Summary
이 논문은 이식 된 원격 장치를 통해 전신 혈량 측정법 및 근전도와 질병 진행에 걸쳐 자유롭게 행동 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 마우스 모델에서 인공 호흡기 근육 활동의 측정을 반복하는 방법을 소개한다.
Abstract
액세서리 호흡 근육은 횡격막 기능이 손상 될 때 환기를 유지하는 데 도움이됩니다. 다음의 프로토콜은 몇 주 또는 보조 호흡 근육 활동의 달 동시에 비 마취, 자유롭게 행동 마우스 환기를 측정하면서 이상 반복 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 무선 송신기의 이식 수술을 포함하고, 전극의 삽입이 흡기 근육의 근전도 활성을 측정하고 부등변 승모근 근육으로 이어지는. 환기 전신 혈량 측정법에 의해 측정하고, 동물의 움직임이 영상에 의해 평가되고, 근전도 활성과 동기화된다. 근 위축성 측삭 경화증의 마우스 모델에서 근육 활동 및 환기의 측정이 도구는 시간이 지남에 따라 어떻게 호흡 근육 활동의 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다 및 환기에 근육 활동의 영향을 평가하는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다. 설명 된 방법은 전자 수asily 다른 근육의 활동을 측정하기 위해 또는 질병이나 부상의 추가 마우스 모델에서 보조 호흡 근육 활동을 평가하기 위해 적용 할 수.
Introduction
액세서리 호흡 근육 (팔) 수요 (예를 들어, 운동)의 시간 동안 환기를 증가시키고 다이어프램 기능이 부상 또는 질병 1, 2 다음 손상된 경우 환기를 유지하는 데 도움이됩니다. 조리개 기능에서의 변경은 물론 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 환자 및 마우스 모델에서 설명되었지만 3, 4, 5, 6, 훨씬 ALS는 팔의 활성 또는 기능에 대해 공지되어있다. 그러나 한 연구는 팔을 모집 ALS 환자 7 그렇지 않은 유사한 다이어프램 부전보다 더 나은 예후를 제안했다. 또한, ARM 활성 마비 다이어프램 (8)의 경우 호흡 충분하다. 이 연구는 ARM 기능을 확대하는 전략이 breathi을 향상시킬 수 있음을 나타냅니다신경 근육 질환, 척수 손상, 또는 격막 기능이 손상되는 다른 조건으로 고통받는 환자에서 NG. 그러나 호흡 ARM 모집을 제어하는 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 방법은 호흡 기능과 팔을 모집하는 방법을 연구하는 데 필요한 질병이나 부상의 동물 모델에서 시간이 지남에 따라 ARM 활동의 변화를 측정 할뿐만 아니라, ARM 모집 및 환기를 개선하는 치료법을 평가. 또한, 조리개 기능의 점진적 감소와 일치 아암의 증가 활성은 ALS 7, 9, 10과 같은 신경 근육 질환의 질환 진행을위한 유용한 바이오 마커 일 수있다.
이 프로토콜은 비 침습적 인 방법으로 깨어 행동 쥐 호흡 근육 및 환기의 활성을 측정 반복 (초기 수술) 등을 설명한다. electromyograph의 동기화 기록Y (EMG)를 전신 혈량 측정법 (WBP), 비디오는 조사자 ARM 활성 충격 환기 어떻게 변화를 평가하고, 피사체가 정지하거나 움직이는 경우에 판별 할 수있다. 이 방법의 주요 장점은 EMG는 13 마취를 필요로하고 /하거나 단말기 (11) 절차 12이다 측정하는 어떤 다른 방법이있는 반면, 깨어 행동 마우스에서 수행 될 수 있다는 것이다. 시간이 지남에 따라 웨이크 마우스의 EMG 활동 기록은 마우스 획득 시스템 (14), (15)에 배선에 의해 속박되는 EMG의 만성 이식 리드를 통해 달성 될 수있다. 정상적인 운동 또는 행동을 방해 할 수있는 마우스를 더링하는 표준 실 혈량 측정법과 양립 할 수 없기 때문에, 전술 한 방법은 무선으로 획득 시스템의 EMG 신호를 송신하는 원격 측정 장치를 사용한다. 송신기 수배터리 전원을 절약하기 위해 자석을 켜거나 끌 수 몇 개월 동안 EMG 활동의 측정을 반복 허용한다. 이 프로토콜은 쉽게 다른 근육에 이르게 EMG를 삽입함으로써 추가의 호흡 또는 비 호흡기 근육의 활동을 측정하도록 구성 될 수있다. 대안 적으로, 두 개의 리드들 중 하나는 슬립 상태를 평가 또는 발작 (16)를 식별하는 EEG 활성을 측정하기 위해 사용될 수있다. 이 기술은 성공적으로 ALS의 마우스 모델에서 질병의 진행에 걸쳐 휴식 ARM 활동의 변화를 측정하고 건강한 쥐 10 ARM 활동을 운전 키 뉴런을 식별하는 데 사용되었다.
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Protocol
실험 절차는 신시내티 아동 병원 의료 센터 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 NIH 가이드를 준수하여 실시 하였다.
1. 원격 측정 장치 임플란트 수술 준비
- 개인 보호 장비 (즉, 스크럽, 신발 커버, 가운, 헤어 네트, 마스크, 수술 장갑)를 착용 할 것.
참고 :이 수술은 멸균 필드가 필요합니다. - 인큐베이터를 켭니다 (서보 제어 가습기 / 유아 인큐베이터는 29 ° C로 설정) 및 건조, 흰 수건에 맞춰 그것을 복구를위한 적절한 온난화을 허용 할 수 있습니다.
- 수술 전에 에틸렌 옥사이드 모든 수술기구 소독 및 사용 전에 효소 세제, 화학 살균제 (또는 제조자에 의해 지정된)와 송신기 살균.
참고 : 수술 악기 # 2 후궁 절제술 포셉 (표준 팁 / 스트레이트 / 12cm) (4 개)를 포함해야한다, 좁은패턴 포셉 (톱니 / 커브 / 12 cm), 조직 분리 위 (직진 / 평활 평활 / 11.5 cm), 및 메스 홀더 블레이드. 좋은 상태에서 수술 도구를 유지하기 위해 송신기의 와이어를 처리하기위한 전용 예약 소독 장비 (이 # 2 집게와 가위)의 별도의 세트를 가지고하는 것이 좋습니다. - 허용 살균제 수술 시야 내 모든 표면을 소독. 수술 분야에서 스테레오 해부 현미경, 이소 플루 란 마취 기계, 수술 도구, 가위 (재료의 표 참조) 놓습니다.
- 마취 스테레오 해부 현미경 앞에 멸균 수건하에 가열 패드 또는 물 담요를 배치하는 동안 마우스 체온을 유지한다.
- 송신기가 사용하기 전에 완벽하게 작동하는지 확인합니다.
참고 : 및 해제 장치를 켜집니다 송신기의 2 내에 배치 작은 자석. 송신기는에와 라에 가깝게 유지하는 경우500 Hz에서 AM 주파수 설정 DIO, 그것은 연속 고음 윙윙 거리는 소음을 방출한다. 배터리 수명을 절약 동물에 주입하기 전에 배터리를 끄십시오. - 전극은 (도 1a) (목표 근육에 도달 할 정도로) 납 약 3cm가되도록 와이어 운반을 위해 예약 위 원위 리드 트리밍 수술 전에 리드 준비한다. 대안 적으로, 상기 장치에 인접 와이어를 코일 uncoiled 리드 약 3cm가되도록 봉합 함께 묶을.
주의 : 단계 1.9에 기재된 바와 같이, 전극의 트림 오프 부는 "리드 캡"(플라스틱 절연 케이싱)를 준비하기 위해 리드 저장한다. 단계 3에서, 송신기 리드 때문에, 근육을 통해 삽입되며, 와이어의 선단이 노출 부분은 제 위치에 유지 캡과 리드를 사용하여 절연되어야한다. - 와이어 자체를 절단하지 않고 플라스틱 커버 0.5 cm 잘라내 메스를 사용한다. fo를 예약 도구를 사용하여R 와이어 처리는 리드 (4)의 단부를 스트레칭 - 그들은 25 게이지 바늘 (도 1B-B '')의 내부에 용이하게 적합하도록 원래 길이의 5 배. 길이가 0.5 cm가되도록, 리드의 노출 된 와이어를 낸다.
- 수술 전에 리드 캡 (플라스틱 튜브 와이어 다루 끝나는) 준비한다. 전극의 세그먼트를 둘러싸는 플라스틱 하우징으로부터 0.25 cm 길이의 튜브를 트리밍 메스를 사용하여 단계 170에서 저장 리드.
참고 : 네 리드 캡이 이식을 받게 될 것이다 각 마우스 필요하지만 캡의 두 배에 필요한 양을 준비하는 것이 좋습니다된다. 추가 무균 준비 리드 캡을 갖는 리드 캡을 확보하는 첫 번째 시도에 실패하는 경우에 도움이된다. - 삽입 된 송신기의 일련 번호를 기록하고 보정 정보와 함께 원래의 포장을 저장합니다. 각각의 송신기는 EMG 기록을위한 다른 주파수 보정을 갖고; 허용되는 EMG를 얻기 위해 수집 소프트웨어에 이러한 입력녹음.
2. 수술 마우스를 준비
- 이식에 대해 원하는 마우스를 선택합니다 (즉, SOD1 (G93A) 또는 제어) 및 동물의 무게.
참고 : - 각각 P120 및 ≥ 24g이 수술을받은 (남성 또는 여성) 마우스의 권장 연령과 체중은 P56입니다. - 2 L / min의 산소 유속으로 3.5 % 이소 플루 란 하에서 마취 마우스. 발가락 핀치와 마우스가 완전히 마취되어 있는지 확인하기 위해 꼬리 핀치를 수행합니다.
- 일단 마취, 1.5 %의 이소 플루 란 레벨 / 분 1 L의 산소 유량을 설정하여 노즈콘을 통해 마취를 드롭 박스에서 마우스를 제거하고 유지한다. 마취가 유지되고 있는지 확인하기 위해 발가락 핀치 및 / 또는 꼬리 핀치를 수행합니다.
- 수술 중 건조에서 눈을 방지하기 위해 윤활유 안과 연고를 적용합니다.
- 귀와 어깨 (그림 1C) 사이에 수술 부위를 노출 마우스를 면도.
- 대체 이소프로판올 먼저 살균제로 소독 한 후, 수술 부위를 보라고. 2 번 더 반복합니다.
3. 기록 부등변과 승모근 EMG 활동에 대한 원격 측정 장치를 주입하는
- 가열 패드를 덮는 멸균 패드 위에 옆으로, 해부 현미경 아래 동물을 배치하고, 테이프 대신에 노즈콘을 확보. 이 심장에서 발생하는 ECG 신호를 줄이기 위해 오른쪽을 이식하는 것이 가장 좋습니다 있습니다.
참고 : 호흡을 모니터링하고 필요한 경우 규칙적인 호흡 속도와 마취의 적절한 수술 비행기를 유지하기는 이소 플루 란 레벨을 조정합니다. - 몸통을 따라 동측 발쪽으로 앞다리를 당깁니다.
참고 :이 위치는 s의 수술에 대한 액세스를 제공, 꼬리 쪽 견갑골 변위calene과 승모근의 근육.- , 무딘 곡선 집게를 가지고 수술 부위에 전면 발 동측를 다시 개최, (그림 1C) 장소에 발을 테이프. 앞발은 절차의 기간 동안 보안이 있는지 확인하려면 강력한 접착제 외과 테이프를 사용합니다.
- 수술 장갑의 새로운 쌍에 넣습니다. 어깨와 귀 (그림 1C에서 빨간 선) 사이에 사선 절개 약 2cm 길이를 만들기 위해 메스를 사용합니다.
- 지방 패드를 위로 당기고 승모근과 활 경근 근육을 벌리 개의 2 절제술 집게 각 손을 사용 흉쇄 및 부등변 근육 (도 1d 및 E)을 덮는 밴드를 노출시킨다.
- 부등변 근육을 식별하는 랜드 마크로서 창백한 흉쇄 근육과 횡격막 신경을 사용합니다. 흉쇄가 infe 거짓말 동안 횡격막 신경이 부등변 근육에 병렬로 실행합니다rior. 부등변 근육이 승모근의 근육 아래에있는 갈비뼈 경추에서 비스듬하게 실행합니다. 바이오 포텐셜 리드 횡격막 신경 (도 1F 및 G)에 인접하여 실행되는 근육으로 식별 할 수있는 전방 부등변 근육에 삽입한다.
참고 :주의. 이 지역은 매우 혈관이며,주의가 쇄골 하 동맥을 절단하지 않도록주의해야합니다. 횡격막 신경 및 상완 신경총 손상을 피하십시오. - 부등변 및 승모근 근육 (그림 1G) 확인 된 후에는 scapulas 사이 동물의 뒷면에 송신기를위한 피하 주머니를 만든다.
- , 조직 분리 가위를 사용하여 피부 바로 아래에 가위의 뭉툭한 끝을 삽입하고 주머니가 송신기의 약 1.25 배 폭을 (그림 1H)이 형성된다 열 때까지 확산.
주 : 송신기는 최소한의 저항을 삽입하지만, 두창한다등은 송신기가 스스로 움직일 수 있도록 큰해서는 안됩니다. 주머니가 너무 작 으면, 송신기는 피부를 긁어 동물하라는 메시지를 표시 및 / 또는 리드를 당겨 수 있습니다 자극을 일으키는 원인이되는 피부에 문질러 수 있습니다. 주머니가 너무 큰 경우, seromas가 형성 수도 있고, 송신기는 불리한 위치로 마이그레이션 할 수 있습니다.
- , 조직 분리 가위를 사용하여 피부 바로 아래에 가위의 뭉툭한 끝을 삽입하고 주머니가 송신기의 약 1.25 배 폭을 (그림 1H)이 형성된다 열 때까지 확산.
- 따뜻한 멸균 식염수로 세척하고, 근육에 대해 평탄면을 상기 송신기를 삽입한다. 이 평평하고, 와이어 꼬임 (도 1I)보다는 서로 포켓 병렬에서 등장하도록 상기 송신기를 배치. 장치에서 와이어의 초과 길이 컬과 평면을 배치.
- 바이 포텐셜 리드의 두 세트가 서로 평면과 평행하게 놓여 있도록 부등변 및 승모근 근육 송신기로부터 리드를 실행.
- 주변의 근육에서 전방 부등변을 분리 추궁 절제술 집게를 사용하고 부등변 뮤스를 통해 25 게이지 바늘을 삽입CLE, 근육 섬유에 수직.
- 니들의 선단부에 한 리드를 삽입하고, 와이어 (도 1J 및 K)의 절연에 근육까지 삽입 리드 남기고 근육에서 바늘을 당긴다. 색 리드하는 근육에 삽입 기록.
- 리드가 삽입 근육에 가까운 와이어의 노출 된 단부에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울을 배치하고, 더 와이어 리드 캡 및 근육 (도 2A 사이에 노출되지 않도록 신속하게 전선을 통해 리드 캡을 밀어 및 B).
참고 :이 EMG는 시아 노 아크릴 레이트 (17), (18) 리드 지키기 위해 받아 연습이지만, 다른 방법은 주위에 실크 봉합사 매듭을 매서 장소에 리드 캡을 확보하는 것입니다. - 캡을 초과 와이어 선단부를 트림 리드 캡 / 와이어의 단부에 시아 노 아크릴 레이트 접착제 방울을 적용한다. 접착제주세요시간 (도 2C 및 D)를 해제하기 전에 중합.
- 거리 1 리드로부터 2mm - 동일한 단계 (단계 3.10-3.12) 같은 근육 제 반대 극성 리드 평행 삽입 1 따른다.
- 단지 부등변 근육 (그림 1L) 및 (M)에 전방에있는 승모근의 근육에 리드를 삽입하는 3.12 - 반복 3.10 단계를 반복합니다.
- 와이어 리드가 제자리에 고정되어 있는지, 그리고 리드 당겨없이 신체의 움직임을 수행 할 수있는 동물의 리드에 충분한 여유가 있는지 확인하십시오. 이 처음으로 동물을하라는 메시지를 표시하거나 리드를 당겨 수 있습니다 자극을 일으킬 수 있기 때문에 리드의 초과 길이가 피부에 밀어하지 않음을 확인합니다. 필요한 경우 잠재적 인 불편 함을 방지하기 위해, 리드 위치를 조정합니다.
- 부드럽게 앞다리를 누른 상태에서 테이프를 제거합니다. 다시 근육을 통해 지방 패드를 당겨 삽입 된 리드를 충당하기 위해 그것을 사용할 수 있습니다. 놀리는에 의해 시아 노 아크릴 레이트 접착제로 절개를 닫습니다피부 플랩 다시 함께 지금까지 절개 라인이. 곡선 집게 함께 피변의 부분을 조이고,이 라인을 따라 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 라인을 적용한다.
- 동물이 마취하에있는 동안 수술후 통증을 완화하기 카프로 펜 0.1ml를 피하 주입한다.
참고 : - 그 후 필요에 따라 다음 이일 후 수술 및 1 하루에 한 번 카프로 펜 0.1 mL로 관리하기 위해 계속합니다. - 노즈콘으로부터 동물을 제거하고 동물 깨어 자발적 케이지 주위로 이동 될 때까지 예열 인큐베이터에서 클린 케이지에 배치. 그 움직임과 경보 모니터링, 이후 적어도 15 분 동안 인큐베이터에서 동물을 유지합니다.
4. 수술 후 케어
- 하우스 동물 별도로 수술을 다음과 같습니다. 다이어트 젤과 물 병 동물을 치유 제공합니다.
- 수술 후 처음 30 분 동안 동물을 모니터링합니다. 동물 적어도 매 시간 F에 확인또는 수술 후 5 시간. 수술 후 일 년에 적어도 하루에 두 번 확인합니다.
- 괴사, 감염을 따라 절개하여 이식 (예, 열, 부종, 발적)를 포함하는 체강 내의 및 장액 형성에 손목 시계.
참고 :이 증상은 수술 후 첫 주 이내에 발생합니다. 수술 후 건강한 치유 동물 일개월 그림 1N에 표시됩니다. EMG 녹음은 이식 후 즉시 할 수 있지만, 동물은 ECG 신호가 즉시 이식 후 높은 수, EMG 및 체적 변동 측정기를 기록하기 전에 치료하는 적어도 하나의 주 주어진다.
5. 취득 동시 근전도 및 혈량 측정법 신호
- 바이어스 흐름을 포함한 모든 수집 장비를 켭니다.
주 : 생쥐의 유량이 통상적 / 분 1.0 L로 설정된다. - 유량계 혈량 측정법을 사용하여 실 (S)을 보정한다.
참고 : 정기적으로 혈량 측정법의 chambe을 확인RS는 물개가 금이 가거나 파손되지 않았는지 확인합니다. 코트 등 한번 진공 그리스와 같은 윤활제와 고무 씰 일주일은 좋은 상태를 유지합니다. - 제조자에 의해 지정된 입력 송신기 교정.
- EMG와 혈량 측정법을 기록하기 전에 그것을 적응 적어도 1 시간에 대해 실 혈량 측정법에 마우스를 놓는다. 다중 챔버를 사용하여, 다음 마우스가 제 2 챔버에서 acclimating 중에 한 마우스에서 기록 할 수있다. 배터리 전원 (그림 1O)을 보존하기 위해 적응 기간 동안 송신기를 켜지 마십시오.
- 이전 (그러나 보정 후)의 레코딩, 주입 된 동물에서 1 내의 강한 자석을 배치하여 상기 송신기를 켜; 송신기가 켜져있을 때, 수신기의 전면에 붉은 빛을 나타낼 것이다.
- "취득"이라는 풀다운 메뉴를 사용하여 수집을 시작하고 "인수를 시작합니다." 녹화 시간은 수 있지만3 시간 - 실험에 의해 달라질 전형적인 혈량 측정법 및 EMG 기록 1 지속된다.
주 : 송신기는 240 Hz에서의 고유 샘플링 속도를 가지고 있습니다. 500 Hz의 빠른 속도는 점을 보간하고 부드러운 파형을 제공하기 위해 소프트웨어로 설정된다. 로우 패스 필터 (즉, 안티 앨리어싱 필터로서 작용) 및 임플란트에 하이 패스 필터는이 원격 장치의 1 내지 50 Hz의 대역폭을 지정. 임플란트 배터리 구동되며 동물이 이식 실드 전기장 유도하기 때문에, 60 Hz의 A / C는 간섭 EMG 신호의 노이즈에 기여하지 않는다. 혈량 측정법, EMG, 비디오가 자동으로 수집 소프트웨어를 통해 실시간으로 동기화됩니다. - 인수가 완료되면, 자석 송신기의 전원을 끄고 챔버에서 동물을 제거합니다.
- 다른 녹음을 시작하는 경우, 챔버를 청소 다음 동물의 새로운 송신기 교정에 입력하고 두 번째 녹화를 시작합니다. 지느러미하면하루에 인수 ished 송신기를 끄고 혈량 측정법 챔버를 청소하고 모든 수집 장비 및 바이어스 흐름을 끕니다.
텔레 메 트리 장치 그림 1. 주입은 호흡 근육의 EMG를 측정합니다. 바이오 포텐셜 두 쌍 (A) 텔레 송신기 EMG를 측정하도록 이끈다. 리드는 원하는 길이 (아래)에 트리밍 또는 코일 및 상기 송신기 (위) 아래에 꿰매어 수있다. (B) 송신기 리드. (B ')는 배선을 노출하는 리드 캡을 트리밍 오프 플라스틱 절연체 (삽입)로 이끈다. (B는 ''4) 연신 와이어와 리드 - 원래 길이의 5 배. 그들은 0.5 cm 길이 (도시하지 않음)가되도록 리드는 손질해야한다. (C) 마우스는 면도 수술 부위와 수술 준비를 제대로위치 앞발. 빨간색 점선은 절개 사이트를 나타냅니다. (D) 초기 절개 다음 볼 지방 패드와 근막 아래에있는 피상적 인 근육. T는 = 승모근. S = 흉쇄. P = 활 경근. 노란색 화살표 = 횡격막 신경. (D)에 도시 된 근육과 횡격막 신경 (E) 만화도. 집게는 깊은 부등변 (F)에 표시된 근육, 및 (G)에 도달하는 승모근과 활 경근 근육을 벌리 사용되어야한다. (F) 랜드 마크는 부등변과 승모근의 위치를 확인하는 데 사용됩니다. 이 이미지는 쇄골 동맥 (흰색 화살표), 횡격막 신경 / 상완 신경총 (흑색 화살표) 및 담색 흉쇄 근육 (노란 화살표)을 보여준다. (G) 만화는 깊은 근육 (즉, 중간 부등변, 전방 부등변 및 SCM), 쇄골 하 동맥과 횡격막 신경의 위치를 묘사. 후방 부등변이 표시되지 않습니다. 이 액세스 할 수있는 경우에만 superfici(D 및 E)에서 알 근육을 벌리된다. 무딘 팁 가위를 사용하여 상기 송신기를위한 포켓을 만들기 (H). 포켓에서 나오는 평행 배치 리드 피하 포켓 송신기를 삽입 (I). 부등변에 25 게이지의 바늘 (J) 삽입은 근육 섬유에 수직 인 와이어 리드에 대한 터널을 확인한다. (K)를 부등변 근육에 삽입 모두 리드. 리드 모자 끝에 위치 제자리에 붙어있다. 승모근에 25 게이지 바늘 (L) 삽입, 근육 섬유에 수직 인 와이어 리드에 대한 터널을 확인한다. (M) 네 리드 승모근과 부등변 근육에 삽입 절개의 폐쇄에 평면 이전에 거짓말. (N)를 완전히 다시 송신기 위치 피하로 마우스를 회수. (O) 동시에 기록 혈량 측정법, 근 EMG 활동하는각각 실 혈량 측정법 (노란 화살표), 원격 수신 패드 (적색 화살표), 카메라 (흑색 화살표)를 사용하여 ND 비디오. 다기능 바이어스 흐름은 마우스에 산소를 공급하는 플라스틱 튜브 (청색 화살표)를 통해 챔버 체적 변동 측정기에 접속된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시아 노 아크릴 레이트 접착제로 리드 캡을 고정 그림 2. (A) 근육의 전극 리드 (E) 인접 와이어의 노출 된 와이어에 시아 노 아크릴 레이트 (퍼플 원)의 작은 방울을 적용한다. 리드 캡 근육에 직접적으로 인접하여 위치하도록 (B)을 신속하게는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 통해 노출 된 선재로 제조 된 리드 캡 (LC)를 밀어. (C플라스틱으로 절연되지 않은 노출 된 전극이 존재하지 않도록) 상기 리드 와이어와 캡의 선단부의 일부를 낸다. (D) 리드 캡의 단부에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울을 적용한다. 동물의 리드 캡의 손질 오프 선단을 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ARM EMG 및 혈량 측정법 6. 분석
- 분석 소프트웨어를 열고 ( "파일"및 "열기 검토 파일"을 선택로 이동) 관심있는 파일을 검토합니다. 탭 "고급 1 속성"을 강조, 30 Hz로 하이 패스 필터 변경 ", 특성 분석"을 선택, 근전도 추적을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 30 Hz에서 하이 패스 필터를 사용하여 EMG 신호를 필터링합니다.
참고 :이 필터링 단계는 아닌 차별, 낮은 주파수 정보를 제거합니다. 동기화 된 비디오 파일의 운동 부족으로 인해 혈량 측정법 트레이스 (도 3a에서 빨간색 박스)에서의 이동에 큰 불규칙한 압력 변화의 부족에 기초하여 육안으로 마우스 비활성 영역의 위치; 마우스가 여전히 잠이나 깨어 있지만 경우에 활동이 발생합니다. - 각 근육에 대해 독립적으로 EMG 복싱을 확인합니다.
- 정류 MS (30) (도 4)를 통해 상기 필터링 된 EMG 신호를 통합한다.
주 : 마우스 3 Hz의 속도로 흡입되므로, 호기는 약 11 통합 값으로 표현된다. - 마우스가 비활성이고 혈량 측정법 트레이스 eupnea (정상 호흡) (도 4)를 도시 할 때 3 초 동안위한 EMG 신호와 연관된 정류 적분 치의 평균을 기준 EMG 진폭을 결정한다.
- 적어도 5이다 적어도 연속 3 개 정류되고 통합 된 값에 의해 정의 된 활성의 "관찰"을 파악기준 EMG 신호 상술 0 % 증가한다 (단계 6.3.2에서 판정).
참고 : 세 개의 연속적인 값이 90 밀리 창을 나타내지 만 일부 관찰이 임계 값 위의 3 개 이상의 값을 포함하고 90 밀리 초보다 더 오래 지속됩니다. - 한숨 (그림 3B) 동안 발생하는 관찰을 제외 동기화 된 비디오 및 혈량 측정법 추적을 사용; (도 3c) 냄새; 또는 머리로 의지 마우스 움직임은 켜거나 정리.
- 두 번째 근육에 대한 6.3.4 - 반복 6.3.1 단계를 반복합니다.
- 정류 MS (30) (도 4)를 통해 상기 필터링 된 EMG 신호를 통합한다.
- 각 근육의 한판 승부 주파수를 계산합니다. 녹음 a) 각각의 비활성 기간의 시작 시간 및 종료 시간과 b) 각 시합이 상기 기준을 사용하여 발생한 시간. 총 비활성 시간을 합계. 시합 주파수를 계산하는 기록 세션의 코스를 통해 비활성 시간의 합계가 관찰 분의 총 수를 나눈다.
- 통기성의 변화를 기록 m의 활성화와 연관되어 있는지 확인uscles.
- 호흡 파라미터를 선택하여 측정한다 (예를 들어, 최대 흡기 유량, 호흡량, 분 부피, 분당 호흡).
참고 : 모든 가능한 선택이 아래 P3 설정 메뉴에서 찾을 수 있습니다 "파생 매개 변수." - 시합 EMG 활동 중에 발생하는 호흡과 기준선 EMG 활동 중에 발생하는 호흡 (도 4)를 식별한다.
- EMG 한판 승부 활동과 연관 기준 EMG 활동과 관련된 독립적 인 파서 세그먼트를 생성하는 혈량 측정법 호흡에 걸쳐 파서 세그먼트를 작성합니다. 에 대한 분석의 유형을 설정해야합니다 "파서 원세그를."
참고 :이 선택은 아래의 P3 설정 풀다운 메뉴에서 찾을 수 있습니다 "데이터 감소 설정을 선택합니다." - 혈량 측정법 추적을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이벤트와 각 파서 세그먼트의 시작을 표시합니다. 드롭 다운 메뉴와 SP의 "이벤트 1"로 파서 분절을 함유 시합 지정세그먼트의 두 종류를 구별하기 "이벤트 2"로 기본 파서 세그먼트를 ecify.
- 은 "기능"메뉴 아래에 "마크 절"저장 "데이터를 파생 마크를." 데이터 파서 메뉴 아래에 "구문 분석 검토 파일"저장 "분석 된 파생 데이터를."
주 : 각 개별 호흡에 대한 선택 호흡 매개 변수 레이블 탭에서 마크 파생 데이터 시트에서 발견되는 "파생의를." - 근육 활동이 통기성의 변화와 연관되어 있는지 확인 (2 이벤트로 표시) 기본 활동 중에 발생하는 호흡 대 (1 이벤트로 표시)의 ARM 시합 중에 발생할 호흡위한 호흡 파라미터 비교.
- 호흡 파라미터를 선택하여 측정한다 (예를 들어, 최대 흡기 유량, 호흡량, 분 부피, 분당 호흡).
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Representative Results
기술 된 프로토콜은 원격 측정 장치를 이식하고 SOD1 (G93A) ALS 모델 마우스 부등변 및 승모근 EMG, WBP 및 비디오를 기록하기 위해 사용되었다. 동물이 비활성화되는 기간 (예를 들어, 움직이지 않는) 녹화를 사용하여 식별 및 WBP 트레이스 (도 3a)의 이동에 관련 활동의 부족에 의해 확인되었다. 비활성 기간은 REM 또는 비 REM 수면에서 보낸 시간뿐만 아니라 시간이 아직 깨어있는 동안 만 (그림 3A)를 포함한다. 이 비활성 기간 동안 EMG 활성은 적어도 3 연속 정류 집적 (30 밀리 초)의 값이 기준 EMG 수준에서 적어도 50 %의 증가 (도 4)과 진폭을 가지고 시합으로 획득 하였다. 한숨 또는 (혈량 측정법에 의해 측정) 스니핑 중에 발생한 활성 발작, 또는 (비디오 의해 평가) 의지 움직임을 분석 (도 3B-C)에서 제외 하였다. EA에서 SOD1 (G93A) 쥐몇 숨을 한 지속 나머지 (그림 4)에서 중간 증상 단계 (표 1) 증가 ARM 활동의 전시 복싱에 rly-. ARM 활성 발작 사전 증상 SOD1 (G93A) (도 3a) 또는 야생형 마우스 (10) 드물다.
| 단계 | 상태 | 무대 발병 | 뒷다리 프리젠 테이션 |
| 0 | 사전 증상 | <P100 | 주목할만한 차이가 wildtypes 비교하지 않습니다. |
| 1 | 질병의 발병 | ~ P100 | 마우스가 꼬리에 매달려 뒷다리 붕괴. |
| 이 | 부전 마비 | ~ P120 | 떨림의 외관 전체 또는 부분 사지 붕괴. | </ TR>
| 삼 | 마비 발병 | ~ P140 | 난이도 걷기, 발가락 컬링 및 / 또는 발 드래그. |
| 4 | 고급 마비 | ~ P150 | 최소 관절 운동은, 뒷다리는 전진 운동을 위해 사용하지. |
| 5 | Endstage | ~ P160 | 30 초 이내에 측면에서 그 자체를 잘 할 수없는 마우스. |
표 1. SOD1 (G93A) 마우스에 ALS-같은 질병 진행의 신경 채점.
그림 3. 대표 WBP 및 EMG는 추적합니다. (A - C) 사전 증상 SOD1 (G93A) 마우스 (연령 P98)에서 부등변과 승모근 근육의 WBP 및 EMG. (A)를 기간 t 때 그는 동물의 분석을 위해 사용되는 나머지 (빨간색 상자)에 있습니다. 동물이 이동 될 때 동기화 된 비디오 녹화에 의해 결정되는 EMG는 전형적인 흔적 빨간색 박스 외부 트레이스는 트레이스 혈량 측정법과 근육 활동이 큰 불규칙한 피크를 표시 (도시 생략). 빨간색 상자가 EMG는 EMG 관찰, 사전 증상 마우스의 특징을 결여 추적 보여줍니다. (B)합니다 (혈량 측정법 추적에 의해) 직접 자주 한숨 선행 발생 EMG 활성 발작. 한숨은 극적인 만료 뒤에 높은 진폭 영감을 특징으로한다. 특성 ECG 신호 검은 화살표 포인트. 마우스 스니핑 동안 EMG 활성의 (C) 복싱 자주 발생한다. 스니핑 여러 호흡 (EMG 활성의 버스트가 발생하는 CO) 위에 두 주파수 및 진폭의 장시간 증가하여 혈량 측정법 트레이스에 반영된다.색상 = "#의 0066CC">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
EMG 활동의 4 득점 복싱 그림. (A 및 B) WBP의 두 가지 예는, 승모근 EMG의 추적을 여과하고, 정류 및 증상 SOD1 (G93A) 마우스 (연령 P126)에서 통합 승모근의 EMG 신호. 청색 라인의 3의 기간에 정류 및 통합 된 신호를 평균함으로써 결정 기준 EMG 레벨을 나타내는 점선. 빨간 점선은 기준 EMG 활동을 통해 진폭의 50 %의 증가를 나타냅니다. 적어도 3 개 개의 연속 정류 통합 값은 50 % 기준 임계 값을 초과하면 활성의 시합이 획득된다. 알을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 arger 버전.
| PIF (ML / s) | TV (ML) | MV (mL / 분) | 주파수 호흡 (호흡 / 분) | |
| 나이브 (N = 5) | 4.4 ± 0.7 | 0.27 ± 0.04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| 주입 (N = 4) | 4.1 ± 0.2 | 0.27 ± 0.11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P 값 | 0.439 | 1.000 | 0.893 | 0.410 |
| 표시 값은 평균 ± SD 반영합니다. P-값은 학생의 t-test로 계산 하였다. | ||||
(하지 이식) 나이브 착상 4 단계 SOD1 (G93A) 마우스 간 호흡 표 2. 비교. 큰 차이는 두 군간 분당 최대 흡기 유량 (PIF) 일 호흡량 (TV), 볼륨 분 (MV), 또는 호흡에서 발견되지 않았다. 나타낸 값은 평균 ± SD를 반영한다. P-값은 학생의 t-test로 계산 하였다.
EMG 및 / 또는 WBP의 반복 측정은 수술 후 1- 2 주간의 회복 기간 후 EMG 신호 또는베이스 라인에서 아주 작은 변화, 몇 개월 동안 같은 마우스를 만들 수 있습니다. 시간 경과는 일반적으로 배터리에 의해 제한되고, 따라서 개별 녹음의 주파수 및 지속 시간에 의해 결정된다. 연구원 인해 이식 장치에 이상 반응이 발생하는 경우가 수 있음을 알고 있어야합니다. 마우스를 피부에 이식 된 근육이나 스크래치 / 씹어에서 전선을 당겨 경우, 리드 또는 전송할 수있다TER는 잘못 배치됩니다. 대부분의 경우, 윤리적 고려 사항은이 동물이 희생 할 것을 지시. 송신기는 제거 멸균 다른 마우스에서 재를 주입 할 수있다.
호흡에 영향을 미치지 않는 장치 주입을 확인하기 위해, ALS 스테이지 (4)의 순 SOD1 (G93A) 마우스 (되지 주입) ALS 스테이지 (4)에 주입하고 SOD1 (G93A) 마우스와 혈량 측정법 측정을 비교 하였다. 큰 차이는 두 군 (표 2) 사이의 분 당 최대 흡기 유량 (PIF) 일 호흡량 (TV), 볼륨 분 (MV), 또는 호흡에서 발견되지 않았다. 부등변 및 승모근은 서로 인접하고 서로 직접 접촉한다. 동시 EMG 복싱 때로는 두 근육에서 관찰되지만, 강한 EMG 복싱 또한 난을 주입 전극 사이에 크로스 토크가 최소가 있음을 보여주는 EMG 복싱은 부등변 (또는 그 반대)에 존재하지 않는다 승모근에서 검출n은 각 근육. 리드가 승모근과 흉쇄 근육에 배치되는 경우 EMG 활성의 독립적 인 관찰도 관찰된다 (데이터는 미도시).
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Discussion
여기 입증 절차는 동일 동물의 많은 개월 동안 호흡 근육 활동 및 환기의 비 침습적 (송신기의 초기 수술 이식 후) 측정을 할 수 있습니다. 이 기술은 마취 된 생쥐의 표준 EMG 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다 실험이 적은 쥐를 요구하는 대신) 다른 질병 단계에서 여러 마우스를 사용하는 (질병 단계에 걸쳐 하나의 마우스에서 같은 사이트에서 데이터를 기록 할 수있는 기능을 제공 1); 2) 데이터 분석을 반복 측정을 사용하는 대신에), 분리 된 실험군과 비교, 즉 더 강한 통계적 실험 (수행 될 수있다; 3) EMG 및 WBP의 동시 기록에 환기 ARM 활성의 효과의 직접적인 평가를 허용; 4) 실험 수면 / 각성의 상이한 상태에서 마우스에 수행 될 수있다. 건강한 쥐가 휴식 ARM 복싱의 매우 낮은 주파수를 가지고 있기 때문에 또한,이 기술은 캘리포니아입니다질병 10의 초기 증상 단계에서 ALS 모델 마우스에서 ARM 활동의 빈도도 작은 변화를 감지 pable. 이 기술은 실험적으로 제어 된 강도에서 천연 동작시 근육 섬유 크지 만 알 수 활동보다는 다음 신경 자극을 측정하기 때문에, 그 모터 유닛의 크기 나 개수를 추정하기에 적합하지 않다. 또 다른 제한은 마우스에서 이식에 적합한 원격 기반 송신기 현재 바이오 포텐셜 리드의 두 가지로 제한된다는 점이다; 따라서, 두 사이트가 동일한 마우스에서 녹음 할 수 있습니다. 이전 14 15 바와 같이, 동일한 마우스에서 두 개 이상의 근육의 동시 기록을 필요로하는 실험은 여러 EMG 도선이 주입 될 수 있고, 와이어 밧줄을 사용하는 취득 시스템에 연결된다. 그러나, 혈량 측정법 챔버 또는 패킹의 변형이 허용해야 할 것이다근육 활동 및 환기를 동시에 기록하는 마우스가 닿는 경우.
이 기술을 적용 할 때, 프로토콜의 특정 단계를주의하여 수행해야합니다. 그들은 움직임을 방해하거나 덮고있는 피부를 자극하지 않도록 바이오 포텐셜 리드 배치해야합니다. 이 마우스의 정상적인 움직임이나 자세에 영향을주지 않도록 또한, 송신기는 위치해야합니다. 실험이 종료 된 후 리드 (즉, 완전히 올바른 근육에 포함 된 인접 근육을 접촉하지 않음) 및 근육 손상이나 감염의 부족의 적절한 배치가 부검에 의해 확인하는 것이 좋습니다. 또한, 송신기는 배터리 수명을 절약하기 위해 모든 기록 세션이 꺼집니다 것이 필수적이다.
가슴 및 목의 근육 영역에서 EMG 측정의 불가피한 결과로서 나타나는 재 기록 심전도 (ECG) 신호의 높은 확률이다gular는 EMG 트레이스 (도 3B, 화살촉) 내에 스파이크. ECG 신호는 모든 금속 근육에 완전히 삽입되도록 리드의주의 배치에 의해 주요 혈관 근처에 배치를 피함으로써 최소화 할 수 있습니다. 심장에 가까운 몸이 아니라 왼쪽, 오른쪽에있는 근육에 리드를 주입하는, 또한 ECG 신호를 줄일 수 있습니다. 심전도 신호는 EMG 계산 알고리즘을 사용하여 트레이스 아웃 또는 독립적으로 기록 된 ECG 신호를 19, 20, 21을 감산하여 필터링 될 수 있지만, 통상적으로는 필요하지 않다. 심전도 신호는 즉시 정규 형상, 주파수 및 진폭에 의해 EMG 신호와 구별 될 수있다.
설명 된 기술은 ALS (10)의 SOD1 (G93A) 마우스 모델에서 휴지 ARM 활성의 변화를 측정하는 데 사용되었다. 액세서리 호흡 근육은 구약 모집그녀 신경 근육 질환 (예, 근이영양증, 척수 근위축증, 말초 신경 병증 등) 다음 신경 또는 척수 손상. ARM 활동 따라서 횡격막의 기능 장애를 측정하고 질병의 심각도를 측정, 부상에서 회복을 감시, 또는 동물의 질병이나 부상 모델의 다양한 호흡을 개선하기 위해 잠재적 인 치료 효과를 평가하기 위해 프록시 역할을 할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품에 대한 지원 VNJ에 SAC와 NIH 연수 보조금 (T32NS007453)에 신시내티 아동 병원 의료 센터 위임 상에 의해 제공되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
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