Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze voor herhaalde metingen van ventilatie en respiratoire spieractiviteit in vrij gedragen amyotrofische laterale sclerose (ALS) muismodel gedurende ziekteprogressie met hele-lichaamsplethysmografie en elektromyografie via een geïmplanteerde apparaat telemetrie.
Abstract
Hulpademhalingsspieren helpen om de ventilatie te behouden wanneer diafragma functie wordt aangetast. Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor herhaalde metingen gedurende weken of maanden accessoire ademhalingsspieren activiteit tegelijkertijd meten ventilatie in een niet-verdoofde, vrij gedragen muis. De techniek omvat de chirurgische implantatie van een radiozender en het inbrengen van de elektrode leidt naar de ongelijkzijdige en trapezius spieren elektromyogram de activiteit van deze ademhalingsspieren te meten. Ventilatie wordt gemeten door het gehele lichaam plethysmografie en dierlijke beweging wordt bepaald door video en wordt gesynchroniseerd met elektromyogram activiteit. Metingen van spieractiviteit en ventilatie in een muismodel van amyotrofische laterale sclerose worden gepresenteerd om te laten zien hoe deze tool kan worden gebruikt om hoe de ademhalingsspieren activiteit veranderingen in de tijd te onderzoeken en om de impact van spieractiviteit op ventilatie te beoordelen. De beschreven werkwijzen kunnen easily worden aangepast aan de activiteit van andere spieren te meten of accessoire ademhalingsspieren activiteit in aanvullende muismodellen van de ziekte of letsel te beoordelen.
Introduction
Hulpademhalingsspieren (ARM) te verhogen ventilatie in tijden van grote vraag (bijvoorbeeld lichaamsbeweging) en helpen om de ventilatie te behouden wanneer diafragma functie in het gedrang komt na letsel of ziekte 1, 2. Hoewel veranderingen in diafragmafunctie zijn goed beschreven in amyotrofische laterale sclerose (ALS) en muismodellen 3, 4, 5, 6, veel minder bekend over de activiteit of functie van wapens in ALS. Echter, een studie suggereert dat ALS patiënten die ARMs werven hebben een betere prognose dan die met vergelijkbare diafragma dysfunctie die dat niet doen 7. Verder ARM activiteit voldoende is voor ademhaling in geval van membraan 8 verlamming. Deze studies geven aan dat strategieën om ARM functie vergroten breathi kan verbeterenng bij patiënten met neuromusculaire ziekten, ruggenmergletsel of andere aandoeningen waarbij diafragmafunctie wordt aangetast. Echter, de mechanismen die ARM werving voor ademhalen zijn grotendeels onbekend. Methoden om de respiratoire functie en veranderingen in de ARM-activiteit na verloop van tijd in diermodellen van de ziekte of verwonding nodig zijn om te bestuderen hoe armen worden aangeworven te meten, alsook om therapieën te evalueren ARM werving en de ventilatie te verbeteren. Bovendien kan de verhoogde activiteit van wapens samenvalt met het progressieve verlies van diafragmafunctie een nuttig biomarker voor ziekteprogressie bij neuromusculaire ziektes zoals ALS 7, 9, 10 zijn.
Dit protocol beschrijft een werkwijze om niet-invasief (na de initiële operatie) een aantal malen meet de activiteit van de ademhalingsspieren en ventilatie in wakkere, gedragen muizen. Gesynchroniseerde opnames van elektromyograafy (EMG), het hele lichaam plethysmografie (WBP) en video laat de onderzoeker hoe veranderingen in armbeweging effect ventilatie beoordelen en te bepalen wanneer de patiënt in rust of bewegen. Een belangrijk voordeel van deze werkwijze is dat deze kan worden uitgevoerd in wakkere, gedragen muizen, terwijl sommige alternatieve methoden voor het meten EMG vereist anesthesie en / of terminalprocedures 11, 12, 13. Het opnemen van EMG-activiteit in wakkere muizen tijd kan ook worden bereikt door het chronische implantatie van EMG leidt, wanneer de muis wordt gebonden door draden aan het acquisitiesysteem 14, 15. Omdat vastmaken van een muis kunnen interfereren met normale ontwikkeling of het gedrag en kunnen niet compatibel met standaard plethysmografie kamer zijn de beschreven werkwijze gebruikt telemetrietoestellen het EMG signaal naar het acquisitiesysteem draadloos te verzenden. De zender kanin- of uitschakelen met een magneet om stroom te besparen en maakt herhaalde metingen van EMG-activiteit gedurende enkele maanden. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om de activiteit van additionele respiratoire of niet- ademhalingsspieren te meten door het plaatsen van de EMG leidt naar verschillende spieren. Als alternatief, één van de twee leidingen kan worden toegepast om EEG-activiteit meten slaaptoestand beoordelen of epileptische activiteit 16 te identificeren. Deze techniek is met succes gebruikt om veranderingen in ARM-activiteit in rust gedurende progressie van de ziekte in een muismodel van ALS te meten en om de belangrijkste neuronen rijden ARM-activiteit in gezonde muizen 10 te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele procedures werden goedgekeurd door de Medisch centrum Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Cincinnati Children's en uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Voorbereiding van telemetrieapparaat Implantaatchirurgie
- Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (dat wil zeggen, scrubs, overschoenen, toga, haar net, masker en chirurgische handschoenen).
OPMERKING: Deze operatie vereist een steriel veld. - Schakel de incubator (servogestuurde bevochtiger / baby incubator ingesteld op 29 ° C) en overeenstemming met droge, witte handdoeken om een goede opwarming hersteltijd te geven.
- Vóór de operatie, steriliseren alle chirurgische instrumenten met ethyleenoxide en steriliseer de zender met een enzymatisch reinigingsmiddel en chemisch steriliserend (of zoals gespecificeerd door de fabrikant) vóór gebruik.
OPMERKING: Chirurgische instrumenten moeten omvatten # 2 laminectomie pincet (standaard tips / straight / 12 cm) (x4), smallepatroon tang (gekartelde / gebogen / 12 cm), weefsel scheiden schaar (recht / stomp-stomp / 11,5 cm) en een scalpel houder en blade. Het wordt aanbevolen om een aparte set van gesteriliseerde instrumenten (twee # 2 pincet en een schaar) exclusief voorbehouden voor de behandeling van de draden van de zender naar de chirurgische instrumenten in goede conditie te houden. - Steriliseren alle oppervlakken binnen het operatiegebied met een aanvaardbare desinfectiemiddel. Plaats een stereo-dissectie microscoop, isofluraan verdoving machine, chirurgische instrumenten, en scheren in het chirurgische veld (zie de tabel van Materials).
- De muis lichaamstemperatuur te handhaven terwijl onder verdoving plaats een verwarmingskussen of water deken onder de steriele doek voor de stereo dissectie microscoop.
- Zorgen dat de zender volledig functioneel voor gebruik.
OPMERKING: Een kleine magneet geplaatst binnen 2 in de zender om het toestel aan en uit. Wanneer de zender is ingeschakeld en die dicht bij rbdio ingesteld op 500 Hz AM frequentie, zal een ononderbroken hoge pieptoon zoemend geluid uitzenden. Om de batterij te sparen, schakelt de batterij uit voordat implanteren in het dier. - Bereid de elektrodeleidingen voor de operatie door het trimmen van de distale draden met een schaar gereserveerd voor de behandeling draden zodat er ongeveer 3 cm van lood (genoeg om het bereiken doelspier) (Figuur 1A). Alternatief spoel de draden proximaal van de inrichting hecht ze met hechtingen zodat er ongeveer 3 cm afgewikkeld lood.
OPMERKING: Sla de afgeknipt deel van de elektrodeleidingen om "lead caps" (kunststof geïsoleerde omhulling) te bereiden, zoals beschreven in stap 1.9. In stap 3, wordt de zender draden worden ingebracht door de spier, zodat de distale blootgestelde deel van de draden moeten worden vastgehouden en geïsoleerd met lood caps. - Met een scalpel 0,5 cm van de kunststof die gesneden moet zonder dat de draad zelf. Gebruik de hulpmiddelen gereserveerd for wire handling aan de uiteinden van de geleiders 4 strekken - 5x hun oorspronkelijke lengte, zodat ze gemakkelijk passen in een 25-gauge naald (Figuur 1B-B ''). Snijd de kerndraad van de draden zodat ze 0,5 cm lang.
- Bereid lood kappen (plastic buizen om de draad te bedekken uiteinden) voor de operatie. Met een scalpel gesneden moet 0,25 cm-lange buizen van kunststof omhulsel dat de segmenten van elektrodedraden opgeslagen uit stap 1.7.
OPMERKING: Vier lead caps zijn vereist voor elke muis die de implantatie zal ondergaan, maar het is het beste om twee keer de benodigde hoeveelheid caps voor te bereiden. Het hebben van extra steriel bereid lead caps is nuttig voor het geval dat het beveiligen van een lead cap is niet succesvol bij de eerste poging. - Het serienummer van het ingebrachte zender en sla de originele verpakking met de geijkte gegevens. Elke zender heeft verschillende frequentie kalibraties voor EMG opname; voer deze in de acquisitie software om aanvaardbare EMG verkrijgenopnames.
2. Voorbereiden van de muis voor Surgery
- Kies de muis voor implantatie (bijv SOD1 (G93A) of controle) en wegen van de dieren.
OPMERKING: De aanbevolen leeftijd en gewicht voor een muis (man of vrouw) deze operatie ondergaan is P56 - P120 en ≥ 24 g, respectievelijk. - Verdoven de muis onder 3,5% isofluraan met 2 l / min zuurstof stroomsnelheid. Voer een teen knijpen en een staart knijpen om ervoor te zorgen dat de muis is volledig verdoofd.
- Eenmaal verdoofd, verwijder de muis van de brievenbus en onderhouden anesthesie via een neuskegel door de isofluraan niveau tot 1,5% en het zuurstofdebiet tot 1 l / min. Voer een teen knijpen en / of de staart knijpen om ervoor te zorgen dat de verdoving wordt gehandhaafd.
- Breng smeermiddel oogzalf om te voorkomen dat de ogen uitdrogen tijdens de operatie.
- Scheren de muis om een chirurgische plaats tussen de nek en schouders (figuur 1C) bloot te leggen.
- Alternate zwabberen de chirurgische site, eerst met een ontsmettingsmiddel en vervolgens met isopropanol. Herhaal dit nog 2 keer.
3. Het implanteren van de telemetrie-inrichting voor opnemen en Scalene Trapezius EMG Activity
- Leg het dier onder een dissectie microscoop op zijn kant op een steriele pad die een verwarmingselement en zet de neusconus vast met tape. Merk op dat het het beste is om de juiste kant te implanteren om ECG signaal afkomstig van het hart te verminderen.
LET OP: Controleer ademhaling en pas de isofluraan levels, indien nodig, om een normale ademhalingsfrequentie en passende chirurgische vlak van anesthesie te handhaven. - Trek de voorpoot in de richting van de ipsilaterale voet langs de romp.
LET OP: Deze positie verdringt het schouderblad caudaal, het leveren van chirurgische toegang tot de scalene en trapezius spieren.- Neem de stompe gebogen tang, hinderen de voorpoot ipsilaterale op de chirurgische lokatie, en plak de poot genomen (figuur 1C). Gebruik sterke lijm chirurgische tape om ervoor te zorgen dat de poot is veilig voor de duur van de procedure.
- Zet op een vers paar chirurgische handschoenen. Met de scalpel een schuine snede ongeveer 2 cm lang te maken tussen de schouder en het oor (rode lijn in figuur 1C).
- Met behulp van twee nr.2 laminectomie tang, een in elke hand, trek de vetkussentje en uit elkaar en de monnikskapspier platysma spieren aan de fascia over de sternocleidomastoideus en scaleni (Figuur 1 D en E) bloot te leggen.
- Gebruik de bleke sternocleidomastoideus en diafragma zenuw als oriëntatiepunten voor de scaleni identificeren. Merk op dat het diafragma zenuw evenwijdig aan de scaleni loopt, terwijl de sternocleidomastoideus ligt Inferior. De scaleni werking schuin van de halswervels de ribben onder de trapezius. Biopotentiaal leidingen worden ingebracht in de voorste scalenus spier, die kan worden geïdentificeerd als de spier die naast de middenrifzenuw (Figuur 1 F en G) verloopt.
LET OP: Let op. Dit gebied is vaatrijke, en de zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat het snijden van de subclavia. Beschadiging van de zenuw diafragma en armvlecht. - Zodra de ongelijkzijdige en trapezius spieren geïdentificeerd (Figuur 1G), maak een subcutane pocket voor de zender op de rug van het dier tussen de schouderbladen.
- Met het weefselopname scheiden schaar, plaatst de stompe uiteinden van de schaar net onder de huid en verspreiden totdat een uitsparingsopening die ongeveer 1,25 maal de breedte van de zender wordt gevormd (Figuur 1H).
NB: De zender moet worden ingevoegd met minimale weerstand, maar de pocket moet niet zo groot dat de zender kan bewegen op zijn eigen. Als de zak te klein is, kan de zender wrijven tegen de huid, waardoor irritatie die het dier kan aanzetten om de huid beschadigen en / of Leidingen buiten. Indien de kamer te groot is, kan seromas vormen of de zender kan migreren naar een ongunstige positie.
- Met het weefselopname scheiden schaar, plaatst de stompe uiteinden van de schaar net onder de huid en verspreiden totdat een uitsparingsopening die ongeveer 1,25 maal de breedte van de zender wordt gevormd (Figuur 1H).
- Spoelen met warme steriele zoutoplossing en voeg de zender met de vlakkere kant tegen de spier. Plaats de zender zodanig dat deze vlak ligt en de kabels komen uit de holte evenwijdig aan elkaar in plaats van gedraaide (Figuur 1I). Krul overtollige stuk draad onder het apparaat en leg het plat.
- Draaien Kabels van de zender naar de ongelijkzijdige en trapezius spieren, zodat de twee stellen geleiders bipotentiële plat en evenwijdig aan elkaar.
- Met de laminectomie tang om de voorste ongelijkzijdige gescheiden van de omringende spieren en plaats een 25-gauge naald door de ongelijkzijdige muscle, loodrecht op de spiervezels.
- Plaats een leiding in de punt van de naald en trek de naald uit de spieren, met achterlating van de ingebracht in de spier tot de isolatie van de draad (Figuur 1J en K) leiden. Record die gekleurde draden waarin de spieren worden ingevoegd.
- Plaats een kleine druppel cyanoacrylaat kleefmiddel op het blootgestelde uiteinde van de draad nabij de spier waar de leiding wordt ingebracht, snel en schuif de leiding dop over de draad zodat geen draad bloot tussen de centrale kap en de spier (figuur 2A en B).
OPMERKING: Hoewel het een aanvaarde praktijk te beveiligen EMG leidt met cyanoacrylaat 17, 18, een alternatieve methode als leidende kap vast te zetten door het leggen van een knoop zijden hechtdraad eromheen. - Knip het draad distaal van de dop en een druppel cyanoacrylaat kleefmiddel op het einde van de leiding cap / draad. Geef de lijmtijd polymeriseren alvorens los (figuur 2C en D).
- Volgt dezelfde stappen (stappen 3,10-3,12) naar de tegengestelde polariteit leiding parallel aan de eerste in dezelfde spier plaatst, 1-2 mm vanaf de eerste geleider.
- Herhaal stap 3,10-3,12 leads in de trapezius, gelegen anterieure de scalenus spier (figuur 1 L en M) invoegen.
- Waarborgen dat de draadgeleiders hun plaats worden gefixeerd en dat er maar genoeg speling in de toevoerleidingen voor het dier om lichaamsbewegingen te voeren zonder het trekken aan de kabels. Zorgen dat de overtollige lengte van de leiding niet duwen tegen de huid, aangezien dit irritatie die het dier kan aanzetten tot nul of Leidingen eruit kan veroorzaken. Verplaats de leads, indien nodig, om eventuele hinder te voorkomen.
- Verwijder de tape ingedrukt houden van de voorpoot. Trek het vetkussentje terug over de spieren en gebruiken om de ingebrachte leidingen dekken. Sluit de incisie met cyanoacrylaat kleefmiddel door plagende huid flappen elkaar, zodat de insnijding lijnen. Knijpen een gedeelte van de huid flappen samen met de gebogen pincet en breng een kleine lijn cyanoacrylaat kleefmiddel langs deze lijn.
- Injecteer 0,1 ml subcutaan carprofen voor verlichting postoperatieve pijn terwijl het dier nog onder narcose.
LET OP: Ga door met 0,1 ml van carprofen eenmaal per dag toe te dienen voor 1 - 2 dagen na de operatie, en vervolgens als dat nodig is na dat. - Verwijder het dier uit de neuskegel en plaats het in een schone kooi in de voorverwarmde incubator tot het dier wakker en bewegen de kooi vrijwillig. Houd het dier in de incubator gedurende ten minste 15 minuten daarna, toezicht op de bewegingen en alertheid.
4. postoperatieve zorg
- Huis dieren afzonderlijk na de operatie. Zorg voor het helen van dieren met een dieet gel en een fles water.
- Monitor het dier voor de eerste 30 minuten na de operatie. Controleer op de dieren die ten minste elk uur fof 5 uur na de operatie. In de dagen na de operatie, controleer minstens tweemaal per dag.
- Letten necrose, infectie langs de incisie en in de lichaamsholte met het implantaat (dat wil zeggen, warmte, zwelling en roodheid), en de vorming seroma.
LET OP: deze tekenen zich voordoen binnen de eerste week na de operatie. Een gezond genezen dier een maand na de operatie is weergegeven in figuur 1 N. Hoewel EMG opnamen onmiddellijk na de implantatie kunnen worden gemaakt, worden de dieren waaraan ten minste een week genezen voor het opnemen en EMG plethysmografie, zoals ECG-signalen direct na implantatie hoog zijn.
5. Gelijktijdige verwerven Elektromyografie en plethysmografie Signalen
- Zet alle acquisitie apparatuur, waaronder vooringenomenheid flow.
OPMERKING: De stroomsnelheid van muizen doorgaans ingesteld op 1,0 l / min. - Kalibreer de plethysmografie kamer (s) met een stromingsmeter.
OPMERKING: Controleer regelmatig de plethysmografie chambers zodat de afdichtingen niet gebarsten of gebroken. Bekleden van een week de rubberen afdichtingen met een smeermiddel zoals vacuüm vet eenmaal hun goede conditie te houden. - Input zender kalibratie zoals gespecificeerd door de fabrikant.
- Plaats de muis in het plethysmografie kamer gedurende ten minste 1 uur te acclimatiseren voorafgaand aan opname EMG en plethysmografie. Het gebruik van meerdere kamers is het mogelijk om op te nemen van één muis terwijl de volgende muis acclimatiseren in een tweede kamer. Niet inschakelen van de zender in de acclimatiseringsperiode om batterijvermogen (Figuur 1O) behouden.
- Voorafgaand aan de opname (maar na ijking), zet de zender door een sterke magneet binnen 1 in de geïmplanteerde dieren; een rood licht op de voorzijde van de ontvanger bevestigt de zender is ingeschakeld.
- Begin acquisitie met behulp van het pulldown menu label "Acquisition" en kies "Start Acquisition." Hoewel de opnameduur kanvariëren per experiment een typische plethysmografie en EMG opname duurt 1-3 uur.
NB: De zender heeft een intrinsieke bemonsteringssnelheid van 240 Hz. Een hogere snelheid van 500 Hz ligt in de software interpoleren tussen punten en een gladdere golfvorm. Het laagdoorlaatfilter (dat dient als een anti-alias filter) en het hoogdoorlaatfilter in het implantaat geef de 1- en 50-Hz bandbreedte voor deze telemetrie-inrichting. 60 Hz A / C storing niet bijdragen tot overmatige ruis in het EMG-signaal, omdat de implantaten batterijen en het dier beschermt het implantaat en leidt van elektrische velden. Plethysmografie, EMG en video worden automatisch gesynchroniseerd in real time via acquisitie software. - Wanneer acquisitie is voltooid, schakelt de zender met een magneet en verwijder het dier uit de kamer.
- Wanneer aanhechten andere opname, reinigen van de kamer, voert de nieuwe zender kalibraties uit de volgende dierlijke en begint de tweede opnamelaag. Als finished door overname van de dag, schakelt de zender plethysmografie reinigen van de kamer, en schakel alle acquisitieapparatuur en de voorspanning stroom.
Figuur 1. Implantatie van telemetrieapparaat tot ademhalingsspieren EMG meten. (A) telemetriezenders met twee paar biopotentiaal tot EMG meten. Leads kunnen worden bijgesneden tot de gewenste lengte (onder) of opgerold en verscholen onder de zender (boven). (B) Zender leidt. (B) leidt met afgeknipt kunststof isolatie om de draden bloot en lood caps (inzet). (B ') leidt met draden gestrekt 4 - 5x hun oorspronkelijke lengte. Leidingen moeten worden ontdaan, zodat zij 0,5 cm lang (niet getoond). (C) Mouse voorbereid voor de operatie, met de geschoren chirurgische plaats en correctgepositioneerd voorpoot. De rode stippellijn geeft de incisie. (D) oppervlakkige spieren zich onder het vetkussentje en fascia, gezien na de eerste incisie. T = trapezius. S = sternocleidomastoid. P = platysma. Gele pijl = middenrifzenuw. (E) cartoon diagram van de spieren en diafragma zenuw getoond in (D). Tang moet worden gebruikt om uit elkaar van de trapezius en platysma spieren naar de diepere scalenus spier, getoond in (F) en (G) te bereiken. (F) Landmarks gebruikt om de locatie van de ongelijkzijdige en trapezius identificeren. Deze afbeelding toont de arteria subclavia (witte pijl), de middenrifzenuw / brachiale plexus (zwarte pijl), en het bleek sternocleidomastoideus (gele pijl). (G) Cartoon die de locatie van de diepere spieren (dat wil zeggen, midden scalene, anterior ongelijkzijdige en SCM), subclavia, en diafragma zenuw. De achterste gelijkzijdig is niet zichtbaar. Deze kunnen alleen worden geopend wanneer de Superficial spieren (in D en E) worden gespreid. (H) Het maken van een vak voor de zender met het stompe uiteinde schaar. (I) ingevoegd zender in de subcutane pocket, met de parallel geplaatste geleiders die uit de zak. (J) Insertie van de 25-gauge naald in de scalene, loodrecht op de spiervezels, een tunnel voor de verbindingsdraad maken. (K) Beide geleiders ingebracht in de scalenus spier. Lood caps staan uiteinde en vastgelijmd. (L) Insertie van de 25-gauge naald in de Monnikskapspier, loodrecht op de spiervezels, een tunnel voor de verbindingsdraad maken. (M) De vier geleiders ingebracht in de monnikskapspier en scaleni en plat vóór het sluiten van de incisie. (N) volledig teruggewonnen muis, de zender zich subcutaan op de rug. (O) Gelijktijdig opnemen plethysmografie, spier-EMG-activiteit, eennd videosignalen via plethysmografie kamer (gele pijl), telemetrie ontvangende pad (rode pijl) en camera (zwarte pijl), respectievelijk. Een multifunctionele voorspanning stroom is verbonden met de plethysmografie kamer via een kunststofbuis (blauwe pijl) om zuurstof te leveren aan de muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. beveiligen Lead Caps met Cyanoacrylaat Adhesive. (A) Breng een kleine druppel cyanoacrylaat (paarse cirkel) aan de kerndraad van de elektrodeleiding (E) draad proximaal van de spier. (B) snel glijden de bereide leiding kap (LC) op de blootgelegde draad over het cyanoacrylaat kleefmiddel zodat de leiding dop gepositioneerd direct grenzend aan de spier. (C) Snij een klein gedeelte van het distale einde van de leiding dop en kabel zodat er geen zichtbare elektroden aanwezig zijn die niet is geïsoleerd met kunststof. (D) Breng een kleine druppel cyanoacrylaat lijm aan het einde van de leiding dop. Verwijder het afgeknipt distale einde van de leiding dop van het dier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6. Analyse van ARM EMG en plethysmografie
- Open de analyse software en het dossier van belang te beoordelen (ga naar "File" en kies "Open beoordeling file"). Filter de EMG-signalen met behulp van een 30-Hz high-pass filter door met de rechtermuisknop te klikken op het EMG sporen, te kiezen voor "Analyse attributen," aandacht voor de "Advanced Attributen 1" tab, en het veranderen van het high-pass filter tot 30 Hz.
OPMERKING: Dit filter verwijdert de stap van niet-discrimineren, laagfrequent informatie. Lokaliseren gebieden van muis inactiviteit door visuele inspectie op basis van het gebrek aan beweging in de gesynchroniseerde video-bestand en het ontbreken van grote, onregelmatige drukveranderingen als gevolg van beweging in de plethysmografie trace (rode doos in figuur 3A); inactiviteit treedt op wanneer de muis in slaap of wakker, maar nog steeds is. - Identificeer EMG periodes onafhankelijk voor elke spier.
- Rectificatie en het gefilterde EMG signaal integreert dan 30 ms (Figuur 4).
Opmerking Omdat muizen ademen met een snelheid van 3 Hz, is elke ademhaling voorgesteld met ongeveer 11 geïntegreerde waarden. - Bepaal de basislijn EMG amplitude door het middelen van de gelijkgericht en geïntegreerd behorende bij het EMG-signaal gedurende 3 sec wanneer de muis inactief en plethysmografie tracering toont eupnea (normale ademhaling) (figuur 4).
- Identificeren "aanvallen" activiteit gedefinieerd door ten minste 3 opeenvolgende gelijkgerichte en geïntegreerde waarden die ten minste 5 zijn0% toename boven de basislijn EMG signaal (bepaald in stap 6.3.2).
OPMERKING: Drie opeenvolgende waarden vertegenwoordigen een 90 ms venster, maar sommige periodes zal meer dan 3 waarden boven de drempel bevatten en zal langer duren dan 90 ms. - Met de gesynchroniseerde video- en plethysmografie trace aanvallen die optreden tijdens zucht (figuur 3B) te sluiten; snuiven (Figuur 3C); of volitionele muisbewegingen, zoals hoofd draaien of verzorgen.
- Herhaal stap 6.3.1 - 6.3.4 voor de tweede spier.
- Rectificatie en het gefilterde EMG signaal integreert dan 30 ms (Figuur 4).
- Bereken de bout frequentie voor elke spier. Opname a) de begintijd en eindtijd van elke actieve periode en b) hoe lang elke wedstrijd bij gebruik van het bovengenoemde criteria. Som de totale inactieve tijd. Verdeel het totale aantal periodes van het totale min inactieve tijd in de loop van de opnamesessie op het gevecht frequentie te berekenen.
- Bepalen of veranderingen in de ventilatie zijn geassocieerd met de activering van de opgenomen muscles.
- Selecteer de ademhaling te meten parameters (bijvoorbeeld, piek inspiratoire flow, ademvolume, minuutvolume en ademhalingen per minuut).
LET OP: Alle mogelijke keuzes zijn te vinden in de P3 Setup pulldown menu onder "afgeleide parameters." - Identificeer de adem die tijdens bout EMG-activiteit en de ademhaling die tijdens EMG basislijnactiviteit (figuur 4).
- Maak parser segmenten overspannen plethysmography ademhalingen die worden geassocieerd met EMG bout activiteit en het creëren van onafhankelijke parser segmenten die in verband worden gebracht met een uitgangswaarde van EMG-activiteit. Zorg ervoor dat het type analyse op te zetten "parser Seg."
LET OP: Deze selectie is te vinden in de P3 Setup pulldown menu onder "Data Reduction Setup." - Markeert het begin van elk parser segment met een althans door rechts te klikken op het spoor plethysmografie. Geef een bout die parser segmenten "Event 1" in het dropdown menu specify de basislijn parser segmenten als "Event 2" naar de twee soorten segmenten.
- Onder het menu "functies", sla de "Merken Section" en "Marks afgeleide gegevens." Onder het menu Gegevens Parser, sla de "Parsed review File" en "Parsed afgeleide gegevens."
LET OP: De geselecteerde ademhaling parameters voor elke individuele adem zijn te vinden in de Marks afgeleide gegevens sheet in het tabblad "Derivations." - Vergelijk de ademhalingsparameters van ademhalingen die tijdens ARM periodes (gemarkeerd als Gebeurtenis 1) versus ademhalingen die tijdens basislijnactiviteit (aangeduid als Event 2) om te bepalen of spieractiviteit wordt geassocieerd met veranderingen in ventilatie.
- Selecteer de ademhaling te meten parameters (bijvoorbeeld, piek inspiratoire flow, ademvolume, minuutvolume en ademhalingen per minuut).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven protocol werd gebruikt om een telemetrie-inrichting implanteren en ongelijkzijdige en trapezius EMG WBP en video van een SOD1 (G93A) ALS muismodel nemen. Perioden waarin het dier inactief (bijvoorbeeld niet beweegt) werden geïdentificeerd via de video-opname en bevestigd door het ontbreken van beweging-gerelateerde activiteit in de WBP trace (Figuur 3A). Inactieve perioden omvatten tijd doorgebracht in REM of non-REM-slaap, evenals tijd wakker, maar nog steeds (Figuur 3A). EMG-activiteit tijdens deze inactieve periode werd gescoord als bout wanneer ten minste 3 opeenvolgende gelijkgerichte en geïntegreerd (meer dan 30 ms) waarden hadden amplitudes van ten minste een toename van 50% boven de basislijn EMG niveaus (figuur 4). Periodes activiteiten die tijdens zucht of snuiven (bepaald door plethysmografie) of volitionele bewegingen (bepaald door video) werden uitgesloten van de analyse (figuur 3B-C). SOD1 (G93A) muizen early- tot half-symptomatische stadium (tabel 1) vertonen periodes van verhoogde armbeweging rusten die laatste een tot meerdere ademhalingen (figuur 4). Periodes van ARM activiteit zeldzaam in presymptomatische SOD1 (G93A) (Figuur 3A) of wildtype muizen 10.
| Stadium | Staat | Stage Onset | achterbeen Presentatie |
| 0 | Pre-symptomatische | <P100 | Geen opmerkelijke verschillen in vergelijking met wildtypes. |
| 1 | begin van de ziekte | ~ P100 | Achterbeen samengevouwen wanneer muis opgehangen staart. |
| 2 | parese | ~ P120 | Gehele of gedeeltelijke achterbeen instorting met verschijning van tremor. | </ Tr>
| 3 | verlamming onset | ~ P140 | Moeite met lopen, teen curling en / of met de voet te slepen. |
| 4 | geavanceerde verlamming | ~ P150 | Minimale gezamenlijke beweging, achterbeen niet worden gebruikt voor voorwaartse beweging. |
| 5 | Eindfase | ~ P160 | Mouse niet in staat om recht zelf van kant binnen 30 seconden. |
Tabel 1. Neurologische Scoring van ALS-achtige ziekteprogressie SOD1 (G93A) muizen.
Figuur 3. Representatieve WBP en EMG sporen. (A - C) WBP en EMG van ongelijkzijdige en trapezius spieren van een pre-symptomatische SOD1 (G93A) muis (leeftijd P98). (A) Perioden wanneer t Hij dier in rust (rode doos) worden gebruikt voor analyse. Sporen buiten de rode doos tonen grote en onregelmatige pieken in de plethysmografie sporen en spieractiviteit in EMG sporen, kenmerkend wanneer een dier beweegt, zoals bepaald met gesynchroniseerde video-opnamen (niet getoond). De rode doos toont EMG sporen ontbreekt EMG periodes, kenmerkend voor een pre-symptomatische muis. (B) Bouts van EMG-activiteit frequent optreden direct voorafgaand aan een zucht (zoals in de plethysmografie sporen). Zucht worden gekenmerkt door hoge-amplitude inspiratie gevolgd door dramatische verlopen. De zwarte pijlpunt wijst naar een karakteristiek ECG-signaal. (C) Bouts van EMG-activiteit vaak voorkomen als de muis snuiven. Snuiven blijkt uit de sporen plethysmografie een langdurige toename van zowel frequentie als amplitude over meerdere ademhalingen (co voorkomende met vele verschillende EMG-activiteit).color = "# 0066CC"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Scoring Bouts van EMG-activiteit. (A en B) Twee voorbeelden van WBP, gefiltreerd Monnikskapspier EMG sporen en gelijkgericht en geïntegreerd Monnikskapspier EMG signalen van een symptomatische SOD1 (G93A) muizen (leeftijd P126). Blauwe gestippelde lijnen geven basislijn EMG-niveau, bepaald door het middelen gelijkgericht en geïntegreerd signalen over een tijdsperiode van 3 seconden. Rode gestippelde lijnen geven een toename van 50% boven de basislijn amplitude EMG-activiteit. Een aanval activiteit wordt gescoord wanneer tenminste 3 opeenvolgende gelijkgerichte en geïntegreerde overschrijden van 50% basislijn drempel. Klik hier om al te bekijkenArger versie van deze figuur.
| PIF (ml / s) | TV (ml) | MV (ml / min) | Ademhalingsfrequentie (ademhalingen / min) | |
| Naïeve (n = 5) | 4,4 ± 0,7 | 0,27 ± 0,04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Geïmplanteerd (n = 4) | 4.1 ± 0.2 | 0,27 ± 0,11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P-value | 0,439 | 1.000 | 0.893 | 0.410 |
| De getoonde waarden weerspiegelen gemiddelde ± SD. P-waarden werden berekend met de t-test van Student. | ||||
Tabel 2. Vergelijking van ademhaling tussen naïeve (niet geïmplanteerd) en geïmplanteerde Fase 4 SOD1 (G93A) muizen. Geen significante verschillen gevonden in de piek inspiratoire flow (PIF), ademvolume (TV), minuut volume (MV) of ademhalingen per minuut tussen de twee groepen. De getoonde waarden geven de gemiddelde ± SD. P-waarden werden berekend met de t-test van Student.
Herhaalde metingen van EMG en / of WBP kan worden gemaakt in dezelfde muis gedurende enkele maanden, met zeer weinig verandering in EMG-signaal of de uitgangswaarde na 1 tot 2 weken herstelperiode na de operatie. Het tijdsverloop wordt typisch beperkt door de batterij en dus wordt bepaald door de frequentie en de duur van de afzonderlijke opnamen. Onderzoekers moeten zich ervan bewust dat de bijwerkingen als gevolg van het geïmplanteerde apparaat af en toe kan optreden. De muis kan trek de draden van de geïmplanteerde spier of kras / kauwen op de huid als de leidingen en verzendenter zijn niet goed geplaatst. In de meeste gevallen, ethische overwegingen dicteren dat deze dieren worden opgeofferd. De zender kan worden verwijderd, gesteriliseerd en opnieuw geïmplanteerd in een muis.
Dat implantatie verifiëren geen invloed ademhaling werden plethysmografie metingen tussen naïeve SOD1 (G93A) muizen (niet geïmplanteerd) in stadium 4 en ALS geïmplanteerd SOD1 (G93A) muizen ALS stadium 4 vergeleken. Geen significante verschillen gevonden in de piek inspiratoire flow (PIF), ademvolume (TV), minuut volume (MV) of ademhalingen per minuut tussen de twee groepen (tabel 2). De ongelijkzijdige en Monnikskapspier liggen naast elkaar en zijn direct tegen elkaar. Hoewel simultane EMG periodes soms worden waargenomen in beide spieren, zijn sterke EMG periodes ook gedetecteerd in de Monnikskapspier wanneer EMG periodes afwezig in de ongelijkzijdige (en vice versa), waaruit blijkt dat er een minimale overspraak tussen elektrodes geïmplanteerd in elke spier. Onafhankelijk aanvallen van EMG-activiteit worden ook waargenomen wanneer leads in de trapezius en sternocleidomastoideus spieren worden geplaatst (gegevens niet getoond).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De procedure hier gedemonstreerd maakt de invasieve (na initiële chirurgische implantatie van de zender) meten van respiratoire spieractiviteit en ventilatie gedurende vele maanden in hetzelfde dier. Deze techniek heeft een aantal voordelen ten opzichte van standaard EMG technieken geanesthetiseerde muizen: 1) de experimenten hebben minder muizen en bieden de mogelijkheid om gegevens van dezelfde plaats nemen in een enkele muis in ziektestadia (in plaats van verschillende muizen op verschillende ziektestadia); 2) signalen kan worden uitgevoerd met krachtigere statistische tests (dwz, herhaalde metingen gebruikt in plaats van vergelijking van afzonderlijke experimentele groepen); 3) de gelijktijdige registratie van EMG en WBP maakt de directe beoordeling van de effecten van armbeweging op ventilatie; en 4) de experimenten kan worden uitgevoerd op muizen in verschillende staten van de slaap / wakker zijn. Omdat bovendien gezonde muizen een zeer lage frequentie van ARM aanvallen in rust is deze techniek caPable detecteren zelfs kleine veranderingen in de frequentie van ARM activiteit bij ALS model muizen symptomatische vroege stadia van de ziekte 10. Omdat deze techniek meet de activiteit van een groot maar onbekend aantal spiervezels in natuurlijk gedrag, in plaats van na zenuwstimulatie op experimenteel gecontroleerde intensiteiten, is het niet geschikt voor het schatten van de grootte motoreenheid of nummer. Een andere beperking is dat telemetrie gebaseerde zenders geschikt is voor implantatie in muizen momenteel beperkt tot twee reeksen biopotentiaal geleiders; dus slechts twee plaatsen worden opgenomen van dezelfde muis. Voor experimenten waarbij de gelijktijdige registratie van meer dan twee spieren in dezelfde muis kunnen meerdere EMG leidingen geïmplanteerd en aangesloten op een acquisitiesysteem gebruik van een draad tether, zoals eerder beschreven 14, 15. Toch zou modificaties van de plethysmografie kamer of afdichtingen nodig zijn omvoor de gelijktijdige registratie van spieractiviteit en ventilatie als een muis wordt vastgebonden.
Bij toepassing van deze techniek bepaalde stappen van het protocol moet met zorg worden uitgevoerd. Biopotentiaal leidingen moeten worden geplaatst dat ze niet onbelemmerde beweging of irriteren de bovenliggende huid. Bovendien moet de zender worden geplaatst dat deze geen invloed op de normale beweging of houding van de muis. Het voorkeur dat de juiste plaatsing van leidingen (dat wil zeggen, volledig geïntegreerd in de juiste spieren niet raakt aangrenzende spieren) en het ontbreken van spierschade of infectie worden gecontroleerd door autopsie na het experiment werd beëindigd. Verder is het noodzakelijk dat de zender is uitgeschakeld na elke opname sessie om de batterij te sparen.
Een onvermijdelijk gevolg van het meten van EMG spieren in de borst halsgebied is de hoge kans op opname elektrocardiogram (ECG) signalen die het opnieuw verschijnengular spikes in de EMG trace (Figuur 3B, pijlpunt). ECG-signalen kan worden geminimaliseerd door zorgvuldige plaatsing van de leidingen zodanig dat alle metalen volledig is ingebed in de spieren en door het vermijden van de plaatsing in de buurt van grote bloedvaten. Implanteren leidt naar spieren aan de rechterzijde van het lichaam in plaats van links, die dichter bij het hart, kan verminderen ECG-signalen. Hoewel het ECG-signaal kan worden gefilterd uit EMG sporen via algoritmes of door het aftrekken van een onafhankelijke geregistreerde ECG-signaal 19, 20, 21 is niet typisch nodig. Het ECG-signaal kan gemakkelijk worden onderscheiden van het EMG-signaal door zijn regelmatige vorm, frequentie en amplitude.
De beschreven techniek is gebruikt om veranderingen in armbeweging rusten in de SOD1 (G93A) muismodel van ALS 10 meten. Hulpademhalingsspieren zijn ook gerekruteerd in othaar neuromusculaire aandoeningen (bijvoorbeeld, spierdystrofie, spinale spieratrofie, perifere neuropathieën, etc.) en na zenuw- of ruggenmergletsels. ARM activiteit kan daarom dienen als een proxy om functionele stoornissen van het membraan te meten en peilen naar de ernst van de ziekte, het toezicht op het herstel van een blessure, of te beoordelen potentiële voordelen van de behandeling om de ademhaling in een verscheidenheid van dierlijke ziekte of letsel modellen te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Steun voor dit werk werd geleverd door een Cincinnati Children's Hospital Medical Center Trustee Award uit aan SAC en een NIH training subsidie (T32NS007453) naar VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
- Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
- Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
- Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
- Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
- Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
- Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
- Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
- Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
- Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
- Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
- Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
- Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
- Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
- Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).
