Summary
Este documento apresenta um método para medições repetidas de ventilação e da actividade dos músculos respiratórios em um modelo de rato comportando livremente esclerose lateral amiotrófica (ELA) em toda a progressão da doença com pletismografia do corpo inteiro e electromiografia através de um dispositivo de telemetria implantada.
Abstract
musculatura respiratória acessória ajudar a manter a ventilação quando a função do diafragma é prejudicada. O protocolo seguinte descreve um método para medições repetidas ao longo de semanas ou meses de actividade muscular respiratório acessório, enquanto que medem simultaneamente a ventilação de um rato não anestesiado, comportando-se livremente. A técnica inclui a implantação cirúrgica de um transmissor de rádio e a inserção do eléctrodo em leva os músculos escaleno e trapézio para medir a actividade electromiograma destes músculos inspiratórios. A ventilação é medido por pletismografia de corpo inteiro, e o movimento dos animais é avaliada por vídeo e é sincronizado com actividade electromiograma. As medições de atividade muscular e ventilação em um modelo de rato com esclerose lateral amiotrófica são apresentados para mostrar como esta ferramenta pode ser usada para investigar como respiratória alterações na atividade muscular ao longo do tempo e para avaliar o impacto da atividade muscular em ventilação. Os métodos descritos pode enviarasily ser adaptado para medir a actividade de outros músculos ou para avaliar a actividade dos músculos respiratórios acessório em modelos de ratinho adicionais de doença ou lesão.
Introduction
Músculos respiratórios acessório (ARMs) aumentar a ventilação durante os períodos de grande procura (por exemplo, o exercício) e ajudar a manter a ventilação quando a função de diafragma está comprometido após a lesão ou doença 1, 2. Embora as alterações na função do diafragma têm sido bem descritos em pacientes de esclerose lateral amiotrófica (ALS) e modelos de ratinho 3, 4, 5, 6, muito menos se conhece sobre a actividade ou a função dos braços em ALS. No entanto, um estudo sugeriu que pacientes com ELA que recrutam ARMs ter um melhor prognóstico do que aqueles com disfunção do diafragma similar que não fazer 7. Além disso, a actividade ARM é suficiente para a respiração em casos de diafragma paralisia 8. Esses estudos indicam que as estratégias para aumentar a função ARM pode melhorar breathing em pacientes que sofrem de doença neuromuscular, lesão da medula espinal, ou outras condições em que a função de diafragma é prejudicada. No entanto, os mecanismos que controlam o recrutamento ARM para respirar são em grande parte desconhecido. Métodos para medir a função respiratória e as alterações na actividade do ARM ao longo do tempo em modelos animais de doença ou lesão são necessários para estudar como ARMs são recrutados, bem como para avaliar terapias para melhorar o recrutamento de ARM e ventilação. Além disso, o aumento da actividade dos braços coincidindo com a perda progressiva da função do diafragma pode ser um biomarcador útil para a progressão da doença em doenças neuromusculares tais como ALS 7, 9, 10.
Este protocolo descreve um método para não-invasiva (após a cirurgia inicial) e repetidamente medir a actividade dos músculos respiratórios e de ventilação em ratos despertos, comportando. gravações sincronizadas de eletromiógrafoy (EMG), pletismografia de corpo inteiro (WBP), e de vídeo permite o investigador para avaliar o modo como as alterações na ventilação impacto actividade ARM e para determinar quando o objecto está em repouso ou em movimento. Uma grande vantagem deste método é que ele pode ser realizado em ratos despertos, comportando, ao passo que alguns métodos alternativos para medir EMG requer anestesia e / ou são procedimentos dos terminais 11, 12, 13. A gravação da actividade EMG em ratos despertos ao longo do tempo pode também ser conseguido através da implantação crónica de EMG conduz, em que o rato é amarrado por fios ao sistema de aquisição 14, 15. Porque amarrar um rato poderia interferir com o movimento ou comportamento normal e pode não ser compatível com uma câmara de pletismografia padrão, o método descrito antes utiliza dispositivos de telemetria sem fios para transmitir o sinal de EMG para o sistema de aquisição. O transmissor podeser ligado ou desligado com um ímã para conservar a energia da bateria e permite medições repetidas de atividade EMG ao longo de vários meses. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para medir a actividade dos músculos respiratórios ou não respiratórias adicionais, inserindo o EMG leva em músculos diferentes. Em alternativa, um dos dois fios pode ser utilizado para medir a actividade de EEG para avaliar o estado do sono ou para identificar a actividade convulsiva 16. Esta técnica tem sido utilizada com sucesso para medir alterações na actividade do ARM em repouso por toda a progressão da doença em um modelo de ratinho de ALS e para identificar neurónios chave de condução actividade ARM em ratos saudáveis 10.
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Protocol
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do Cincinnati Children Hospital Medical Center Institucional Animal e conduzido de acordo com o Guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação para telemetria cirurgia de implante de dispositivos
- Utilizar equipamento de proteção individual (ou seja, esfrega, sapato cobre, vestido, rede de cabelo, máscara e luvas cirúrgicas).
NOTA: Esta cirurgia requer um campo estéril. - Ligar a incubadora (incubadora humidificador / infantil servo-controlado definido como 29 ° C) e alinhá-lo com, toalhas brancos secos para permitir o aquecimento adequado para a recuperação.
- Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com óxido de etileno e esterilizar o transmissor com um detergente enzimático e esterilizante químico (ou, conforme especificado pelo fabricante) antes da utilização.
NOTA: Os instrumentos cirúrgicos devem incluir # 2 forceps laminectomia (padrão dicas / hetero / 12 cm) (x4), estreitofórceps padrão (serrilhada / curvo / 12 cm), uma tesoura de separação de tecido (hetero / blunt-romba / 11,5 cm), e um suporte de lâmina de bisturi e. Recomenda-se a ter um conjunto separado de instrumentos esterilizados (dois # 2 pinça e tesouras) reservados exclusivamente para lidar com os fios do transmissor para manter os instrumentos cirúrgicos em boas condições. - Esterilizar todas as superfícies dentro do campo cirúrgico com um desinfectante aceitável. Posicionar um microscópio de dissecção som, máquina de isoflurano anestésico, instrumentos cirúrgicos, e clippers no campo cirúrgico (ver a Tabela de Materiais).
- Para manter a temperatura do corpo do rato sob anestesia, colocar uma almofada de aquecimento ou cobertor de água sob a toalha estéril em frente do microscópio de dissecção estéreo.
- Certifique-se de que o transmissor é totalmente funcional antes de usar.
NOTA: Um pequeno ímã colocado dentro de 2 em do transmissor irá ligar o dispositivo ligado e desligado. Quando o transmissor está ligado e colocado junto a um raDio fixado em frequência AM 500 Hz, emitirá, um zumbido agudo contínua. Para economizar bateria, desligue a bateria antes de implantá-lo no animal. - Prepara-se o eléctrodo leva antes da cirurgia aparando as pistas distais com a tesoura reservados para a manipulação de fios de modo a que haja cerca de 3 cm de chumbo (o suficiente para alcançar o músculo alvo) (Figura 1A). Alternativamente, o enrolamento dos fios proximal ao dispositivo e ligá-los com suturas de modo que há cerca de 3 cm de chumbo desenrolada.
NOTA: salvar a parte recortada-off do eléctrodo leva a fim de preparar "caps" (chumbo plástico isolado de revestimento), tal como descrito na etapa 1.9. No passo 3, as ligações do transmissor vai ser inserido através do músculo, de modo e a parte distal, exposta dos fios tem de ser mantido no lugar e isolados utilizando tampões de chumbo. - Usar um bisturi para aparar 0,5 cm de do revestimento de plástico, sem cortar o fio em si. Use as ferramentas reservados fomanuseamento fio r para esticar as extremidades dos condutores 4 - 5 vezes o seu comprimento original de modo a que eles se encaixam facilmente dentro de uma agulha de calibre 25 (Figura 1B-B ''). Aparar o fio exposto dos condutores de modo que eles são de 0,5 cm de comprimento.
- Preparar tampões de chumbo (tubos de plástico para cobrir as extremidades dos fios) antes da cirurgia. Usar um bisturi para cortar fora tubos de 0,25 cm de comprimento a partir do invólucro de plástico em torno dos segmentos de eléctrodo leva salvo na etapa 1.7.
NOTA: Quatro tampões de chumbo são necessários para cada rato que vai sofrer a implantação, mas é melhor para preparar o dobro da quantidade necessária de caps. Tendo em tampões adicionais de chumbo preparado estéreis é útil no caso de garantir uma pastilha de chumbo é mal sucedido na primeira tentativa. - Registe o número de série do transmissor inserido e guarde a embalagem original com as informações calibrado. Cada transmissor tem diferentes calibrações de frequência para o registo do EMG; inserir estes no software de aquisição para obter EMG aceitávelgravações.
2. Preparar o mouse para a cirurgia
- Escolha do rato desejado para o implante (isto é, de SOD-1 (G93A) ou controlo) e pesar o animal.
NOTA: A idade recomendada e peso para um rato (macho ou fêmea) submetidos a esta cirurgia é P56 - P120 e ≥ 24 g, respectivamente. - Anestesiar o rato sob 3,5% de isofluorano com uma taxa de 2 L / min de fluxo de oxigénio. Realizar uma pitada dedo do pé e uma pitada de cauda para se certificar de que o mouse é totalmente anestesiado.
- Uma vez anestesiados, remover o ratinho na caixa de queda e manter a anestesia por meio de um cone de nariz, definindo o nível isoflurano a 1,5% e a taxa de fluxo de oxigénio a 1 L / min. Realizar uma pitada dedo do pé e / ou pitada cauda para se certificar de que a anestesia é mantida.
- Aplicar unguento oftálmico lubrificante para evitar que os olhos de secar durante a cirurgia.
- Raspar o rato para expor um local cirúrgico entre a orelha e o ombro (Figura 1C).
- Alternate limpando o local da cirurgia, primeiro com desinfectante e depois com isopropanol. Repita mais 2 vezes.
3. Implantar o dispositivo de telemetria para gravar escaleno e trapézio EMG Atividade
- Colocar o animal por baixo de um microscópio de dissecação, no seu lado no topo de uma almofada que cobre estéril numa almofada de aquecimento, e proteger o cone de nariz no lugar com fita adesiva. Note que é melhor para implantar o lado direito para reduzir o sinal ECG proveniente do coração.
NOTA: Controlar a respiração e ajustar os níveis de isoflurano, se necessário, para manter uma taxa de respiração regular e plano cirúrgico apropriado de anestesia. - Puxe o membro anterior para o pé ipsilateral ao longo do tronco.
NOTA: Esta posição desloca a escápula caudal, proporcionando um acesso cirúrgico para as sCalene e trapézio músculos.- Tomar as pinças curvas cegas, segurar a ipsilateral pata dianteira para o sítio cirúrgico, e gravar a pata no lugar (Figura 1C). Use forte esparadrapo adesivo para se certificar de que a pata é seguro para a duração do procedimento.
- Coloque em um novo par de luvas cirúrgicas. Usar o bisturi para fazer uma incisão oblíqua, de aproximadamente 2 cm de comprimento, entre o ombro e a orelha (linha vermelha na Figura 1C).
- Usando dois # 2 fórceps laminectomia, um em cada lado, puxar para trás a almofada de gordura e afastados dos músculos do trapézio e platisma para expor a fáscia que cobre os músculos esternocleidomastóideos e escaleno (Figura 1D e E).
- Use o músculo esternocleidomastóideo pálido e nervo frênico como marcos para identificar os músculos escaleno. Note-se que o nervo frênico corre paralela para os músculos escaleno, enquanto o esternocleidomastóideo reside INFErior. Os músculos escaleno correr obliquamente de vértebras cervicais para as costelas sob o músculo trapézio. Leva biopotenciais vai ser inserido no músculo escaleno anterior, que pode ser identificada como o músculo que corre adjacente ao nervo frénico (Figura 1F e G).
NOTA: Cuidado. Esta área é altamente vascularizado, e os cuidados devem ser tomados para evitar o corte da artéria subclávia. Evite danificar o nervo e do plexo braquial frênico. - Uma vez que os músculos escaleno e trapézio foram identificados (Figura 1G), fazer uma bolsa subcutânea para o transmissor nas costas do animal, entre as escápulas.
- Usar a tesoura de separação de tecido, inserir as pontas rombas das tesouras logo abaixo da pele e espalhá-los até uma bolsa de abertura que é de cerca de 1,25x a largura do transmissor é formada (Figura 1H).
NOTA: O transmissor deve ser inserido com a resistência mínima, mas a pocket não deve ser tão grande que o transmissor pode se mover por conta própria. Se o bolso é demasiado pequena, o transmissor pode esfregar contra a pele, causando irritação que pode levar o animal a arranhar a pele e / ou puxar as pontas de fora. Se o bolso é demasiado grande, poderiam formar seroma, ou o transmissor pode migrar para uma posição desfavorável.
- Usar a tesoura de separação de tecido, inserir as pontas rombas das tesouras logo abaixo da pele e espalhá-los até uma bolsa de abertura que é de cerca de 1,25x a largura do transmissor é formada (Figura 1H).
- Lavar com solução salina quente, estéril e inserir o transmissor com o lado mais plana contra o músculo. Posicionar o transmissor de modo a que ele fique plano e os fios sair da bolsa, paralelas umas às outras, em vez de torcida (Figura 1I). Enrolar qualquer excesso de comprimento do fio por baixo do dispositivo e colocá-lo plano.
- Executar os cabos do transmissor para os músculos escaleno e trapézio de modo que os dois conjuntos de condutores bipotenciais ficar na posição horizontal e paralelamente uns aos outros.
- Utilizar as pinças de laminectomia para separar o escaleno anterior a partir dos músculos que rodeiam e inserir uma agulha de calibre 25 através do mus escalenocle, perpendicular às fibras musculares.
- Inserir uma vantagem para a ponta da agulha e em seguida puxar a agulha para fora do músculo, deixando para trás a vantagem inserida no músculo-se para o isolamento do fio (Figura 1J e K). Ficha que fios coloridos são inseridos no qual o músculo.
- Colocar uma pequena gota de adesivo de cianoacrilato sobre a extremidade exposta do fio, perto do músculo onde está inserido o chumbo, e rapidamente deslizar a tampa de chumbo ao longo do fio de modo que nenhum fio ficar exposta entre a tampa de chumbo e o músculo (Figura 2A e B).
NOTA: Embora seja uma prática aceita para garantir EMG lidera com cianoacrilato 17, 18, um método alternativo é o de garantir a tampa de chumbo no lugar por amarrar um nó fio de seda em torno dele. - Aparar o excesso de fio distai na tampa e aplicar uma gota de adesivo de cianoacrilato para a extremidade do condutor do tampão / fio. Submeter a colatempo para polimerizar antes de soltar (Figura 2C e D).
- Seguir as mesmas etapas (etapas 3,10-3,12) para inserir a polaridade oposta chumbo paralelo ao primeiro, no mesmo músculo, 1 - 2 mm de distância da primeira ligação.
- Repita os passos 3,10-3,12 inserir leva para o músculo do trapézio, situada imediatamente anterior ao músculo escaleno (Figura 1 L e M).
- Verifique se os fios de arame são fixos no lugar e que não é apenas uma folga suficiente nos leva para o animal para executar os movimentos do corpo sem puxar os fios. Assegurar que qualquer excesso de comprimento de chumbo não empurrar contra a pele, pois isso pode causar irritação que pode levar o animal para zero ou puxar os fios para fora. Reposicionar os cabos, se necessário, para evitar qualquer desconforto potencial.
- Remova cuidadosamente a fita segurando o membro anterior. Puxe a almofada de gordura para trás sobre o músculo e usá-lo para cobrir os fios inseridos. Fechar a incisão com adesivo de cianoacrilato por provocaçãoas abas de pele para trás em conjunto de modo que as linhas de incisão para cima. Comprima uma porção das abas de pele, juntamente com as pinças curvas e aplicar uma pequena linha de adesivo de cianoacrilato ao longo desta linha.
- Injectar 0,1 mL de subcutaneamente carprofeno para aliviar a dor pós-operatória, enquanto o animal está ainda sob anestesia.
NOTA: Continue a administrar 0,1 ml de carprofeno, uma vez por dia, durante 1 - 2 dias pós-cirurgia, e em seguida, se necessário depois disso. - Remover o animal a partir do cone de protecção, e colocá-lo em uma gaiola limpa em incubadora a pré-aquecido até que o animal está acordado e movendo-se em torno da gaiola voluntariamente. Manter o animal na incubadora durante pelo menos 15 min depois, acompanhando os movimentos e estado de alerta.
4. Cuidados pós-operatórios
- Casa animais seguir separadamente cirurgia. Fornecer animais cura com gel de dieta e uma garrafa de água.
- Monitorar o animal durante os primeiros 30 minutos após a cirurgia. Verifique no animal, pelo menos a cada hora fou 5 h pós-cirurgia. Nos dias seguintes cirurgia, verifique, pelo menos, duas vezes por dia.
- Ver para necrose, infecção ao longo da incisão e dentro da cavidade do corpo contendo o implante (ou seja, calor, inchaço e vermelhidão) e formação de seroma.
NOTA: Estes sinais ocorrem na primeira semana após a cirurgia. Um saudável curado animais um mês após a cirurgia é mostrado na Figura 1N. Embora registos EMG pode ser feito imediatamente após a implantação, os animais recebem pelo menos uma semana antes de curar a gravação de EMG e pletismografia, como sinais de ECG pode ser elevado imediatamente após a implantação.
5. A aquisição de sinais simultâneos Eletromiografia e pletismografia
- Ligue todos os equipamentos de aquisição, incluindo o fluxo de viés.
NOTA: A taxa de fluxo para ratinhos é tipicamente fixado em 1,0 L / min. - Calibrar a câmara (s) de pletismografia utilizando um medidor de fluxo.
NOTA: Verifique periodicamente a chambe pletismografiars para garantir que os selos não estão rachadas ou quebradas. Revestir uma semana os vedantes de borracha com um lubrificante, tal como gordura de vácuo uma vez para manter a sua boa condição. - calibração do transmissor de entrada conforme especificado pelo fabricante.
- Colocar o rato na câmara de pletismografia durante pelo menos 1 h a aclimatar-lo antes da gravação de EMG e pletismografia. A utilização de várias câmaras, é possível gravar a partir de um rato, enquanto o rato é próxima de aclimatação de uma segunda câmara. Não ligue o transmissor durante o período de aclimatação, a fim de economizar energia da bateria (Figura 1O).
- Antes de gravar (mas após a calibração), ligar o transmissor ao colocar um íman forte dentro de um em do animal implantado; uma luz vermelha na parte da frente do receptor indicará quando o transmissor está ligado.
- Comece a aquisição usando o menu suspenso identificado como "Aquisição" e escolha "Iniciar Aquisição". Embora a duração de gravação podevariar por experiência, um típico pletismografia e gravação EMG dura 1-3 h.
NOTA: O transmissor tem uma taxa de amostragem de 240 Hz intrínseca. A taxa mais rápida de 500 Hz está definido no software para interpolar entre os pontos e fornecer uma forma de onda suave. O filtro passa-baixo (que serve como um filtro anti-alias) e o filtro de passagem alta no implante especificar a largura de banda de 1 a 50 Hz para este dispositivo de telemetria. 60-Hz interferência A / C, não contribuem para o excesso de ruído no sinal EMG porque os implantes são alimentados por bateria e protege o animal leva o implante e a partir de campos eléctricos. Pletismografia, EMG, e vídeo são automaticamente sincronizados em tempo real, via software de aquisição. - Quando a aquisição está terminado, desligar o transmissor com um magneto e remover o animal a partir da câmara.
- Se iniciar outra gravação, limpar a câmara, entram nas novas calibrações do transmissor a partir do animal seguinte, e iniciar a segunda gravação. Se fintada com aquisição para o dia, desligar o transmissor, limpar a câmara de pletismografia, e desligar todo o equipamento de aquisição e o fluxo de polarização.
Figura 1. Implantação de telemetria do dispositivo para medir EMG dos músculos respiratórios. Transmissores (A) de telemetria com dois pares de biopotencial leva a medir EMG. Derivações pode ser cortado para o comprimento desejado (inferior) ou enrolado e dobrado por baixo do transmissor (topo). (B) O transmissor leva. (B') conduz aparadas com isolamento plástico-off para expor os fios e para fazer tampas de chumbo (inset). (B '') Conduz com arames esticados 4 - 5 vezes o seu comprimento original. Leads deve ser aparada de modo que eles são de 0,5 cm de comprimento (não mostrado). (C) rato preparado para a cirurgia, com o sítio cirúrgico raspada e corretamentepata dianteira posicionada. A linha pontilhada vermelha indica o local da incisão. (D) os músculos superficiais localizados debaixo da almofada de gordura e fáscia, visto na sequência da incisão inicial. T = trapézio. S = esternocleidomastoideu. P = platysma. A seta amarela = nervo frênico. Diagrama de (E) dos desenhos dos músculos e do nervo frénico mostrado em (D). Uma pinça deve ser usada para afastar os músculos do trapézio e platisma para alcançar o músculo mais profundo escaleno, mostrado em (F) e (G). (F) Marcos usado para identificar a localização da escaleno e o trapézio. Esta imagem mostra a artéria subclávia (seta branca), o plexo nervoso / braquial frénico (seta preta), e o esternocleidomastoideu pálido (seta amarela). (G) desenhos animados que descreve a localização dos músculos mais profundos (ou seja, escaleno médio, escaleno anterior, e SCM), artéria subclávia, e nervo frênico. O escaleno posterior não é visível. Estes podem ser acessados somente quando o SUPERFICImúsculos al (em D e E) estão afastados. (H) Fazer um bolso para o transmissor usando a tesoura de ponta romba. (I) transmissor Inserida na bolsa subcutânea, com os condutores paralelos posicionado emergentes do bolso. (J) a inserção da agulha de calibre 25 para o escaleno, perpendicular às fibras musculares, para formar um túnel para o condutor do fio. (K) Os dois condutores inseridos no músculo escaleno. tampões de chumbo são posicionados na extremidade e colado no lugar. (G) A inserção da agulha de calibre 25 para o trapézio, perpendicular às fibras musculares, para formar um túnel para o condutor do fio. (M) Todos os quatro condutores inseridos nos músculos e trapézio escaleno e encontra-se plana antes do encerramento da incisão. (N) totalmente recuperado do rato, com a via subcutânea transmissor posicionado na parte de trás. (O) gravar, simultaneamente, pletismografia, a actividade EMG do músculo, umand vídeo usando uma câmara de pletismografia (seta amarela), telemetria receber almofada (seta vermelha), e a câmara (seta preta), respectivamente. Um fluxo de polarização multifuncional está ligado à câmara de pletismografia por meio de um tubo de plástico (seta azul) para fornecer oxigénio para o rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Protegendo Caps liderança com Adesivo de cianoacrilato. (A) Aplicar uma pequena gota de cianoacrilato (círculo roxo) para o fio exposto do cabo do eléctrodo (E) proximal do fio para o músculo. (B) rapidamente deslizar a tampa de chumbo preparado (LC) para o fio exposto sobre o adesivo de cianoacrilato de modo que a tampa de chumbo é posicionado directamente adjacente ao músculo. (C) Apare fora uma pequena porção da extremidade distal da tampa de ligação e o fio de modo que não há eléctrodo exposto presente que não é isolado com plástico. (D) Aplicar uma pequena gota de adesivo de cianoacrilato para a extremidade da tampa de chumbo. Remover a extremidade distal-aparado fora da tampa de chumbo a partir do animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Análise da ARM EMG e pletismografia
- Abra o software de análise e analisar o arquivo de interesse (Vá em "Arquivo" e escolha "Abrir arquivo de avaliação"). Filtrar os sinais de EMG usando um filtro de alta freqüência de 30 Hz com o botão direito do mouse sobre o traçado EMG, escolhendo "Analisar Atributos", destacando "Atributos avançados 1" na guia, e mudar o filtro passa alta de 30 Hz.
NOTA: Este passo de filtragem remove não discriminar, informação de baixa frequência. Localizar áreas de inactividade do rato por inspecção visual com base na falta de movimento no ficheiro de vídeo sincronizado e a ausência de grandes alterações de pressão, devido ao movimento irregular no rastreio pletismografia (caixa vermelha na Figura 3A); inatividade ocorre quando o mouse está dormindo ou acordado, mas ainda. - Identificar ataques EMG de forma independente para cada músculo.
- Rectificar e integrar o sinal de EMG filtrada sobre 30 ms (Figura 4).
Observação: Uma vez que os ratinhos respirar a uma taxa de 3 Hz, cada respiração é representado por aproximadamente 11 valores integrados. - Determinar a amplitude da linha de base EMG pela média dos valores corrigidos e integrados associados com o sinal de EMG durante um período de 3 segundos quando o rato é inactiva e o traço mostra pletismografia eupnéica (respiração normal) (Figura 4).
- Identificar "ataques" de actividade definida por, pelo menos, 3 valores consecutivos rectificadas e integrados que são, pelo menos, um 5aumento 0% acima da linha de base do sinal de EMG (determinado no passo 6.3.2).
NOTA: Três valores consecutivos representam uma janela de 90 ms, mas algumas lutas conterá mais de 3 valores acima do limite e vai durar mais tempo do que 90 ms. - Usar o vídeo e pletismografia traço sincronizado para excluir ataques que ocorrem durante suspiros (Figura 3B); cheirar (Figura 3C); ou os movimentos do rato volicionais, tais como a cabeça ou transformando preparação.
- Repita os passos 6.3.1 - 6.3.4 para o segundo muscular.
- Rectificar e integrar o sinal de EMG filtrada sobre 30 ms (Figura 4).
- Calcular a frequência de ataque para cada músculo. Registo a) o início e tempo de fim de cada período de tempo inactivo e b) o tempo de cada ataque ocorreu utilizando os critérios acima referidos. Soma o tempo de inatividade total. Divida o número total de ataques pela min total de tempo inativo no decorrer da sessão de gravação para calcular a frequência de ataque.
- Determinar se as alterações na ventilação estão associados com a activação do m gravadouscles.
- Seleccionar os parâmetros da respiração para ser medida (por exemplo, pico de fluxo inspiratório, volume corrente, volume minuto, e respirações por minuto).
NOTA: Todas as seleções possíveis pode ser encontrada no menu suspenso Configuração P3 em "parâmetros derivados." - Identificar as respirações que ocorrem durante a actividade EMG ataque e as respirações que ocorrem durante a actividade da linha de base EMG (Figura 4).
- Criar segmentos analisador abrangendo respirações pletismografia que estão associados com a atividade ataque EMG e criar segmentos analisador independentes que estão associados com a atividade EMG linha de base. Certifique-se de definir o tipo de análise a "Analisador Seg."
NOTA: Esta seleção é encontrado no menu suspenso Configuração P3 em "Setup redução de dados." - Marcar o início de cada segmento analisador com um evento clicando com o botão direito sobre o traço pletismografia. Especificar um ataque contendo segmentos analisador como "Evento 1" no menu suspenso e specify os segmentos do analisador de referência como "Evento 2" para distinguir as duas classes de segmentos.
- Sob o menu "Funções", salvar a "Seção marcas" e "marcas derivadas de dados." Sob o menu Dados Analisador, salvar o "Arquivo Parsed comentário" e "Parsed Derivado de dados."
NOTA: Os parâmetros da respiração selecionados para cada respiração indivíduo são encontradas na folha de dados derivados marcas na guia "derivações". - Comparar os parâmetros respiratórios para respirações que ocorrem durante ataques ARM (marcados como Evento 1) versus respirações que ocorrem durante a actividade da linha de base (marcado como Evento 2) para determinar se a actividade do músculo é associado a alterações na ventilação.
- Seleccionar os parâmetros da respiração para ser medida (por exemplo, pico de fluxo inspiratório, volume corrente, volume minuto, e respirações por minuto).
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Representative Results
O protocolo descrito foi usado para implantar um dispositivo de telemetria e para gravar escaleno e trapézio EMG, WBP, e de vídeo de um rato SOD1 (G93A) modelo de ALS. Os períodos em que o animal é inactivo (por exemplo, não se move) foram identificados utilizando a gravação de vídeo e confirmado pela falta de actividade de movimento relacionadas com o traço em WBP (Figura 3A). Os períodos inactivos incluem o tempo gasto no sono REM ou não-REM do sono, bem como o tempo gasto acordado mas ainda (Figura 3A). Actividade EMG durante este tempo inactivo foi marcado como um ataque quando, pelo menos, 3 consecutivos rectificadas e integrados (mais de 30 ms) tinha valores amplitudes com, pelo menos, um aumento de 50% em relação aos níveis de linha de base de EMG (Figura 4). Crises de actividade que ocorreram durante ou suspiros cheirar (determinado por pletismografia), ou movimentos volicionais (avaliadas por vídeo) foram excluídos da análise (Figura 3B-C). SOD1 (G93A) em ratinhos eArly- para fases mid-sintomática (Tabela 1) exibem ataques de aumento da actividade do ARM em repouso que durar de uma a várias respirações (Figura 4). Crises de actividade do ARM são raros em SOD-1 pré-sintomática (G93A) (Figura 3A) ou ratinhos de tipo selvagem 10.
| Etapa | Estado | Stage Onset | Apresentação dos membros posteriores |
| 0 | Pré-sintomático | <P100 | Não há diferenças notáveis em comparação com tipos selvagens. |
| 1 | O início da doença | ~ P100 | colapso do membro posterior quando ratinho é suspenso a partir da cauda. |
| 2 | Paresia | ~ P120 | colapso hindlimb total ou parcial com aparência de tremor. | </ Tr>
| 3 | paralisia início | ~ P140 | curta dificuldade, curling dedo do pé e / ou arrastando pé. |
| 4 | paralisia avançada | ~ P150 | movimento articular mínima, hindlimb não está sendo usado para o movimento para a frente. |
| 5 | Estágio final | ~ P160 | Rato incapaz de endireitar-se de um lado dentro de 30 segundos. |
Tabela 1. Pontuação neurológica de ALS de tipo progressão da doença em SOD1 (G93A) Ratos.
Figura 3. Representante LSP e EMG Traços. (A - C) LSP e EMG do músculo escaleno e trapézio a partir de um de SOD-1 pré-sintomática (G93A) de ratinho (P98 idade). Períodos de (A) quando T Ele animal está em repouso (caixa vermelha) são utilizados para análise. Traços fora da caixa vermelha mostram picos grandes e irregulares na atividade vestígios de pletismografia e muscular no EMG traça, típica quando um animal está em movimento, tal como determinado por gravações de vídeo sincronizadas (não mostrado). A caixa vermelha mostra EMG traça falta ataques EMG, característica de um rato pré-sintomático. (B) Bouts de actividade EMG ocorrem frequentemente precede directamente um suspiro (como mostrado no traço pletismografia). Suspiros são caracterizados por inspiração de alta amplitude seguido por expiração dramático. A seta preta aponta para um sinal de ECG característico. (C) Bouts de actividade EMG ocorrem frequentemente, enquanto o rato é cheirar. Fungar reflecte-se no rastreio de pletismografia por um aumento prolongado tanto em frequência e amplitude sobre o múltiplas respirações (co-ocorrem com rajadas de actividade EMG).color = "# 0066CC"> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Pontuação Bouts de EMG Actividade. (A e B) Dois exemplos de WBP, filtrada vestígios trapézio EMG, e rectificado e sinais integrados trapézio EMG a partir de um SOD1 sintomática (G93A) de ratinho (P126 idade). Azul linhas pontilhadas indicam o nível de linha de base de EMG, determinada pela média sinais rectificados e integrados ao longo de um período de tempo de 3 s. linhas a tracejado vermelhas indicam um aumento de 50% na amplitude da linha de base em relação à actividade EMG. Um ataque de actividade é marcado quando, pelo menos, 3 valores consecutivos rectificadas e integrados exceder o limiar da linha de base de 50%. Por favor clique aqui para ver alversão Arger desta figura.
| PIF (mL / s) | TV (mL) | MV (mL / min) | A frequência respiratória (respirações / min) | |
| Ingénuo (n = 5) | 4,4 ± 0,7 | 0,27 ± 0,04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Implantado (n = 4) | 4,1 ± 0,2 | 0,27 ± 0,11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P-valor | 0,439 | 1.000 | 0,893 | 0.410 |
| Os valores apresentados reflectem a média ± SD. Os valores P foram calculados com um teste t de Student. | ||||
Tabela 2. Comparação de Respiração Entre Ingénuo (não implantado) e implantadas Fase 4 SOD1 (G93A) Ratos. Não foram encontradas diferenças significativas no pico de fluxo inspiratório (PIF), volume corrente (TV), volume minuto (VM), ou respirações por minuto entre os dois grupos. Os valores apresentados reflectem a média ± DP. Os valores P foram calculados com um teste t de Student.
As medidas repetidas de EMG e / ou WBP pode ser feita no mesmo rato ao longo de vários meses, com muito pouca alteração no sinal EMG ou de linha de base depois de um período de recuperação de 1 a 2 semanas após a cirurgia. O decurso de tempo é tipicamente limitada pela vida útil da bateria e, assim, irá ser determinado pela frequência e duração das gravações individuais. Os investigadores devem estar cientes de que eventos adversos devido ao dispositivo implantado podem ocorrer ocasionalmente. O rato pode puxar para fora os fios do músculo implantado ou zero / mastigação na pele se os condutores ou transmitirTer são indevidamente colocado. Na maioria dos casos, considerações éticas ditam que estes animais serem sacrificados. O transmissor pode ser removido, esterilizado, e re-implantado no outro rato.
Para verificar que o implante do dispositivo não afecta a respiração, as medições da pletismografia entre SOD1 ingénuo (G93A) ratinhos (não implantado) no ALS fase 4 e ratinhos implantados SOD1 (G93A) no ALS fase 4 foram comparados. Não foram encontradas diferenças significativas no pico de fluxo inspiratório (PIF), volume corrente (TV), volume minuto (VM), ou respirações por minuto entre os dois grupos (Tabela 2). O escaleno e trapézio são adjacentes uns aos outros e estão directamente em contacto uns com os outros. Embora ataques EMG simultâneas são, por vezes, observada em ambos os músculos, fortes ataques EMG também são detectados no trapézio quando ataques EMG estão ausentes no escaleno (e vice-versa), o que demonstra que existe mínimo conversa cruzada entre os eléctrodos implantados in cada músculo. também são observadas crises independentes da actividade EMG em que as ligações são colocados no trapézio e esternocleidomastoideo (dados não mostrados).
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Discussion
O procedimento aqui demonstrado permite a medição não invasiva (após o implante cirúrgico inicial do transmissor) da actividade dos músculos respiratórios e de ventilação ao longo de muitos meses, no mesmo animal. Esta técnica tem várias vantagens sobre as técnicas de EMG padrão em ratos anestesiados: 1) os ensaios requerem menos ratinhos e proporcionam a capacidade de gravar os dados a partir do mesmo local, em um único rato através de estádios da doença (em vez de utilizar vários ratinhos em diferentes estios de doen); 2) análise dos dados pode ser realizada com os testes estatísticos mais poderosas (por exemplo, por meio de medidas repetidas em vez de comparar os grupos experimentais separados); 3) a gravação simultânea de EMG e WBP permite a avaliação directa dos efeitos da actividade do ARM de ventilação; e 4) as expericias podem ser realizadas em ratinhos em diferentes estados de sono / vigília. Além disso, porque os ratos saudáveis têm uma muito baixa frequência de ataques ARM em repouso, esta técnica é cApable de detectar mesmo as pequenas mudanças na frequência de actividade de ARM em ratinhos modelo de ELA em fases precoce sintomáticos da doença de 10. No entanto, porque esta técnica mede a actividade de um número grande, mas desconhecida de fibras musculares durante o comportamento natural, em vez da seguir à estimulação do nervo em intensidades experimentalmente controlados, ele não é adequado para estimar o tamanho da unidade de motor ou número. Outra limitação é que os transmissores-base de telemetria adequados para implantação em ratinhos estão actualmente limitadas a dois conjuntos de condutores de biopotenciais; assim, apenas dois locais pode ser gravada a partir do mesmo rato. Para as experiências que requerem a gravação simultânea de mais do que dois músculos do mesmo rato, várias ligações eletromiográficas pode ser implantado e ligado a um sistema de aquisição usando uma corda de arame, como anteriormente descrito 14, 15. No entanto, seriam necessárias modificações na câmara de pletismografia ou vedações para permitirpara a gravação simultânea da actividade muscular e ventilação se um rato fica presa.
Ao aplicar esta técnica, certos passos do protocolo deve ser realizado com cuidado. leads biopotenciais devem ser colocados de modo a não impedir o movimento ou irritar a pele sobrejacente. Além disso, o transmissor deve ser posicionado de modo que ele não afecta o movimento normal ou postura do rato. Recomenda-se que o posicionamento adequado dos condutores (isto é, totalmente incorporados no músculo correcta e não em contacto com os músculos adjacentes) e a ausência de danos ou infecção muscular são verificados por autópsia após a experiência foi terminada. Além disso, é imperativo que o transmissor é desligado após cada sessão de gravação para conservar a vida da bateria.
Uma consequência inevitável de medição de EMG a partir de músculos na região do peito e pescoço é a elevada probabilidade de sinais de gravação de electrocardiograma (ECG), que aparecem como regular picos dentro do traço EMG (Figura 3B, seta). sinais de ECG pode ser minimizado pela colocação cuidadosa dos condutores de tal modo que todo o metal é totalmente incorporados no músculo e evitando colocação perto de grandes vasos sanguíneos. Implantação de leads em músculos do lado direito do corpo, em vez de à esquerda, que é mais perto do coração, também pode reduzir os sinais de ECG. Embora o sinal do ECG podem ser filtrados de EMG traços usando algoritmos computacionais ou subtraindo um sinal gravado independentemente ECG 19, 20, 21, não é normalmente necessário. O sinal de ECG pode ser prontamente distinguido do sinal de EMG por sua forma normal, a frequência e amplitude.
A técnica descrita tem sido utilizado para medir alterações na actividade de ARM em repouso no (G93A) modelo de rato SOD1 de ELA 10. musculatura respiratória acessória também são recrutados em otsuas doenças neuromusculares (por exemplo, distrofia muscular, atrofia muscular espinal, as neuropatias periféricas, etc.) e nervosas seguinte ou danos na espinal medula. actividade do ARM pode, portanto, servir como um indicador para medir deficiência funcional do diafragma e avaliar a gravidade da doença, monitorar a recuperação de uma lesão, ou avaliar os potenciais benefícios de tratamento para melhorar a respiração em uma variedade de modelos de doen animal ou ferimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Apoio para este trabalho foi fornecido pelo Prêmio Trustee Hospital Medical Center Infantil Cincinnati para SAC e uma bolsa de formação NIH (T32NS007453) para VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
- Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
- Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
- Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
- Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
- Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
- Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
- Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
- Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
- Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
- Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
- Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
- Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
- Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
- Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).
