Summary
В работе вводится метод для повторных измерений вентиляции и активности дыхательных мышц в свободно ведет себя амиотрофический боковой склероз (БАС) модели мыши в течение прогрессирования заболевания с плетизмографии всего тела и электромиографии через имплантированный устройства телеметрии.
Abstract
Вспомогательные дыхательные мышцы помогают поддерживать вентиляцию при включении функции диафрагмы нарушается. Следующий протокол описан способ повторных измерений в течение нескольких недель или месяцев вспомогательной активности дыхательных мышц при одновременном измерения вентиляции в не наркоз, свободно ведет себя мыши. Методика включает в себя хирургическую имплантацию радиопередатчика и введение электрода приводит в разносторонних и трапециевидных мышцы для измерения электромиограммы активности этих мышц вдоха. Вентиляционный измеряются с помощью плетизмографии всего тела, а движение животных оцениваются видео и синхронизирован с электромиограммой активностью. Измерение активности мышц и вентиляции в мышиной модели бокового амиотрофического склероза представлено, чтобы показать, как этот инструмент может быть использован чтобы исследовать, как дыхательные изменения мышечной активности с течением времени и оценить влияние мышечной активности на вентиляции. Описанные методы могут еasily быть адаптировано для измерения активности других мышц или оценить принадлежность дыхательной активности мышц в дополнительных мышиных моделях болезни или травмы.
Introduction
Вспомогательные дыхательные мышцы (ИПС) увеличить вентиляцию во время повышенного спроса (например, упражнение) и помогают поддерживать вентиляцию при включении функции диафрагмы скомпрометирована после травмы или болезни 1, 2. Хотя изменения в функции диафрагмы были хорошо описаны в боковой амиотрофический склероз (БАС) больных и модели мыши 3, 4, 5, 6, гораздо меньше известно о деятельности или функции ARMs в АЛС. Тем не менее, один исследование показало, что у больных БАС , которые вербуют ОРУЖИЕ имеют лучший прогноз , чем те , с подобной дисфункции диафрагмы , которые не 7. Кроме того, АРМ активность является достаточным для дыхания в случаях паралича диафрагмы 8. Эти исследования указывают на то, что стратегии расширяющие функции ARM может улучшить breathiнг у пациентов, страдающих от нервно-мышечных заболеваний, травмы спинного мозга или других условий, в которых функция диафрагмы обесцененным. Тем не менее, механизмы, контролирующие набор ARM для дыхания в значительной степени неизвестны. Методы измерения функции дыхания и изменения в ARM активности в течение долгого времени в животных моделях болезни или травмы, которые необходимы для изучения того, как набираются ИПС, а также для оценки терапии для улучшения набора ARM и вентиляции. Кроме того, повышенная активность ARMs , совпадающей с прогрессирующей потерей функции диафрагмы может быть полезным биомаркером прогрессирования заболевания в нервно - мышечных заболеваний , таких как ALS 7, 9, 10.
Этот протокол описан способ неинвазивного (после начальной операции) и неоднократно измерения активности дыхательных мышц и вентиляции у бодрствующих, ведущих себя мышей. Синхронные записи электромиографу (ЭМГ), всего тела плетизмографии (ФСФ), и видео позволяют исследователю оценить, как изменения в ARM активности воздействия вентиляции и определить, когда объект находится в состоянии покоя или движения. Основное преимущество этого способа состоит в том , что она может быть выполнена в бодрствующем, ведущих себя мышее, тогда как некоторые альтернативных методы для измерения ЭМГА требует анестезии и / или терминальные процедуры 11, 12, 13. Запись ЭМГ активности у бодрствующих мышей с течением времени также может быть достигнуто за счет хронической имплантации ЭМГ приводит, где мышь привязаны проводами к системе сбора данных 14, 15. Поскольку привязывать мышь может мешать нормальному движению или поведения и не могут быть совместимы со стандартной плетизмографии камеры, описанный метод использует телеметрические устройства для беспроводной передачи сигнала ЭМГ к системе сбора данных. Передатчик можетбыть включен или выключен с магнитом для экономии заряда аккумулятора и позволяет провести повторные измерения ЭМГ активности в течение нескольких месяцев. Этот протокол может быть легко адаптирован для измерения активности дополнительной дыхательной или не дыхательной мускулатуры, вставив ЭМГ приводит в различные мышцы. В качестве альтернативы, один из двух проводов может быть использован для измерения активности ЭЭГ для оценки состояния сна или для выявления судорожной активности 16. Этот метод успешно использовались для измерения изменений в ARM активности в состоянии покоя на протяжении прогрессирования заболевания в мышиной модели ALS и определить ключевые нейроны поводковых активности у здорового мышея 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры были одобрены Цинциннати Детская больница Медицинского центра Institutional Animal Care и использования Комитетом и проводится в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Подготовка к телеметрической Implant Устройства хирургии
- Наденьте средства индивидуальной защиты (то есть, скрабы, бахилы, халат, волосы сетки, маски и хирургические перчатки).
Примечание: Эта операция требует стерильного поля. - Включите инкубатор (сервоуправление увлажнителя / младенец инкубатор установлен на 29 ° C) и линии его с сухими белыми полотенцами для обеспечения надлежащего потепления для восстановления.
- До операции стерилизации хирургических инструментов все с оксидом этилена и стерилизовать передатчик с ферментативным моющим средством и химического стерилизующего (или, как указано производителем) перед использованием.
Примечание: Хирургические инструменты должны включать # 2 ламинэктомию щипцов (стандарт советов / прямые / 12 см) (x4), узкоемодели щипцы (зубчатые / изогнутые / 12 см), ткани для отделения ножницы (прямые / тупыми тупых / 11,5 см), а также держатель скальпель и лезвие. Рекомендуется иметь отдельный набор стерилизованных инструментов (два # 2 пинцета и ножниц), зарезервированных исключительно для обработки провода передатчика, чтобы держать хирургические инструменты в хорошем состоянии. - Стерилизовать все поверхности в пределах операционного поля с приемлемым дезинфицирующим средством. Установите стерео рассечения микроскоп, изофлуран анестетика машины, хирургические инструменты и стрижки в операционном поле (см таблицы материалов).
- Для поддержания температуры тела мышей в то время как под наркозом, поместить грелку или воду под одеяло стерильного полотенце перед стерео рассечения микроскопа.
- Убедитесь, что передатчик является полностью функциональным перед использованием.
Примечание: Небольшой магнит помещен в 2 в трансмиттера превратит устройство включения и выключения. Когда передатчик включен и проведено близко к раDIO установлен на частоте AM 500 Гц, он будет издавать непрерывный, пронзительный жужжащий шум. Для экономии заряда батареи, включите батарею от прежде, чем имплантировать его в животное. - Подготовка электрод приводит до операции путем обрезки дистальных ведут с ножницами , зарезервированными для обработки проводов , так что есть примерно 3 см свинца (достаточно , чтобы достичь целевой мышцы) (Фигура 1А). Альтернативно, катушка провода проксимально к устройству и связать их вместе со швами, так что есть приблизительно 3 см развернутого свинца.
Примечание: Сохранение обрезано-офф часть электрода приводит для того, чтобы подготовить «свинцовые колпачки» (пластиковый изолированный корпус), как описана на стадии 1.9. На шаге 3, передатчик провод будет вставлен через мышцу, так и дистальная, открытая часть проводов должна удерживаться на месте и изолирована с помощью свинца шапки. - Используйте скальпель, чтобы обрезать 0,5 см пластикового покрытия, не разрезая сам провод. Используйте инструменты защищены Ф.О.Обработка г проволоки , чтобы растянуть концы проводов 4 - 5x свою первоначальную длину , так что они легко помещается внутри 25- го калибра иглы (Фигура 1В-B «»). Обрежьте оголенный провод из проводов, так что они 0,5 см в длину.
- Подготовьте свинцовые колпачки (пластиковые трубы, чтобы покрыть концы проводов) до операции. Используйте скальпель, чтобы обрезать 0,25 см-длинные трубы из пластикового корпуса, окружающего сегменты электрода приводит спасено от стадии 1.7.
Примечание: Четыре свинцовые крышки необходимы для каждой мыши, которые будут претерпевать имплантации, но лучше всего готовить в два раза больше необходимое количество крышек. Наличие дополнительных стерильные готовы свинцовые крышки полезно в случае обеспечения свинцовый колпачок неудачно с первой попытки. - Записайте серийный номер вставленного передатчика и сохранить оригинальную упаковку с калиброванной информацией. Каждый передатчик имеет различные частотные калибровки для записи ЭМГ; ввести их в программное обеспечение сбора данных для получения приемлемого ЭМГАзаписи.
2. Подготовка мыши для хирургии
- Выберите нужную мышь для имплантации (т.е. SOD1 (G93A) или контроль) и взвесить животное.
Примечание: Рекомендуемый возраст и вес для мыши (мужского или женского пола) проходит эта операция P56 - Р120 и ≥ 24 г, соответственно. - Обезболить мышь под 3,5% изофлураном с 2 л / мин скоростью потока кислорода. Выполните носок щепотку и хвост щепотку, чтобы убедиться, что мышь полностью под наркозом.
- После того, как под наркозом, удалить мышь из коробки капель и поддержания анестезии с помощью носового конуса, установив изофлуран уровень до 1,5%, а расход кислорода на 1 л / мин. Выполните носок щепотку и / или хвост щепотку, чтобы убедиться, что анестезия поддерживается.
- Нанесите смазку глазной мази, чтобы предотвратить глаз от высыхания во время операции.
- Бритье мыши , чтобы выставить хирургический участок между ухом и плечом (фиг.1Сом).
- Альтернативные моечные хирургический сайт, сначала с дезинфицирующим и затем изопропиловым спиртом. Повторите еще 2 раза.
3. Имплантация телеметрического устройства для записи разностороннего и трапециевидного ЭМГ активности
- Поместите животное под рассечение микроскопом, на его стороне в верхней части стерильной площадки, покрывающей грелку, и закрепить носовой конус на месте с лентой. Обратите внимание, что лучше имплантировать правую сторону, чтобы уменьшить сигнал ЭКГ, исходящее от сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор дыхания и отрегулировать Isoflurane уровней, при необходимости, поддерживать регулярную частоту дыхания и соответствующую хирургическую плоскость анестезии. - Потяните переднюю конечность к ипсилатеральной стопы вдоль туловища.
Примечание: Эта позиция смещает лопатку каудальна, обеспечивая хирургический доступ к сcalene и трапециевидные мышцы.- Возьмите тупые изогнутые щипцы, сдерживаться передней лапой Ипсилатерального к хирургическому участку и заклеивание лапы на месте (рис 1C). Используйте сильную клеевую хирургическую ленту, чтобы убедиться, что лапа является безопасной для продолжительности процедуры.
- Наденьте новую пару хирургических перчаток. Используйте скальпель , чтобы сделать косой разрез, около 2 см длиной, между плечом и ухом (красная линия на фиг.1C).
- Использование два # 2 ламинэктомии щипцов, один в каждой руке, тянуть обратно жировую ткань и раздвинута трапециевидная и подкожную мышцы , чтобы выставить фасцию , охватывающую кивательные и лестничные мышцы (рис 1D и Е).
- Используйте бледно - кивательную мышцу и диафрагмальный нерв в качестве ориентиров , чтобы определить мышцы неравносторонних. Обратите внимание , что диафрагмальный нерв проходит параллельно лестничные мышцы, а кивательные лежит инфРИОР. Мышцы разносторонних бежать наискось от шейных позвонков до ребер под трапециевидной мышцей. Биопотенциалов провода будут вставлены в переднюю мышцу, неравнобедренном , которые могут быть идентифицированы как мышцы , которая проходит рядом с диафрагмального нерва (рис 1F и G).
Примечание: Внимание. Эта область насыщена сосудами, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать сокращения подключичной артерии. Избегайте повреждения диафрагмального нерва и плечевого сплетения. - После того , как разносторонняя и трапециевидная мышца была идентифицирована (рис 1G), сделать подкожный карман для передатчика на задней часть животного, между лопатками.
- Используйте ткани для отделения ножницы, вставить тупые концы ножниц под кожу и не распространять их до тех пор , карманное отверстие , которое составляет около 1.25x ширина передатчика формируется (рис 1H).
Примечание: Передатчик должен быть вставлен с минимальным сопротивлением, но рябиныи др не должно быть настолько большим, что передатчик может двигаться сам по себе. Если карман слишком мал, передатчик может трется кожей, вызывая раздражение, которое может побудить животное поцарапать кожу и / или тянуть провода из. Если карман слишком велик, серома может образовывать или передатчик может мигрировать в невыгодное положение.
- Используйте ткани для отделения ножницы, вставить тупые концы ножниц под кожу и не распространять их до тех пор , карманное отверстие , которое составляет около 1.25x ширина передатчика формируется (рис 1H).
- Промыть теплым, стерильный физиологический раствор и вставьте передатчик с плоской стороной к мышце. Поместите передатчик так , что она лежит плоский и провода выходят из кармана, параллельно друг другу , а не искривленной (рис 1I). Завиток избыточной длины проволоки под устройством и положить его плоским.
- Запуск провода от передатчика к разносторонним и трапециевидным мышцам так, чтобы два комплекта bipotential приводит лежит плоский и параллельно друг друг.
- Используйте ламинэктомии щипцы для отделения передних косого от окружающих мышц и вставить 25 калибра иглу через неравнобедренный MusCLE, перпендикулярно мышечных волокон.
- Вставьте один свинец в кончик иглы , а затем вытащить иглу из мышцы, оставляя позади свинца , вставленный в мышцах до изоляции провода (рис 1J и K). Запись которого цветные провода вставлены в какой мышцу.
- Поместите небольшую каплю цианакрилатный клея на открытом конец проволоки, близко к мышце , где вставляется свинец, и быстро скользить ведущий колпачок на провод так , что ни один провод не подвергаются между крышкой свинца и мышцами (рис 2A и В).
Примечание: Несмотря на то, что является общепринятой практикой для обеспечения EMG ведет с цианоакрилатом 17, 18, альтернативный способ заключается в обеспечении свинцовой крышки на месте, завязывая шелковую шовный узел вокруг него. - Обрежьте излишки дистальнее проводной колпачок и нанесите каплю клея цианакрилового до конца ведущего колпачка / провода. Дайте клеювремя полимеризации перед выпуском (рис 2C и D).
- Выполните те же действия (шаги 3,10-3,12), чтобы вставить противоположную полярность ведущую параллельно первому в одной и той же мышцы, 1 - 2 мм от первого свинца.
- Повторите шаги 3.10 - 3.12 для вставки ведет в трапециевидной мышцы, расположенный впереди на лестничной мышцы (рис 1 л и M).
- Убедитесь, что провода провода закреплены на месте и что есть только достаточно провисания проводов для животных для выполнения движений тела без потянув провода. Убедитесь в том, что любая избыточная длина свинца не нажмет на коже, так как это может вызвать раздражение, которое может подсказать животное, чтобы поцарапать или тянуть провода из. Переставьте провода, если это необходимо, чтобы предотвратить любые возможные неудобства.
- Аккуратно удалите ленту, удерживающую вниз переднюю конечность. Вытяните жировую ткань обратно через мышцу и использовать его для покрытия вставленных проводов. Закрыть разрез с цианакриловым клеем на дразнязакрылки кожи вместе с тем, что насечки выстраивается. Pinch части кожных лоскутов вместе с изогнутым пинцетом и нанесите небольшую линию цианакрилатный клея вдоль этой линии.
- Вводят 0,1 мл подкожно карпрофена, чтобы облегчить послеоперационную боль, пока животное все еще находится под наркозом.
Примечание: Продолжайте вводить 0,1 мл карпрофена один раз в день в течение 1 - 2 дней после операции, а затем по мере необходимости после этого. - Удалите животное с головной части и поместите его в чистой клетку в подогретом инкубаторе, пока животное не спит и двигается вокруг клетки добровольно. Держите животное в инкубаторе в течение по крайней мере 15 минут после этого, контроль за его движениями и настороженность.
4. Послеоперационный
- Дом животных отдельно после операции. Обеспечить исцеление животных с гелем диеты и бутылкой воды.
- Контролировать животное в течение первых 30 мин после операции. Проверьте на животное, по крайней мере каждый час фили 5 ч после операции. В течение нескольких дней после операции, проверьте, по крайней мере, два раза в день.
- Часы для некроза, инфекции вдоль разреза и внутри полости тела , содержащего имплантат (то есть, тепло, отек и покраснение), и формирование серома.
Примечание: Эти знаки происходят в течение первой недели после операции. Здоровый зажила животное один месяц после операции показан на рисунке 1N. Несмотря на то, ЭМГ запись может быть сделана сразу после имплантации животных дают по крайней мере, одну неделе, чтобы залечить перед записью ЭМГА и плетизмографии, так как сигналы ЭКГ могут быть высокими сразу после имплантации.
5. Приобретение Одновременной Электромиографии и плетизмография Сигналы
- Включите все оборудование, приобретение, включая поток смещения.
Примечание: Скорость потока для мышей обычно устанавливается на уровне 1,0 л / мин. - Откалибруйте плетизмографии камеру (ы) с помощью расходомера.
Примечание: Периодически проверяйте плетизмографии ChambeRS, чтобы гарантировать, что уплотнения не треснули или сломаны. Смажьте резиновые уплотнения со смазкой, такие как вакуумной смазки раз в неделю, чтобы поддерживать их в хорошем состоянии. - Входные данные калибровки передатчика, как указано производителем.
- Поместите мышь в плетизмографии камере в течение не менее 1 ч, чтобы акклиматизироваться его перед записью ЭМГ и плетизмографии. Использование нескольких камер, можно записывать с одной мышей в то время как следующая мышь акклиматизации во второй камере. Не включите передатчик в течение периода акклиматизации в целях экономии заряда аккумулятора (рис 1O).
- До начала записи (но после калибровки), включите передатчик, помещая сильный магнит в пределах 1 в имплантированного животного; красный свет на передней панели приемника будет указывать, когда передатчик включен.
- Начало приобретения с помощью ниспадающего меню с надписью «Приобретение» и выберите «Start Приобретения.» Хотя продолжительность записи можетварьироваться в зависимости от эксперимента, типичные плетизмографии и запись ЭМГА длятся 1 - 3 ч.
Примечание: Передатчик имеет характеристическую частоту дискретизации 240 Гц. Более быстрая скорость 500 Гц устанавливаются в программном обеспечении для интерполяции между точками и обеспечить более гладкую форму волны. Фильтр нижних частот (который служит в качестве анти-псевдоним фильтра) и фильтр верхних частот в имплантат указать полосу частот от 1 до 50 Гц в течение этого телеметрического устройства. 60 Гц / C помехи не способствуют избыточному шуму в сигнале ЭМГА, потому что имплантат с питанием от батарей, и животное защищает имплантат и ведет от электрических полей. Плетизмография, EMG и видео автоматически синхронизируются в режиме реального времени с помощью программного обеспечения сбора. - Когда приобретение закончено, выключить передатчик с помощью магнита и удалить животное из камеры.
- Если при запуске другой записи, очистить камеру, ввести в новых калибровках передатчика из следующего животного, и начать вторую запись. Если реброс приобретением бедных и обнищавших слоев в течение дня, выключите передатчик, очистите плетизмографии камеру, и отключить все приобретения оборудования и поток смещения.
Рисунок 1. Имплантация телеметрического устройства для измерения дыхательных мышц EMG. (А) Телеметрические передатчики с двумя парами биопотенциалов приводит к ЭМГ измерения. Провода могут быть обрезаны до нужной длины (внизу) или змеевики и заправлены под передатчик (вверху). (В) передатчик приводит. (В») ведет с подстриженной-офф пластиковой изоляции , чтобы обнажить провода и сделать свинцовые колпачки (вставка). (В «») провода с проводами растянутых 4 - 5 раз от их первоначальной длины. Провода должны быть обрезаны, так что они имеют длину 0,5 см (не показан). (C) Мышь подготовлена к операции, с бритым хирургическим вмешательством и правильнорасположенная лапка. Красная пунктирная линия указывает место разреза. (D) Поверхностные мышцы , расположенные под жировой ткани и фасции, видно после первоначального разреза. Т = трапециевидная. S = кивательный. Р = подкожная. Желтая стрелка = диафрагмальный нерв. (Е) Мультфильм схема мышц и диафрагмального нерва , показанных в (D). Щипцы должны быть использованы для раздвинуты трапециевидной и подкожной мышцы, чтобы достичь более глубоких неравносторонних мышц, как показаны в (F) и (G). (F) Ориентиры используется для определения местоположения лестничных и трапециевидного. Это изображение показывает подключичной артерии (белая стрелка), диафрагмального нерва / плечевого сплетения (черная стрелка), и бледно-кивательной мышцы (желтая стрелка). (G) Мультфильм , изображающая расположение глубоких мышц (т.е. средней лестничной, передней лестничной и SCM), подключичной артерии и диафрагмального нерва. Задний неравносторонним не видно. Они могут быть доступны только тогда, когда superficiAl мышцы (в D и Е) разведены. (Н) Создание карман для передатчика с использованием тупым кончиком ножниц. (I) , вставленный передатчик в подкожном кармане, с параллельными расположением выводов , выходящих из кармана. (J) , вставки из 25- го калибра иглы в лестничном, перпендикулярны мышечных волокна, чтобы сделать туннель для провода свинца. (К) Оба провода вставлен в лестничную мышцу. Свинцовые колпачки расположены на конце и приклеивают на место. (L) Вставка 25- го калибра иглы в трапециевидной, перпендикулярно мышечных волокон, чтобы сделать туннель для провода свинца. (M) Все четыре провода вставлены в трапециевидной и лестничные мышцы и лежа перед закрытием разреза. (N) , полностью выздоровел мышь, с передатчиком расположена подкожно на спине. (О) Одновременно запись плетизмография, ЭМГ активность мышц, Aго видео с помощью плетизмографии камеры (желтая стрелка), телеметрический приема колодки (красная стрелка), и камеру (черная стрелка), соответственно. Поток смещения многофункционального подключен к камере с помощью плетизмографии пластиковой трубки (синяя стрелка) для подачи кислорода к мыши. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Обеспечение Lead Колпачков с Цианакрилатным клеем. (А) Применить небольшую каплю цианакриловым (фиолетовый круг) на оголенный провод электрода провод (Е) провод проксимальнее мышцы. (Б) Быстро скользить подготовленный колпачок свинца (LC) на оголенный провод над цианоакрилатным адгезивом , так что свинец крышка расположена в непосредственной близости к мышце. (С) Обрежьте небольшую часть дистального конца ведущего колпачка и проволоки, так что нет электрода подвержен настоящим, не изолирован пластиком. (D) Нанесите одну маленькую каплю цианакриловым клея к концу свинцовой крышкой. Удалить обрезанный-офф дальнего конца ведущего колпачка от животного. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
6. Анализ ARM ЭМГ и плетизмографии
- Откройте программное обеспечение для анализа и просмотра файла интереса (перейти к «Файл» и выберите «Открыть файл обзора»). Фильтр сигналов ЭМГ с использованием фильтра верхних частот 30 Гц-правой кнопкой мыши на след ЭМГ, выбирая «Анализ атрибутов,» выделяя «Дополнительные атрибуты 1» вкладку, и изменение фильтра верхних частот до 30 Гц.
Примечание: Этот шаг фильтрация удаляет неселективном, низкочастотную информацию. Расположить области неактивности мыши путем визуального осмотра на основании отсутствия движения в синхронном видеофайла и отсутствие больших, нерегулярных изменений давления вследствие движения в плетизмографии след (красный прямоугольник на фигуре 3А); пассивность происходит, когда мышь спит или бодрствует, но до сих пор. - Определение ЭМГА приступов независимо для каждой мышцы.
- Устранить и интегрировать отфильтрованный сигнал EMG в течение 30 мс (Рисунок 4).
Примечание: Поскольку у мышей дышит со скоростью 3 Гц, каждый вдох представлен около 11 комплексных значений. - Определить амплитуду базовой линии EMG путем усреднения выпрямленных и интегрированных значений , связанные с сигналом ЭМГА в течение 3 секунд , когда мышь неактивна , а плетизмографии след показывает нормальное дыхание (нормальное дыхание) (фиг.4).
- Определение «приступы» деятельности, определенные по меньшей мере 3 последовательных выпрямляется и комплексных значений, которые являются по меньшей мере, 5увеличение 0% выше базовой линии сигнала EMG (определено на этапе 6.3.2).
Примечание: Три последовательных значения представляют собой окно 90 мс, но некоторые приступы будут содержать более 3 значения выше порога, и будет длиться дольше, чем 90 мс. - Используйте синхронизированное видео и плетизмографию след , чтобы исключить приступы , которые происходят во время вздохов (фигура 3В); нюхают (рис 3C); или волевые движения мыши, такие как поворот головы или ухаживание.
- Повторите шаги 6.3.1 - 6.3.4 для второго мышцы.
- Устранить и интегрировать отфильтрованный сигнал EMG в течение 30 мс (Рисунок 4).
- Вычислить частоту боя для каждой мышцы. Запись а) начало времени и время окончания каждого неактивного периода, и б) время каждый бой произошел с использованием вышеуказанных критериев. Сложите общее время неактивности. Разделите общее количество схваток в общей мин неактивного раза в течение сеанса записи, чтобы вычислить частоту боя.
- Определить, если изменения в вентиляции связаны с активацией записанного мuscles.
- Выбор параметров дыхания для измерения (например, пиковый поток вдоха, дыхательный объем, минутный объем и вдохов в мин).
Примечание: Все возможные выборы можно найти в раскрывающемся меню настройки P3 под «производные параметрами.» - Определить вдохов , которые происходят во время боя ЭМГ активности и вдохов , которые происходят во время базовой ЭМГ активности (Рисунок 4).
- Создание сегментов анализатора, охватывающие плетизмография вдохи, которые связаны с боем ЭМГОМ и создать независимые сегменты синтаксического анализа, которые связаны с базовым ЭМГОМ активностью. Убедитесь в том, чтобы установить тип анализа к «Parser Seg.»
Примечание: Этот выбор находится в меню настройки P3 выпадающим под «Настройка сокращения данных.» - Отметить начало каждого сегмента парсера с событием, щелкнув правой кнопкой мыши на плетизмографии след. Укажите бой, содержащий сегменты синтаксического анализа как «Событие 1» в раскрывающемся меню и зрecify базовых сегментов синтаксического анализа, как «Event 2», чтобы различать два класса сегментов.
- В меню «Функции», за исключением «Marks раздел» и «Знаки производных данных.» В меню Parser данных, за исключением «Файл Parsed Обзор» и «Parsed производный данных.»
Примечание: Выбранные параметры дыхания для каждого отдельного дыхания находится в Marks Derived листа данных на вкладке с надписью «Дифференцирования.» - Сравните дыхательные параметры вдохов, которые происходят во время ARM приступов (помеченных как Событие 1) по сравнению с вдохами, которые происходят во время базовой активности (помеченной как событие 2), чтобы определить, если мышечная активность связана с изменениями в системах вентиляции.
- Выбор параметров дыхания для измерения (например, пиковый поток вдоха, дыхательный объем, минутный объем и вдохов в мин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный протокол был использован для имплантации телеметрического устройства и записывать неравносторонний и трапециевидной ЭМГ, ФСФ и видео в SOD1 (G93A) модель ALS мыши. Периоды , в котором животное является неактивным (например, не двигается) , были идентифицированы с использованием видеозаписи и подтверждается отсутствием двигательной активности , связанной в трассировке ФСФ (рис 3А). Неактивные периоды включают в себя время , проведенное в REM или медленного сна, а также время , проведенное в сознании , но до сих пор (фиг.3А). ЭМГ активности в течение этого времени неактивного был забит как бой , когда по крайней мере 3 последовательных выпрямляется и интегрированные (более 30 мс) значения имели амплитуды с по меньшей мере на 50% больше по сравнению с исходным уровнем ЭМГ (рисунок 4). Приступы деятельности , которые имели место во время вздыхая или нюхают (определяются плетизмографией) или волевые движения (оцениваемые с помощью видео) были исключены из анализа (фигура 3В-C). SOD1 (G93A) мышей при еаrly- до середины-симптоматической стадии (таблица 1) , проявляют приступы повышенной активности ARM в состоянии покоя , что длиться от одного до нескольких вдохов (рисунок 4). Приступы ARM активности редки в предварительно симптоматической SOD1 (G93A) (рис 3A) или 10 мышей дикого типа.
| стадия | состояние | Стадия Наступление | Презентация задних конечностей |
| 0 | Предварительно симптоматическое | <P100 | Никаких существенных различий по сравнению с wildtypes. |
| 1 | Болезнь начала | ~ P100 | Коллапс задних конечностей, когда мышь отстранена от хвоста. |
| 2 | Парез | ~ P120 | Полное или частичное обрушение задних конечностей с появлением тремора. | </ TR>
| 3 | Паралич начало | ~ P140 | Трудность ходьбе, ноги керлинг и / или нога волочение. |
| 4 | Расширенный паралич | ~ P150 | Минимальное совместное движение задние конечности не используются для движения вперед. |
| 5 | конечная стадия | ~ P160 | Мышь не может само право из стороны в течение 30 секунд. |
Таблица 1. Неврологические Подсчет АЛС-как развитие болезни при SOD1 (G93A) у мышей.
Рисунок 3. Представитель ФСФ и EMG Следы. (А - С) ФСФ и ЭМГ разносторонних и трапециевидных мышц из предварительно симптоматическое SOD1 (G93A) мыши (возраст P98). (A) периоды , когда т он животное в состоянии покоя (красное поле) используется для анализа. Следы за пределами красной коробки показывают большие и нерегулярные пики активности плетизмографии следов и мышц в ЭМГ следов, типично, когда двигается животное, как определен синхронизированных видеозаписью (не показано). Красный прямоугольник показывает EMG следов отсутствует ЭМГ приступов, характерные предварительно симптоматическая мыши. (В) Приступы ЭМГ активности часто возникают непосредственно предшествующий вздох (как показано на плетизмографии следа). Вздыхает характеризуются высокой амплитуды вдоха с последующим драматическим истечением. Черные Arrowhead указывает на характерный сигнал ЭКГ. (C) Приступы ЭМГ активности часто встречаются в то время как мыши обнюхивать. Нюхают находит свое отражение в плетизмографии след длительным повышением частоты и амплитуды над несколькими вдохами (совместное место с всплесками активности ЭМГ).цвет = «# 0066CC»> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Скоринг приступов ЭМГ активности. (А и Б) Два примера WBP, фильтруют трапециевидную EMG следов, и выпрямляются и интегрированные трапециевидной ЭМГ сигналы от симптоматической SOD1 (G93A) мышей (возраст P126). Голубые пунктирные линии указывают на базовый уровень ЭМГ, определяется путем усреднения выпрямляется и комплексных сигналов в течение периода времени 3 с. Красные пунктирные линии указывают на увеличение 50% амплитуды над базовой ЭМГ активности. Приступ активности оценивается, когда по крайней мере 3 последовательных выпрямляется и интегрированные значения превышают 50% базового порога. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть альArger версия этой фигуры.
| ПИФ (мл / с) | TV (мл) | М.В. (мл / мин) | Частота дыхания (вдохи / мин) | |
| Наивные (п = 5) | 4,4 ± 0,7 | 0,27 ± 0,04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Имплантированный (п = 4) | 4,1 ± 0,2 | 0,27 ± 0,11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| Р-значение | 0,439 | +1,000 | 0,893 | 0,410 |
| Значения, указанные отражают среднее ± стандартного отклонения. P-значения были рассчитаны Т-тест Стьюдента. | ||||
Таблица 2. Сравнение между Дыханием Наивной (не Имплантированным) и имплантировал Этап 4 SOD1 (G93A) у мышей. Никаких существенных различий не было обнаружено в пиковым потоком (PIF), дыхательный объем (TV), минутный объем (MV), или вдохов в минуту между этими двумя группами. Величины, показанные отражают среднее значение ± SD. P-значения были рассчитаны Т-тест Стьюдента.
Повторные измерения ЭМГ и / или WBP могут быть выполнены в одной и той же мыши в течение нескольких месяцев, с очень небольшим изменением сигнала ЭМГ или базовой линии после периода восстановления от 1 до 2 недель после операции. Временный ход, как правило, ограничен срок службы батареи и, таким образом, будет определяться по частоте и длительности отдельных записей. Исследователи должны знать, что неблагоприятные события, связанные с имплантированным устройством иногда может произойти. Мышь может вытащить провода из имплантированной мышцы или царапанию / жеваний на коже, если провод или передаватьтер неправильно размещены. В большинстве случаев, по этическим соображениям, эти животные будут принесены в жертву. Передатчик может быть удален, стерилизовали, и повторно имплантировали в другой мыши.
Для того, чтобы проверить, что имплантации устройства не влияет на дыхание, сравнивали измерения плетизмографии между наивным SOD1 (G93A) мышей (не имплантированной) на 4-й стадии АЛС и имплантированного SOD1 (G93A) у мышей на 4-й стадии АЛС. Никаких существенных различий не было обнаружено в пиковым потоком (PIF), дыхательный объем (TV), минутный объем (MV), или вдохов в минуту между двумя группами (таблица 2). Неравносторонние и трапециевидные находятся рядом друг с другом и находятся в непосредственном контакте друг с другом. Несмотря на то, одновременно приступы ЭМГ иногда наблюдаются в обеих мышцах, сильные приступы ЭМГ также обнаружены в трапециевидной, когда EMG приступы отсутствуют в неравнобедренном (и наоборот), демонстрируя, что есть минимальное перекрестные помехи между электродами имплантировали Iп каждая мышца. также наблюдаются Независимые приступы ЭМГ активности, когда провода помещаются в трапециевидной и кивательной мышцы (данные не показаны).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура продемонстрирована здесь позволяет неинвазивным (после первоначальной хирургической имплантации передатчика) измерения активности дыхательных мышц и вентиляции в течение многих месяцев в том же животном. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению со стандартными методами ЭМГ в анестезированных мышей: 1) эксперименты требуют меньшего количества мышей и обеспечивают возможность записи данных с того же сайта в одной мыши через стадии заболевания (вместо использования нескольких мышей на разных стадиях заболевания); 2) анализ данных может быть выполнен с более мощными статистическими испытаниями (то есть, с помощью повторных измерений вместо сравнения отдельных экспериментальных групп); 3) одновременная запись ЭМГА и WBP позволяет прямой оценку воздействия ARM деятельности по вентиляции; и 4) эксперименты могут быть выполнены на мышах в различных состояниях сна / бодрствования. Кроме того, поскольку здоровые мыши имеют очень низкую частоту ARM приступов в покое, эта техника чpable обнаруживать даже небольшие изменения в частоте ARM активности у мышей модели ALS на ранних симптоматических стадиях заболевания 10. Однако, поскольку этот метод измеряет активность большого, но неизвестного количества мышечных волокон во время естественного поведения, а не после стимуляции нерва на экспериментально контролируемых интенсивностей, он не подходит для оценки размера блока двигателя или номер. Другое ограничением является то, что передатчики телеметрической основы, пригодные для имплантации у мышей в настоящее время ограничены два наборов биопотенциальных выводов; Таким образом, только два места могут быть записаны с одной и той же мыши. Для экспериментов , требующих одновременной записи более двух мышц в той же мыши, множественные провода ЭМГ могут быть имплантированы и подключен к системе сбора данных с использованием проволоки троса, как описано ранее , 14, 15. Тем не менее, модификация плетизмографии камеры или уплотнения потребовалось бы, чтобы позволитьдля одновременной регистрации активности мышц и вентиляции, если мышь привязанный.
При применении этого метода, определенные шаги протокола должны выполняться с осторожностью. Биопотенциал провод должен быть расположен так, чтобы они не мешали движению и не раздражают кожу облегающей. Кроме того, передатчик должен быть установлен так, что он не влияет на нормальное движение или положение мыши. Рекомендуется , чтобы правильное расположение выводов (то есть, полностью погруженных в правильной мышцы и не соприкасающихся соседние мышцы) , а также отсутствие повреждений мышц или инфекции аттестованы аутопсии после эксперимента было прекращено. Кроме того, необходимо, чтобы передатчик выключен после каждой записи сессии, чтобы сохранить срок службы батареи.
Неизбежное следствие измерения ЭМГА от мышц в области груди и шее области является высокой вероятностью сигналов записи электрокардиограммы (ЭКГ), которые появляются в регорловой шипы в пределах следа ЭМГ (рис 3B, стрелолист). Сигналы ЭКГ могут быть сведены к минимуму путем тщательного размещения проводов таким образом, что весь металл полностью погруженных в мышцы и избежать размещения вблизи крупных кровеносных сосудов. Имплантация приводит в мышцы на правой стороне тела, а не слева, который находится ближе к сердцу, может также уменьшить сигналы ЭКГ. Хотя сигнал ЭКГ может быть отфильтрован из ЭМГА следов с помощью вычислительных алгоритмов или путем вычитания независимо записанного сигнала ЭКГ 19, 20, 21, это обычно не требуется. ЭКГ сигнал может быть легко отличить от сигнала ЭМГ по его правильной формы, частоты и амплитуды.
Описанная методика была использована для измерения изменений в ARM активности в состоянии покоя в SOD1 (G93A) мышиной модели ALS 10. Вспомогательные дыхательные мышцы также набраны в ВЗее нервно - мышечных заболеваний (например, мышечная дистрофия, спинальная мышечная атрофия, периферические невропатии и т.д.) и после нервных или повреждений спинного мозга. Таким образом, активность АРМ может служить в качестве посредника для измерения функциональных нарушений диафрагмы и оценить тяжесть заболевания, контролировать восстановление после травмы, или оценить потенциальные выгоды лечения, чтобы улучшить дыхание в различных болезнях животных или травмы моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Поддержка этой работы была предоставлена премия Доверительного больница Медицинского центра Цинциннати Детская с САК и грант NIH обучения (T32NS007453) до VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
- Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
- Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
- Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
- Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
- Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
- Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
- Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
- Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
- Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
- Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
- Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
- Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
- Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
- Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).
