Summary
本稿では、移植された遠隔測定装置を介して全身プレチスモグラフィと電と疾患の進行を自由に行動、筋萎縮性側索硬化症（ALS）のマウスモデルにおいて換気および呼吸筋活動の繰り返し測定のための方法を紹介します。
Abstract
アクセサリー呼吸筋は、絞り機能が損なわれたときに換気を維持するのに役立ちます。同時に、非麻酔に換気を測定しながら以下のプロトコルは、自由にマウスを行動、アクセサリー呼吸筋活動の数週間または数ヶ月にわたって繰り返し測定するための方法を記載しています。技術は、無線送信機の外科的移植を含み、電極の挿入は、これらの吸息筋の筋電活動を測定するために斜角と僧帽筋につながります。換気は、全身プレチスモグラフィにより測定され、動物の動きを映像によって評価され、筋電図活動と同期しています。筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルにおける筋活動と換気の測定は、このツールは、時間の経過とともにどのように呼吸筋活動の変化を調査するために使用することができ、換気の筋活動の影響を評価する方法を示すために提示されています。記載されている方法は、電子ことができますasily他の筋肉の活性を測定したり、病気やけがの追加のマウスモデルに付属呼吸筋の活動を評価するために適合させます。
Introduction
アクセサリー呼吸筋（腕が）高い需要（ 例えば、運動）の時代に換気を高め、絞り機能が損傷または疾患1、2次危険にさらされたとき、換気を維持するのに役立ちます。絞り機能の変化は十分にはるかに少ない筋萎縮性側索硬化症（ALS）の患者およびマウスモデル3、4、5、6、に記載されているが、ALSにおけるアームの活性または機能について知られています。しかし、一つの研究腕を募集ALS患者がないではない7と同様のダイヤフラム不全のものより良好な予後を持っていることが示唆されました。また、ARM活性がダイヤフラム麻痺8の場合には呼吸するのに十分です。これらの研究は、ARMの機能を強化するための戦略がbreathiを向上させる可能性があることを示します神経筋疾患、脊髄損傷、または絞り機能が損なわれている他の条件を患っている患者ではNG。しかし、呼吸のためのARM動員を制御するメカニズムは不明な点が多いです。病気や怪我の動物モデルで時間をかけて呼吸機能およびARM活性の変化を測定するための方法は、アームが募集されている方法を研究するだけでなく、ARM動員および換気を改善するための治療法を評価するために必要とされています。また、絞り機能の進行性の喪失と一致アームの増加した活性は、ALS 7、9、10のような神経筋疾患における疾患進行のために有用なバイオマーカーであり得ます。
このプロトコルは、（最初の手術後）非侵襲的にする方法を説明して繰り返し目覚め、行動マウスで呼吸筋や換気の活性を測定します。筋電の同期化の録音Y（EMG）、全身プレチスモグラフィー（WBP）、およびビデオは研究者は、ARM活性衝撃換気のどの変化を評価するために、被写体が静止し、または移動しているときを決定することを可能にします。この方法の主な利点は、EMGを測定するためのいくつかの代替方法は、麻酔を必要とする、および/または端末の手順11、12、13であるのに対し、それは、覚醒、行動マウスで行うことができることです。経時的な覚醒マウスにおけるEMG活動の記録は、マウスを捕捉システム14、15にワイヤにより係留されるEMGリードの慢性注入によって達成されてもよいです。マウスを係留する通常の移動や動作に干渉する可能性があり、標準のプレチスモグラフィーチャンバーと互換性がないため、記載された方法は、無線で収集システムにEMG信号を送信する遠隔測定装置を使用します。送信することができますバッテリ電力を節約するために磁石をオンまたはオフにし、数ヶ月にわたってEMG活動の繰り返し測定を可能にします。このプロトコルは、容易に異なる筋肉につながるEMGを挿入することによって、追加の呼吸器または非呼吸筋の活動を測定するように適合させることができます。あるいは、2点のリードの一方はスリープ状態を評価するために、または発作活動16を識別するために、EEG活性を測定するために使用することができます。この技術は、正常ALSのマウスモデルにおける疾患の進行を通して、安静時のARM活性の変化を測定し、健康なマウス10でARMの活動を駆動する重要な神経細胞を識別するために使用されてきました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
実験手順は、シンシナティ小児病院医療センター施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用のためのNIHガイドを遵守して行われました。
1.テレメトリデバイスのインプラント手術の準備
- 個人用保護具（ すなわち、スクラブ、靴カバー、ガウン、ヘアネット、マスク、手術用手袋）の上に置きます。
注：この手術は無菌フィールドが必要です。 - インキュベーター（29°Cに設定し、サーボ制御加湿器/乳児保育器）と回復のための適切な温暖化を可能にするために、乾燥、白いタオルで行をオンにします。
- 手術前に、エチレンオキシドとすべて手術器具を滅菌し、使用前に酵素洗剤及び化学滅菌剤（又は製造業者によって指定される）と送信機を滅菌します。
注：手術器具は＃2椎弓切除鉗子（標準のヒント/ストレート/ 12センチメートル）（X4）を含める必要があり、狭いですパターン鉗子（セレーション/湾曲/ 12でCM）、組織分離はさみ（直/ブラントブラント/ 11.5センチメートル）、及びメスホルダーとブレード。良好な状態で手術器具を維持するために送信機の配線を処理するために排他的に予約滅菌器（2つの＃2の鉗子やハサミ）の別のセットを持っていることをお勧めします。 - 許容される消毒剤で手術領域内の全ての表面を殺菌します。位置立体解剖顕微鏡、イソフルラン麻酔機械、手術器具、および手術野におけるバリカン（ 材料の表を参照のこと）。
- 麻酔下、立体解剖顕微鏡の前に無菌タオル下で加熱パッドまたは水ブランケットを配置しながら、マウスの体温を維持します。
- トランスミッタは使用前に完全に機能していることを確認してください。
注：送信機の中で2内に配置された小さな磁石がオンとオフデバイスを向けるだろう。送信機がオンで、RAに近接して保持されたとき500 HzのAM周波数に設定DIOは、連続、甲高いブンブン音を放出します。バッテリ寿命を節約するために、動物にそれを注入する前にバッテリーをオフにしてください。 - 電極は、（目標の筋肉に到達するのに十分な）リードの約3cm（ 図1A）が存在するようにワイヤを取り扱うために予約ハサミで遠位リードをトリミングすることによって、手術前につながる準備。代替的に、デバイスの近位ワイヤをコイルと解か鉛の約3cm存在するように縫合糸と一緒に結びます。
注：ステップ1.9で説明したように電極のトリミングオフ部分は、「リードキャップ」（プラスチック絶縁ケーシング）を調製するためにリード保存。ステップ3において、送信機リードので、筋肉を通って挿入され、ワイヤの先端露出部分が所定の位置に保持され、リード線キャップを使用して絶縁されなければなりません。 - ワイヤ自体を切断することなく、プラスチック被覆の0.5cmにトリミングするためにメスを使用。 foを予約ツールを使用してくださいRワイヤはリード4の端部を伸張する処理-彼らは25ゲージ針（ 図1B-B「」）の内部に容易に収まるように、元の長さは5倍。彼らは長さ0.5センチになるように、リード線の露出線をトリム。
- 手術前（プラスチックチューブは、ワイヤ端部を覆うように）リードキャップを準備します。電極のセグメントを囲むプラスチック筐体0.25センチ長い管をトリミングするためにメスを使用し、ステップ1.7から保存つながります。
注：4つのリードキャップは、移植を受ける各マウスに必要な、それはキャップの二倍に必要な量を用意するのが最善ですされています。追加の無菌調製リードキャップを有するリードキャップを固定する最初の試行に失敗した場合に有用です。 - 挿入された送信機のシリアル番号を記録し、較正情報を元のパッケージを保存します。各送信機は、EMGの記録のために異なる周波数較正を有します。許容EMGを取得するために取得ソフトウェアにこれらを入力します。レコーディング。
2.手術のためにマウスを準備
- 移植のために所望のマウス（ すなわち、SOD1（G93A）またはコントロール）を選択して、動物の重量を量ります。
注： - P120と≥24グラム、それぞれマウスのための推奨年齢と体重（男性または女性）、この手術を受けるには、P56です。 - 2リットル/分の酸素流量で3.5％イソフルラン下でマウスを麻酔。マウスが完全に麻酔をかけていることを確認するために、つま先のピンチとテールピンチを実行します。
- 一旦麻酔し、ドロップボックスからマウスを削除し、1 L /分の1.5％のイソフルランレベルを設定し、酸素流量によってノーズコーンを介して麻酔を維持します。麻酔が維持されていることを確認するために、つま先のピンチおよび/または尾のピンチを実行します。
- 手術中に乾燥から目を防ぐために、潤滑剤眼軟膏を適用します。
- 耳と肩（ 図1C）との間の手術部位を露出するために、マウスを剃ります。
- 代替イソプロパノールで最初に消毒剤で、次いで、手術部位を拭きます。さらに2回繰り返します。
3.録音不等辺及び僧帽EMG活性に対する遠隔測定装置を植え込みます
- 加熱パッドを覆う滅菌パッドの上にその側面に、解剖顕微鏡下に動物を置き、テープで適所にノーズコーンを確保します。それは心から発信ECG信号を減らすために右側を移植するのが最善であることに注意してください。
注：呼吸を監視し、必要に応じて、通常の呼吸速度と麻酔の適切な外科的平面性を維持するために、イソフルランのレベルを調整します。 - 胴体に沿って同側の足に向けて前肢を引き出します。
注：この位置は、sの外科的アクセスを提供し、尾側肩甲骨を変位しますcaleneと僧帽筋の筋肉。- 、鈍い湾曲鉗子を取る手術部位へのフロント足の同側をバック保持し、（ 図1C）の場所に足をテープで固定します。足が手続きの期間中、安全であることを確認するために、強力な接着性外科用テープを使用してください。
- 手術用手袋の新鮮なペアに置きます。肩と耳（ 図1Cに赤線）との間に、斜めの切開、約2cm長を作るためにメスを使用。
- 2つの＃2椎弓切除鉗子、それぞれの手に1を使用して、胸鎖乳突筋と斜角筋（ 図1D及びE）を覆う筋膜を露出させるために脂肪パッドを引き戻すと、僧帽及び広頸筋筋肉を広げ。
- 斜角筋を識別するための目印として、淡い胸鎖乳突筋と横隔膜神経を使います。胸鎖乳突筋がinfeに位置しながら、横隔膜神経は、斜角筋と平行に走ることに注意してくださいrior。斜角筋は僧帽筋の下の肋骨に頚椎から斜めに実行します。生体電位リードは、横隔神経（ 図1F 及びG）に隣接して走る筋肉として同定することができる前斜角筋、中に挿入されます。
注：注意。この領域は、高度に血管である、とケアは鎖骨下動脈を切断しないように注意しなければなりません。横隔神経及び腕神経叢の損傷を防ぎます。 - 斜角と僧帽筋（ 図1G）が同定された後、肩甲骨の間に、動物の背中に送信するための皮下ポケットを作ります。
- 、組織分離はさみを使って皮膚のすぐ下にはさみの鈍先端を挿入し、その約1.25倍、送信機の幅は（ 図1H）が形成されている開いたポケットまで、それらを広めます。
注：送信機が最小の抵抗で挿入されなければならないが、ポックらは、送信機が独自に動くことができるように大きなすべきではありません。ポケットが小さすぎる場合、送信機は皮膚を傷つけるおよび/またはリード線を引き出すために動物を促すことができる炎症を引き起こし、肌と擦れることができます。ポケットが大きすぎると、seromasは形成することができる、または送信機は、不利な位置に移動することができます。
- 、組織分離はさみを使って皮膚のすぐ下にはさみの鈍先端を挿入し、その約1.25倍、送信機の幅は（ 図1H）が形成されている開いたポケットまで、それらを広めます。
- 暖かい、滅菌生理食塩水でフラッシュし、筋肉に対する平坦側と送信機を挿入します。位置送信機をそれが平らにし、ワイヤがポケットから出て、互いに平行ではなく（ 図1I）捩れるようになっています。デバイスの下ワイヤの余分な長さをカールし、平坦に置きます。
- バイポテンシャルリード2組の平坦で互いに平行に位置するように斜角と僧帽筋に送信機からリードを実行します。
- 周囲の筋肉から前斜角筋を分離するために、椎弓切除鉗子を使用し、不等辺MUSを通じて25ゲージの針を挿入CLE、筋線維に垂直。
- 針の先端に一方のリードを挿入した後、筋肉の外針を引き出し、ワイヤ（ 図1J及びK）の絶縁まで筋肉に挿入リードを残します。色付きのリードがどの筋肉に挿入されたレコード。
- リードが挿入されている筋肉に近接し、ワイヤの露出端上にシアノアクリレート接着剤の小滴を配置し、かつ迅速に何ワイヤがリードキャップ及び筋肉（ 図2Aとの間に露出されないように、ワイヤ上のリードキャップをスライドおよびB）。
注：それはEMGは、シアノアクリレート17、18とリード確保する慣例ですが、別の方法は、その周りに絹縫合糸の結び目を結ぶことにより、代わりにリードキャップを確保することです。 - キャップに過剰ワイヤ先端をトリム及び/ワイヤリードキャップの端部にシアノアクリレート接着剤の滴を適用します。糊を付け（ 図2C及びD）を解放する前に重合するための時間。
- 2ミリメートル離れた第一のリードから - 1、同じ筋肉に最初に逆極性リード平行を挿入する（3.10から3.12ステップ）と同じ手順に従います。
- ちょうど斜角筋（ 図1LおよびM）の前方に位置し、僧帽筋にリード線を挿入するために3.12 -繰り返して、3.10を繰り返します。
- ワイヤリードが所定の位置に固定されているとリードを引っ張ることなく、体の動きを実行するために動物のためのリード線でちょうど十分なたるみがあることを確認してください。これはスクラッチに動物を促したり、リードを引き出すことが刺激を引き起こす可能性があるとして、鉛の余分な長さが肌にプッシュしていないことを確認してください。必要に応じて任意の潜在的な不快感を防ぐために、リードを再配置します。
- そっと前足を押さえ、テープを取り外します。背中の筋肉の上に脂肪パッドを引き、挿入されたリード線をカバーするためにそれを使用。からかいによってシアノアクリレート系接着剤で切開部を閉じますバック一緒に皮膚のフラップアップ切開ラインとなるよう。湾曲鉗子と共に皮膚フラップの部分を挟持し、この線に沿ってシアノアクリレート接着剤の小さな線を適用します。
- 動物が麻酔下にある間に術後の痛みを軽減するためにカルプロフェン皮下に0.1mLのを注入します。
注： - その後、必要に応じて、その後の2日後に手術、および1のために一日一回カルプロフェン0.1mLのを管理し続けます。 - ノーズコーンから動物を削除し、動物が起きていると自発的にケージの周りに移動するまで予熱したインキュベーター中できれいなケージに入れてください。その動きと覚醒を監視し、その後少なくとも15分間インキュベーター中に動物を維持します。
4.術後ケア
- ハウス動物は別途手術後。ダイエットジェルや水のボトルで動物を癒してください。
- 手術後の最初の30分間動物を監視します。動物、少なくとも毎時間fにチェックまたは術後5時間。手術後の日では、少なくとも一日二回確認してください。
- 壊死、感染切開部に沿ってインプラント（ すなわち、熱、腫脹、発赤）を含む体腔内、および血清腫の形成を監視します。
注：これらの兆候は手術後1週間以内に発生。手術後の健康癒さ動物1ヶ月は、図1Nに示されています。 EMGの録音は、移植直後に行うことができますが、動物は、ECG信号は移植直後高くすることができて、EMGおよびプレチスモグラフィを記録する前に癒すために、少なくとも1週間を与えられています。
5.同時電や脈波信号を取得
- バイアス流を含め、すべての収集装置の電源をオンにします。
注：マウスのための流量は通常/分1.0リットルに設定されています。 - 流量計を使用して、プレチスモグラフィチャンバー（複数可）を較正します。
注：定期的にプレチスモグラフィーchambeをチェックRSはシールが割れたり、壊れていないことを確認します。コート週に一度、真空グリースなどの潤滑剤とゴム製シールは、それらの良好な状態を維持します。 - 製造業者によって指定された入力送信校正。
- EMGおよび容積脈波を記録する前に順応するために少なくとも1時間プレチスモグラフィチャンバー内にマウスを置き。複数のチャンバを用いて、次のマウスが第二のチャンバに順応され、一方のマウスから記録することができます。バッテリ電源（ 図1O）を節約するために順応期間中に送信機の電源を入れないでください。
- 記録の前に（しかし、キャリブレーション後）、移植された動物の1以内に強力な磁石を配置することによって、送信機の電源をオンに送信機がオンのとき、受信機の前面に赤色光が表示されます。
- 「取得」と表示されたプルダウンメニューを使用して取得を開始し、選択し、「取得を開始します。」記録時間は、かもしれないが3 H - 実験によって異なり、典型的なプレチスモグラフィおよびEMG記録が1続きます。
注：送信機は240ヘルツの固有サンプリングレートを有します。 500ヘルツの速い速度は、点間を補間して、より滑らかな波形を提供するために、ソフトウェアに設定されています。インプラントにおけるローパスフィルタ（つまり、アンチエイリアスフィルタとして機能する）とハイパスフィルタは、この遠隔測定装置用の1〜50 Hzの帯域幅を指定します。インプラントは電池式であり、動物は、インプラントを遮蔽し、電界から導くため60HzのA / C干渉はEMG信号における過剰雑音に寄与しません。脈波検査、EMG、およびビデオを自動的に収集ソフトウェアを経由してリアルタイムで同期されます。 - 取得が完了すると、磁石と送信機をオフにして、チャンバから動物を削除します。
- 他の記録を開始する場合は、室内をきれいに、次の動物から新しいトランスミッタの校正に入り、第2の記録を開始します。フィンの場合その日のために取得してished、送信機をオフにし、脈波検査室をきれいにし、すべての収集装置およびバイアス流をオフにします。
呼吸筋EMGを測定するために、遠隔測定装置の図1注入。生体電位の2組（A）テレメトリ送信機はEMGを測定するために導きます。リードは、所望の長さ（下）にトリミング又はコイル及びトランスミッタ（トップ）の下に隠れすることができます。 （B）トランスミッタリード。 （B」）は、配線を露出するリードキャップ（挿入図）を作るためにトリミングオフプラスチック絶縁と導きます。 （B '）のワイヤとリード4を延伸-元の長さは5倍。それらは（図示せず）が0.5 cmの長さになるようにリードがトリミングされるべきです。 （C）マウスを剃毛手術部位で、手術の準備をして正しく配置前足。赤い点線は、切開部位を示します。 （D）最初の切開後に見られる脂肪パッドおよび筋膜、下に位置する表在筋。 T =僧帽筋。 S =胸鎖乳突筋。 P =広頚筋。黄色の矢印=横隔膜神経。筋肉及び（D）に示した横隔神経の（E）漫画図。鉗子（F）に示す深い斜角筋に到達する僧帽や広頚筋筋肉を広げために使用されるべきであると（G）。 （F）のランドマークは、不等辺と僧帽の位置を識別するために使用されます。この画像は、鎖骨下動脈（白矢印）、横隔神経/腕神経叢（黒矢印）、淡胸鎖乳突筋（黄色矢印）を示しています。 （G）の漫画は、より深い筋肉（ すなわち、中央の斜角筋、前斜角筋、およびSCM）、鎖骨下動脈、および横隔膜神経の位置を表します。事後不等辺は表示されません。これらは、アクセスすることができた場合にのみsuperfici（DおよびEにおいて）ら筋肉を広げています。 （H）鈍先端はさみを使用して送信するためのポケットを作ります。 （I）は、ポケットから出てくる平行に配置リードと、皮下ポケットに送信機を挿入しました。不等辺に25ゲージ針の（J）の挿入は、筋線維に直交する、リード線のためのトンネルを作ります。 （K）斜角筋に挿入両方のリード。リードキャップは端に位置し、所定の場所に接着されています。 （L）筋線維に垂直な僧に25ゲージ針の挿入、リード線のためのトンネルを作成します。 （M）すべての4点のリード僧と斜角筋に挿入され、前切開部の閉鎖に平らに横たわっています。 （N）は、完全に背面に送信位置決め皮下で、マウスを回収しました。 （O）同時に記録プレチスモグラフィ、筋肉のEMG活動、ND映像それぞれ、プレチスモグラフィチャンバー（黄色の矢印）、テレメトリー受信パッド（赤矢印）、及びカメラ（黒矢印）を使用。複合バイアス流は、マウスに酸素を供給するためにプラスチックチューブ（青色矢印） を介して、プレチスモグラフィチャンバーに接続されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
シアノアクリレート系接着剤でリードキャップを確保 2.図 。 （A）筋肉に電極リード（E）ワイヤの近位の露出されたワイヤにシアノアクリレート（紫色の円）の小滴を適用します。リードキャップを筋肉に直接隣接して配置されているように（B）をすばやくシアノアクリレート接着剤の上に露出したワイヤ上に調製されたリードキャップ（LC）をスライド。 （Cプラスチック製で絶縁されていない全く露出した電極が存在しないように）リードキャップ及びワイヤの遠位端部の小さな部分を切り落とします。 （D）リードキャップの端部にシアノアクリレート接着剤の小滴を適用します。動物からのリードキャップのトリミングオフ遠位端を削除します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ARM EMGと脈波の6分析
- 解析ソフトウェアを開き、（「ファイル」に移動し、「開くレビューファイル」を選択します）興味のあるファイルを確認します。タブ「高度は1属性」、および30 Hzにハイパスフィルタを変更するハイライト表示「属性の分析」を選択、EMGのトレースを右クリックして30 Hzのハイパスフィルタを使用したEMG信号をフィルタリングします。
注：このフィルタリングステップは、非差別、低周波数情報を削除します。 同期映像ファイルの移動の欠如と容積脈波のトレースの移動に起因する大きい、不規則な圧力変化（ 図3Aに赤いボックス）の欠如に基づいて、目視検査によって、マウスの非アクティブの領域を見つけ。マウスが眠ったり起きまだあるとき不活動が発生します。 - 各筋肉のために独立してEMGの試合を識別します。
- 30ミリ秒（ 図4）上で濾過EMG信号を整流し、統合。
注：マウスは3ヘルツの速度で呼吸しているので、各呼吸は、約11積算値で表されます。 - マウスは非アクティブであり、容積脈波のトレースがeupnea（正常な呼吸）（ 図4）を示しているときに3秒の期間のEMG信号に関連付けられた整流積分値を平均化することによって、ベースラインEMG振幅を決定します。
- 少なくとも5、少なくとも3つの連続する整流積分値によって定義されたアクティビティの「発作」を識別（ステップ6.3.2で決定された）ベースラインEMG信号上0％増加しました。
注：3つの連続値は90ミリ秒のウィンドウを表すが、一部の試合は、3つの以上の値がしきい値を超えて含まれていますし、長い90ミリ秒以上続きます。 - ため息（ 図3B）中に発生する発作を除外するために、同期ビデオや脈波検査トレースを使用してください。スニッフィング（ 図3C）。あるいはヘッド等の意志マウスの動きは、旋回またはグルーミング。
- 第二の筋肉のために6.3.4 - を繰り返して、6.3.1を繰り返します。
- 30ミリ秒（ 図4）上で濾過EMG信号を整流し、統合。
- 各筋肉のための試合の頻度を計算します。レコードA）各々の非アクティブ期間の開始時刻と終了時刻、およびb）各試合は、上記の基準を使用して発生した時間。総非アクティブな時間を合計します。試合周波数を計算するためのレコーディング・セッションの過程で非アクティブ時間の合計分で発作の総数を割ます。
- 換気の変化が記録Mの活性化と関連しているかどうかを決定uscles。
- 測定対象の呼吸パラメータを選択します（ 例えば、ピーク吸気流、一回換気量、分時拍出量、および分あたりの呼吸）。
注：すべての可能な選択は、下P3セットアッププルダウンメニューで見つけることができる「導出されたパラメータ。」 - EMG試合活動中に起こる呼吸及びEMGベースライン活性（ 図4）の間に起こる呼吸を識別する。
- EMG試合活性に関連するベースラインEMG活動に関連付けられている独立したパーサーセグメントを作成されたプレチスモグラフィの呼吸にまたがるパーサー・セグメントを作成します。分析の種類を設定してください「パーサワンセグ。」
注：この選択は、下P3セットアッププルダウンメニューで発見された「データ削減のセットアップ。」 - 脈波検査トレースを右クリックしてイベントで、各パーサセグメントの先頭をマークします。ドロップダウンメニューとSPに「イベント1」としてパーサセグメントを含む試合を指定しますセグメントの2つのクラスを区別するために「イベント2」としてベースラインパーサセグメントをecify。
- 「関数」メニューで、「マークスのセクション」を保存して、「マークはデータを導出しました。」データパーサのメニューで、「解析されたレビューファイル」と保存「解析された得られたデータを。」
注：個々の息のために選択された呼吸パラメータは、ラベルされたタブのマーク派生データシートで発見された「派生の。」 - 筋活動は、換気の変化に関連付けられているかどうかを決定する（イベント2としてマークされた）ベースラインの活動中に起こる呼吸対（イベント1としてマーク）ARMの試合中に発生する呼吸用呼吸パラメータを比較します。
- 測定対象の呼吸パラメータを選択します（ 例えば、ピーク吸気流、一回換気量、分時拍出量、および分あたりの呼吸）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
記載されたプロトコルは、遠隔測定装置を移植すると、SOD1（G93A）ALSモデルマウスの斜角と僧帽EMG、WBP、およびビデオを記録するために使用しました。動物が非アクティブである期間（ 例えば、移動しません）ビデオ録画を使用して識別し、WBPトレース（ 図3A）における運動関連活性の欠如によって確認されました。非アクティブ期間は、REMまたは非REM睡眠に費やされる時間、ならびに時間まだ起き費やさなく（ 図3A）が挙げられます。この非アクティブ時間の間EMG活性は、少なくとも3の連続する整流及び統合（30以上MS）値は、ベースラインEMGレベルよりも少なくとも50％増加した（ 図4）と振幅を持っていた試合のように採点しました。 （映像によって評価）（プレチスモグラフィーにより測定）ため息又はスニッフィング中に発生した活性の発作、または随意運動を解析（ 図3B-C）から除外しました。 EAのSOD1（G93A）マウス半ば症候性の段階（ 表1）、いくつかの呼吸（ 図4）のいずれかに続く安静時増加したARM活動の展示の試合にrly-。 ARM活性の発作が発症前SOD1（G93A）（ 図3A）または野生型マウス10に稀です。
| ステージ | 状態 | ステージ発症 | 後肢プレゼンテーション |
| 0 | 発症前 | <P100 | wildtypesに比べ顕著な差はありません。 |
| 1 | 疾患の発症 | 〜P100 | マウスを尾から吊り下げられて、後肢崩壊。 |
| 2 | 不全麻痺 | 〜P120 | 振戦の出現との完全または部分的後肢の崩壊。 | </ TR>
| 3 | 麻痺発症 | 〜P140 | 歩行困難、つま先のカーリングおよび/または足のドラッグ。 |
| 4 | 高度な麻痺 | 〜P150 | 最小の関節の動き、前方への動きのために使用されていない後肢。 |
| 5 | 末期 | 〜P160 | 30秒以内側から自らを正すことができないマウス。 |
表1 SOD1（G93A）マウスにおけるALS様疾患進行の神経学的スコアリング。
図3. 代表WBPとEMGトレース。 （A - C）プレ症候性SOD1（G93A）マウス（年齢P98）からWBPと斜角と僧帽筋のEMG。 （A）期間T彼の動物を分析に使用されている残りの（赤いボックス）です。典型的な赤いボックスを表示外部トレースEMGトレースにおける容積脈波のトレースと筋活動が大きく不規則なピークが、動物が移動して、同期ビデオ録画（図示せず）によって決定されます。赤いボックスはEMGがEMG発作、発症前マウスの特徴を欠いているトレース示します。 EMG活性の（B）発作は、しばしば（容積脈波のトレースに示されるように）直接ため息先行起こります。ため息を劇的満了に続いて高振幅のインスピレーションによって特徴付けられます。特徴的なECG信号の黒矢印ポイント。マウスが盗聴されている間（C）EMG活性の発作が頻繁に発生します。スニッフィングは、複数回の呼吸（EMG活動のバーストと共起）オーバー周波数と振幅の両方において長期増加により容積脈波のトレースに反映されます。カラー=「＃0066CCの」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
EMG活動の 4 得点発作図 。 （AおよびB）WBPの2つの例は、僧帽EMGトレースを濾過し、整流症候性SOD1（G93A）マウス（年齢P126）から統合された僧帽EMG信号。青線は3秒の期間にわたって整流積分された信号を平均することによって決定し、ベースラインEMGレベルを示す点在しました。赤い点線はベースラインEMG活性超える振幅の50％の増加を示しています。少なくとも3つの連続整流積分値が50％のベースライン閾値を超えたときに活性の試合を採点します。 アルをご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図のargerバージョン。
| PIF（ミリリットル/秒） | TV（ミリリットル） | MV（mL /分） | 呼吸頻度（呼吸/分） | |
| ナイーブ（N = 5） | 4.4±0.7 | 0.27±0.04 | 58±13 | 223±41 |
| 注入（N = 4） | 4.1±0.2 | 0.27±0.11 | 56±29 | 201±32 |
| P値 | 0.439 | 1.000 | 0.893 | 0.410 |
| 示されている値は、平均±SD反映しています。 P値はスチューデントのt検定を用いて計算しました。 | ||||
ナイーブ（注入されない）、および移植さステージ4 SOD1（G93A）マウスの間で呼吸の薄いページ=「1」> 表2の比較。有意差は両群間で毎分最大吸気流量（PIF）、一回換気量（TV）、分のボリューム（MV）、または呼吸に見つかりませんでした。示した値は平均±SDを反映しています。 P値はスチューデントのt検定を用いて計算しました。
EMGおよび/またはWBPの繰り返し測定は、手術後1〜2週間の回復期間後のEMG信号またはベースラインではほとんど変化して、数ヶ月にわたり同じマウスで行うことができます。時間経過は、典型的には、電池寿命によって制限され、従って、個々の記録の頻度および持続時間によって決定されるであろう。研究者は原因埋め込み装置への有害事象が稀に起こる可能性があることに注意する必要があります。マウスは、皮膚に移植された筋肉やスクラッチ/咀嚼から配線を引き出す場合リードまたは送信してもよいです。ターが不適切に配置されています。ほとんどの場合、倫理的配慮は、これらの動物を犠牲にすることを指示します。送信機は、除去滅菌し、別のマウスに再注入してもよいです。
呼吸影響しないデバイス注入を確認するために、ALSステージ4におけるナイーブSOD1（G93A）マウス（非移植）ALSステージ4における及び移植SOD1（G93A）マウスの間にプレチスモグラフィの測定値を比較しました。有意差は両群（ 表2）の間、毎分最大吸気流量（PIF）、一回換気量（TV）、分のボリューム（MV）、または呼吸に見つかりませんでした。不等辺と僧帽は、互いに隣接し、互いに直接接触しています。同時EMGの発作が時々両方の筋肉において観察されているが、強いEMG発作はまた、Iを注入電極間のクロストークが最小あることを実証し、EMGの試合が不等辺（およびその逆）には存在しない僧帽筋で検出されますnは各筋肉。リードは僧と胸鎖乳突筋の筋肉に置かれたときにEMG活動の独立した発作も観察される（データは示さず）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここに示された手順は同じ動物で何ヶ月にわたる呼吸筋の活動と換気の（送信機の初期外科的移植後の）非侵襲的な測定が可能になります。この技術は、麻酔したマウスにおける標準EMG技術に勝るいくつかの利点を有する：1）実験は、より少ないマウスを必要とし）の代わりに、異なる疾患段階で複数のマウスを使用する（病期を横切る単一のマウスに同じサイトからのデータを記録する能力を提供します。 2）データの解析は、より強力な統計的検定（ すなわち、代わりに別の実験群を比較する反復測定を使用して）を行うことができます。 3）EMGとWBPの同時録画は、換気のARMの活動の影響を直接評価することができます。そして4）実験は、睡眠/覚醒の異なる状態でマウスで実行することができます。健康なマウスが静止してARMの試合の非常に低い周波数を持っているので、また、この技術は、CAです病気10の初期の症候性段階でALSモデルマウスにおけるARM活動の周波数における小さな変化を検出するpable。この技術は実験的に制御強度で自然な行動時の筋線維の大きいが、未知の数の活動ではなく、以下の神経刺激を測定しかし、それはモータ部の大きさや数を推定するには適していません。別の制限は、マウスにおける移植に適した遠隔測定ベースの送信機は、現在、生体電位リードの二組に限定されていることです。このように、2つだけのサイトが同じマウスから記録することができます。先に図14、 図15に記載したのと同じマウスでつ以上の筋の同時記録を必要とする実験のために、複数のEMGリードは、ワイヤ、テザーを使用して取得システムに注入し、接続されていてもよいです。しかし、プレチスモグラフィチャンバーまたはシールへの変更を可能にするために必要とされるであろう筋活動と換気の同時記録のためにマウスがつながれている場合。
この技術を適用する場合、プロトコルの特定のステップは、注意して行わなければなりません。彼らは動きを妨げたり、覆っている皮膚を刺激しないように、生体電位リードを配置する必要があります。それは、マウスの正常な動きや姿勢に影響を与えないように加えて、送信機が配置されなければなりません。実験が終了した後、リードの適切な配置（ すなわち、完全に正しい筋肉に埋め込まれ、隣接する筋肉に接触していない）と筋肉の損傷や感染症の欠如は、剖検によって検証されていることをお勧めします。さらに、送信機は、バッテリ寿命を節約するために、すべてのレコーディングセッションの後にオフになっていることが不可欠です。
胸や首の領域の筋肉からEMGを測定する不可避の結果は、再として表示記録心電図（ECG）信号の高い尤度でありますEMGトレース内gularスパイク（ 図3B、矢印）。 ECG信号は、すべての金属が筋肉中に完全に埋め込まれるようにリードを慎重に配置することによって、主要な血管の近くに配置することを回避することにより最小限に抑えることができます。心臓に近いボディではなく、左、右側の筋肉にリードを植え込む、また、ECG信号を減らすことができます。 ECG信号は、EMGから濾過してもよいが、計算アルゴリズムを使用して、トレースまたは独立して記録されたECG信号19、20、21を減算することにより、それは典型的には必要ではありません。 ECG信号は、規則的な形状、周波数、および振幅によってEMG信号から容易に区別することができます。
記載された技術は、ALS 10のSOD1（G93A）マウスモデルにおける安静時ARM活性の変化を測定するために使用されてきました。アクセサリー呼吸筋はまた、OTで募集されています彼女の神経筋疾患（ 例えば、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、末梢神経障害など ）、および以下の神経や脊髄損傷。 ARMの活動は、そのため、振動板の機能障害を測定し、疾患の重症度を測る、怪我からの回復を監視し、または動物の疾病や傷害モデルのさまざまな呼吸を改善するための潜在的な治療上の利点を評価するためのプロキシとして機能することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品のサポートはVNJにSACおよびNIH訓練助成金（T32NS007453）へシンシナティ小児病院医療センターの受託者賞によって提供されました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
- Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
- Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
- Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
- Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
- Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
- Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
- Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
- Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
- Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
- Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
- Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
- Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
- Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
- Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).
