Summary
Her presenterer vi en prosedyre for å utføre storskala Ca 2+ avbildning med cellulær oppløsning på tvers av flere kortikale lag i fritt bevegelige mus. Hundrevis av aktive celler kan observeres samtidig ved hjelp av et miniatyrhodet mikroskop kombinert med en implantert prisme sonde.
Abstract
In vivo krets og mobilnivå funksjonell bildebehandling er et kritisk verktøy for å forstå hjernen i handling. Høyoppløselig bildebehandling av musekortiske nevroner med tofotonmikroskopi har gitt unikt innblikk i kortikal struktur, funksjon og plastisitet. Disse studiene er imidlertid begrenset til hodede faste dyr, og reduserer den adferdsmessige kompleksiteten som er tilgjengelig for studier. I dette papiret beskriver vi en prosedyre for å utføre kronisk fluorescensmikroskopi med cellulær oppløsning på tvers av flere kortikale lag i fritt oppførte mus. Vi brukte et integrert miniatyrisert fluorescensmikroskop parret med en implantert prisme sonde for samtidig å visualisere og registrere kalsiumdynamikken til hundrevis av nevroner på tvers av flere lag av den somatosensoriske cortexen som musen forlovet i en romanobservasjonsoppgave i flere dager. Denne teknikken kan tilpasses andre hjernegrupper i forskjellige dyrearter for andre betegnelser paradigms.
Introduction
Cortexen er en viktig spiller i mange komplekse mentale og atferdsfunksjoner, fra oppmerksomhet, sensorisk oppfatning og top-down kognitiv kontroll 1 , 2 , 3 til motivasjons-, belønnings- og avhengighetsveier 4 , 5 . Å forstå de beregningsmessige prosessene som ligger til grund for sin funksjon er et viktig mål å drive en bedre klinisk forståelse av mange psykiske og atferdsforstyrrelser.
Mange nåværende teorier om psykiatrisk sykdom senterer ideen om at kortikale nevrale krets dysfunksjon eller diskoordinering kan ligge til grund for kognitive og adferdsmessige abnormiteter som er kjennetegn ved forhold som skizofreni 6 , autisme 7 eller tvangssyndrom 8 . Dermed oppnår man nevraaktivitetsdata fra populasjonsnivå fra koRtiske kretser innenfor riktig sammenheng med samtidig atferdsdata er av stor betydning, og kan ideelt sett målrettes mot bestemte celletyper for finere nevrale kretsdiseksjon.
Miniaturiserte mikroskoper i forbindelse med implanterbare gradientbrytningsindeks (GRIN) mikrolinser muliggjør optisk tilgang til neuronale ensembler under frie bevegelige forhold fra et mangfold av mulige hjernegrupper 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inkludert cortex 14 , 15 , 16 . Ved å bruke et mobilt mikroskopisystem kombinert med genetisk kodede kalsiumindikatorer, muliggjør konsistent avbildning av den samme cellulære befolkningen som omfatter hundrevis av nevroner i løpet av dager til uker i mange hjernegrupper 9 , og kan væreGenetisk målrettet mot bestemte celletyper ved bruk av viral vektor eller transgene teknikker.
Som cortex er kjent for å støtte forskjellige funksjoner og koble til forskjellige hjerneområder, avhengig av plasseringen av cellene i cortical lamina 17 , 18 , 19 , er vi interessert i å skaffe samtidig flerlags nevral aktivitet i våte oppførende fag. Her viser vi hvordan du kan vise hundrevis av fluorescensmerkede nevroner i fritt oppførsel av mus over dager, ved hjelp av det miniatyriserte fluorescensmikroskop 20 parret med en implantert prisme-sonde, som gir en flerlagsvisning av cortexen ( figur 1 ).
Prismåleren som brukes her består av to separate GRIN-linser: et prisme og et sylindrisk reléobjektiv ( figur 1 ). Lyset fra mikroskopet stimulerer fluorescensmerketCeller som befinner seg langs bildebehandlingsoverflaten av prisme-sonden, etter å være reflektert av hypotenus av prismedelen av sonden. Det utstrålede lyset fra cellene reflekterer også av prismens hypotenuse, samles inn gjennom mikroskopens mål og når sensoren i mikroskopet. Prisme sonden som brukes i denne prosedyren er tilpasset for enkel bruk med standard stereotaksisk utstyr.
Det miniatyriserte fluorescensmikroskop 20 detekterer virkningspotensial-fremkalte Ca 2+ transienter i nevronpopulasjoner med enkeltcelleoppløsning, etter at disse cellene har blitt spesifikt merket med Ca 2+ -følsomme genetisk kodede fluorescerende indikatorer. I denne protokollen injiserer vi Ca 2+ -indikatoren kodet i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implanterer en prisme sonde, installerer mikroskopet, og oppnår så mange dager somatosensoriske (S1 bakre lemmer) nevrale aktivitetsdata Fra et dyr avsløreD til nye objektoverflater under fri leting ( figur 2 ).
Protocol
Prosedyrer med dyrepersoner er godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk (IACUC) hos LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, California.
1. Preoperativ forberedelse
- Steriliser verktøyene som skal brukes i kirurgiske prosedyrer i en sterilisator med sterilisator og tørk operasjonsområdet med 70% etanol. Slå på varmeputen som er plassert over det stereotaksiske trinnet og oppretthol det ved 37 ° C.
- Bedøv dyret med isofluran (5% for induksjon og 1-2% for vedlikehold, 0,6-0,8 L / min O2). Kontroller at det ikke er en tårefleksrefleks for å bedømme dybde av anestesi.
- Monter dyret i en stereotaksisk ramme utstyrt med øre og tennestenger.
- Påfør øyenfargesalven på dyrets øyne og dekk dem med et stykke mørkt papir for å beskytte dem mot tørking og intense kirurgiske lys.
- Subkutant injiser dyret med ketoprofen (2,5Mg / kg) eller karprofen (2,5 mg / kg)
2. Virusinjeksjonsoperasjon
- Trim og barber hodebunnen mellom øynene og ørene og desinfiser huden med 3 alternativer på 70% etanol og betadin.
- Utsett skallen ved å gjøre et snitt i hodebunnen, som starter mellom øynene og strekker 1,5 cm rostrocaudal med et sterilt kirurgisk blad. Åpne huden for å avsløre skallen, og fjern periosteumet rundt ønsket injeksjonssted ved hjelp av bomullspinne og en skalpell. Skyll skallen med sterilt PBS. Rengjør og poler skallen med bomullspinner.
- Nivå skallen, og markør de stereotaksiske koordinatene for virusinjeksjon med en markør. Bruk en 0,5 mm burr på en høyhastighets mikrodrill (satt til rundt 7.000-10.000 omdr./min.), Lag et lite hull i skallen. Påfør lite trykk mens du borer og periodisk rengjør benstøvet og fukt området med sterilt PBS for å hindre at hjernevevet overopphetes, til hjernens overflate er igjenverket. Hold hjernen fuktig der hullet bores.
- Bruk en 26 G nål til å plukke opp virus ( f.eks. AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) i mikrosprøyten, og erstatt den deretter med en 35 G nål til injeksjon. Fest microsyringen lastet med virus til manipulator armen av stereotaksisk apparat.
- Ta sprøyten nær hullet på injeksjonsstedet og juster nålens vinkel slik at den går inn i 90 ° vinkel mot hjernens overflate. Senk nålen til den berører pia mater og pierce gjennom dura. Begynn å senke nålen i trinn på 10 μm / s til den når den ønskede dybden (z). Fest nålens plassering der med den stereotaksiske armen.
- Sett mikrosprøytepumpen for å injisere 250 nL virus ved 25 nL / min.
- Kritisk trinn: Siden virusvolumet som skal injiseres, avhenger av titer og fortynning, utføres fortynningseksperimenter på forhånd, for å etablere optimale volum- og konsentrasjonskriterier for bildebehandling av cellerI forsøket.
- Hvis det ser ut som noe virus eksploderer ut av injeksjonsstedet, pause injeksjonen og vent til hjernevævet absorberer virusfallet. Vent i 5-7 minutter etter at totalvolumet er injisert før du trekker nålen inn. Farger som hurtiggrønn kan også legges til virusoppløsningen for å bidra til å kontrollere injeksjonshastigheten i tilfelle viruset ser utstrålende ut av hjernens overflate.
- For å merke flere lag i cortex, bruk flere injeksjoner om nødvendig. Start på ventral-mest-stedet først og vent i 5-7 minutter etter injeksjonen, og dra nålen til neste mest dorsale punkt for injeksjon ( f.eks. Injeksjon ved -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML og 400 og 600 μm DV). Vent 10 min etter den endelige injeksjonen før du trekker ut nålen og fjern den fra stereotaksisk oppsett.
- Bland en liten mengde av et in vivo biokompatibelt gjennomsiktig elastomer lim fra dobbeltrørssprøyten (F.eks Kwik-Sil) og dekke hullet i skallen med den. Påfør cyanakrylat lim på toppen av laget av elastomer lim og la det kurere.
- Sutur hodebunnen og la dyret komme seg fra anestesi i en varm gjenvinningsbur til den er ambulerende. Administrer ketoprofen (2,5 mg / kg) eller karprofen (2,5 mg / kg) subkutant før du returnerer dyret til sitt hjembur. Enkelt hus etter kirurgi fag for å beskytte operasjonsstedet og gjenta dosen 24 timer senere.
- Etter fjerning av mikrosprøyten skylles begge 26 G og 35 G nåler 7-10 ganger med destillert vann for å rengjøre før lagring.
3. Prism Probe Implant Surgery
- 1-2 uker etter virusinjeksjon, forberede seg på prismasimplantatoperasjonen. Desinfiser prisme sonden i 70% etanol og rengjør den med linsepapir. Sett prismerproben i linserholderverktøyet og stram sekskantskruen med skrutrekker. Sett mikroskopet i baseholderen (denMagneter vil holde den på plass).
- Forbered dyret som beskrevet under Pre-operative Preparation-delen.
- Trim og barber dyrets hode mellom øynene og ørene og desinfiser huden med alternerbare servietter av 70% etanol og betadin.
- Utsett skallen ved å stikke inn huden med et par sterile saks og fjern hudflappen og underliggende periosteum. Tørk og pudse skallen med bomullspinner. Sørg for tilstrekkelig fjerning av omkringliggende muskelvev for å skape et rent, tørt, bredt bein fundament for å forberede seg på følgende trinn.
- Implantskalle skruer i den kontralaterale halvkule for å gjøre implantatet stabilt og sikkert. Disse kan også være nyttige hvis du velger å implantere en headbar for våkne hodetfiksering for å klargjøre dyret for eksperimentelle bildebehandlingsøkter i seksjon 5.
- Nivå skallen og med markør markere AP og ML koordinatene for innsetting av linse. Ved hjelp av en 0,5 mm burr på en microdrill åpne en rund craniotomi, som sikrer thE kraniotomi-diameter er bare større enn prismediameteren, dvs. 1,0 mm i dette tilfellet. Bor forsiktig mens du pauser periodisk for å skylle skallen med sterilt PBS og sug det bort med bomullspinner. Fjern benstøvet som genereres.
- Kritisk trinn: Plasser craniotomi slik at når prisma er satt inn i cortex, ligger den flate kanten (bildeflate) mot virusinnsprøytningsstedet og ligger innenfor en radius på 150-200 μm.
- Stopp boring rett før skallen er helt fortynnet. Blodkar skal være synlige gjennom den fortynnede bein. Fjern benpluggen forsiktig med fine 45 ° tapper.
- Fjern dura med # 5 tanger.
- Kritisk trinn: Når hjernevævet er utsatt, hold alltid vevet fuktig. Legg en bomullspinne dyppet i steril saltløsning over craniotomi. Dette vil også holde press på vevet.
- For å lette presset i hjernevævet duRing innføring av prisme sonden, lage en innføringskanal før tiden. Fest en rettkjedet disseksjonskniv til elektrodeholderarmen til den stereotaksiske apparatet og monter den på stereotaksisk apparatur i en vinkel slik at knivbladet er vinkelrett på krøllens krølling (10 ° vinkel i dette tilfellet) og i en Plan parallelt med virusinjeksjonskolonnen.
- Plasser kniven forsiktig over craniotomi langs den fremre medialkanten i dette tilfellet og ~ 200 μm lateral til virusinjeksjonsstedet med kanten på baksiden ( fig. 1 ). Null ut Z-aksen når knivspissen berører piaen og senk den gradvis (i trinn på 10 μm / s) til en dybde hvor prismodulen setter inn. Deretter beveger du kniven 1 mm bakover for å skape en vei for prismens forkant. Pause og kontroll for blødning som kan skje mens du gjør snittet med en pre-steril saltvann gjennomvåt gelfoam.
- Fest objektivholderen (med prisme-sonden og mikroskopet) til den stereotaksiske manipulatorarmen i samme vinkel som kniven i forrige trinn. Juster prisma slik at den ferske siden av prisma er over snittet og parallelt med virusinjeksjonskolonnen. Dette trinnet kan kreve en fin korreksjon av den stereotaksiske armposisjonen. Juster justeringen ved å holde deg nær skallen for å få raskere resultater.
- Når prismen er i riktig vinkel, senk den gradvis i hjernen i 10 μm trinn til en slutt z på 1,1 mm for denne sonden, fra hjernens overflate. Hjernevævet vil utvide seg rundt prismaet, og ethvert press som er opprettet ligger bak visualizatiPå fly og vil ikke påvirke synsfeltet. Koble mikroskopet til en datamaskin med oppkjøpsprogramvare installert via en USB3-port og visualiser feltfluorescens ved å slå på LED-lampen.
- Dekk eventuelle eksponerte vev rundt prismaet i kraniotomi i et meget tynt beskyttende lag av elastomer lim med en 25 G nål.
- Etter at elastomer limet er herdet (vanligvis i ~ 3-5 minutter), bruk en 25 G nål for å påføre litt cyanoakrylat lim for å feste glasset av prisma linse til den tilstøtende skallen over laget av elastomer lim for å hindre at linsen beveger seg inne Craniotomi. Inkluder kantene på prisme sonde mansjetten for bedre vedheft. Ikke få noen lim på toppen av den implanterte prisme sonden. Når cyanoakrylat limet er herdet, skru linsholderen og fjern mikroskopet forsiktig. Trekk deretter langsomt den stereotaksiske manipulatorarmen for å la prisme sonden sikkert implanteres.
- Påfør et lag av dental akryl ellerCyanoakrylat lim rundt implantatet for å dekke alle utsatte skaller overflater, opp til, men ikke berøre det omkringliggende tilbaketrukne muskelvev. Dekker et stort område med skalle med denne kranettdekselet, vil senere hjelpe til med bunnplastfeste. Huden rundt implantatstedet skal helbrede seg selv rundt kranetthetten.
- Kritisk trinn: Ikke la klebemiddel berøre noen av de omkringliggende hud- eller muskelvevene, og ikke kvel opp noen hud i kranetthetten. Å gjøre det vil irritere huden, og kan føre til overdreven riper og potensiell skade på implantatet.
- Valgfritt: Hvis du ønsker å bruke et vått hodefyrt oppsett for å feste og løsne mikroskopet til et dyrs grunnplate i eksperimentelle bildebehandlingsøkter, i stedet for kort bedøvelse eller skrubbing av dyret, implantere en ledestang i kranetthetten som er kompatibel med en våken hode- Fast oppsett av valg (ikke vist i denne protokollen).
- Bland katalysatoren og basen fra et silisiumE klebemiddelsprøyte og sett en dråpe av elastomeren inne i prisma sonden mansjett for å dekke sonde linse toppen for å hindre skade og støv fra å bosette seg.
- Fjern dyret fra den stereotaksiske rammen og tillate gjenoppretting fra anestesi i et varmt kammer. Administrer ketoprofen (2,5 mg / kg) eller karprofen (2,5 mg / kg) subkutant, og returner dyret til et rent hjem bur når det er ambulant. Husk alle emner for å beskytte implantatet og gjenta dosen 24 timer senere.
4. Bordplate vedlegg for montering av miniatyrmikroskop
- Én uke til 10 dager etter implantering av prisme sonden, sjekk for virusuttrykk i vevet gjennom den implanterte prisme sonden, og å feste en baseplate på skallen hvis preparatet viser celleaktivitet. Mikroskopet vil legge på baseplaten under levende bildebehandling.
- Følg trinnene som er skissert i den preoperative prosedyren for å forberede dyret for bunnplastvedlegg.
- Fjern silikoneklempen på overflaten av den implanterte prisma sonde linse toppen. Undersøk linsesondeoverflaten, og rengjør eventuell rusk forsiktig med linsepapir og 70% etanol for å sikre at billedoverflaten er ren.
- Koble mikroskopet til DAQ-boksen og koble det via USB3-porten til PCen.
- Åpne oppkjøpsprogramvaren på datamaskinen og koble mikroskopet via USB3-porten. Bruk oppkjøpsprogramvaren til å kontrollere neural aktivitet, og for å måle og dokumentere visningsfeltet for fremtidige opptak i dette emnet.
- Fest en grunnplate til mikroskopet og fest bundplaten settskruen for å holde grunnplaten på plass, og fest mikroskopet i mikroskopgriperen på stereotaksisk mikromekanipulatorarm ved mikroskopets kropp. Fest grippen til en Newport stang, som kan monteres på stereotaksisk mikromanipulatorarm.
- Plasser mikroskopet over prisme sonde linse ved hjelp av sTereotaxisk mikromanipuatorarm. Visuelt inspiser orienteringen ved å se prisma linse fra siden og baksiden av dyrestadiet. De optiske aksene til både mikroskop objektivet og prisme sonde linse må være justert.
- Slå på mikroskop LED gjennom programvaren. Evaluer kvaliteten på mikroskopjusteringen ved å fokusere på toppflaten på den implanterte prisma-sondeobjektivet i oppkjøpsprogramvaren. Når det er riktig justert, må kantene på prismannsobjektivets toppflate være skarpe.
- Juster mikroskopets fysiske avstand over den implanterte prisme sonden ved hjelp av den stereotaksiske manipulatorarmen for å oppnå det ønskede brennpunktet i vevet. Den optisk optimaliserte avstanden mellom mikroskopobjektivet og det implanterte GRIN-objektivet er ~ 500 μm.
- Lagre et referansefluorescensbilde når det ønskede bildeplanet er tatt.
Kritisk punkt: Fra dette punktet, ikke juster mikroskopets posisjon, da dette vil endre lokasjonenPå avbildningsplanet i vevet.
MERK: Påfør lim i neste trinn for permanent å fikse grunnplatens posisjon i forhold til kranetthetten. Limet kan oppleve litt krymping i volumet på den følgende dag eller to, noe som kan forandre fokusplanet i vevet. Forutsetningen forklarer dette ved å måle mengden krymping for limblandingen og avstanden ex vivo , og deretter bakke den endelige Z-posisjonen til mikroskopet + basisplaten med den mengden før den går videre til klæbemiddelpåføringstrinnet. - Bruk dental akryl eller cyanoakrylat for å feste grunnplaten permanent til akrylhetten som dekker dyrets skall, og bro over gapet med akryl eller lim. Anvendelse av dental akryl / cyanoakrylat gradvis og herding i flere trinn kan minimere effekten av den tidligere nevnte krymping på sluttposisjonen til mikroskopets bildeplan.
- Kritisk trinn: Vær forsiktig når du bruker tannlegeAkryl / cyanoakrylat for å forhindre at materiale kommer i kontakt med mikroskopets objektivlins, settskruen eller mikroskopkroppen, noe som vil forhindre korrekt bruk av instrumentasjonen senere.
- Kritisk trinn: Trykk ikke på mikroskopet mens du påfører limet. Trykket på mikroskopet eller grunnplaten kan føre til bevegelse av mikroskopobjektivet i forhold til prisme-sondeobjektivet, noe som kan resultere i feiljustering eller en forandring av fokusplanet i vevet som vil kreve rask re-justering.
- Kontroller at dental akryl / cyanoakrylat har herdet og herdet ved å tappe akrylet med et par tang eller sprøytespiss. Oppnå et siste referansefluorescensbilde med oppkjøpsprogramvaren.
- Slip mikroskopet fra grippen og trekk grippen fra mikroskopet. Hvis cyanoakrylat eller et annet transparent lim ble brukt, dekk det med svart neglelakk eller et lag med svart dental sement for å hindre enMbient lyslekkasje i hodethetten, noe som kan forurense fremtidige bilder som er oppnådd under eksperimenter.
- På dette tidspunktet fjerner du mikroskopet hvis det er nødvendig. For å skille mikroskopet fra bunnplaten, løsne bunnplaten setteskruen ved å dreie settskruen ca. ½ omdreining mot urviseren. Klem mikroskopkroppen mens du støtter grunnplaten og akrylhetten med den andre hånden, og trekk mikroskopet rett opp. Bytt den ut i oppbevaringsbeholderen.
- Beskytt den implanterte prisme sonden med en basisplate deksel. Dette forhindrer at støvpartikler løsner seg på linsens overflate, noe som kan være vanskelig å rengjøre etter at grunnplaten er installert.
- Fest bunnplatedekselet på bunnplaten og forskyv settskruen med omtrentlig ½ omdreining med urviseren eller til settskruen flenser med bunnplatedekselet. Ikke overtreng.
- Fjern dyret fra anestesi og skjerm i et varmt gjenvinningskammer til ambulerende. Gå tilbakeE dyr til sitt hjem bur. Husk alle dyrene med implanterte grunnplater for å beskytte implantatet.
5. Imaging flere kortiske lag i en fritt bevegelige mus
- Forbered oppførselsapparatet ( f.eks. Fenotyper, Noldus) ved å rengjøre og desinfisere det og tørke ned med 10% blekemiddel.
- Koble mikroskopet til DAQ-boksen, og koble det til datamaskinen og start oppkjøpsprogramvaren.
- Kontroller om det er rikelig med lagringsplass på oppkjøpsdatamaskinen og gjør plass til kalsiumbildingsfilmene. Lagre direkte fra programvaren til den lokale harddisken, i stedet for å skrive til en ekstern harddisk, for å imøtekomme den høye dataoverføringshastigheten mellom mikroskopet og datamaskinen og forhindre tap av data under opptak.
- Bedøv dyret med isofluran (5% i oksygen) i et induksjonskammer for å feste mikroskopet. Alternativt kan du scruff dyret forsiktig eller bruke et vått hodefyrt oppsettMed en headbar hvis anestesi er kjent for å forstyrre det valgte atferdsparadigma-paradigmet.
- Fjern bunnplatedekselet ved å dreie bunnplaten settskruen mot urviseren og løft ut bunnplatedekselet.
- Sett mikroskopet i grunnplaten på dyret. Mikroskopet bør klebes på plass ved hjelp av magneter på basisplaten. Forleng grunnskruen til en liten motstand føles.
- Kritisk trinn: Ikke stram på settplaten for å forhindre skade på mikroskophuset.
- Kontroller bildeplanet i vevet ved å skaffe et fluorescensbilde i programvaren, og juster om nødvendig fokalplanet i vevet ved å løsne skruen til mikroskopturtallet, rotere mikroskoptårnet for å justere det fine fokuset, og stram igjen tårnet Boltsettskrue.
- Kritisk trinn: Ikke tving turret til å snu uten å først løsne settskruen, ogIkke stram tårnskruen forover.
- Hvis du gjennomfører en longitudinell studie, går du tilbake til den fysiske tårnposisjonen for å fange det samme synsfeltet. I maskinvaren merker du antall tårnvinger, eller den fysiske posisjonen til tårnet, for hvert dyr som er avbildet med samme mikroskop, for rask retur til samme synsfelt.
- Frigjør dyret som bærer mikroskopet i sitt hjem bur eller adferdskammer for akklimatisering, og å avvente slitasje av anestesi hvis det er aktuelt.
- Kritisk trinn: Trene dyrene for å bære vekten av mikroskopet ved hjelp av et dummymikroskop i flere økter, før det sikres at det ikke påvirker deres normale oppførsel før du starter eksperimentelle økter, når du bærer mikroskopet. Regelmessig håndtering og trening for våken fastholding forhindrer unødig stress på dyrene.
- Velg oppkjøpsinnstillingene som skal brukes til å samle data. Dette inkluderer fraJeg vurderer for å fange data (for eksempel 20 fps, Gain of 1 og LED power of 50%). Kontroller bildehistogrammet når du velger innstillingene for å sikre god SNR.
MERK: Den numeriske blenderåpningen for fluorescensoppsamling er 0,35 for 1 mm prismannsonden sammenlignet med 0,5 for den 1 mm rette sonden. - Start oppføringsprogramvaren og programmer den til å utløse mikroskopet ved ønsket bildeopptakssyklus ( f.eks. En 4X 5 min ON 2 min OFF). Koble TTL-porten på Noldus IO-boksen til TRIG-porten på DAQ-boksen via en RJ45 til BNC-kabel.
- Plasser dyret i adferds arenaen hvis ikke allerede der, og start eksperimentet.
- Etter anskaffelse av ønskede data, bedøv dyret med isofluran (5% i oksygen) i et induksjonskammer, eller forsiktig opprettholde dyret forsiktig.
- Løsne grunnskruen og løsne mikroskopet fra grunnplaten ved å trekke opp mikroskopet forsiktig. Sett på plass dekselet på grunnplaten og stram grunnplaten forsiktigTe sett skrue.
- Returner dyret til hjemmebburet til neste opptakssesjon. Bruk referansefluorescensbildene som en veiledning for etterfølgende bildeserier for å gå tilbake til det samme synsfeltet.
6. Evaluering av storskala Ca 2+ bildedata
- For å trekke ut celleplassering og Ca 2+ -dynamikk innen synsfeltet fra data, kan forskjellige dataanalyseplaner brukes. Mosaic, en dataanalysplattform designet spesielt for å behandle storskala Ca 2+ bildefilmer, har blitt brukt til denne studien her.
- Rectify defekte piksler og interpolere eventuelle individuelle falt rammer i de rå filmene i forbehandlingstrinnet. Buk bildene i verdensrommet fra det fulle 1.440 x 1.080 pixelfeltet til 720 x 540 piksler for å redusere dataopptaket.
- For å korrigere for bevegelsesartefakter i hjernen med hensyn til mikroskopets bildesensor, registrer du filmene ved hjelp av en streng ImageJ-basert bildereformGassalgoritme (TurboReg).
- For å identifisere individuelle nevroner, uttrykke bildene som relative endringer i fluorescens ΔF / F 0 = FF 0 / F 0 hvor F 0 er det gjennomsnittlige bildet som er oppnådd ved å gjennomsnittlig hele filmen.
- Identifiser de romlige filtre som svarer til individuelle celler ved hjelp av en etablert celle-sorteringsalgoritme. Her brukte vi hoved- og individuell komponentanalyse 21 for å identifisere individuelle nevroner.
MERK: En hendelse ble spesifisert når toppamplitude av en hendelse i et spor var mer enn 8 standardavvik fra sporets grunnlinje i vårt datasett, og celleplasseringen og Ca 2+ -dynamikkdata ble eksportert for videre analyse.
Representative Results
Protokollen som er skissert her beskriver en effektiv og effektiv måte å utføre langsgående multilag Ca 2+ avbildning fra hundrevis av kortikale nevroner i fritt oppførte mus ved bruk av prismerprober ( Figur 1 ). Tidligere tilnærminger til flerskikts kortikal bildebehandling er først og fremst begrenset til hodede faste dyr 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . For å skaffe seg dette nivået av data i en fritt oppførende kontekst, ble en miniatyrisert mikroskopplattform brukt for atferds fleksibilitet; En genetisk kodet kalsiumindikator (GCaMP6f) ble brukt til å målrette en bestemt cellepopulasjon (CAMKII + -celler i cortexen); Og en prisme sonde ble valgt for å gi et kronisk flerskiktsfelt.
figur 2 , trinn 1) før kronisk implantering av en prisme sonde for å aktivere optisk tilgang til de merkede celler ( figur 2 , trinn 2). Et grunnplater som tjener som en sikker, midlertidig brygge for posisjonering av mikroskopet under bildebehandling ble deretter installert over dyrets hode ( Figur 2 , Trinn 3), som muliggjør visualisering av kortikal aktivitet på tvers av flere cellelag i en våken oppførsel eksperimentell Oppsett ( figur 2 , trinn 4).
For å sikre at den ønskede cellulære populasjonen ble målrettet, vises en post mortem-koronal hjerneseksjon fra en representativ mus i figur 3 med prisme-sondens kanal og synsfelt merket i forhold til GCaMP6f-labEled nevroner i lag 2/3 og 5 av den somatosensory cortex.
Under våken opptegning med systemet ble aktiviteten til de somatosensoriske kortikale nevronene registrert da musen ble eksponert for tre forskjellige miljøer - Åpen felt (Dag 1), Objektskjennelse (Dag 2-4) og Det nye objektet (Dag 5) ( Figur 4 ). På dag 1 ble musen plassert i en adferds arena uten noen objekter. På dag 2-4 ble musen plassert i arenaen med de samme to teksturelt forskjellige objektene (en gelpute og en treblokk). På dag 5 ble en av objektene erstattet med et nytt objekt. Dyret ble avbildet over 5 dager i 20 minutter hver dag.
Etter celleutvinning ved hjelp av Ca 2+ bildedataanalyseprogrammet ble romlige filtre tilsvarende cellesteder overlagt på den midlere fluorescerende intensitetsprojeksjon av mikroskopopptaksdataene( Figur 5) . En hvit strekket linje skiller lag 2/3 og 5 celler. Tilsvarende Ca 2+ -spor fra 5 celler fra hvert lag viser brennstoffmønsteret til cellene i to forskjellige atferdsmessige sammenhenger - Objektkunnskap og objektiv eksponering. Lag 2/3 celler var mer aktive sammenlignet med lag 5-celler på dagen da musen ble utsatt for et nytt objekt. Dette er også tydelig fra rasterplottene som viser terskelbrannaktiviteten til alle avbildede celler på dagene 1, 4 og 5.
Figur 1: In vivo Ca 2+ Imaging over flere kortiske lag i fritt bevegelige mus. ( A ) Prism sonde spesifikasjoner og avbildning av bildeplan. Det reflekterende belegget på innsiden av hypotenuse muliggjør avbildning 90 ° fra innsprøyningsplanet til prisme sonden. Linsen cuFf integreres med objektivholderen, som strømlinjerer implantasjonsprosedyren og muliggjør potensiell visning av fluorescens i omgivende vev under implantasjon ( B ) (i). Illustrasjon av plassering av prisme sonde kraniotomi og knivinnsnitt i forhold til virusinjeksjonsstedet, og (ii) illustrasjon av plassering av prisme sonde flat side i forhold til knivinnsnitt og virusinjeksjonssted. ( C ) Illustrasjon av in-vivo Ca 2+ -bildeoppsett som viser lysbanen for et lite område i hele synsfeltet gjennom prisme sonde implantert i musekortex. ( D ) Eksempelvis synsfelt under prismannsinstallasjon. Miniatyrmikroskop er festet til objektivholderen, som holder prisme-sonden mulig for å kontrollere virusuttrykket under prisme-sondeinstallasjonen. ( E ) Integrasjon av mikroskop med prisme sonde for multilag kortortisk avbildning av GCaMP6f merkede S1 celler. F Eksempelvis synsfeltUnder grunnplaten installasjon. Klar blodkar mønster er synlig på tidspunktet for grunnplaten installere med noen celler i råbilde. Flere celler er tydelig synlige når DF / F er slått på i oppkjøpsprogramvinduet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk Viser tidslinjen for arbeidsflythendelser for Prism Probe Implantation og Microscope Installasjon. Antall uker er representert på X-aksen og arbeidsflytstrinnene i prosedyrene langs Y-aksen. ( A ) Grafisk illustrerende viral injeksjon (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) langs samme dorso-ventral-akse, for å merke flere lag av musens somatosensory cortex. ( B ) 2 uker etter virusinjeksjoner, en prisme probE er implantert på en akse som er parallell med virusinjeksjonsstedene. ( C ) Omtrent en uke etter prisme-sondeimplantasjonen, er dyret sjekket for ekspresjon med mikroskopet og en grunnplate er montert på hodet hvis en populasjon av celler er synlig. ( D ) Dyret er så klar for kronisk avbildning under relevante oppførselsoppgaver (Museklipp, modifisert etter tillatelse fra UW-Madison Biochemistry MediaLab). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Postmortem Histologisk Validering av Prism Probe Location og GCaMP Expression. ( A ) Koronalseksjonen fra en representativ mushjerne som viser prismesystemet og med bildesiden vendt motGCaMP6f-uttrykkende celler (AAV1.CaMKII.GCaMP6f uttrykt i nevroner i lag 2/3 og 5). ( B ) Samme koronale hjerneseksjon etter farging for DAPI. Målestokk = 250 μm ( C ) Zoomet i lys av GCaMP6f uttrykker celler i somatosensorisk cortex. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Musaktivitet under Habituation, Familiarization og Novel Object Exposure Testing ble sporet av video ved hjelp av videosoftware. ( A ) På dag 1 ble dyret plassert i en adferds arena uten noen gjenstander (Open Field). ( B ) På dagene 2-4 ble de samme to teksturelt forskjellige objektene (gelpute og treblokk) plassert i arenaen (Object Familiarization). ( C ) På dag 5 ble en av gjenstandene erstattet med en ny gjenstand (treblokk med sandpapir) (Novel Object Exposure). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kalsiumdynamikk fra overfladiske og dype lag av somatosensorisk cortex fra en representativ mus som er avbildet med mikroskopet. ( A ) Fusjonert bilde av neuronal ruimtfiltre (grønne blokker) og gjennomsnittlig fluorescensintensitetsprojeksjon av mikroskopopptaket gjennom prisfrekvensfeltet. Border mellom supragranulære og infragranulære lag angitt med en hvit strekket linje. Skalbjelke = 100 μm. ( B ) Kalsiumspor fra fem eksempel overfladiske og dype lagceller (fylt blå og rødt cElls i panel A), som indikerer enheter av standardavvik for fluorescens etter hoved- og uavhengig komponentanalyse. Horisontal skala 50 s og vertikal skala 10 SD ( C ) Rasterplot av celler fra overflatiske (lag 2/3) og dype lag (lag 5) vist over Åpne felt, Objektkompetanse og Novel objektutforskning. Skalbjelke = 100 s. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Forståelse av neural kretsaktivitet under våken oppførsel er et viktig nivå av nevro-vitenskapelig etterforskning som trengs for å effektivt dissekere hjernens funksjon i helse og sykdom. Cortex er en spesielt viktig region for å studere i sammenheng med våken oppførsel, da den spiller en viktig rolle i mange viktige sensoriske, kognitive og utøvende funksjoner 28 , 29 .
Den kortikale kolonnen antas å være den grunnleggende funksjonelle enheten i cortex og populasjonsnivåaktiviteten av kortikale celler er kjent for å variere basert på deres fysiske plassering i kolonnen. Eksempelvis stimulerer eksitatoriske nevroner i lag 2/3 i den somatosensoriske cortex primært til andre neokortiske områder og modulerer andre kortikale nettverk 30 , mens celler i dypere lag primært prosjekterer til subkortiske områder som thalamus 31 . Registrere aktiviteten til hundreS av forhåndsdefinerte corticale celler samtidig og pålitelig over tid på tvers av forskjellige laminer i fritt oppførte fag, vil i stor grad fremme vår forståelse av kortikal informasjonsflyt, noe som muliggjør finere funksjonell disseksjon av kortikale kolonner informert av sanntidsadferddsinformasjon og oppgaverelevant tids- skalaer.
Innsamling av dette nivået av nevrale kretsdata gjøres mulig ved bruk av en effektiv og strømlinjeformet miniatyrisert mikroskopi-plattform for å gjennomføre storskala Ca 2+ -bildebehandling i fritt oppførte fag (eller hovede fag som ønsket). Brukes med genetisk kodede kalsiumindikatorer for å muliggjøre spesifikk målretting av celletype og avbildning av et flerlags synsfelt levert av en kronisk implantert prisme-sonde, undersøkte denne protokollen en sak blant mange mulige anvendelser: observere laminære forskjeller i somatosensorisk kortisk behandling når mus Fysisk engasjert med et nytt objekt ( figur 5 ).Dette er den første prosessuelle illustrasjonen av denne typen spesifikke, in vivo tilnærming for celletype for å studere flere kortikale lag i våte, fritt oppførte dyr, og bredere spekteret av eksperimentelle metoder som er tilgjengelige for å forstå laminære strukturer i den aktive hjerne.
Det periskopiske synsfelt aktivert av prisme-sonden i denne teknikken kan gjennomførbart påføres andre hjernestrukturer når bevaring av vevet direkte dorsalt til en region av interesse er ønsket; For eksempel kan CA3-bildebehandling oppnås uten forstyrrelse av hippokampfunksjonen.
Prismodellbasert tilnærming for avbildning av Ca 2+ -aktivitet krever fysisk innsetting og permanent implantering av en mikroprism i barken, noe som tilsvarer opprettelsen av en kortisk lesjon hvor linsesonden sitter inn. Dette kan føre til forstyrrelser i det lokale nevrale kretsløpet, inkludert avskjæring av apikale dendriter og prosesser. THans prosedyre vil også føre til en initial aktivering av glialceller i regionen, selv om dette forventes å være lokalisert til vevet ca. 150 μm fra prismeflaten, og å avta etter at hjernen har helbredet 22 . Det er svært viktig å vurdere om denne teknikken vil påvirke normal kretsanatomi og / eller oppførsel av dyrene når du planlegger eksperimenter. Behaviorskontrollgrupper bør alltid utføres for å sikre at det ikke er noen signifikante endringer i baseline atferd som kan forårsake forvirrende eksperimentelle resultater.
Ved hjelp av denne miniatyriserte, mobile Ca 2+ -bildebehandlingsteknikken med nevro-farmakologisk manipulasjon, ulike kognitive, sosiale, motoriske eller iboende atferdsparadigmaer, og kombinere det med andre fysiologiske beregninger, kan du fordyre og berike studier som er fokusert på å forstå funksjonelle roller i nevrale kretser i atferd og signal Prosessering 32 . Suppression eller aktivAtion av visse veier modulert av legemidler kan påvirke tilhørende atferd, noe som lett kan studeres ved hjelp av denne teknologien 33 . Forgrening i forskjellige celletyper ved å modifisere målingen av kalsiumindikatoren er en annen kraftig og nyttig applikasjon, og muliggjør mange kreative kombinasjoner av eksperimentelle verktøy for å adressere ulike neurale kretsspørsmål.
Disclosures
Forfatterne har lest journalens policy og har følgende konkurrerende interesser: SG, SO og VC er betalt ansatte hos Inscopix.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger og K. Svoboda fra Genie-prosjektet Genetisk kodet Neuronal Indicator and Effector (GENIE) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute for deres sjenerøse donasjon av AAV1-GCaMP6f Til University of Pennsylvania Vector Core. De vil også gjerne takke A. Olson og Neuroscience Microscopy Core ved Stanford University støttet av NIH NS069375 stipend for sine konfokale mikroskopi tjenester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
| Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
| Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
| Heating Pad 5 X 12.5 cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
| Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
| NanoFil 10 μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
| 35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
| Omnidrill35, 115 - 230 V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
| AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
| Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
| Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
| Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
| Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
| Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
| Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
| ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
| ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
| Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
| Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
| Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
| Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |
References
- McConnell, S. K. Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex. Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).
- Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
- Miller, E. K., Cohen, J. D. An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).
- Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior. Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making. Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).
- Ferenczi, E. A., et al. Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior. Science. 351 (6268), aac9698 (2016).
- Anomal, R. F., et al. Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism. Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).
- Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective. Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Sun, C., et al. Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).
- Kitamura, T., et al. Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory. Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).
- Pinto, L., Dan, Y. Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior. Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).
- Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons. Nat. Comm. 7, 10763 (2016).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Hooks, B. M., et al. Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex. The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).
- Rowland, D. C., Moser, M. -B. From cortical modules to memories. Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Chia, T. H., Levene, M. J. In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism. J. Vis. Exp. (30), (2009).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).
- Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse. J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- Rogan, S. C., Roth, B. L.
- Berdyyeva, T., et al. Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope. PloS One. 9 (11), e112068 (2014).
