5. कंप्यूटर पर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और USB3 पोर्ट के माध्यम से माइक्रोस्कोप कनेक्ट करें। तंत्रिका गतिविधि की जांच के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, और इस विषय में भावी रिकॉर्डिंग के लिए दृश्य सेटिंग के क्षेत्र को मापने और उनका दस्तावेजीकरण करने के लिए।
  6. सूक्ष्मदर्शी के लिए एक बेसप्लेट संलग्न करें और बेसप्लेट सेट स्क्रू को स्थिति में बेसप्लेट को पकड़ने के लिए जकड़ें और माइक्रोस्कोप के शरीर द्वारा स्टीरियोटेक्सिक माइक्रोमैनेइपरेटर बांह पर माइक्रोस्कोप ग्रिपर में माइक्रोस्कोप सुरक्षित करें। ग्रिपर को न्यूपोर्ट रॉड से संलग्न करें, जिसे स्टीरियोटेक्सिक माइक्रोमनिपुलेटर बांह पर रखा जा सकता है।
  7. प्रिज़्म जांच लेंस से ऊपर सूक्ष्मदर्शी स्थिति का उपयोग करेंटेरेओटेक्सिक माइक्रोमैनिपुएटर बांह पशु मंच के पीछे और पीछे से प्रिज्म लेंस को देखकर अभिविन्यास का निरीक्षण करना। दोनों खुर्दबीन उद्देश्य और प्रिज्म जांच लेंस के ऑप्टिकल कुल्हाड़ियों को गठबंधन किया जाना चाहिए।
  8. सॉफ्टवेयर के माध्यम से माइक्रोस्कोप एलईडी चालू करें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच लेंस के शीर्ष चेहरे पर ध्यान केंद्रित करके माइक्रोस्कोप संरेखण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें। जब ठीक से गठबंधन किया जाता है, तो प्रिज्म जांच के किनारे लेंस शीर्ष चेहरे तेज होनी चाहिए।
  9. ऊतक के अंदर वांछित फोकल विमान को प्राप्त करने के लिए स्टिरियोटेक्सिक मैनिपुलेटर बांह का इस्तेमाल करते हुए प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच के ऊपर माइक्रोस्कोप की शारीरिक दूरी को समायोजित करें। माइक्रोस्कोप उद्देश्य और प्रत्यारोपित GRIN लेंस के बीच ऑप्टिकली अनुकूलित दूरी ~ 500 माइक्रोन है
  10. एक संदर्भ प्रतिदीप्ति छवि सहेजें एक बार वांछित इमेजिंग विमान पर कब्जा कर लिया है।
    महत्वपूर्ण बिंदु: इस बिंदु से, माइक्रोस्कोप की स्थिति को समायोजित न करें, क्योंकि यह स्थानीयता बदल देगाऊतक में इमेजिंग विमान पर
    नोट: कपाल टोपी के संबंध में स्थायी रूप से आधारपटल की स्थिति को स्थायी रूप से ठीक करने के अगले चरण में चिपकने वाला लागू करें। चिपकने वाले को अगले या दो दिनों में कुछ मात्रा में संकोच का अनुभव हो सकता है, जो टिशू में फोकल प्लेन को बदल सकता है। पूर्वनिर्धारित रूप से आपके चिपकने वाला मिश्रण और दूरी पूर्व विवो के लिए संकोचन की मात्रा को मापने के लिए, फिर चिपकने वाला आवेदन चरण की प्रगति से पहले उस राशि के द्वारा माइक्रोस्कोप + बेसप्लेट की अंतिम जेड स्थिति का समर्थन किया जाता है।
  11. ऐक्रेलिक या चिपकने वाली खाई को तोड़कर पशु की खोपड़ी को कवर करने वाले ऐक्रेलिक कैप को बेसप्लेट को स्थायी रूप से संलग्न करने के लिए दंत ऐक्रेलिक या साइनोस्रीलेट का उपयोग करें। दांतों की ऐक्रेलिक / साइनोस्रीलेट को धीरे-धीरे लागू करना और कई चरणों में इलाज करना माइक्रोस्कोप के इमेज प्लेन की अंतिम स्थिति पर पहले उल्लिखित संकोचन के प्रभाव को कम कर सकता है।
    1. महत्वपूर्ण कदम: दांत लगाने के दौरान ध्यान रखनासूक्ष्मदर्शी के लेंस, सेट स्क्रू या माइक्रोस्कोप बॉडी से संपर्क करने से किसी भी सामग्री को रोकने के लिए ऐक्रेलिक / साइनोस्रीलेट, जो बाद में इंस्ट्रूमेंटेशन के उचित संचालन को रोक देगा।
    2. महत्वपूर्ण कदम: चिपकने वाला आवेदन करते समय, माइक्रोस्कोप पर धक्का न दें। सूक्ष्मदर्शी या बेसप्लेट पर दबाव, प्रिज्म जांच लेंस के सापेक्ष माइक्रोस्कोप उद्देश्य की गति का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप मिसाइलनमेंट या टिशू में फोकल प्लेन का परिवर्तन हो सकता है जिसके लिए तत्काल पुन: समायोजन की आवश्यकता होती है।
  12. यह सत्यापित करें कि दांतेदार ऐक्रेलिक / साइनोस्रीलाट ने संदंश या सिरिंज टिप की एक जोड़ी के साथ ऐक्रेलिक को टैप करके ठीक किया और कठोर किया है। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एक अंतिम संदर्भ प्रतिदीप्ति छवि प्राप्त करें
  13. ग्रिपर से माइक्रोस्कोप जारी करें और माइक्रोपरोक से ग्रिपर को वापस ले लें। यदि cyanoacrylate या किसी अन्य पारदर्शी चिपकने वाला इस्तेमाल किया गया था, तो इसे काले नेल पॉलिश या काले दंत सिमेंट की एक परत से रोकने के लिए कवर करेंमेबियंट प्रकाश रिसाव सिर टोपी में है, जो प्रयोगों के दौरान प्राप्त की गई छवियों को दूषित कर सकता है।
  14. इस बिंदु पर, यदि आवश्यक हो तो माइक्रोस्कोप को हटा दें बेसप्लेट से सूक्ष्मदर्शी को अलग करने के लिए सेट स्क्वा को मोड़कर लगभग साढ़े गोल की बारी-बारी से बदलकर बेसप्लेट सेट पेंच छोड़ दें। दूसरी ओर बेसप्लेट और ऐक्रेलिक टोपी का समर्थन करते हुए माइक्रोस्कोप बॉडी को पिंच और सीधे माइक्रोस्कोप खींचें। इसे अपने भंडारण कंटेनर में बदलें
  15. बेसप्लेट कवर के साथ प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच को सुरक्षित रखें यह किसी धूल कण को ​​लेंस की सतह पर व्यवस्थित करने से रोक देगा, जो बेसप्लेट स्थापित होने के बाद साफ करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
  16. बेसप्लेट कवर बेसप्लेट पर संलग्न करें और सेट स्क्रू को लगभग आधा बारी की ओर या जब तक सेट स्क्रू बेसप्लेट कवर से फ्लश नहीं किया जाता है, तब तक आगे बढ़ें। अधिक मत कसो।
  17. संज्ञाहरण से पशु निकालें और चलने तक एक गर्म वसूली कक्ष में निगरानी करें। वापसी वेंई पशु अपने घर पिंजरे के लिए प्रत्यारोपण की रक्षा के लिए प्रत्यारोपित बेसपेप्स के साथ सभी जानवरों को अकेले घर बनाएं

5. इमेजिंग मल्टीपल कॉर्टिकल लेयर ऑफ़ फ्रीली मूविंग माउस

  1. यह सफाई और disinfecting और 10% ब्लीच समाधान के साथ नीचे पोंछते द्वारा व्यवहार तंत्र, ( जैसे Phenotyper, Noldus) तैयार करें।
  2. अपने डीएक्यू बॉक्स में माइक्रोस्कोप प्लग करें, और इसे कंप्यूटर से कनेक्ट करें और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को लॉन्च करें।
  3. अधिग्रहण कंप्यूटर पर पर्याप्त फ़ाइल संग्रहण स्थान की जांच करें और कैल्शियम इमेजिंग फिल्मों के लिए जगह बनाएं। माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर के बीच उच्च डेटा अंतरण दर को समायोजित करने के लिए और रिकॉर्डिंग के दौरान डेटा हानि को रोकने के लिए बाहरी हार्ड ड्राइव को लिखने के बजाय सॉफ़्टवेयर से स्थानीय हार्ड डिस्क पर सीधे सहेजें।
  4. खुर्दबीन को संलग्न करने के लिए एक प्रेरण कक्ष में isoflurane (ऑक्सीजन में 5%) के साथ पशु को anesthetize। वैकल्पिक रूप से, धीरे-धीरे पशु को झुकाते हैं या एक जाग सिर-तय सेटअप का उपयोग करते हैंएक हेडबार के साथ अगर संज्ञाहरण को पसंद के व्यवहार प्रतिमान के साथ हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है
  5. बेसप्लेट सेट्सक्राउ काउंटर की बारीकी से बेसप्लेट कवच को हटाकर बेसप्लेट कवर को हटा दें।
  6. जानवर पर बेसप्लेट में माइक्रोस्कोप सीट करें। सूक्ष्मदर्शी को बेसप्लेट पर मैग्नेट की सहायता से जगह लेनी चाहिए। बेसप्लेट सेट स्क्रू अग्रिम करें जब तक कि थोड़ा प्रतिरोध महसूस न हो।
    1. महत्वपूर्ण कदम: सूक्ष्मदर्शी आवास के नुकसान को रोकने के लिए बेसप्लेट सेट स्क्रू को कसने से अधिक मत करना।
  7. सॉफ़्टवेयर में एक प्रतिदीप्ति स्नैपशॉट प्राप्त करने के द्वारा ऊतक में इमेजिंग प्लेन की जांच करें, और यदि आवश्यक हो तो ऊतक में फोकल प्लेन को खुर्दबीन बुर्ज सेट पेंच ढक कर, ठीक फ़ोकस समायोजित करने के लिए खुर्दबीन बुर्ज घूर्णन करके समायोजित करें, फिर बुर्ज को कसने से कस लें आवास सेट पेंच
    1. महत्वपूर्ण चरण: सेट पेंच को ढुकने के बिना कभी भी बुर्ज को चालू न करें, औरबुर्ज सेट स्क्रू को कसने से अधिक मत करो
  8. यदि एक अनुदैर्ध्य अध्ययन का आयोजन किया जाता है, तो भौतिक बुर्ज स्थिति में देखने के लिए उसी क्षेत्र को कैप्चर करें। हार्डवेयर में, बुर्ज की संख्या, या बुर्ज की भौतिक स्थिति, ध्यान दें कि एक ही सूक्ष्मदर्शी दृश्य के समान क्षेत्र में त्वरित वापसी के लिए प्रत्येक जानवर के लिए चित्रित किया गया है।
  9. अपने घर के पिंजरे या व्यवहार कक्ष में उत्खनन के लिए खुर्दबीन ले जाने वाले जानवर को छोड़ दें, और लागू होने पर एनेस्थेसिया को बंद करने का इंतजार करें।
    1. महत्वपूर्ण कदम: कई सत्रों तक एक डमी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके खुर्दबीन का भार उठाने के लिए जानवरों को प्रशिक्षित करें, जब तक यह सुनिश्चित न हो कि माइक्रोस्कोप पहनने से पहले प्रयोगात्मक सत्र शुरू होने से पहले, उनके सामान्य व्यवहार में हस्तक्षेप नहीं होता। नियमित रूप से संभालना और जागने की रोकथाम के लिए प्रशिक्षण जानवरों पर अनुचित तनाव को रोक देगा।
  10. आंकड़ों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिग्रहण सेटिंग का चयन करें। इसमें एफएए शामिल हैडेटा कैप्चर करने के लिए मुझे दर ( जैसे 20 एफपीएस, 1 का लाभ, और 50% की एलईडी पॉवर)। अच्छा हिंदुस्तान एसआईआर सुनिश्चित करने के लिए सेटिंग्स का चयन करते समय छवि हिस्टोग्राम देखें
    नोट: प्रतिदीप्ति संग्रह के लिए संख्यात्मक एपर्चर 1 मिमी की चपेट जांच के लिए 0.35 है जबकि 1 मिमी सीधे जांच के लिए 0.5 की तुलना में।
  11. वांछित इमेजिंग रिकॉर्डिंग साइकल पर माइक्रोस्कोप को ट्रिगर करने के लिए व्यवहार सॉफ्टवेयर और प्रोग्राम लॉन्च करें ( जैसे कि 2 मिनट के बंद पर 4x 5 मिनट)। टीएलटी पोर्ट को नील्डस आईओ बॉक्स पर डीआरएक्स बॉक्स पर ट्राईग पोर्ट पर आरजे 45 से बीएनसी केबल के साथ कनेक्ट करें।
  12. व्यवहारिक क्षेत्र में पशु रखें यदि पहले से वहां नहीं है, और प्रयोग शुरू करें।
  13. वांछित डेटा प्राप्त करने के बाद, एक प्रेरण कक्ष में isoflurane (ऑक्सीजन में 5%) के साथ जानवरों को फिर से अनैतिकता, या धीरे-धीरे जानवर को रोकें।
  14. बेसप्लेट सेट स्क्रू को हटा दें और धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप खींचकर बेसप्ले से माइक्रोस्कोप अलग करें। बेसप्लेट कवर को बदलें और धीरे से बेसप्ला को कस लेंते सेट स्क्रू
  15. घर के पिंजरे में अगले रिकॉर्डिंग सत्र तक पशु वापसी करें। दृश्य प्रतिदीप्ति छवियों को उसी दृश्य दृश्य पर वापस जाने के लिए बाद के इमेजिंग सत्रों के लिए एक गाइड के रूप में उपयोग करें।

6. बड़े पैमाने पर सीए 2+ इमेजिंग डेटा का मूल्यांकन

  1. डेटा से दृश्य के क्षेत्र में सेल स्थान और सीए 2 + गतिशीलता निकालने के लिए, विभिन्न डेटा विश्लेषण प्लेटफॉर्म का उपयोग किया जा सकता है। मोज़ेक, इस अध्ययन के लिए बड़े पैमाने पर सीए 2 + इमेजिंग फिल्मों की प्रक्रिया के लिए विशेष रूप से डिजाइन एक डेटा विश्लेषण मंच का उपयोग इस अध्ययन के लिए किया गया है।
  2. प्रीप्रोसेसिंग चरण में दोषपूर्ण पिक्सेल को सुधारें और कच्ची फिल्मों में किसी भी व्यक्ति को छोड़े गए फ़्रेमों को दोहराएं। आंकड़ों के पदचिह्न को कम करने के लिए पूर्ण रूप से चित्रों को 1,440 x 1,080 पिक्सेल क्षेत्र से 720 x 540 पिक्सल तक बिनो।
  3. माइक्रोस्कोप छवि संवेदक के संबंध में मस्तिष्क में गति कलाकृतियों के लिए सही करने के लिए, कठोर ImageJ आधारित छवि का उपयोग करके फिल्मों को पंजीकृत करेंजिस्ट्रेस एल्गोरिथम (टर्बोरेग)
  4. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए, प्रतिदीप्ति ΔF / एफ 0 = एफएफ 0 / एफ 0 में सापेक्ष परिवर्तन के रूप में छवियों को फिर से अभिव्यक्त करें, जहां एफ 0 की फिल्म पूरी फिल्म की औसत से प्राप्त की गई है।
  5. एक स्थापित सेल-सॉर्टिंग एल्गोरिथम का उपयोग करके अलग-अलग कोशिकाओं के अनुरूप स्थानिक फ़िल्टर की पहचान करें। यहाँ हम व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए प्रिंसिपल और व्यक्तिगत घटक विश्लेषण 21 का इस्तेमाल किया।
    नोट: एक घटना निर्दिष्ट की गई थी कि ट्रेस में एक घटना के पीक आयाम हमारे डेटा सेट में ट्रेस की आधारभूत रेखा से आठ से अधिक मानक विचलन थे और आगे के विश्लेषण के लिए सेल स्थान और सीए 2 + गतिशीलता डेटा निर्यात किया गया था।

Representative Results

यहां बताया गया प्रोटोकॉल, प्रिज्म जांच ( चित्रा 1 ) का प्रयोग करके स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में सैकड़ों कॉर्टिकल न्यूरॉन्स से अनुदैर्ध्य बहु-परत सीए 2+ इमेजिंग करने का एक प्रभावी और कुशल तरीका बताता है। मल्टी लेयर कॉर्टिकल इमेजिंग की ओर पिछले दृष्टिकोण मुख्य रूप से निश्चित जानवरों 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 के लिए प्रतिबंधित हैं। स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले संदर्भ में इस स्तर के आंकड़ों को प्राप्त करने के लिए, एक लघु सूक्ष्मदर्शी मंच का उपयोग व्यवहारिक लचीलेपन के लिए किया गया था; एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (जीसीएएमपी 6 एफ) का उपयोग एक विशिष्ट सेल आबादी (कोंकटेक में CAMKII + कोशिकाओं) को लक्षित करने के लिए किया गया था; और एक प्रिज्म जांच को सीनियर, मल्टी-लेयर फील्ड ऑफ़ व्यू प्रदान करने के लिए चुना गया था।

चित्रा 2 , चरण 2) तक ऑप्टिकल पहुंच को सक्षम करने के लिए एक प्रिज्म जांच के आरोपण से पहले एक उपयुक्त कैल्शियम सूचक को एन्कोड करने वाले एक वायरल वेक्टर को प्रांतस्था ( चित्रा 2 , चरण 1) में अंतःक्षिप्त किया गया था। इमेजिंग सत्रों के दौरान सूक्ष्मदर्शी की स्थिति के लिए एक सुरक्षित, अस्थायी डॉक के रूप में कार्य करने वाला बेसप्लेट पशु के सिर ( चित्रा 2 , चरण 3) पर स्थापित किया गया था, जिससे प्रयोगात्मक व्यवहार में जागृत कई सेल परतों में कॉर्टिकल गतिविधि के दृश्य को सक्षम किया गया था सेटअप ( चित्रा 2 , चरण 4)।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि वांछित सेलुलर आबादी को निशाना बनाया जा रहा था, एक प्रतिनिधि माउस से एक पोस्टमार्टम कोरोनल मस्तिष्क खंड चित्रा 3 में दिखाया गया है जिसमें प्रिज्म प्रोब ट्रैक्ट और जीसीएएमपी 6f प्रयोगशालास्लेथोसेंसी प्रांतस्था के 2/3 और 5 परतों में एलिड न्यूरॉन्स

तंत्र के साथ इमेजिंग के व्यवहार में जागने के दौरान, सोमैटोसेंसरी कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की गतिविधि दर्ज की गई जब माउस तीन अलग-अलग परिवेशों- ओपन फील्ड (दिन 1), ऑब्जेक्ट फैमिलीइजेशन (दिन 2-4) और उपन्यास ऑब्जेक्ट (5 दिन) के संपर्क में था ( चित्रा 4 ) 1 दिन पर माउस को किसी भी ऑब्जेक्ट से रहित व्यवहार क्षेत्र में रखा गया था। 2-4 दिवसीय दिन पर माउस को दो अलग-अलग मूलभूत वस्तुओं (एक जेल पैड और लकड़ी के ब्लॉक) के साथ मैदान में रखा गया था। 5 दिन, वस्तुओं में से एक को उपन्यास वस्तु के साथ बदल दिया गया था। जानवर को हर दिन 20 मिनट के लिए 5 दिनों में इमेज दिया गया था।

सीए 2 + इमेज डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए सेल निष्कर्षण के बाद, सेल स्थानों के लिए उपयुक्त स्थानिक फिल्टर माइक्रोस्कोप रिकॉर्डिंग डेटा के मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रक्षेपण पर मढ़ा हुआ था( चित्रा 5) । एक सफेद धराशायी रेखा परतों 2/3 और 5 कोशिकाओं को अलग करती है। प्रत्येक परतों में से 5 कोशिकाओं से संबंधित सीए 2 + निशान दो अलग-अलग व्यवहार संबंधी संदर्भों में कोशिकाओं के फायरिंग पैटर्न को दिखाते हैं- ऑब्जेक्ट फैमिलीजेशन और नोवल ऑब्जेक्ट एक्सपोजर। उस दिन लेयर 2/3 कोशिकाएं अधिक सक्रिय थीं, उस दिन लेयर 5 कोशिकाओं की तुलना में जब माउस को एक उपन्यास ऑब्जेक्ट से उजागर किया गया था। यह रेखापुंज भूखंडों से भी स्पष्ट होता है जो दिन 1, 4 और 5 पर सभी इमेजेट कोशिकाओं की थ्रेसहोल्ड फायरिंग गतिविधि दिखाती है।

आकृति 1
चित्रा 1: विवो सीए 2+ इमेजिंग में एकाधिक सीटिकल परतों में स्वतंत्र रूप से चलती चूहे में। ( ए ) प्रिज्म जांच विनिर्देशों और इमेजिंग विमान का चित्रण हाइपोटिन्यूज के अंदर पर चिंतनशील कोटिंग चश्मे जांच के सम्मिलन विमान से इमेजिंग 90 डिग्री की अनुमति देता है। लेंस क्यूएफएफ लेंस धारक के साथ एकीकृत करता है, जो आरोपण प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है और आरोपण ( बी ) (i) के दौरान परिवेशी टिशू प्रतिदीप्ति के संभावित देखने की अनुमति देता है। विषाणु इंजेक्शन साइट के मुताबिक चश्मे जांच जांच और चाकू चीरा के स्थान का चित्रण, और (ii) चाकू चीरा और वायरस इंजेक्शन साइट के मुताबिक चश्मा जांच फ्लैट साइड के स्थान का चित्रण। ( सी ) इन-विवो सीए 2 + इमेजिंग सेटअप का चित्रण, जो माउस कंटैक्स में प्रत्यारोपित किए गए प्रिज्म जांच के माध्यम से देखने के पूरे क्षेत्र के भीतर एक छोटे से क्षेत्र के लिए प्रकाश पथ दिखा रहा है। ( डी ) प्रिज्म जांच स्थापना के दौरान देखने का उदाहरण क्षेत्र। लघु सूक्ष्मदर्शी लेंस धारक से जुड़ा हुआ है, जिसमें प्रिज्म जांच की जाती है, जो प्रिज्म जांच अधिष्ठापन के दौरान वायरस अभिव्यक्ति की जांच करने की अनुमति देती है। ( ई ) GCaMP6f के बहु-परत cortical इमेजिंग के लिए चश्मे जांच के साथ माइक्रोस्कोप का एकीकरण S1 कोशिकाओं के लेबल। एफ दृश्य क्षेत्र देखेंबेसप्लेट स्थापना के दौरान कच्चे छवि में कुछ कोशिकाओं के साथ बेसप्लेट इंस्टॉल करने के समय रक्त वाहिका पैटर्न स्पष्ट होता है। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर विंडो में डीएफ / एफ चालू होने पर अधिक कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2: योजनाबद्ध प्रक्षेपण और माइक्रोस्कोप स्थापना के लिए वर्कफ़्लो घटनाओं की समयरेखा दिखा रहा है। एक्स अक्ष पर सप्ताह की संख्या का प्रतिनिधित्व किया जाता है और वाई अक्ष के साथ प्रक्रियाओं के वर्कफ़्लो चरण होते हैं। ( ए ) वायरल इंजेक्शन (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) को दर्शाती ग्राफ़िक, एक समान डोरो-वेंट्रल अक्ष के साथ, माउस स्मोमटोसेंसरिक कंटैक्स के कई परतों को लेबल करने के लिए। ( बी ) 2 सप्ताह पोस्ट वायरस इंजेक्शन, एक प्रिज्म समस्याई एक अक्ष पर प्रत्यारोपित किया जाता है जो वायरस इंजेक्शन साइटों के समानांतर है। ( सी ) प्रिज्म जांच आरोपण के लगभग एक हफ्ते बाद, जानवरों को माइक्रोस्कोप के साथ अभिव्यक्ति के लिए चेक किया जाता है और यदि एक कोशिका की आबादी दिखाई दे रही है तो बेसप्लेट सिर पर मुहिम की जाती है। ( डी ) पशु तब प्रासंगिक व्यवहार कार्यों के दौरान क्रोनिक इमेजिंग के लिए तैयार है (माउस क्लिप आर्ट-यूडब्ल्यू-मैडिसन बायोकेमेस्ट्री मीडियालाब की अनुमति के बाद संशोधित) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: पोस्टमार्टम प्रिज्म जांच स्थान और जीसीएएमपी अभिव्यक्ति के हिस्टोलॉजिकल मान्यता। ( ए ) एक प्रतिनिधि माउस मस्तिष्क से कोरोनल अनुभाग जो प्रिज़्म जांच के पथ को दिखाता है और इसके इमेजिंग पक्ष का सामना करना पड़ रहा हैGCaMP6f व्यक्त कोशिकाओं (AAV1.CaMKII.GCaMP6f परतों 2/3 और 5 में न्यूरॉन्स में व्यक्त) ( बी ) डीएपीआई के लिए धुंधला होने के बाद भी एक समान कालिक मस्तिष्क खंड। स्केल बार = 250 माइक्रोन ( सी ) जीसीएएमपी 6 एफ के मोज़े में ज़ूम होकर सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स में कोशिकाओं को व्यक्त करते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: अभ्यावेदन, परिचित, और उपन्यास वस्तु एक्सपोज़र टेस्टिंग के दौरान माउस क्रियाकलाप वीडियो सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए वीडियो ट्रैक किया गया था। ( ए ) 1 दिन, जानवर किसी भी वस्तुओं (खुले मैदान) से रहित एक व्यवहार क्षेत्र में रखा गया था। ( बी ) 2-4 दिनों के बाद, दो अलग-अलग मूलभूत वस्तुओं (जेल पैड और लकड़ी ब्लॉक) को क्षेत्र में रखा गया था (ऑब्जेक्ट फ़िमीliarization)। ( सी ) 5 दिन, वस्तुओं में से एक को एक उपन्यास वस्तु (रेत कागज के साथ लकड़ी ब्लॉक) (उपन्यास वस्तु एक्सपोजर) के साथ बदल दिया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: माइक्रोस्कोप के साथ पेश किया गया एक प्रतिनिधि माउस की स्टेमेटेन्सरी कोर्टेक्स की सतही और दीप परतों से कैल्शियम डायनेमिक्स। ( ए ) न्यूरॉनल स्पेसिफिक फिल्टर (ग्रीन ब्लॉब्स) की मर्ज की गई छवि और दृश्य के प्रिज्म जांच के माध्यम से माइक्रोस्कोप रिकॉर्डिंग का प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रक्षेपण। एक सफेद डैश्ड लाइन द्वारा संकेतित सुपर्रैगरेन्यूलर और इन्फ्रग्रैनल्यूलर परतों के बीच सीमा। स्केल बार = 100 माइक्रोन ( बी ) कैल्शियम पांच उदाहरणों से सतही और गहरे परत की कोशिकाओं (भरे हुए नीले और लाल सीप्रिंसिपल और स्वतंत्र घटक विश्लेषण निम्नलिखित प्रतिदीप्ति मानक विचलन की इकाइयों का संकेत है, पैनल ए में ells)। क्षैतिज स्केल बार 50 एस और ऊर्ध्वाधर पैमाने पर 10 एसडी ( सी ) सतही (परतों 2/3) और खुली क्षेत्र, ऑब्जेक्ट फैमिलीजेशन और नोवल ऑब्जेक्ट एक्सप्लोरेशन पर दिखाए गए गहरे परत (परत 5) से कोशिकाओं की रास्टर प्लॉट। स्केल बार = 100 एस इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

जागरूकता के दौरान तंत्रिका सर्किट गतिविधि को समझना स्वास्थ्य और बीमारी में मस्तिष्क समारोह का प्रभावी ढंग से विश्लेषण करने के लिए तंत्रिका विज्ञान संबंधी जांच का एक महत्वपूर्ण स्तर है। कांटेक्स जागरूकता के संदर्भ में अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण क्षेत्र है, क्योंकि यह कई महत्वपूर्ण संवेदी, संज्ञानात्मक और कार्यकारी कार्यों 28 , 2 9 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

कोर्टेक्स में कॉर्टिकल कॉलम को मूल कार्यात्मक इकाई माना जाता है और कॉर्टिकल कोशिकाओं की आबादी-स्तरीय गतिविधि कॉलम के भीतर उनके भौतिक स्थान के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, 2/3 में परतों में उत्तेजक न्यूरॉन्स मुख्य रूप से अन्य नियोक्लास्टिक क्षेत्रों में स्थित है और अन्य कॉर्टिकल नेटवर्क 30 को व्यवस्थित करता है, जबकि गहरे परतों में कोशिकाओं को मुख्य रूप से थैलेमस 31 जैसे उप-क्षेत्रीय क्षेत्रों में प्रोजेक्ट किया जाता है। सौ की गतिविधि रिकॉर्डिंगपूर्व-निर्दिष्ट कॉर्टिकल कोशिकाओं के साथ-साथ स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले विषयों में अलग-अलग लैमीनाओं में समय-समय पर बहुत सीक्रेटिकल सूचना प्रवाह की हमारी समझ को आगे बढ़ाएगा, जिससे वास्तविक समय व्यवहार संबंधी जानकारी और कार्य प्रासंगिक समय-समय पर सूचित किए जाने वाले कॉर्टिकल कॉलम के बेहतर कार्यात्मक विच्छेदन की अनुमति होगी- तराजू।

तंत्रिका सर्किट डेटा के इस स्तर को इकट्ठा करना एक कुशल और सुव्यवस्थित लघु सूक्ष्मदर्शी मंच के उपयोग के साथ-साथ बड़े पैमाने पर सीए 2+ इमेजिंग को स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले विषयों (या वांछित सिर-फिक्स्ड विषयों) में संचालित करने में संभव है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों द्वारा सेल-प्रकार के विशिष्ट लक्ष्यीकरण को सक्षम करने के लिए और एक दीर्घ-प्रत्यारोपित प्रिज्म जांच द्वारा उपलब्ध कराए गए बहु-परत क्षेत्र को इमेजिंग करने के लिए प्रयुक्त किया गया, इस प्रोटोकॉल ने कई संभावित अनुप्रयोगों में एक मामला का पता लगाया: सोमाटोसेंसरी कॉर्टिकल प्रोसेसिंग में लामिना का अंतर देखकर जब चूहों भौतिक रूप से एक उपन्यास वस्तु ( चित्रा 5 ) के साथ जुड़ा हुआ है।यह इस प्रकार की कोशिका-प्रकार विशिष्ट का पहला प्रक्रियात्मक उदाहरण है, जो सक्रिय रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों को जागृत करने के लिए कई प्रकार की परतों का अध्ययन करने और सक्रिय मस्तिष्क में लामिना संरचनाओं को समझने के लिए उपलब्ध प्रयोगात्मक विधियों के स्पेक्ट्रम को विस्तृत करने के लिए विवो दृष्टिकोण में है।

इस तकनीक में चश्मे जांच द्वारा सक्षम दृश्य के पेरिस्कोपिक फ़ील्ड को अन्य मस्तिष्क संरचनाओं पर लागू किया जा सकता है, जब ऊतक को सीधे बोर के क्षेत्र में सीधे पृष्ठीय के संरक्षण की आवश्यकता होती है; उदाहरण के लिए, सीए 3 इमेजिंग हिप्पोकैम्पल फ़ंक्शन के विघटन के बिना हासिल की जा सकती है।

इमेजिंग सीए -2 + इमेजिंग के लिए प्रिज्म जांच आधारित दृष्टिकोण को कोर्टेक्स में एक माइक्रोप्रिज्म के भौतिक सम्मिलन और स्थायी आरोपण की आवश्यकता होती है, जो एक कॉर्टिकल घाव के निर्माण के समान है जहां लेंस जांच डाली जाती है। इसके परिणामस्वरूप स्थानीय तंत्रिका सर्किट में बाधा उत्पन्न हो सकती है, जिसमें एपिकल डेन्ड्रैक्ट्स और प्रोसेस की रोकथाम भी शामिल है। टीउसकी प्रक्रिया क्षेत्र में ग्लिअल कोशिकाओं की एक प्रारंभिक सक्रियण भी पैदा करेगी, हालांकि यह उम्मीद है कि यह चश्मे के चेहरे से ऊतक को 150 माइक्रोन के स्थान पर स्थानांतरित करने के लिए और मस्तिष्क 22 को ठीक करने के बाद कम हो जाएगा। यह विचार करना बेहद जरूरी है कि प्रयोग की योजना बनाते समय यह तकनीक सामान्य सर्किट शरीर रचना और / या जानवरों के व्यवहार को प्रभावित करेगी। व्यवहार नियंत्रण समूहों को हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए कि आधारभूत व्यवहारों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हैं जो भ्रामक प्रयोगात्मक परिणामों का उत्पादन कर सकते हैं।

न्यूरोफर्माकोलॉजिकल हेरफेर, विभिन्न संज्ञानात्मक, सामाजिक, मोटर या आंतरिक व्यवहार के मानदंडों के साथ इस लघुकृत मोबाइल सीए 2 + इमेजिंग तकनीक का उपयोग करना, और इसे अन्य शारीरिक मेट्रिक्स के साथ जोड़ना व्यवहार और सिग्नल में तंत्रिका सर्किट की कार्यात्मक भूमिकाओं को समझने पर केंद्रित अध्ययन को गहरा और समृद्ध कर सकता है प्रसंस्करण 32 दमन या सक्रियड्रग्स द्वारा नियंत्रित कुछ रास्तेों के व्यवहार से संबंधित व्यवहार को प्रभावित किया जा सकता है, जिसे आसानी से इस तकनीक का उपयोग करके 33 हो सकता है । कैल्शियम सूचक के लक्ष्यीकरण को संशोधित करके विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में बांटना एक और शक्तिशाली और उपयोगी अनुप्रयोग है, और विभिन्न तंत्रिका सर्किट प्रश्नों को संबोधित करने के लिए प्रयोगात्मक टूल के कई रचनात्मक संयोजनों को सक्षम करता है।

Disclosures

लेखकों ने जर्नल की पॉलिसी पढ़ ली है और निम्नलिखित प्रतियोगी हित हैं: एसजी, एसओ और वीसी इनकोकिक्स में कर्मचारियों का भुगतान करते हैं।

Acknowledgments

लेखक AAV1-GCaMP6f के अपने उदार दान के लिए हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के जनेलिया रिसर्च कैम्पस में जेनेटिक-एन्कोडेड न्यूरॉनल इंडिकेटर और एफ़ाक्कोटर (जेनआईई) प्रोजेक्ट से वी। जयरामन, डीएस किम, एलएल लोगर और के। सेवोबोडा को धन्यवाद देना चाहते हैं। पेन्सिलवेनिया वेक्टर कोर विश्वविद्यालय के लिए वे स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी में ए। ओल्सन और न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर का धन्यवाद करना चाहते हैं, जो उनकी confocal माइक्रोस्कोपी सेवाओं के लिए एनआईएच एनएस069375 अनुदान द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurostar Motorized
Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument		 Kopf Model 963SD Surgery
Stereoscope Labomed Prima DNT Surgery and Imaging
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" Jack FHC 40-90-5D-02 Surgery
Heating Pad 5 X 12.5 cm  FHC 40-90-2-07 Surgery
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D Surgery
Microsyringe Pump World Precision Instruments UMP3 model; serial 155788 F110 Surgery
NanoFil 10 μL Syringe World Precision Instruments NANOFIL Surgery
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK World Precision Instruments NF35BV-2 Surgery
Omnidrill35, 115 - 230 V World Precision Instruments 503598 Surgery
Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05 Surgery
nVista Inscopix 100-001048 Imaging
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 Penn Vector Core AV-1-PV3435 Surgery
Ketoprofen Victor Medical 5487 Surgery
Carprofen Victor Medical 1699008  Surgery
Isoflurane Victor Medical 1001054 Surgery
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm) Pfizer (Fisher Scientific) NC9841478 Surgery
Dumont #5/45 forceps Fine Science Tools 11251-35 Surgery
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30 Surgery
Dissecting knives Fine Science Tools 10055-12 Surgery
ProView Implant Kit Inscopix 100-000756 Surgery and Imaging
ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length Inscopix 100-000592 Surgery and Imaging
Kwik-Sil adhesive pack of 2 World Precision Instruments KWIK-SIL Surgery
Kwik-Cast Sealant World Precision Instruments KWIK-CAST Surgery and Imaging
Miniature Optical Mounting Post Newport M-TSP-3 Imaging
Microscope Baseplate Inscopix BPL-2 Imaging
Microscope Baseplate Cover Inscopix BPC-2 Imaging

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References

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Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55579, doi:10.3791/55579 (2017).

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