Summary
Här presenterar vi ett förfarande för att utföra storskalig Ca 2+ -bildning med cellulär upplösning över flera kortikala skikt i fritt rörliga möss. Hundratals aktiva celler kan observeras samtidigt med ett miniatyr, huvudmonterat mikroskop kopplat till en implanterad prisma sond.
Abstract
In vivo krets och cellulär nivå funktionell bildbehandling är ett viktigt verktyg för att förstå hjärnan i handling. Högupplösningsavbildning av muscortikala neuroner med tvåfotonmikroskopi har gett unika insikter i kortikal struktur, funktion och plasticitet. Dessa studier är dock begränsade till att fasta fasta djur, vilket avsevärt minskar den beteendemässiga komplexiteten som är tillgänglig för studier. I detta dokument beskriver vi ett förfarande för att utföra kronisk fluorescensmikroskopi med cellulär upplösning över flera kortikala skikt hos frilövande möss. Vi använde ett integrerat miniatyriserat fluorescensmikroskop parat med en implanterad prisma sond för att samtidigt visualisera och registrera kalciumdynamiken hos hundratals neuroner över flera lager av den somatosensoriska cortexen som musen förlovat i en ny objektutforskningsuppgift, över flera dagar. Denna teknik kan anpassas till andra hjärnregioner i olika djurarter för andra beteendepatienteraradigms.
Introduction
Cortexen är en viktig aktör i många komplexa mentala och beteendemässiga funktioner, från uppmärksamhet, sensorisk uppfattning och top-down kognitiv kontroll 1 , 2 , 3 mot motivation, belöning och missbruksvägar 4 , 5 . Att förstå de beräkningsprocesser som ligger till grund för sin funktion är ett viktigt mål att driva en bättre klinisk förståelse för många psykiska och beteendestörningar.
Många aktuella teorier om psykiatrisk sjukdom ligger centralt kring idén om att kortikala neurala kretsdysfunktioner eller diskoordination kan ligga till grund för kognitiva och beteendemässiga abnormiteter som är kännetecken för förhållanden som schizofreni 6 , autism 7 eller tvångssyndrom 8 . Således erhöll man uppgift om neurala aktivitetsdata från populationen från koRtiska kretsar inom det korrekta sammanhanget med samtidig beteendeinformation är av stor betydelse och kan idealiskt riktas mot specifika celltyper för finare neuralt kretsdissektion.
Miniatyriserade mikroskop i samband med implanterbara gradientbrytningsindex (GRIN) mikrolinser möjliggör optisk åtkomst till neuronella ensembler under fritt rörliga förhållanden från en mångfald av möjliga hjärnområden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inkluderande cortex 14 , 15 , 16 . Genom att använda ett mobilmikroskopysystem kopplat till genetiskt kodade kalciumindikatorer möjliggör konsekvent avbildning av samma cellulära population som omfattar hundratals neuroner över dagar till veckor i många hjärnregioner 9 och kan varaGenetiskt riktade mot specifika celltyper med användning av viral vektor eller transgena tekniker.
Eftersom cortex är känt för att stödja olika funktioner och ansluta till olika hjärnregioner beroende på placeringen av cellerna i cortical lamina 17 , 18 , 19 , är vi intresserade av att erhålla simultan flerlags neural aktivitet i vakna uppträdande ämnen. Här visar vi hur man bildar hundratals fluorescensmärkta neuroner i fritt uppträdande möss över dagar, med hjälp av det miniatyriserade fluorescensmikroskopet 20 parat med en implanterad prisma sond, som erbjuder en flerskiktsvy av cortexen ( Figur 1 ).
Prismatsonden som används här består av två separata GRIN-linser: ett prisma och en cylindrisk relälins ( Figur 1 ). Ljuset från mikroskopet exciterar fluorescensmärkningenCeller belägna längs prismatorns bildningsytan, efter att de reflekterats från hypotenusen av probens delprofil. Det emitterade ljuset från cellerna speglar också av prismans hypotenus, samlas in genom mikroskopets mål och når sensorn i mikroskopet. Den prisma sonden som används i denna procedur är anpassad för enkel användning med standard stereotaxisk utrustning.
Det miniatyriserade fluorescensmikroskopet 20 detekterar aktionspotential-framkallade Ca2 + -transienter i neuronpopulationer med enkelcellsupplösning, efter det att dessa celler har märkts specifikt med Ca2 + -sensitiva genetiskt kodade fluorescerande indikatorer. I detta protokoll injicerar vi Ca 2+ -indikatorn kodad i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantera en prisma sond, installera mikroskopet och sedan erhålla flera dagar av neurala aktivitetsdata för SAT-bakbenet Från ett djur exponeraD till nya objektytor under fri utforskning ( Figur 2 ).
Protocol
Procedurer för djurprofiler har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, Kalifornien.
1. Preoperativ förberedelse
- Sterilisera verktygen som ska användas vid kirurgiska ingrepp i en varmpärlsterilisator och torka operationsområdet med 70% etanol. Slå på värmeplattan placerad över stereotaxsteget och håll den vid 37 ° C.
- Bedöda djuret med isofluran (5% för induktion och 1-2% för underhåll, 0,6-0,8 L / min O2). Kontrollera om det inte finns en tipp-nippelreflektion för att bedöma djupet av anestesi.
- Montera djuret i en stereotaxisk ram utrustad med örat och tänder.
- Applicera oftalmisk salva på djurets ögon och täck dem med ett stycke mörkt papper för att skydda dem mot torkning och intensiva kirurgiska ljus.
- Subkutant injicera djuret med ketoprofen (2,5Mg / kg) eller karprofen (2,5 mg / kg)
2. Virusinjektionsoperation
- Trim och raka hårbotten mellan ögonen och öronen och desinficera huden med 3 alternativa tappar av 70% etanol och betadin.
- Exponera skallen genom att göra ett snitt i hårbotten, börjar mellan ögonen och förlänga 1,5 cm rostrocaudal med ett sterilt kirurgiskt blad. Öppna huden för att exponera skallen, och ta bort periosteum runt det önskade injektionsstället med hjälp av bomullspinne och en skalpell. Skölj skalle med sterilt PBS. Rengör och polera skallen med bomullspinne.
- Nivå skallen, och markera med en markör de stereotaxiska koordinaterna för virusinjektion. Använd en 0,5 mm burr på en mikrodrill med hög hastighet (inställd på runt 7 000-10 000 varv / minut), skapa ett litet hål i skallen. Applicera ett litet tryck under borrningen och ständigt rengöra benstoftet och fukta området med sterilt PBS för att förhindra hjärnvävnad från överhettning tills hjärnytan är återvärkte. Håll hjärnan fuktig där hålet borras.
- Använd en 26 G nål för att plocka upp virus ( t.ex. AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) i mikrosprutan och byt sedan ut den med en 35 G nål för injektion. Fäst mikrofiltran laddad med virus till manipulatorns arm i den stereotaxiska apparaten.
- Ta sprutan nära hålet på injektionsstället och justera nålens vinkel så att den går in i 90 ° vinkel mot hjärnans yta. Sänk nålen tills den rör pia mater och piercera genom dura. Börja sänka nålen i steg om 10 μm / s tills det når önskat djup (z). Montera nålstället där med hjälp av den stereotaxiska armen.
- Ställ in mikrosprutpumpen för att injicera 250 nL virus vid 25 nL / min.
- Kritiskt steg: Eftersom virusvolymen som skall injiceras beror på titer och utspädning, kör utspädningsexperiment i förväg för att fastställa optimala volymer och koncentrationskriterier för bildbehandling av cellerI experimentet.
- Om något virus ser ut ur injiceringsstället, pausa injektionen och vänta tills hjärnvävnaden absorberar virusfallet. Vänta i 5-7 minuter efter att den totala volymen har injicerats innan nålen dras tillbaka. Färger som snabbgrön kan också sättas till viruslösningen för att hjälpa till att styra injektionshastigheten i händelse av att viruset ser ut ur huden.
- För att märka flera lager i cortex, använd flera injektioner om det behövs. Börja på den ventralaste sidan först och vänta i 5-7 minuter efter injektionen och dra upp nålen till nästa mest dorsala punkt för injektion ( t.ex. injicera vid -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML och 400 och 600 μm DV). Vänta 10 minuter efter den sista injektionen innan du drar ut nålen och ta bort den från den stereotaxiska inställningen.
- Blanda en liten mängd av ett in vivo biokompatibelt transparent elastomerhäftande material från dubbelrörsprutan (T.ex. Kwik-Sil) och täcka hålet i skallen med det. Applicera cyanoakrylatlim på toppen av skiktet av elastomerer och låt det härda.
- Sutur hårbotten och låt djuret återhämta sig från anestesi i en varm återhämtningsbur tills den är ambulerande. Administrera ketoprofen (2,5 mg / kg) eller carprofen (2,5 mg / kg) subkutant innan du återvänder djuret till sitt hembur. Enstaka hus efter operationen för att skydda operationsplatsen och upprepa dosen 24 h senare.
- Efter avlägsnande av mikrosprutan, spola både 26 G och 35 G nålar 7-10 gånger med destillerat vatten för att rengöra före lagring.
3. Prism Probe Implant Surgery
- 1-2 veckor efter virusinjektion, förbereda sig för prismatsimplantatoperationen. Desinficera prismatsonden i 70% etanol och rengör den med linspapper. Sätt in prisma sonden i linshållarverktyget och dra åt sexskruven med skruvmejseln. Sätt i mikroskopet i bashållaren (theMagneter håller den på plats).
- Förbered djuret enligt beskrivningen i avsnittet Preoperativ förberedelse.
- Trim och raka djurets huvud mellan ögonen och öronen och desinficera huden med alternativa torkar av 70% etanol och betadin.
- Exponera skallen genom att öka huden med ett par sterila saxar och ta bort fliken och underliggande periosteum. Torka och polera skallen med bomullspinne. Se till att det är tillräckligt med avlägsnande av omgivande muskelvävnad för att skapa en ren, torr, bred benfundament för att förbereda följande steg.
- Implantskalle skruvar i den kontralaterala halvklotet för att göra implantatet stabilt och säkert. Dessa kan också vara användbara om du väljer att implantera en huvudstång för vakande huvudfästning för att klara djuret för experimentella bildsessioner i avsnitt 5.
- Nivå skallen och med en markör markera AP och ML koordinater för linsinsättning. Med en 0,5 mm burr på en microdrill öppnas en rund kraniotomi, vilket säkerställer thE-kraniotomdiametern är bara större än prismediametern, dvs 1,0 mm i det här fallet. Borra försiktigt medan du pausar intermittent för att spola skallen med sterilt PBS och suga bort det med bomullspinne. Ta bort benstoftet som genereras.
- Kritiskt steg: Placera kraniotomi så att när prisman sätts in i barken, ligger den platta kanten (bildningsytan) mot virusinjektionsstället och ligger inom en radius av 150-200 μm.
- Sluta borra precis innan skallen är helt tunn. Blodkärl ska vara synliga genom det förtunnade benet. Ta bort benpluggen försiktigt med fina 45 ° tångar.
- Ta bort dura med # 5 tångar.
- Kritiskt steg: När hjärnvävnaden är utsatt, håll alltid vävnaden fuktig. Placera en bomullspinne doppad i steril saltlösning över kraniotomi. Detta kommer även att hålla tryck på vävnaden.
- För att lindra trycket i hjärnvävnaden duRinginsättning av prismatsonden, skapa ett införingsområde före tiden. Fäst en rakkantad dissektionskniv i elektrodenhållaren på den stereotaxiska apparaten och montera den på stereotaxanordningen i en vinkel så att knivbladet är vinkelrätt mot kranens krökning (10 ° vinkel i detta fall) och i en Plan parallellt med virusinjektionskolonnen.
- Placera försiktigt kniven ovanför kraniotomin längs den främre medialkanten i detta fall och ~ 200 μm lateral mot virusinjektionsstället med skäreggen mot baksidan ( Figur 1 ). Noll ut Z-axeln när knivspetsen rör pia och sänk den gradvis (i steg om 10 μm / s) till ett djup vid vilken prismatorn sätts in. Flytta sedan kniven 1 mm bakåt för att skapa en väg för prismans framkant. Paus och kontroll för eventuell blödning som kan hända när du gör snittet med en för steril saltlösning, nedsänkt bit av gelfoam.
- Fäst linshållaren (med prismatsonden och mikroskopet) i den stereotaxiska manipulatorns arm i samma vinkel som kniven i föregående steg. Rikta prisman så att prismans plana sida ligger över snittet och parallellt med virusinjiceringskolonnen. Detta steg kan kräva en viss finkorrigering av den stereotaxiska armpositionen. Justera justeringen genom att hålla dig nära skallen för snabbare resultat.
- När prisman är i rätt vinkel sänker du gradvis det i hjärnan i steg om 10 μm till en slutlig z av 1,1 mm för denna sond, från hjärnans yta. Hjärnvävnaden kommer att expandera runt prisman och allt tryck som skapas ligger bakom visualizatiPå plan och påverkar inte synfältet. Anslut mikroskopet till en dator med förvärvsprogram som installerats via en USB3-port och visualisera fältfluorescens genom att släcka lysdioden.
- Täck eventuell utsatt vävnad runt prisman i kraniotomin i ett mycket tunt skyddande skikt av elastomerer med hjälp av en 25G nål.
- När elastomerskiktet är härdat (vanligtvis i ~ 3-5 min) använd en 25G nål för att applicera lite cyanoakrylatklister för att fästa prismatlinsglaset i den angränsande skallen över skiktet av elastomerskikt för att förhindra att linsen rör sig inuti Kraniotomi. Inkludera kanterna på prismansmuffen för bättre vidhäftning. Fånga inte någon lim på det implanterade prismatets överkant. När cyanoakrylatlimet är härdat, skruva loss linshållaren och försiktigt avlägsna mikroskopet. Dra sedan långsamt in den stereotaxiska manipulatorns arm för att låta prisma sonden säkert implanteras.
- Applicera ett lager av dental akryl ellerCyanoakrylatlim runt implantatet för att täcka all exponerad skalleyta, upp till men inte vidröra den omgivande returerade muskelvävnaden. Om du täcker ett stort område med skalle med detta kranlock kommer det senare att hjälpa till i basplattaanslutningen. Huden runt implantatplatsen ska läka sig själv kring kranlocket.
- Kritiskt steg: Låt inte bindemedel peka på någon av de omgivande hud- eller muskelvävnaderna och krossa inte någon hud i kranlocket. Om du gör det, kommer det att irritera huden och kan leda till mycket repor och potentiell skada på implantatet.
- Valfritt: Om du vill använda en vaken huvudmonterad inställning för att fästa och lossa mikroskopet på ett djurs basplatta vid experimentella bildsessioner i stället för att kortbedöva eller skruva av djuret, implantera en huvudstång i kranlocket som är kompatibel med en vaken huvud- Fast inställning av valet (visas inte i detta protokoll).
- Blanda katalysatorn och basen från en kiselE självhäftande spruta och sätta en droppe av elastomeren inuti prismansmuffen för att täcka sondlinsens topp för att förhindra eventuella skador och damm från sedimentering.
- Ta bort djuret från den stereotaxa ramen och tillåta återhämtning från anestesi i en varm kammare. Administrera ketoprofen (2,5 mg / kg) eller carprofen (2,5 mg / kg) subkutant och returnera djuret till en ren hemmabur när den är ambulerande. Husa alla ämnen för att skydda implantatet och upprepa dosen 24 h senare.
4. Basplattafäste för installation av miniatyrmikroskop
- En vecka till 10 dagar efter implantering av prisma sonden, kontrollera för virusuttryck i vävnaden genom den implanterade prisma sonden och att fästa en basplatta på skalle om preparatet visar cellaktivitet. Mikroskopet kommer docka på basplattan under live imaging.
- Följ anvisningarna i det förberedande förfarandet för att förbereda djuret för basplattafästet.
- Ta bort silikonhäftande lock över ytan av den implanterade prismondens linsen. Undersök linsproppytan och rengör eventuellt skräp försiktigt med linspapper och 70% etanol för att säkerställa att bildningsytan är ren.
- Anslut mikroskopet till dess DAQ-box och anslut det via USB3-porten till datorn.
- Öppna förvärvsprogrammet på datorn och anslut mikroskopet via USB3-porten. Använd förvärvsprogrammet för att kontrollera neurala aktiviteter och för att mäta och dokumentera visningsfältet för framtida inspelningar i detta ämne.
- Fäst en bottenplatta på mikroskopet och fäst bottenplattan med skruven för att hålla bottenplattan på plats och fäst mikroskopet i mikroskopbandet på den stereotaxa mikromekanipulationsarmen genom mikroskopets kropp. Fäst grippen på en Newport-stång, som kan monteras på den stereotaxa mikromekanipulationsarmen.
- Placera mikroskopet ovanför prismatslinsen med sTereotaxisk mikromanipuatorarm. Visuellt inspektera orienteringen genom att titta på prismalinsen från sidan och baksidan av djursteget. De optiska axlarna för både mikroskopobjektivet och prismatslinsen måste vara inriktade.
- Slå på mikroskop LED genom mjukvaran. Utvärdera kvaliteten på mikroskopets inriktning genom att fokusera på den implanterade prisma-problinsens övre yta i förvärvsprogrammet. Vid korrekt inriktning bör kantarna på prismans linsens toppyta vara skarpa.
- Justera mikroskopets fysiska avstånd ovanför den implanterade prisma sonden med hjälp av den stereotaxiska manipulatorns arm för att erhålla det önskade fokusplanet inuti vävnaden. Det optiskt optimerade avståndet mellan mikroskopets mål och den implanterade GRIN-linsen är ~ 500 μm.
- Spara en referensfluorescensbild när det önskade avbildningsplanet fångats.
Kritisk punkt: Justera inte mikroskopets position från denna tidpunkt, eftersom detta kommer att ändra platsenPå avbildningsplanet i vävnaden.
ANMÄRKNING: Applicera lim i nästa steg för att permanent fixa basplattans position i förhållande till kranlocket. Limet kan uppleva en viss krympning av volymen på följande dag eller två, vilket kan ändra fokalplanet i vävnaden. Beräkna förebyggande detta genom att mäta mängden krympning för din limblandning och avstånd ex vivo , och sedan backa den slutliga Z-positionen på mikroskop + basplattan med den mängd innan du går vidare till det adhesiva applikationssteget. - Använd dental akryl eller cyanoakrylat för att permanent fästa bottenplattan på det akrylhölje som täcker djurets skalle och överbrygga gapet med akryl eller lim. Applicering av dental akryl / cyanoakrylat gradvis och härdning i flera steg kan minimera effekten av den tidigare nämnda krympningen på det slutliga läget hos mikroskopets bildplan.
- Kritiskt steg: Var försiktig när du ansöker tandläkareAkryl / cyanoakrylat för att förhindra att något material kommer i kontakt med mikroskopets objektivlins, setskruven eller mikroskopkroppen, vilket förhindrar att instrumentet används senare.
- Kritiskt steg: Tryck inte på mikroskopet medan du applicerar limet. Tryck på mikroskopet eller basplattan kan orsaka rörelse av mikroskopets objektiv i förhållande till prisma sondlinsen, vilket kan resultera i feljustering eller en ändring av fokusplanet i vävnaden som skulle kräva snabb omjustering.
- Kontrollera att dental akryl / cyanoakrylat har härdat och härdat genom att tappa akryl med ett par tångar eller sprutspetsar. Skaffa en slutlig referensfluorescensbild med förvärvsprogrammet.
- Lossa mikroskopet från grippen och dra in grippen från mikroskopet. Om cyanoakrylat eller annat transparent klister används, täck det med svart nagellack eller ett lager svart dentalcement för att förhindra enMbient ljusläckage i huvudlocket, vilket kan förorena framtida bilder som förvärvats under experiment.
- Ta bort mikroskopet om det behövs. För att separera mikroskopet från bottenplattan ska du lossa bottenplattan med skruven genom att vrida inställningsskruven ungefär ½ vrid moturs. Knippa mikroskopkroppen medan du stöder bottenplattan och akryllocket med den andra handen och dra mikroskopet rakt uppåt. Byt ut det i förvaringsbehållaren.
- Skydda den implanterade prisma sonden med ett bottenplatta skydd. Detta förhindrar att dammpartiklar sätter sig på linsytan, vilket kan vara svårt att rengöra efter att basplattan har installerats.
- Fäst bottenplåtslocket på bottenplattan och skjut in skruven med ungefär ½ vrid medurs eller tills inställningsskruven spolas med basplattans lock. Övertra dig inte.
- Ta bort djuret från anestesi och övervaka i en varm återhämtningskammare till ambulerande. Återvänd thE djur till sitt hem bur. Husa alla djur med implanterade bottenplattor för att skydda implantatet.
5. Bildning av flera kortiska lager i en fritt rörlig mus
- Förbered beteendeapparaten ( t.ex. Fenotyper, Noldus) genom att rengöra och desinficera den och torka ner med 10% blekmedel.
- Anslut mikroskopet till sin DAQ-box och anslut det till datorn och starta förvärvsprogrammet.
- Kontrollera om det finns gott om lagerförvaringsutrymme på uppköpsdatorn och skapa plats för kalciumbildningsfilmerna. Spara direkt från programvaran till den lokala hårddisken, istället för att skriva till en extern hårddisk för att tillgodose den höga dataöverföringshastigheten mellan mikroskop och dator och förhindra dataförlust under inspelningar.
- Bedöda djuret med isofluran (5% i syre) i en induktionskammare för att fästa mikroskopet. Alternativt, skruva försiktigt djuret eller använd en vaken huvudfast installationMed en huvudstång om anestesi är känt att störa det beteendeparadigm som valts.
- Ta bort bottenplåtslocket genom att vrida bottenplattan med skruvarna motsols och lyft ut bottenplattans lock.
- Sätt mikroskopet i bottenplattan på djuret. Mikroskopet ska snäppa på plats med hjälp av magneterna på bottenplattan. Förbättra grundskruven till basplattan tills ett litet motstånd känns.
- Kritiskt steg: Dra inte åt bottenplattan för att förhindra skador på mikroskophuset.
- Kontrollera bildbildningsplanet i vävnaden genom att skaffa en fluorescens ögonblicksbild i mjukvaran och justera om nödvändigt fokalplanet i vävnaden genom att lossa mikroskoptornsskruven, rotera mikroskoptornet för att justera det fina fokuset och dra åt spaken igen Husskruv.
- Kritiskt steg: Tvinga aldrig tornet att vrida utan att först lossa inställningsskruven ochStram inte skruven på tornet.
- Om du utför en longitudinell studie, återgå till det fysiska tornet för att fånga samma synfält. I hårdvaran noterar du hur mycket tornet vrider eller tornets fysiska position för varje djur som avbildas med samma mikroskop för att snabbt återvända till samma synfält.
- Släpp djuret som bär mikroskopet i sitt hembur eller beteendeskammare för acklimatisering, och vänta på bortslitning av anestesi om det är tillämpligt.
- Kritiskt steg: Träna djuren för att bära vikten av mikroskopet med ett dummymikroskop för flera sessioner tills det säkerställs att om du bär mikroskopet inte stör deras normala beteende innan du börjar experimentella sessioner. Regelbunden hantering och träning för vaken fasthållning förhindrar otillbörlig stress hos djuren.
- Välj de förvärvsinställningar som ska användas för att samla in data. Detta inkluderar fraJag betygsätter för att fånga data ( t.ex. 20 fps, Gain of 1, och LED-effekt på 50%). Kontrollera bildhistogrammet när du väljer inställningarna för att säkerställa bra SNR.
OBS: Den numeriska bländaren för fluorescensuppsamling är 0,35 för prismatsonden med 1 mm jämfört med 0,5 för den 1 mm raka sonden. - Starta beteendemjukvaran och programmera den för att utlösa mikroskopet vid önskad bildhanteringsinspelningscykel ( t.ex. en 4X 5 min ON 2 min OFF). Anslut TTL-porten på Noldus IO-rutan till TRIG-porten på DAQ-rutan via en RJ45 till BNC-kabel.
- Placera djuret i beteendesparken om det inte redan finns och starta experimentet.
- Efter förvärv av önskade data, bedöda djuret med isofluran (5% i syre) i en induktionskammare eller försiktigt vakna upp djuret.
- Lossa bottenplattan och skruva loss mikroskopet från basplattan genom att försiktigt dra upp mikroskopet. Sätt tillbaka basplattans lock och dra åt grundplattan försiktigtTe sätta skruven.
- Återvänd djuret till hemburet tills nästa inspelningssession. Använd referensfluorescensbilderna som en guide för efterföljande bildsessioner för att återgå till samma synfält.
6. Utvärdering av storskala Ca 2+ bilddata
- För att extrahera cellplats och Ca 2+ -dynamik inom synfältet från data kan olika dataanalysplattformar användas. Mosaic, en dataanalysplattform avsedd för att bearbeta storskaliga Ca 2+ -bildningsfilmer har använts för denna studie här.
- Rektifiera defekta pixlar och interpolera eventuella fallna ramar i de råa filmerna i förbehandlingssteget. Fyll i bilderna i rymden från hela fältet 1 440 x 1 080 pixlar till 720 x 540 pixlar för att minska dataavtrycket.
- För att korrigera rörelseartefakter i hjärnan med avseende på mikroskopens bildsensor, registrera filmerna med hjälp av en noggrann ImageJ-baserad bildreformG-algoritm (TurboReg).
- För att identifiera enskilda neuroner, uttrycka bilderna igen som relativa förändringar i fluorescens ΔF / F 0 = FF 0 / F 0 där F 0 är den genomsnittliga bilden som erhållits genom att medge hela filmen.
- Identifiera de rumsliga filtren som motsvarar enskilda celler med hjälp av en etablerad cellsorteringsalgoritm. Här använde vi huvud- och individkomponentanalys 21 för att identifiera enskilda neuroner.
OBS! En händelse specificerades när toppamplituden för en händelse i ett spår var mer än 8 standardavvikelser från spårets baslinje i vår dataset och cellplatsen och Ca 2+ -dynamikdata exporterades för vidare analys.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här beskriver ett effektivt och effektivt sätt att utföra longitudinell flerskikts Ca 2+ avbildning från hundratals kortikala neuroner hos fritt uppförande möss med användning av prisma-prober ( Figur 1 ). Tidigare tillvägagångssätt gentemot multilags kortikal bildbehandling har i första hand varit begränsad till att fasta fasta djur 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . För att förvärva denna nivå av data i ett fritt uppträdande sammanhang användes en miniatyriserad mikroskopplattform för beteendeflexibilitet; En genetiskt kodad kalciumindikator (GCaMP6f) användes för att rikta en specifik cellpopulation (CAMKII + -celler i cortexen); Och en prisma-prob valdes för att tillhandahålla ett kroniskt flerskiktsfält.
Figur 2 , Steg 1), innan kronisk implantering av en prismatsond för att möjliggöra optisk åtkomst till de märkta cellerna ( Figur 2 , Steg 2). En basplatta som fungerar som en säker, tillfällig brygga för positionering av mikroskopet under bildsessionerna installerades sedan över djurets huvud ( Figur 2 , Steg 3), vilket möjliggör visualisering av kortikal aktivitet över flera cellskikt i en vaken uppförande experimentell Setup ( Figur 2 , Steg 4).
För att säkerställa att den önskade cellulära populationen målades, visas en post mortem coronal hjärnsektion från en representativ mus i Figur 3 med prisma sondområdet och synfält markerat i förhållande till GCaMP6f labEled neurons i lag 2/3 och 5 av den somatosensory cortexen.
Under vaken uppträder avbildning med systemet registrerades aktiviteten hos de somatosensoriska kortikala nervcellerna när musen utsattes för tre olika miljöer - Open Field (Dag 1), Objektbekännelse (Dag 2-4) och Nya objekt (Dag 5) ( Figur 4 ). På dag 1 placerades musen i en beteendespark som saknar föremål. På dag 2-4 placerades musen i arenan med samma två texturellt olika föremål (en gelkudde och ett träblock). På dag 5 ersattes en av föremålen med ett nytt objekt. Djuret avbildades över 5 dagar i 20 min varje dag.
Efter cellutvinning med användning av Ca 2+ bilddataanalysprogrammet överlagrades rumsfilter som motsvarade celllänkar på den medelvärda fluorescensintensitetsprojektionen av mikroskopinspelningsdata( Figur 5) . En vit streckad linje skiljer lager 2/3 och 5 celler. Motsvarande Ca 2+ spår från 5 celler från var och en av skikten visar cellens bränningsmönster i två olika beteendeskontexter - Objektförändring och objektiv exponering av objekt. Lag 2/3 celler var mer aktiva jämfört med skikt 5 celler på den dag då musen exponerades för ett nytt objekt. Detta framgår också av rasterplanerna som visar tröskelvärdet för alla avbildade celler på dagarna 1, 4 och 5.
Figur 1: In vivo Ca 2+ Imaging över flera kortiska lager i fritt rörliga möss. ( A ) Prism sond specifikationer och avbildning av bildplan. Den reflekterande beläggningen på insidan av hypotenusen möjliggör avbildning 90 ° från prismatorns införingsplan. Linsen cuFf integreras med linshållaren, vilket effektiviserar implantationsproceduren och möjliggör potentiell visning av fluorescens i omgivande vävnad under implantationen ( B ) (i). Illustration av placering av prisma-sondkraniotomi och knivinsnitt i förhållande till virusinjektionsstället, och (ii) illustration av placeringen av prismondens plana sida relativt knivinsnittet och virusinjektionsstället. ( C ) Illustration av in-vivo Ca 2+ -bildningsinställningar som visar ljusbanan för ett litet område inom hela synfältet genom prismatorn implanterad i muscortex. ( D ) Exempel synfält under prismatsinstallation. Miniatyrmikroskop är fastsatt på linshållaren, som håller prisma sonden möjliggör kontroll av virusuttrycket under prismatsinstallation. ( E ) Integrering av mikroskop med prismatsond för multilags kortikal bildbehandling av GCaMP6f-märkta S1-celler. F Exempel synfältUnder basplattans installation. Tydligt blodkärlmönster är synligt vid tidpunkten för basplattformen med vissa celler i råbilden. Fler celler är tydligt synliga när DF / F är påslagen i fönstret för uppköpsprogramvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk Visar tidslinjen för arbetsflödeshändelser för prismsimplantation och mikroskopinstallation. Antal veckor representeras på X-axeln och arbetsflödesstegen i rutinerna längs Y-axeln. ( A ) Grafisk illustrerande viral injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) längs samma dorso-ventralaxel för att märka flera lager av musens somatosensoriska cortex. ( B ) 2 veckor efter virusinjektioner, en prisma probE implanteras vid en axel som är parallell med virusinjektionsställena. ( C ) Cirka en vecka efter prismatsimplantationen kontrolleras djuret för uttryck med mikroskopet och en basplatta är monterad på huvudet om en population av celler är synlig. ( D ) Djuret är sedan redo för kronisk bildbehandling under relevanta beteendemässiga uppgifter (muspixel modifierad efter tillstånd från- UW-Madison Biochemistry MediaLab). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Postmortem Histologisk Validering av Prism Probe Plats och GCaMP Expression. ( A ) Koronavsnitt från en representativ mushjärna som visar prismakroppen och med dess bildsidor vända motDe GCaMP6f-uttryckande cellerna (AAV1.CaMKII.GCaMP6f uttryckta i neuroner i skikt 2/3 och 5). ( B ) Samma koronala hjärnsektion efter färgning för DAPI. Skala bar = 250 μm ( C ) Zoomat med tanke på GCaMP6f uttrycker celler i somatosensory cortex. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Musaktivitet under Habituation, Familiarization och Novel Object Exposure Testing var videospårad med hjälp av videoprogramvara. ( A ) På dag 1 placerades djuret i en beteendespark som saknade föremål (Open Field). ( B ) På dagarna 2-4 placerades samma två texturellt olika föremål (gelplatta och träblock) i arenan (Object Familiarization). ( C ) På dag 5 ersattes en av föremålen med ett nytt föremål (träblock med sandpapper) (Novel Object Exposure). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kalciumdynamik från ytliga och djupa lager av somatosensorisk cortex hos en representativ mus som avbildats med mikroskopet. ( A ) Sammanfogad bild av neuronala rumsfilter (gröna blobs) och medelvärdesfluorescensintensitetsprojektion av mikroskopets inspelning genom prisma sondfältet. Gräns mellan supragranulära och infragranulära skikt som indikeras av en vit streckad linje. Skalstång = 100 μm. ( B ) Kalsiumspår från fem exempel ytliga och djupa lagerceller (fylld blå och röd cElls i panel A), vilket indikerar enheter av standardavvikelse för fluorescens efter principiell och oberoende komponentanalys. Horisontell skala bar 50 s och vertikal skala bar 10 SD ( C ) Rasterplot av celler från ytliga (lager 2/3) och djupa lager (lager 5) visas över Öppna fält, Objekttifiering och Novel objektutforskning. Skalstång = 100 s. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Att förstå neuralt kretsaktivitet under vakat beteende är en vital nivå av neurovetenskaplig undersökning som behövs för att effektivt dissekera hjärnans funktion i hälsa och sjukdom. Cortexen är en särskilt viktig region för att studera i samband med vaket beteende, eftersom det spelar en viktig roll i många viktiga sensoriska, kognitiva och verkställande funktioner 28 , 29 .
Den kortikala kolonnen anses vara den grundläggande funktionella enheten i cortex och populationsnivåaktiviteten hos kortikala celler är känd för att skilja sig beroende på deras fysiska placering i kolonnen. Exempelvis sträcker excitatoriska nervceller i skikt 2/3 i den somatosensoriska cortexen primärt till andra neokortiska områden och modulerar andra kortikala nätverk 30 medan celler i djupare skikt främst verkar för subkortiska områden som thalamus 31 . Spela in aktiviteten av hundraS av fördefinierade kortikala celler samtidigt och tillförlitligt över tid över olika laminer hos fritt uppträdande personer skulle avsevärt öka vår förståelse för kortikalt informationsflöde, vilket möjliggör en finare funktionell dissektion av kortikala kolumner informerad av realtids beteendeinformation och uppgiftsrelevant tids- skalor.
Att samla denna nivå av neurala kretsdata är möjlig med hjälp av en effektiv och strömlinjeformad miniatyriserad mikroskopiplattform för att genomföra storskalig Ca 2+ -bildning i fritt uppträdande ämnen (eller huvudfästa ämnen som önskat). Används med genetiskt kodade kalciumindikatorer för att möjliggöra specifikt inriktning av celltyp och avbilda ett flerskiktsfält som tillhandahålls av en kroniskt implanterad prisma sond, undersökte detta protokoll ett fall bland många möjliga tillämpningar: observera laminära skillnader i somatosensorisk kortikal bearbetning när möss Fysiskt förlovad med ett nytt objekt ( figur 5 ).Detta är den första procedurillustrationen av denna typ av celltypsspecifik in vivo-tillvägagångssätt för att studera flera kortikala skikt i vakna, fritt uppförande djur och breddar spektrumet av experimentella metoder som är tillgängliga för att förstå laminära strukturer i den aktiva hjärnan.
Det periskopiska synfältet aktiverat av prismatsonden i denna teknik kan med fördel tillämpas på andra hjärnstrukturer när bevarande av vävnaden direkt dorsal till en region av intresse är önskvärt; Till exempel kan CA3-bildbehandling uppnås utan störning av hippocampalfunktionen.
Prismatsbaserad metod för bildbehandling av Ca2 + -aktivitet kräver fysisk införande och permanent implantering av en mikroprism i cortexen, vilket motsvarar skapandet av en kortikalskada där linsproben sätts in. Detta kan leda till störningar i den lokala neurala kretsen, inklusive avskiljning av apikala dendriter och processer. THans förfarande kommer också att leda till en initial aktivering av glialceller i regionen, fastän detta förväntas lokaliseras till vävnaden ca 150 | im från prismans ansikte och att sänka sig efter att hjärnan har läkt 22 . Det är mycket viktigt att överväga om denna teknik kommer att påverka normala kretsanatomi och / eller beteende hos djuren vid planering av experiment. Behaviorskontrollgrupper bör alltid genomföras för att säkerställa att det inte finns några signifikanta förändringar i baslinjebeteenden som kan ge upphov till förvirrande experimentella resultat.
Användning av denna miniatyriserade mobil Ca 2+ bildteknik med neurofarmakologisk manipulation, olika kognitiva, sociala, motoriska eller inneboende beteendeparadigma och kombinera det med andra fysiologiska mätvärden kan fördjupa och berika studier som är inriktade på att förstå funktionella roller hos neurala kretsar i beteende och signal Bearbetning 32 . Suppression eller aktivAtion av vissa vägar som moduleras av droger kan påverka associerade beteenden, som lätt kan studeras med hjälp av denna teknik 33 . Att förgrena sig till olika celltyper genom att modifiera målningen av kalciumindikatorn är en annan kraftfull och användbar applikation och möjliggör många kreativa kombinationer av experimentella verktyg för att hantera olika neurala kretsfrågor.
Disclosures
Författarna har läst journalens policy och har följande konkurrerande intressen: SG, SO och VC betalas anställda hos Inscopix.
Acknowledgments
Författarna vill tacka V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger och K. Svoboda från Genie-projektet (Genie-Encoded Neuronal Indicator and Effector) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute för deras generösa donation av AAV1-GCaMP6f Till University of Pennsylvania Vector Core. De skulle också vilja tacka A. Olson och Neuroscience Microscopy Core vid Stanford University med stöd av NIH NS069375 bidrag för sina konfokala mikroskopitjänster.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
| Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
| Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
| Heating Pad 5 X 12.5 cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
| Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
| NanoFil 10 μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
| 35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
| Omnidrill35, 115 - 230 V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
| AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
| Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
| Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
| Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
| Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
| Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
| Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
| ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
| ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
| Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
| Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
| Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
| Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |
References
- McConnell, S. K. Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex. Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).
- Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
- Miller, E. K., Cohen, J. D. An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).
- Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior. Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making. Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).
- Ferenczi, E. A., et al. Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior. Science. 351 (6268), aac9698 (2016).
- Anomal, R. F., et al. Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism. Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).
- Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective. Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Sun, C., et al. Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).
- Kitamura, T., et al. Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory. Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).
- Pinto, L., Dan, Y. Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior. Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).
- Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons. Nat. Comm. 7, 10763 (2016).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Hooks, B. M., et al. Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex. The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).
- Rowland, D. C., Moser, M. -B. From cortical modules to memories. Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Chia, T. H., Levene, M. J. In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism. J. Vis. Exp. (30), (2009).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).
- Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse. J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- Rogan, S. C., Roth, B. L.
- Berdyyeva, T., et al. Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope. PloS One. 9 (11), e112068 (2014).
