Summary

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

Published: April 08, 2017
doi:

Summary

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Abstract

Lo sviluppo di strumenti genoma di modifica programmabili ha facilitato l'uso di genetica inversa per comprendere i ruoli specifici sequenze genomiche giocano nel funzionamento delle cellule ed organismi interi. Questa causa è stata enormemente aiutato dalla recente introduzione del CRISPR / sistema-a Cas9 strumento versatile che permette ai ricercatori di manipolare il genoma e trascrittoma al fine di, tra le altre cose, knock out, abbattere, o bussano nei geni in modo mirato maniera. Allo scopo di mettere fuori un gene, CRISPR / Cas9-mediata rotture a doppio filamento reclutano fine-joining non omologhe riparazione del DNA percorso per introdurre l'inserimento frameshift causano o delezione di nucleotidi nel sito rottura. Tuttavia, un individuo RNA guida può causare indesiderati effetti off-target e per escludere questi fuori, l'uso di più RNAs guida è necessario. Questa molteplicità di bersagli significa anche che è richiesto uno screening ad alto volume di cloni, che a sua volta pone l'uso di un efciente tecnica high-throughput al genotipo i cloni eliminazione diretta. tecniche di genotipizzazione correnti sia soffrono di limitazioni intrinseche o comportano costi elevati, quindi rendendoli inadatti per alte produttività. Qui, si dettaglio il protocollo per l'utilizzo fluorescente PCR, che utilizza il DNA genomico da lisato cellulare grezzo come modello, e quindi risolvere i frammenti di PCR mediante gel elettroforesi capillare. Questa tecnica è abbastanza accurata per differenziare differenza una base-pair tra frammenti e quindi è adeguata indicante la presenza o l'assenza di un frameshift nella sequenza codificante del gene bersaglio. Questa conoscenza precisa preclude efficacemente la necessità di una fase di sequenziamento di conferma e permette agli utenti di risparmiare tempo e costi nel processo. Inoltre, questa tecnica ha dimostrato di essere versatile genotipizzazione varie cellule di mammifero di varia origine tessuto mirato da RNA guida contro numerosi geni, come mostrato qui e altrove.

Introduction

approcci di genetica inversa hanno permesso agli scienziati per chiarire gli effetti delle alterazioni specifiche nel genoma sulla cella o tutto l'organismo. Ad esempio, l'espressione di un particolare gene può essere attenuato di silenziamento genico 1, 2 (riduzione parziale) o gene knockout 3, 4 (ablazione completa) al fine di determinare l'effetto che questo ha sulla funzione della cella o sulla sviluppo dell'organismo.

Esperimenti gene knockout sono più facili dall'introduzione della nucleasi programmabili sequenza-specifiche, quali nucleasi zinco-dito (ZFNs) e trascrizione attivatore simile nucleasi effettrici (Talens). Tuttavia, la relativamente recente caratterizzazione del cluster intervallati regolarmente breve ripetizione palindromo (CRISPR) / Sistema Cas9 ha reso estremamente facile per qualsiasi laboratorio in tutto il mondo per eseguire genesperimenti knockout e. In sostanza, il sistema / Cas9 CRISPR costituito da due componenti essenziali: un singolo guida RNA (sgRNA), che riconosce e si lega con la complementarità di base ad una sequenza specifica nel genoma, e un'endonucleasi chiamato Cas9. Le conseguenze della specifica azione vincolante e del complesso sgRNA-Cas9 su DNA genomico è la scissione doppio filamento del DNA. Questo, a sua volta, fa scattare il meccanismo di risposta al danno del DNA nella cellula, che viene successivamente riparato attraverso le vie non omologhi end-giunzione (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR). Poiché il meccanismo NHEJ riparazione (ma non il meccanismo HR) comporta spesso l'inserimento o delezione di nucleotidi casuali nel sito di riparazione, con conseguente inserimento / delezione (INDEL) mutazioni, può causare la griglia di lettura di un esone spostare. Questo può quindi provocare il knockout del gene dovuto premature terminazione della traduzione e decadimento mediato da un nonsenso 5, 6,7.

Nonostante la comodità offerta dalla introduzione del sistema di CRISPR / Cas9 in buttare giù un gene, la genotipizzazione dei cloni di cellule bersaglio resta un collo di bottiglia, soprattutto in un ambiente 8, 9 high-throughput. tecniche esistenti o soffrono principali limitazioni intrinseche o sono finanziariamente costoso. Ad esempio, il saggio SURVEYOR o T7E1, che è un saggio enzimatico che rileva disallineamenti di DNA duplex 10, non è in grado di distinguere tra cloni di tipo selvatico e mutanti omozigoti (cloni cui alleli sono mutati identico), poiché questi cloni hanno alleli identici e pertanto non presentano disallineamenti nella loro sequenza di DNA 11. Inoltre, l'uso di Sanger sequenziamento, che è considerato il gold standard nella genotipizzazione cloni mutanti, in una configurazione ad alta produttività è indesiderabile a causa della sua costo elevato. Qui, vi presentiamo una detprotocollo soffriva esattamente della tecnica gel elettroforesi capillare PCR-fluorescente, che può aggirare le limitazioni delle altre tecniche di genotipizzazione esistenti ed è particolarmente utile nell'esecuzione di uno schermo ad elevata capacità di cloni knockout nucleasi-mediata. Questo metodo è tecnicamente semplice da eseguire e consente di risparmiare tempo e costi.

Protocol

1. Ottenere CRISPR / Cas9 mirati cloni singola cella cellule HepG2 seme su una piastra da 6 pozzetti a 500.000 cellule per pozzetto in 2 mL di Modified Eagle Medium senza antibiotici di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS). Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. cellule trasfezione con il plasmide co-esprimono Cas9 e sgRNA specifica contro il gene di interesse utilizzando un reagente di trasfezione adeguato secondo le istruzioni del produttore. NOTA: pe…

Representative Results

La tecnica gel elettroforesi capillare PCR fluorescente qui descritto è previsto per essere applicabile a qualsiasi regione targetable nel genoma in qualsiasi linea cellulare che è suscettibile di consegna DNA estraneo. Abbiamo già dimostrato la sua applicazione di mira tre geni in una linea di cellule di cancro del colon-retto 12. Qui vi mostriamo la sua efficacia in genotipizzazione una linea di cellule di carcinoma epatocellulare, HepG2, mirata con un CRISPR…

Discussion

Il bussare fuori di un gene specifico in una linea cellulare modello di scelta è diventata routine per chiarire il ruolo che il gene gioca in quel particolare contesto cellulare. Infatti, più schermate genoma sono attualmente disponibili che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 target virtualmente tutti noti geni umani nel genoma 14, 15, 16. Con questi schermi di grandi dimensioni (o anche su piccola scala mira dei singoli gen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare la signora Tan Shi Min, la signora Helen Ong, e il dottor Zhao Yi per aiutare con gli esperimenti di elettroforesi capillare gel. Questo lavoro è stato sostenuto da NMRC / IRG concedere NMRC / 1314/2011 e MOE ACRF Tier 2 Fondo concessione MOE2011-T2-1-051.

Materials

HEPG2 cells ATCC HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid Addgene PX458
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific 15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade GE Healthcare SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) AITbiotech None Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) AITbiotech None Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer AITbiotech None Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit QIAGEN 201223
Hi-Di Formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard Thermo Fisher Scientific 4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific 4306737
3500xL Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405633
3500 Series 2 program Thermo Fisher Scientific 4476988
Gene Mapper 5 program Thermo Fisher Scientific 4475073
Gentra Puregene Cell Kit QIAGEN 1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
NAP1L1 Antibody (N-term) Abgent AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] GeneTex GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 515-035-003

References

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Cite This Article
Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M. S., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. J. Vis. Exp. (122), e55586, doi:10.3791/55586 (2017).

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