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Genetics

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

doi: 10.3791/55586 Published: April 8, 2017

Summary

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Abstract

Lo sviluppo di strumenti genoma di modifica programmabili ha facilitato l'uso di genetica inversa per comprendere i ruoli specifici sequenze genomiche giocano nel funzionamento delle cellule ed organismi interi. Questa causa è stata enormemente aiutato dalla recente introduzione del CRISPR / sistema-a Cas9 strumento versatile che permette ai ricercatori di manipolare il genoma e trascrittoma al fine di, tra le altre cose, knock out, abbattere, o bussano nei geni in modo mirato maniera. Allo scopo di mettere fuori un gene, CRISPR / Cas9-mediata rotture a doppio filamento reclutano fine-joining non omologhe riparazione del DNA percorso per introdurre l'inserimento frameshift causano o delezione di nucleotidi nel sito rottura. Tuttavia, un individuo RNA guida può causare indesiderati effetti off-target e per escludere questi fuori, l'uso di più RNAs guida è necessario. Questa molteplicità di bersagli significa anche che è richiesto uno screening ad alto volume di cloni, che a sua volta pone l'uso di un efciente tecnica high-throughput al genotipo i cloni eliminazione diretta. tecniche di genotipizzazione correnti sia soffrono di limitazioni intrinseche o comportano costi elevati, quindi rendendoli inadatti per alte produttività. Qui, si dettaglio il protocollo per l'utilizzo fluorescente PCR, che utilizza il DNA genomico da lisato cellulare grezzo come modello, e quindi risolvere i frammenti di PCR mediante gel elettroforesi capillare. Questa tecnica è abbastanza accurata per differenziare differenza una base-pair tra frammenti e quindi è adeguata indicante la presenza o l'assenza di un frameshift nella sequenza codificante del gene bersaglio. Questa conoscenza precisa preclude efficacemente la necessità di una fase di sequenziamento di conferma e permette agli utenti di risparmiare tempo e costi nel processo. Inoltre, questa tecnica ha dimostrato di essere versatile genotipizzazione varie cellule di mammifero di varia origine tessuto mirato da RNA guida contro numerosi geni, come mostrato qui e altrove.

Introduction

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approcci di genetica inversa hanno permesso agli scienziati per chiarire gli effetti delle alterazioni specifiche nel genoma sulla cella o tutto l'organismo. Ad esempio, l'espressione di un particolare gene può essere attenuato di silenziamento genico 1, 2 (riduzione parziale) o gene knockout 3, 4 (ablazione completa) al fine di determinare l'effetto che questo ha sulla funzione della cella o sulla sviluppo dell'organismo.

Esperimenti gene knockout sono più facili dall'introduzione della nucleasi programmabili sequenza-specifiche, quali nucleasi zinco-dito (ZFNs) e trascrizione attivatore simile nucleasi effettrici (Talens). Tuttavia, la relativamente recente caratterizzazione del cluster intervallati regolarmente breve ripetizione palindromo (CRISPR) / Sistema Cas9 ha reso estremamente facile per qualsiasi laboratorio in tutto il mondo per eseguire genesperimenti knockout e. In sostanza, il sistema / Cas9 CRISPR costituito da due componenti essenziali: un singolo guida RNA (sgRNA), che riconosce e si lega con la complementarità di base ad una sequenza specifica nel genoma, e un'endonucleasi chiamato Cas9. Le conseguenze della specifica azione vincolante e del complesso sgRNA-Cas9 su DNA genomico è la scissione doppio filamento del DNA. Questo, a sua volta, fa scattare il meccanismo di risposta al danno del DNA nella cellula, che viene successivamente riparato attraverso le vie non omologhi end-giunzione (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR). Poiché il meccanismo NHEJ riparazione (ma non il meccanismo HR) comporta spesso l'inserimento o delezione di nucleotidi casuali nel sito di riparazione, con conseguente inserimento / delezione (INDEL) mutazioni, può causare la griglia di lettura di un esone spostare. Questo può quindi provocare il knockout del gene dovuto premature terminazione della traduzione e decadimento mediato da un nonsenso 5, 6,7.

Nonostante la comodità offerta dalla introduzione del sistema di CRISPR / Cas9 in buttare giù un gene, la genotipizzazione dei cloni di cellule bersaglio resta un collo di bottiglia, soprattutto in un ambiente 8, 9 high-throughput. tecniche esistenti o soffrono principali limitazioni intrinseche o sono finanziariamente costoso. Ad esempio, il saggio SURVEYOR o T7E1, che è un saggio enzimatico che rileva disallineamenti di DNA duplex 10, non è in grado di distinguere tra cloni di tipo selvatico e mutanti omozigoti (cloni cui alleli sono mutati identico), poiché questi cloni hanno alleli identici e pertanto non presentano disallineamenti nella loro sequenza di DNA 11. Inoltre, l'uso di Sanger sequenziamento, che è considerato il gold standard nella genotipizzazione cloni mutanti, in una configurazione ad alta produttività è indesiderabile a causa della sua costo elevato. Qui, vi presentiamo una detprotocollo soffriva esattamente della tecnica gel elettroforesi capillare PCR-fluorescente, che può aggirare le limitazioni delle altre tecniche di genotipizzazione esistenti ed è particolarmente utile nell'esecuzione di uno schermo ad elevata capacità di cloni knockout nucleasi-mediata. Questo metodo è tecnicamente semplice da eseguire e consente di risparmiare tempo e costi.

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Protocol

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1. Ottenere CRISPR / Cas9 mirati cloni singola cella

  1. cellule HepG2 seme su una piastra da 6 pozzetti a 500.000 cellule per pozzetto in 2 mL di Modified Eagle Medium senza antibiotici di Dulbecco (DMEM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS). Incubare per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. cellule trasfezione con il plasmide co-esprimono Cas9 e sgRNA specifica contro il gene di interesse utilizzando un reagente di trasfezione adeguato secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: per esempio, sgRNA può essere clonato nel pSpCas9 (BB) 2A-GFP vettore, come descritto in precedenza 4.
  3. Sostituire il terreno di coltura 4-16 ore dopo la trasfezione con 2 ml di terreno fresco senza antibiotico.
  4. Circa 48 ore dopo la trasfezione, raccolgono cella singola sospensione dalle trypsinizing cellule.
    1. Trypsinize le cellule in 0,2 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 1 ml di terreno e risospendere thoroughly.
  5. Ordinare le cellule per cloni GFP-positive, come descritto in precedenza 12, e raccogliere circa 3.500 cellule.
  6. Piastra le cellule filtrate GFP-positive sui piatti 10 cm a 500, 1000 e 2000 cellule per piatto in 8 ml di penicillina / streptomicina terreno di coltura supplementato. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
  7. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2, sostituendo la soluzione ogni cinque giorni, fino crescono in colonie singole cellule abbastanza grandi da essere visibili a occhio nudo. Per la maggior parte linee cellulari di cancro, questo richiede circa due settimane dal giorno della placcatura.
  8. Quando le colonie sono di dimensione appropriata (cioè, visibile ad occhio nudo), trasferire singole colonie di pozzetti di una piastra di coltura a 96 pozzetti contenente 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS.
    1. Aspirare le colonie singole cellule con una pipetta 200 microlitri con un piccolo volume di terreno. Risospendere le cellule a fondo in apozzi dividuo triturando più volte.
  9. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2, sostituendo la soluzione ogni cinque giorni, fino a raggiungere 50 - 90% di confluenza. Per la maggior parte linee cellulari di cancro, questo richiede circa 24-48 ore.

2. Estrazione greggio DNA genomico usando un metodo diretto di lisi

  1. Quando le cellule raggiungono 50 - 90% di confluenza, rimuovere la maggior quantità di terreno di coltura dai pozzetti possibile utilizzando aspirazione sotto vuoto multicanale o una pipetta multicanale.
  2. Aggiungere 25 ml di 0,05% tripsina-EDTA (senza rosso fenolo) in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 7 minuti.
  3. Risospendere le cellule trypsinized accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. Controllare le cellule al microscopio per fare in modo che essi sono staccati dalla superficie di plastica.
  4. Creare una replica dei singoli cloni trasferendo circa 5 microlitri della sospensione singola cella per un 96 pozzetti cultura plat vuotoe. Aggiungere 200 ml di terreno di coltura in ciascun pozzetto e mantenere le cellule fino cloni positivi sono identificati mediante elettroforesi su gel fluorescente PCR-capillare (vedi sotto). Serie espandere le celle a piatti 10 cm o qualsiasi altra scala scelta (vedi sezione 7).
  5. Aggiungere 5 ml di cella singola sospensione dal punto 2.3 a 10 ml di casalingo tampone-lyse diretta (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS, e 20 Tween-0.3%) 12 in una 96 pozzetti PCR e mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. centrifugare brevemente (per portare il liquido verso il fondo dei pozzetti).
  6. Aggiungere 200 ml di terreno di coltura per il restante ~ 15 ml di sospensione cellulare dal punto 2.3 e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2, unitamente alla replica dal punto 2.4.
  7. Sottoporre i lisati dal punto 2.5 al seguente programma ciclo termico per garantire la completa lisi delle cellule e il rilascio di DNA genomico: 65 ° C per 30 s, 8 ° C per 30 s, 65 ° C per 1,5 min, 97 ° C per 3 min, 8 ° C per 1 minuto, 65 ° C per 3 min, 97 ° C per 1 minuto, 65 ° C per 1 min, e 80 ° C per 10 min. Centrifugare brevemente lisati.
  8. Diluire lisati aggiungendo 40 microlitri di acqua priva di nucleasi e miscelare accuratamente con un vortex. centrifugare brevemente. I lisati diluiti possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -20 ° C per diversi mesi senza significativa perdita di qualità.

3. Esecuzione fluorescente PCR per amplificare CRISPR / Regioni Cas9 target

  1. Disegno due primer fluoroforo marcato forward (sia marcato all'estremità 5' ) per ciascuna / regione bersaglio Cas9 CRISPR; siti che sono maggiori di 300 bp l'uno dall'altro dovrebbero essere considerati due regioni bersaglio separate (ad esempio, verde Primer fluoroforo-marcato per il controllo di tipo selvatico non mirati e blu innesco fluoroforo-marcato per CRISPR / cloni Cas9 mirati taglio; vedere la Tabella di Materia ls).
    1. Procurarsi questi primer marcati in avanti e un primer inverso senza etichetta di conseguenza. Si noti che i primer possono essere progettati utilizzando qualsiasi strumento di scelta e che gli ampliconi dovrebbero essere 200 - lungo 500 bp.
  2. Eseguire la PCR come descritto in precedenza 12 per amplificare regioni bersaglio utilizzando i primer marcati.
    1. Utilizza 3 ml di lisati diluiti dal punto 2.8 in una reazione di 20 microlitri (vedi Tabella 1) e il seguente programma ciclo termico: 94 ° C per 10 min (1 ciclo); 94 ° C per 10 s, 64 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min (4 cicli); 94 ° C per 10 s, 61 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min (4 cicli); 94 ° C per 10 s, 58 ° C per 30 s, 68 ° C per 1 min (4 cicli); 94 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s, e 68 ° C per 1 min (35 cicli).
  3. Risolvere 5 ml di ampliconi di PCR su un gel di agarosio 1% per controllare dimensioni e relativa quantità di ampliconiss = "xref"> 12.
    NOTA: L'esecuzione di questo passo per tutti i campioni è incoraggiato ma non necessaria; risolto un numero selezionato di campioni è sufficiente per stimare la quantità di ampliconi presenti nei campioni in generale.

4. I campioni Preparazione per capillare elettroforesi su gel

  1. Diluire ampliconi di tipo selvatico (cellule parentali non mirati) e CRISPR / DNA Cas9 mirati in acqua priva di nucleasi a circa 2,5 ng / mL. Assicurati di diluire il campione sufficiente di DNA di tipo selvatico da aggiungere ad ogni campione di DNA mirata (un minimo di 0.5 ml di campione di tipo selvatico diluito per campione mirato è richiesto).
  2. Mescolare il tipo selvatico diluito e campioni di DNA bersaglio a pari rapporto (ad esempio, mescolare 1 ml di campione di tipo selvatico con 1 ml di campione mirato).
  3. Aggiungere 1 ml di ampliconi misti a 8,7 ml di formammide deionizzata e 0,3 ml di dimensioni standard colorante marcato con un pozzetti 96 PCR piastra che è compatibile con l'un geneticoalyzer.
    NOTA: L'uso di un master mix di formammide e lo standard dimensioni (cioè, una preparazione di una premiscela di formammide e lo standard dimensione in un 29: 1 rapporto prima dell'aggiunta di ampliconi garantire importi standardizzati) è consigliato.
  4. Strettamente sigillare la piastra e riscaldare i campioni a 95 ° C per 3 minuti usando un termociclatore PCR.
  5. Posizionare la piastra sul ghiaccio subito dopo la fase di riscaldamento e incubare per almeno 3 minuti.

5. L'esecuzione capillare elettroforesi su gel su un analizzatore genetico

  1. Impostare parametri del test, protocollo dello strumento, e dimensione protocollo-invitando il software elettroforesi su gel capillare collegato ad un analizzatore genetico.
    NOTA: Questa fase è necessaria solo per il primo corsa elettroforetica; il programma può essere salvato per un utilizzo futuro. Per le esecuzioni successive, andare direttamente al punto 5.2.
    1. Fare clic sull'icona "Crea nuovo Plate" sul cruscotto software.
    2. Dare il run nome fittizio e selezionare le seguenti opzioni: Numero di pozzi, 96; Targhetta, frammento; Capillare Lunghezza, 50 cm; e Polymer, POP7. Fare clic sul pulsante "Assegna Targa Contenuto".
    3. In "saggi", fai clic su "Crea nuovo Assay"; apparirà un nuovo pannello.
    4. Nome del saggio "FPCR-CGE Assay" e verificare che "Tipo di applicazione" è impostato correttamente come "frammento".
    5. Istituito protocollo dello strumento facendo clic sul pulsante "Crea nuovo" sotto "Strumento protocollo."
      1. Impostare o scegliere le seguenti opzioni e parametri nelle aree appropriate: Tipo di applicazione, frammento; Capillare Lunghezza, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Run Module, FragmentAnalysis; Nome protocollo, FPCR-CGE Strumento protocollo; Forno temperatura, 60 ° C; Eseguire di tensione, il 19,5 kV; Pre-run di tensione, 15 kV; Iniezione di tensione, 1,6 kV; Tempo di esecuzione, 1.330 s; Pre-Run Time, 180 s; Tempo di iniezione, 15 s; e Data Delay, 1 s.
    6. Click sul pulsante "Applica a Assay" e poi il pulsante "Salva in Biblioteca" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
    7. Impostare un protocollo di dimensioni-chiamata facendo clic sul pulsante "Crea nuovo" sotto "Sizecalling protocollo."
      1. Impostare o scegliere le seguenti opzioni e parametri nelle aree appropriate: nome del protocollo, FPCR-CGE Sizecalling protocollo; formato standard, GS500 (-250) LIZ; Taglia-chiamante, SizeCaller v1.1.0; Impostazioni di analisi, -; Analisi gamma, completa; Dimensionamento gamma, completa; Dimensioni metodo di chiamata, Southern locale; Peak Primer, presente; Blu, Verde, Arancione Canali, (controllo); Altezza del picco minimo, 175 per tutti i canali; Utilizzare Smoothing, None; Usa riferimento Per (Baseline Window (Pt)), (Check) 51; Minimo Peak metà larghezza, 2; Peak Dimensioni finestra, 15; Polinomiale Laurea, 3; Slope Soglia Peak Start, 0.0; Slope Soglia Peak End, 0.0; Impostazioni QC, -; Misura qualità, -; Fail se il valore è <0.25; Passare se il valore è <0,75; Assumere Linearità da 0 a 80 bp0 bp; e Actuate Pull-Up flag se Rapporto di Pull-Up ≤ 0,1 e pull-up di scansione ≤ 1.
    8. Fare clic sul pulsante "Applica a Assay" e poi il pulsante "Save to Library" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
    9. Assicurarsi che il saggio è salvato cliccando sul pulsante "Salva in Biblioteca" una volta di più e uscire dal pannello facendo clic sul pulsante "Chiudi".
    10. Torna alla pagina "Assegnare piastra contenuti", fai clic sul link "Crea nuovo file Convenzione nome" sotto "File Name Conventions".
    11. Nome del programma "FPCR-CGE File Name".
    12. In "Attributi disponibili", selezionare gli attributi desiderati che appariranno nel nome del file (ad esempio, "Data di Run", "Tempo di Run," "Beh Posizione" e "Nome campione"). Scegliere la posizione del file desiderato in cui verranno memorizzati i risultati della corsa.
    13. Fare clic sul pulsante "Applica a Assay" e poiil pulsante "Salva in Biblioteca" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
    14. Torna alla pagina "Assegnare contenuto della piastra", fai clic sul link "Crea nuovo gruppo Risultati" sotto "Risultati Gruppi."
    15. Nome del programma "FPCR-CGE Risultati Gruppi."
    16. In "Attributi disponibili", selezionare gli attributi desiderati che appariranno nel nome del file (ad esempio, "Nome Assay"). Scegliere la posizione del file desiderato in cui verranno memorizzati i risultati della corsa.
    17. Fare clic sul pulsante "Applica a Assay" e poi il pulsante "Save to Library" per salvare il programma. Chiudere il pannello di continuare.
  2. Impostare il programma per un elettroforesi gestito seguendo la procedura di seguito.
    1. Vai sul cruscotto e cliccare sull'icona "Crea nuovo Plate".
    2. Assegnare un nome alla corsa come desiderato (per una facile consultazione, includere la data, linea cellulare, e il nome del gene). Selezionare le seguenti opzioni: Numero di pozzi, 96; Targhetta, frammento; Capillare Lunghezza, 50 cm; e Polymer, POP7. Fare clic sul pulsante "Assegna Targa Contenuto".
    3. Etichettare ciascun pozzetto del campione desiderato (ad esempio, un campione può essere denominato "NC" per indicare che il pozzo è un controllo negativo).
    4. Nella sezione "Saggi", "Nome file convenzioni" e "Risultati Gruppi" box, fare clic su "Aggiungi collegamento dalla libreria" e selezionare i programmi creati nel passo 5.1.3 a 5.1.17.
    5. Evidenziare tutti i pozzi da analizzare e selezionare i programmi relativi alla voce "saggi", "Nome file convenzioni" e "Risultati Gruppi" controllando le caselle accanto a loro.
  3. Prima di caricare la piastra sul vassoio dell'analizzatore genetico, applicare la guarnizione di gomma sulla piastra a 96 pozzetti e mettere la piastra sigillata nel caso di plastica che viene fornito con l'analizzatore genetico.
  4. Premere il pulsante "Tray" nella parte anteriore dell'analizzatore genetico, e quando il re del vassoiodolori parte anteriore dell'apparecchio, aprire la porta e caricare la piastra incassata sul vassoio. Assicurarsi che la piastra sia bloccato in posizione e quindi chiudere lo sportello.
  5. Clicca su "Link Plate per Run" pulsante.
  6. Nella pagina "piastre di carico per Run", fare un controllo finale per assicurare che tutti i reagenti e le condizioni sono corrette e in ordine.
  7. Fare clic sul pulsante "Start Esegui". Ogni ciclo di 24 campioni (i primi pozzi 3x8 della piastra a 96 pozzetti) richiede meno di 55 minuti per completare.

6. Analisi della elettroferogramma per determinare paia di basi Differenze

  1. Quando il capillare elettroforesi su gel di esecuzione, aprire il software di analisi per analizzare i risultati.
  2. Fare clic su "Aggiungi campioni al progetto" icona e cercare la cartella contenente i file di esecuzione. Ricordiamo dal punto 5.1.12 la posizione assegnata dei file di risultati.
  3. Selezionare tutti i file dei risultati di ogni iniezione nella corsa completato e click sul pulsante "Aggiungi a elenco"; i nomi di questi file iniziano con "Inj" e contengono i dettagli della corsa.
  4. Fai clic sul pulsante "Aggiungi e analizzare" per procedere con l'analisi.
  5. Seleziona tutti i campioni nella corsa cliccando sul primo campione e trascinando il cursore verso il basso per l'ultimo campione e quindi fare clic sull'icona "Mostra Terreni".
  6. Per controllare la qualità del formato standard, aprire il canale arancione dei risultati controllando l'icona arancione e deselezionando il resto delle icone colorate; questo è importante assicurarsi che la dimensione-chiamata è preciso ed affidabile.
  7. Per visualizzare i picchi corrispondenti ai frammenti derivati ​​dal controllo non mirati e cloni mirati, controllare le icone blu e verde di aprire letture da questi canali.
  8. Posizionare il cursore sopra l'asse orizzontale dei primi risultati trama e tasto destro del mouse per selezionare "Visualizza". Scorrere verso il basso per visualizzare tutti i risultati a colpo d'occhio per determinarese c'è qualche problema principale con la corsa. Per ingrandire una specifica gamma di valori, fare clic destro con il mouse sul relativo asse della trama, scegliere "Zoom A ..." e digitare l'intervallo dei valori di interesse.
    NOTA: Un potenziale problema principale è che tutti i campioni danno picchi di bassa intensità. Ciò è generalmente dovuto allo stoccaggio prolungato di ampliconi fluoroforo etichettati prima della corsa elettroforesi capillare o l'eccessiva diluizione di ampliconi, che può essere facilmente corretti ripetendo il passo PCR o diluendo gli ampliconi con un fattore di diluizione inferiore, rispettivamente.
  9. Per salvare i risultati, seguire la procedura descritta di seguito.
    1. Assicurarsi che i canali blu e verde sono selezionati e cliccare sull'icona "Sizing Table".
    2. Salvare la tabella dei valori in formato delimitato da tabulazioni di testo (.txt) aprendo "File" e scegliere "Esporta tabella". Nome del file di conseguenza e selezionare la posizione del file di scelta.
    3. Per salvare la tramas della corsa in formato PDF, andare su "File" e fare clic sull'opzione "Stampa". Scegliere il produttore del pdf relativo e premere il tasto "Stampa". Nome del file di conseguenza e selezionare la posizione del file di scelta.
  10. Per calcolare la differenza di dimensioni dei frammenti derivati ​​dal controllo di tipo selvatico non mirati e le CRISPR / cloni Cas9-mirati, seguire la procedura descritta di seguito.
    1. Aprire il file di scheda di testo delimitato (.txt) dal punto 6.9.2 con un foglio di calcolo. La tabella dovrebbe includere questi quattro colonne importanti: "Dye Peak / campione" (che indica un canale blu o verde), "Sample File Name" (i primi caratteri indicano il bene o il nome del campione), "Size" (che indica la dimensione del frammento chiamato), e "altezza" (che indica l'intensità di fluorescenza del picco).
    2. Per individuare i picchi rilevanti, escludere quelli che non sono nella gamma di dimensione prevista.
      NOTA: in genere, le mutazioni INDEL raramente risultato in piùdi una differenza di 100 bp in altezza; pertanto, sono esclusi picchi le cui dimensioni differisce di più di 100 bp dal picco di controllo di tipo selvatico (picco dominante nel canale verde). Questo può essere fatto facilmente usando il "Between" opzione sotto la funzione "Formattazione condizionale" nel foglio di calcolo.
    3. Per rimuovere i picchi non specifici, che sono indistinguibili dal livello di fondo, utilizzare la "minore di" opzione sotto la funzione "Formattazione condizionale" nel foglio di calcolo di escludere picchi le cui altezze sono inferiori a 2.000 unità. Questo valore di cut-off è stato empiricamente determinata e può pertanto adeguato ove ritenuto opportuno.
    4. Calcolare la differenza di dimensione del frammento tra ciascuno dei picchi risultanti nel canale blu (CRISPR / cloni Cas9-mirate) e la suola picco nel canale verde (controllo di tipo selvatico non mirati) sottraendo il secondo dal primo.
      NOTA: E 'importante utilizzare valori attribuiti ad ogni elettrof capillarecampione ESIS, in quanto vi possono essere differenze inter-campione nella dimensione del frammento del controllo di tipo selvatico.
    5. Arrotondare i valori all'intero più vicino per determinare il numero di coppie di basi che sono stati inseriti in o cancellati da eventuali sequenza genomica in questione. Quando buttare giù un gene è di interesse, selezionare i cloni le cui mutazioni sono indel non di multipli di 3 bp al fine di garantire che non v'è frameshift nel sequenza codificante.

7. verifica dello stato di Knockout cloni

  1. Espandere i singoli cloni knockout dalla piastra a 96 pozzetti (dai passi 2.4 e 2.6) ad una piastra a 24 pozzetti da trypsinizing cellule utilizzando 25 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 5 min.
  2. Aggiungere 125 ml di medium (DMEM integrato con il 10% FBS) alle cellule trypsinized e risospendere accuratamente.
  3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere la maggior quantità del mezzo possibile aspirazione sottovuoto utilizzando o una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 500 ml di mezzo, e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino a quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza.
  5. Espandere i singoli cloni in serie dalla piastra 24 pozzetti ad una piastra da 6 pozzetti e dal 6 pozzetti a 10 cm piatto quando raggiungere l'80 - 90% di confluenza ripetendo i punti da 7.1 a 7.4, utilizzando i seguenti volumi: 50 microlitri di 0,25% tripsina-EDTA e 150 ml di mezzo (per espandere dalla piastra 24 pozzetti alla piastra da 6 pozzetti) e 200 ml di 0,25% tripsina-EDTA e 1 ml di terreno (per espandere dal 6- pozzetti a 10 cm piatto).
  6. Raccogliere i cloni quando raggiungere l'80 - 90% di confluenza dalle trypsinizing cellule usando 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5 min.
  7. Aggiungere 5 ml di terreno (DMEM integrato con il 10% FBS) alle cellule trypsinized e resuspend accuratamente.
  8. Trasferire la sospensione cellulare equamente in due provette da 15 ml, centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, e rimuovere il mezzo più possibile. Una parte delle cellule sia per l'estrazione di DNA genomico e l'altro per l'estrazione delle proteine ​​totali.
  9. Per la verifica tramite sequenziamento Sanger, seguire la procedura descritta di seguito.
    1. Estrarre il DNA genomico da cloni come descritto in precedenza 12.
    2. Eseguire l'amplificazione PCR della regione che attraversa il sito di destinazione CRISPR / Cas9, come descritto nel paragrafo 3.2, ma utilizzare primer senza etichetta. Non utilizzare primer marcati per questo passo, come la fluorescenza dal tag interferirà con la successiva fase di sequenziamento Sanger.
    3. Purificare gli ampliconi utilizzando un kit di pulizia PCR, come descritto in precedenza 12.
    4. Sequenziare gli ampliconi purificati utilizzando i primer di PCR utilizzati nello step 7.9.2 per determinare il genotipo dei cloni, come descritto precedente ay 12.
  10. Per la verifica tramite analisi Western Blot, estrarre proteine delle cellule di tipo selvatico e cloni mirati, come descritto in precedenza 12.
    1. Effettuare analisi Western blot utilizzando anticorpi contro la proteina appropriate del gene bersaglio, come descritto in precedenza 12; un vero e proprio clone di eliminazione diretta è privo di espressione della proteina.

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Representative Results

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La tecnica gel elettroforesi capillare PCR fluorescente qui descritto è previsto per essere applicabile a qualsiasi regione targetable nel genoma in qualsiasi linea cellulare che è suscettibile di consegna DNA estraneo. Abbiamo già dimostrato la sua applicazione di mira tre geni in una linea di cellule di cancro del colon-retto 12. Qui vi mostriamo la sua efficacia in genotipizzazione una linea di cellule di carcinoma epatocellulare, HepG2, mirata con un CRISPR / Cas9 costrutto contro la proteina Assemblea Nucleosoma 1 Ti piace 1 gene (NAP1L1). Infatti, abbiamo utilizzato con successo la tecnica gel elettroforesi capillare-PCR fluorescente al genotipo varie altre cellule, comprese le linee non umani mammiferi cellule, mirati in numerosi altri geni 12, 13.

Esperimento-saggio, il fluorescente PCR-capillare su gel elettroforesi technique è facile e veloce da eseguire. Dopo l'introduzione di espressione Cas9 e sgRNA costruisce nelle cellule e la selezione dei cloni positivi, i singoli cloni vengono lisati direttamente dalla piastra di coltura a 96 pozzetti utilizzando il nostro tampone di lisi casalingo, diretto Lyse Buffer 12. Nella nostra esperienza, i lisati risultanti possono essere conservati a -20 ° C o inferiore per diversi mesi senza significativa perdita di qualità del DNA genomico. La fase di lisi è seguita dalla fase di amplificazione PCR, che prevede la produzione di ampliconi fluoroforo etichettato che attraversano la regione bersaglio CRISPR. Il protocollo PCR fluorescente disponibile è stato ottimizzato per questo scopo e ha prodotto costantemente ampi prodotti PCR, indipendentemente dalla regione di essere amplificati. La figura 1 mostra un risultato rappresentativo della risoluzione dei ampliconi derivanti dalla fase PCR fluorescente, con ogni corsia corrispondente ad un / clone Cas9 targeting individuale CRISPR e diverse fasce CORRESPonding alle regioni amplificate dei singoli alleli nei cloni. Nella nostra esperienza, l'uso di altre polimerasi e dei loro protocolli concomitanti ha provocato una resa inferiore amplicone. Anche se questo può essere facilmente corretti regolando il fattore di diluizione durante la preparazione del campione per gel elettroforesi capillare, il livello di rumore di fondo o possono pertanto essere più elevato quando vengono utilizzati ampliconi di resa inferiore. Dopo la fase di PCR amplificati sono diluiti, e quelle del campione di tipo selvatico e cloni mirati vengono miscelati in rapporto pari prima di essere aggiunti al buffer formammide deionizzata e dimensioni standard, denaturato, e risolti su un gel capillare.

Dopo il completamento del gel elettroforesi capillare, i risultati genotipizzazione sono pronti per essere analizzati. Due serie di importanti risultati sono richiesti dalla corsa elettroforetica: elettroferogrammi contenenti i picchi corrispondenti ai singoli segnali di fluorescenza e the tabella dei risultati contenente tutti i valori necessari richiesti per il calcolo. La Figura 2 mostra i risultati per la genotipizzazione dei due cloni mirati dal sgRNA contro il gene NAP1L1 in cellule HepG2. I picchi verdi corrispondono agli ampliconi del allele di tipo selvatico non mirati nelle cellule HepG2 parentali, mentre i picchi blu corrispondono ampliconi dei INDEL alleli mutazione contenenti dei CRISPR / cloni Cas9 mirati. Come chiaramente mostrato, i due cloni sono mutanti omozigoti (mutanti con alleli mutati identico), con l'eliminazione di uno e dieci nucleotidi in entrambi gli alleli. È importante notare che gli elettroferogrammi sono utilizzati solo per scopi di visualizzazione, mentre i valori di picco sono importanti nel determinare il numero di differenze di coppie di basi tra l'amplicone dei cloni mirati e quella delle cellule di tipo selvatico.

Per convalidare l'autenticità dello stato di eliminazione diretta, si consiglia di eseguireSanger sequenziamento e l'analisi Western Blot per confermare l'abolizione dell'espressione genica nelle cellule. I due cloni identificati sopra dato risultati Sanger sequenziamento coerenti con i risultati di elettroforesi su gel di PCR-capillare fluorescenti (Figura 3A). Essi inoltre visualizzati ablazione completa dell'espressione proteica NAP1L1 (figura 3B), come previsto di cloni knockout.

Figura 1
Figura 1: PCR amplificati di HepG2 cloni mirati da CRISPR / Cas9 Contro il NAP1L1 Gene. Ampliconi del passo PCR fluorescente sono stati risolti su gel di agarosio due separati (superiore ed inferiore), e ogni corsia corrisponde ad un singolo clone mirato. L: DNA ladder (le dimensioni delle singole bande sono date accanto al diagramma). Si prega di cliccare il suoe per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: l'andamento di segnali di fluorescenza da due campioni risolti tramite capillare elettroforesi su gel. L'asse orizzontale rappresenta la dimensione del frammento e l'asse verticale rappresenta l'intensità del segnale di fluorescenza. I picchi blu corrispondono a frammenti derivati ​​da CRISPR / cloni mirati Cas9-mediate, mentre i picchi verdi corrispondono a frammenti derivati ​​da cellule di tipo selvatico. linee magenta corrispondono alle posizioni automatiche picco-chiamando determinati dal software di analisi, che segna posizioni che presentano costantemente picchi attraverso campioni. I valori forniti accanto ai singoli picchi corrispondono alle dimensioni dei frammenti (in bp) e sono ottenuti dal software di analisi. I valori tra parentesi rappresentano la differenza di dimensioni tra calcolata fra individuogments da un clone mirato e il frammento di tipo selvatico. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: i risultati dei dosaggi per confermare l'Knockout del gene bersaglio in due cloni. (A) Sanger sequenziamento risultati e (B) analisi Western blot utilizzando anticorpi contro la proteina indicata. Nucleotidi in blu rappresentano la sequenza bersaglio sgRNA, quelli in rosso rappresentano il motivo adiacente protospacer (PAM), quelli in marrone rappresentano nucleotidi base-sostituito, e trattini rappresentano le posizioni in cui il nucleotide sono soppresse nella allele. I valori tra parentesi accanto ai singoli nomi clone rappresentano il genotipo degli alleli del clone; "-1" e "-10" significa che gli alleli contengono una delezione di uno e dieci nucleotidi rispettivamente dimensione approssimativa delle proteine rilevate nel Western Blot analisi:. ~ 54 kDa per NAP1L1 e ~ 84 kDa per P84 (controllo di carico). Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.

Reagente Volume per una reazione (pi)
soluzione specifica Kit 4
10x PCR Buffer 2
10 microns di primer in avanti (con etichetta) 1
10 micron primer inverso (senza etichetta) 1
mix 25 mM dNTP 0.4
Taq DNA Polymerase 0.2
acqua 8.4
lisato diluito 3
Totale 20

Tabella 1: I reagenti per la reazione fluorescente PCR.

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Discussion

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Il bussare fuori di un gene specifico in una linea cellulare modello di scelta è diventata routine per chiarire il ruolo che il gene gioca in quel particolare contesto cellulare. Infatti, più schermate genoma sono attualmente disponibili che utilizzano il sistema CRISPR / Cas9 target virtualmente tutti noti geni umani nel genoma 14, 15, 16. Con questi schermi di grandi dimensioni (o anche su piccola scala mira dei singoli geni di interesse), è importante progettare e utilizzare sgRNAs rivolte diversi loci dello stesso gene. risultati coerenti tra le diverse sgRNAs utilizzati sarebbero inequivocabilmente capitolare il vero effetto della deplezione del gene. Come tale, il targeting di un singolo gene richiederebbe un passo genotipizzazione alto volume al genotipo precisione una moltitudine di cloni da ciascuna delle sgRNA individuale utilizzato. La tecnica di elettroforesi su gel PCR-capillare fluorescente ha descrittori può eseguire proprio questo compito.

Mentre la maggior parte dei metodi di genotipizzazione esistenti sono suscettibili di scopi ad elevata capacità, ciascuno di essi soffre di alcune limitazioni intrinseche che li rendono meno ideale. Il geometra, o T7E1, test, che rileva disallineamenti di DNA duplex 10, non è in grado di distinguere tra cellule di tipo selvatico e mutanti omozigoti (cloni con due alleli identicamente mutati) a causa del fatto che entrambi questi cloni producono due piani privi di disallineamenti 11. Il saggio lunghezza del frammento di restrizione polimorfismo (RFLP), che riporta la scomparsa dei siti di restrizione dovute a mutazioni INDEL della regione bersaglio CRISPR 17, è limitata dalla disponibilità di opportuni siti di restrizione in corrispondenza della zona bersaglio 18. La tecnica di analisi di fusione del DNA, che percepisce diversi genotipi in base alle loro curve di fusione 19, 20, soffre di una mancanza di coerenza. Inoltre, tutti e tre questi metodi non sono particolarmente informativo in quanto non riportano il verificarsi di un frameshift nella sequenza genetica. Al contrario, il sequenziamento Sanger - che è attualmente la tecnica genotipizzazione più popolare - è estremamente informativo, in quanto fornisce l'esatta sequenza della regione genomica presi di mira. Tuttavia, questa tecnica è costosa, soprattutto in esperimenti su larga scala. Così, la caratterizzazione della PCR-capillare tecnica gel elettroforesi fluorescente qui descritto è di vitale importanza perché può aggirare tutte le limitazioni incontrate da altre tecniche sopra descritte.

La tecnica di elettroforesi su gel PCR-capillare fluorescente consente agli utenti di distinguere tra tutti i possibili genotipi un clone può esistere in-tipo selvatico, mutante eterozigote (caratterizzato da un allele di tipo selvatico e un allele mutante), omozigote mutante (caratterizzata da due identalleli mutanti ici), e mutante eterozigote composto (caratterizzata da due alleli mutanti non identici). Questi genotipi sono facilmente differenziabili dai modelli di punta della elettroferogramma. Inoltre, questa tecnica genotipizzazione riporta la differenza tra la dimensione del frammento dell'amplicone tipo selvatico e quella dei cloni mirate e una precisione di una singola coppia di basi. Questo riporta in modo efficace la presenza o l'assenza di un frameshift nella sequenza genetica, permettendo agli utenti di ridurre la loro convalida per solo una manciata di cloni, risparmiando tempo e costi. In cima a quello, questa tecnica permette anche per la multiplazione di gene targeting (cioè, può contemporaneamente genotipo più di un bersaglio), e consente il rilevamento di una popolazione cellulare eterogenea dalla presenza di modelli di punta aberranti (ad esempio, la presenza di tre o più picchi nella elettroferogramma di cellule diploidi). Oltre alle linee cellulari usate qui e precedentemente 12 </ sup>, 13, abbiamo anche genotipizzati successo varie altre linee cellulari umane e non umane, comprese le cellule staminali e cellule neuronali (dati non pubblicati), utilizzando la tecnica gel elettroforesi PCR-capillare fluorescente, e ci aspettiamo che questa tecnica è applicabile a tutte le cellule che sono suscettibili di CRISPR / Cas9 targeting. Inoltre, poiché questa tecnica riporta il genotipo dei singoli alleli nella cellula, è estremamente utile per la genotipizzazione di celle multi-alleliche, come le cellule tumorali che hanno aneuploidia o amplificazioni genetiche.

Il protocollo qui descritto (compreso tutto il materiale utilizzato) è stato ottimizzato per la genotipizzazione versatile e riproducibile CRISPR / cloni Cas9 mirati. Tuttavia, ci sono alcune parti che garantiscono modifica. Essi includono, ma non sono limitati a: 1) l'uso di un diverso vettore di espressione sgRNA (o strategia di clonazione), che può richiedere l'uso di una diversa strategia di selezione(Ad esempio, la selezione di cloni antibiotico anziché FACS); 2) l'uso di una polimerasi diversa per la fase di PCR fluorescente; e 3) l'uso di etichette diverse fluorescenti. Inoltre, è importante notare che un paio di fasi essenziali del protocollo può risultare problematica. Per uno, gli ampliconi PCR fluorescenti possono produca bande non specifiche nell'elettroferogramma gel di agarosio, o il modello di picco nella elettroferogramma gel capillare possono essere "rumoroso". Ciò è probabilmente dovuto alla qualità non ottimale dei primer PCR e quindi possono essere risolti con ri-progettazione questi primer. Si consiglia di testare la qualità dei primer utilizzando oligonucleotidi non marcati prima di procurare quelli fluoroforo etichettati per assicurare la coerenza, riproducibilità e specificità del procedimento di amplificazione. L'altro fattore importante da notare è l'efficienza del RNA guida CRISPR, che può determinare il tasso di ottenere veri cloni positivi knockout. Dal momento che nessuno della ricerca prog sgRNApistoni che sono attualmente disponibili sono infallibile, l'efficacia di ogni singolo sgRNA può essere determinato solo empiricamente. Pertanto, è importante progettare e utilizzare più di una sgRNA (preferibilmente tre o più) per ogni genica mirata per ridurre la possibilità di non ottenere un clone ko di successo.

Mentre la tecnica di gel elettroforesi capillare PCR fluorescente è informativo, sensibile, e facile da usare, si tratta con alcuni avvertimenti. In primo luogo, questa tecnica richiede l'uso di un analizzatore genetico, che non può essere prontamente disponibili. Tuttavia, poiché l'analizzatore genetico utilizzato per questo scopo è lo stesso utilizzato per esperimenti di sequenziamento Sanger, il protocollo gel elettroforesi capillare può essere affidata a fornitori di servizi di sequenziamento Sanger esistenti. Infatti, abbiamo precedentemente organizzato con nostro fornitore di servizi di sequenziamento per eseguire il protocollo gel elettroforesi capillare ad un costo comparabile a quando fatto in casa. In secondo luogo, la precisione della techniqUE può soffrire quando mutazioni INDEL più di 30 bp sono coinvolti. Nella nostra esperienza, la tecnica gel elettroforesi capillare PCR fluorescente tende a sottostimare la dimensione dei indels quando vengono osservate notevoli indels (> 30 bp). Tuttavia, nella nostra esperienza, una vasta maggioranza di mutanti visualizzata lunghezze di mutazione molto breve INDEL (la maggior parte sono meno di 5 bp). Tuttavia, questo è altamente dipendente dal sito di destinazione CRISPR e linea cellulare utilizzato. In terzo luogo, la tecnica gel elettroforesi capillare PCR-fluorescente non è in grado di rilevare sostituzioni di basi su NHEJ riparazione presso il sito di taglio CRISPR / Cas9. Tuttavia, è stato riportato che la sostituzione di base a seguito della riparazione NHEJ di rotture a doppio filamento è un evento raro 21, e non hanno dannosamente alterare la fase di lettura del gene. Quarto, questa tecnica rivela soltanto cambiamenti nella regione bersaglio amplificato nel passaggio PCR fluorescente e quindi non segnalare eventuali aberrazioni fuori bersaglio (cambiamenti genetici outside regione amplificata). Se è richiesto un sondaggio così completa degli effetti off-target del singolo sgRNA CRISPR, si consiglia di sequenziamento del genoma completo di rilevare con precisione eventuali cambiamenti nel genoma dei cloni mirati. Tuttavia, questo piuttosto costoso esperimento non è necessaria se più di uno sgRNA viene utilizzato per genica mirata, come discusso in precedenza. Infine, la tecnica gel elettroforesi capillare PCR fluorescente qui descritto ha un limite dimensione del frammento di 600 bp. Ciò può costituire un problema se la regione bersaglio costituito da sequenze ripetute o ha contenuto eccezionalmente alto guanina-citosina (GC), che possono influenzare PCR efficienza di amplificazione e specificità. Questo problema facilmente prevenibili sottolinea l'importanza di una progettazione accurata bersaglio sgRNA, che deve includere la considerazione adeguata per l'amplificazione adeguata della regione di destinazione. Pertanto, considerando i punti di forza e avvertimenti della tecnica gel elettroforesi capillare PCR-fluorescente, questo metodo facile di genotipizzazionepuò alleviare l'onere di elevati volumi di genotipizzazione di cloni ad eliminazione diretta, che resta un collo di bottiglia a questo giorno.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare la signora Tan Shi Min, la signora Helen Ong, e il dottor Zhao Yi per aiutare con gli esperimenti di elettroforesi capillare gel. Questo lavoro è stato sostenuto da NMRC / IRG concedere NMRC / 1314/2011 e MOE ACRF Tier 2 Fondo concessione MOE2011-T2-1-051.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPG2 cells ATCC HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid Addgene PX458
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific 15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade GE Healthcare SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) AITbiotech None Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) AITbiotech None Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer AITbiotech None Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit QIAGEN 201223
Hi-Di Formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard Thermo Fisher Scientific 4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific 4306737
3500xL Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405633
3500 Series 2 program Thermo Fisher Scientific 4476988
Gene Mapper 5 program Thermo Fisher Scientific 4475073
Gentra Puregene Cell Kit QIAGEN 1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
NAP1L1 Antibody (N-term) Abgent AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] GeneTex GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 515-035-003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M. S., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. J. Vis. Exp. (122), e55586, doi:10.3791/55586 (2017).More

Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M. S., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. J. Vis. Exp. (122), e55586, doi:10.3791/55586 (2017).

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