Den genotyping teknikken beskrevet her, som fluorescerende par polymerase-kjedereaksjon (PCR) for å kapillært gelelektroforese, gjør det mulig for high-throughput genotyping av nuklease-mediert knockout kloner. Det omgår begrensninger overfor andre genotype-teknikker og er mer kostnadseffektivt enn sekvenseringsmetoder.
Utviklingen av programmerbare genom-redigeringsverktøy har muliggjort bruk av revers genetikk for å forstå de spesifikke roller genomiske sekvenser spiller i funksjon av celler og hele organismer. Denne årsaken har vært enormt hjulpet av den nylige lanseringen av CRISPR / Cas9 system et allsidig verktøy som lar forskere å manipulere genomet og transkriptomet for å blant annet slå ut, slå ned, eller slå på gener i en målrettet måte. I den hensikt å slå ut et gen, CRISPR / Cas9-medierte dobbel-strengbrudd rekruttere ikke-homologe ende-sammenføyning DNA reparasjon vei for å innføre den rammeskift-forårsaker insersjon eller delesjon av nukleotider ved pause stedet. Imidlertid kan en individuell veiledning RNA føre til uønskede off-target-effekter, og for å utelukke disse ut, er det nødvendig å bruke flere førings-RNA. Denne flerhet av mål betyr også at en høy-volum screening av kloner er nødvendig, som i sin tur ber bruk av en efkelig høy gjennomstrømming teknikk for å genotype knockout kloner. Nåværende teknikker for genotyping enten lider av iboende begrensninger eller medføre høye omkostninger, og dermed gjør dem uegnet for high-throughput formål. Her har vi detalj protokollen for å benytte fluorescens-PCR som anvender genomisk DNA fra rå cellelysat som en mal, og deretter løse de PCR-fragmentene via kapillar-gelelektroforese. Denne teknikken er nøyaktige nok til å skille ett basepar forskjell mellom fragmenter og derfor er tilfredsstillende i å indikere nærvær eller fravær av en rammeskift i den kodende sekvensen til den målsøkte gen. Dette presis kunnskap utelukker effektivt behovet for en bekreftende sekvense trinn, og tillater brukere å spare tid og kostnader i prosessen. Videre har denne teknikk vist seg å være allsidig i genotyping forskjellige pattedyr celler av forskjellige vev opprinnelse rettet av førings RNA mot tallrike gener, slik som vist her og andre steder.
Omvendt genetiske metoder har tillatt forskere å belyse effekten av spesifikke endringer i genomet på cellen eller hele organismen. For eksempel kan ekspresjon av et bestemt gen svekkes ved hjelp av gen knockdown 1, 2 (delvis reduksjon) eller gen knockout 3, 4 (fullstendig ablasjon) for å bestemme den virkning dette har på funksjonen av cellen eller på utvikling av organismen.
Gene knockout eksperimenter har blitt lettere siden innføringen av sekvens-spesifikke programmerbare nukleaser, slik som zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjonsaktivator-lignende effektor-nuklease (Talens). Men den relativt nylige karakterisering av gruppert regelmessig ispedd korte palindromisk repeat (CRISPR) / Cas9 systemet har gjort det svært enkelt for alle laboratorie hele verden til å utføre gene knockout eksperimenter. I hovedsak CRISPR / Cas9 system består av to essensielle komponenter et enkelt hjelpe-RNA (sgRNA), som gjenkjenner og binder via base komplementaritet til en spesifikk sekvens i genomet, og en endonuklease som kalles Cas9. Den kjølvannet av den spesifikke binding, og virkningen av sgRNA-Cas9 kompleks på genom-DNA er den dobbelt-tråd spalting av DNA. Dette i sin tur utløser den DNA-skade svar mekanisme i cellen, som deretter reparert via de ikke-homologe ende-sammenføyning (NHEJ) eller homolog rekombinasjon (HR) veier. Siden NHEJ reparasjonsmekanismen (men ikke den HR-mekanisme) ofte resulterer i tilfeldig innskudd eller delesjon av nukleotider på stedet for reparasjon, noe som resulterer i innsetting / sletting (Indel) mutasjoner, kan det føre til at leserammen til et ekson å skifte. Dette kan da føre til at knockout av genet grunn av for tidlig avslutning av translasjon og nonsense-mediert nedbrytning 5, 6,7.
Til tross for fordelene som oppnås ved innføringen av CRISPR / Cas9 system i å slå ut et gen, den genotyping av kloner av målsøkte celler er fortsatt en flaskehals, spesielt i en high-throughput innstilling 8, 9. Eksisterende teknikker enten lider store iboende begrensninger eller er økonomisk kostbart. For eksempel, er den inspektør eller T7E1 analysen som er en enzymatisk analyse som detekterer feiltilpasninger i DNA-duplekser 10, ikke i stand til å skille mellom villtype-kloner og homozygote mutanter (kloner som alleler er mutert identisk), ettersom disse kloner har identiske alleler og dermed presenterer ikke mistilpasninger i sin DNA-sekvens 11. I tillegg er bruk av Sanger-sekvensering, som regnes som gullstandarden i genotyping mutantkloner, i en high-throughput oppsett uønsket på grunn av sin høye pris. Her presenterer vi en Detailed protokollen av den fluorescerende PCR-kapillar-gel-elektroforese teknikk som kan omgå begrensningene til de andre eksisterende genotyping teknikker, og er spesielt nyttig ved utførelse av en høy gjennomstrøming av nuklease-mediert knockout kloner. Denne metoden er teknisk enkel å utføre og sparer tid og kostnader.
Banke ut av et spesifikt gen i en modell cellelinje av valget har blitt rutine for å belyse rollen at genet spiller i den bestemte celle sammenheng. Faktisk er flere genomskjermer er for tiden tilgjengelig som bruker CRISPR / Cas9 system for å føre praktisk talt alle kjente humane gener i genomet 14, 15, 16. Med disse store skjermer (eller til og med små-skala målretting av individuelle gener som er av interesse), er det v…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Ms Tan Shi Min, Ms Helen Ong, og Dr. Zhao Yi for å hjelpe med kapillær gel elektroforese eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av NMRC / IRG gi NMRC / 1314/2011 og MOE AcRF Tier 2 Fund bevilgning MOE2011-T2-1-051.
HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |