Summary
Este documento presenta un método para mediciones repetidas de la ventilación y la actividad de los músculos respiratorios en un modelo de ratón libremente comportarse esclerosis lateral amiotrófica (ALS) a lo largo de progresión de la enfermedad con pletismografía de cuerpo entero y electromiografía través de un dispositivo de telemetría implantado.
Abstract
músculos respiratorios accesorios ayudan a mantener la ventilación cuando se deteriora la función del diafragma. El siguiente protocolo describe un método para mediciones repetidas durante semanas o meses de actividad de los músculos respiratorios accesorio mientras que mide simultáneamente la ventilación en un ratón no anestesiados, comportarse libremente. La técnica incluye la implantación quirúrgica de un transmisor de radio y la inserción de electrodo conduce a los músculos escalenos y trapecio para medir la actividad electromiograma de estos músculos inspiratorios. La ventilación se midió por pletismografía de cuerpo entero, y el movimiento de los animales se evalúa por vídeo y se sincroniza con la actividad electromiograma. Las mediciones de la actividad muscular y la ventilación en un modelo de ratón de la esclerosis lateral amiotrófica se presentan para mostrar cómo esta herramienta se puede utilizar para investigar cómo respiratoria cambios en la actividad muscular en el tiempo y para evaluar el impacto de la actividad muscular en la ventilación. Los métodos descritos pueden enviarasily ser adaptado para medir la actividad de otros músculos o para evaluar la actividad de los músculos respiratorios accesorio en modelos adicionales ratón de la enfermedad o lesión.
Introduction
Músculos respiratorios accesorios (ARMs) aumentar la ventilación durante los momentos de alta demanda (por ejemplo, ejercicio) y ayudan a mantener la ventilación cuando la función de diafragma se ve comprometida después de una lesión o enfermedad 1, 2. Aunque los cambios en la función del diafragma han sido bien descritos en pacientes esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y modelos de ratón 3, 4, 5, 6, se sabe mucho menos acerca de la actividad o función de las armas en la ELA. Sin embargo, un estudio sugiere que los pacientes con ELA que reclutan ARM tienen un mejor pronóstico que aquellos con disfunción del diafragma similar que no lo hacen 7. Además, la actividad ARM es suficiente para la respiración en casos de parálisis diafragma 8. Estos estudios indican que las estrategias para aumentar la función del brazo pueden mejorar breathing en pacientes que sufren de enfermedad neuromuscular, lesión de la médula espinal, o de otras condiciones en las que se altera la función del diafragma. Sin embargo, los mecanismos que controlan el reclutamiento ARM para la respiración son en gran parte desconocidos. Los métodos para medir la función respiratoria y cambios en la actividad ARM en el tiempo en los modelos animales de la enfermedad o lesión se necesitan para estudiar cómo se reclutan ARMs, así como para evaluar terapias para mejorar el reclutamiento ARM y ventilación. Por otra parte, el aumento de la actividad de armas coincidiendo con la pérdida progresiva de la función del diafragma puede ser un biomarcador útil para progresión de la enfermedad en las enfermedades neuromusculares tales como ALS 7, 9, 10.
Este protocolo describe un método para no invasiva (después de la cirugía inicial) y repetidamente medir la actividad de los músculos respiratorios y la ventilación en, ratones comportándose despierto. grabaciones sincronizadas de electromiógrafoy (EMG), pletismografía de cuerpo entero (WBP), y de vídeo permiten que el investigador para evaluar cómo los cambios en la actividad de ARM ventilación impacto y para determinar cuando el sujeto está en reposo o en movimiento. Una ventaja importante de este método es que puede ser realizado en ratones, comportándose despierto, mientras que algunos métodos alternativos para medir EMG requiere anestesia y / o son procedimientos de terminal 11, 12, 13. El registro de la actividad EMG en ratones despiertos con el tiempo también se puede lograr a través de la implantación crónica de EMG conduce, en el que el ratón está atado por cables al sistema de adquisición 14, 15. Debido a la inmovilización de un ratón podría interferir con el movimiento o comportamiento normal y puede no ser compatible con una cámara de pletismografía estándar, el método descrito utiliza dispositivos de telemetría para transmitir de forma inalámbrica la señal EMG al sistema de adquisición. El transmisor puedeser encendido o apagado con un imán para ahorrar energía de la batería y permite mediciones repetidas de la actividad EMG durante varios meses. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para medir la actividad de los músculos respiratorios o no respiratorias adicionales mediante la inserción de la EMG conduce en diferentes músculos. Alternativamente, uno de los dos conductores se pueden usar para medir la actividad EEG para evaluar el estado de sueño o para identificar la actividad convulsiva 16. Esta técnica se ha utilizado con éxito para medir cambios en la actividad de ARM en reposo a lo largo de progresión de la enfermedad en un modelo de ratón de ELA y para identificar las neuronas clave que impulsan la actividad de ARM en ratones sanos 10.
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Protocol
Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Niños de Cincinnati Hospital Medical Center Institucional Animal y llevaron a cabo en cumplimiento de la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Preparación para la cirugía de implante de dispositivos de telemetría
- Use equipo de protección personal (es decir, exfoliantes, cubiertas para zapatos, vestido, red de pelo, mascarilla y guantes quirúrgicos).
NOTA: Esta cirugía requiere un campo estéril. - A su vez en la incubadora (servo-controlado incubador humidificador / bebé ajustado a 29 ° C) y la línea con toallas secas, blanco para permitir el calentamiento adecuado para la recuperación.
- Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con óxido de etileno y esterilizar el transmisor con un detergente enzimático y esterilizante químico (o según lo especificado por el fabricante) antes de su uso.
NOTA: Los instrumentos quirúrgicos deben incluir # 2 fórceps laminectomía (estándar tips / recta / 12 cm) (4 veces), estrechofórceps patrón (dentada / curvada / 12 cm), tijeras separar tejido (recto / romo romo / 11,5 cm), y un soporte de escalpelo y la cuchilla. Se recomienda tener un conjunto separado de instrumentos esterilizados (dos # 2 pinzas y tijeras) reservadas exclusivamente para el manejo de los hilos del transmisor para mantener las herramientas quirúrgicas en buenas condiciones. - Esterilizar todas las superficies dentro del campo quirúrgico con un desinfectante aceptable. Coloque un microscopio de disección estéreo, máquina de isoflurano anestésico, herramientas quirúrgicas, y máquinas de cortar en el campo quirúrgico (véase la Tabla de Materiales).
- Para mantener la temperatura del cuerpo del ratón mientras bajo anestesia, coloque una almohadilla de calefacción o manta de agua debajo de la toalla estéril frente al microscopio de disección estéreo.
- Asegúrese de que el transmisor es completamente funcional antes de su uso.
NOTA: Un pequeño imán colocado dentro de 2 en del transmisor a su vez, el dispositivo de encendido y apagado. Cuando el transmisor está activado y se mantuvo cerca de un raDio fijado en 500 Hz de frecuencia AM, emitirá un ruido continuo, agudo zumbido. Para ahorrar batería, gire la batería antes de implantarlo en el animal. - Prepare el electrodo conduce antes de la cirugía por el recorte de los cables distales con las tijeras reservados para el manejo de cables de modo que no es de aproximadamente 3 cm de plomo (suficiente para alcanzar el músculo de la blanco) (Figura 1A). Alternativamente, la bobina los cables proximal al dispositivo y atarlos juntos con suturas de modo que no es de aproximadamente 3 cm de plomo desenrollada.
Nota: Guarde la parte recortada-off del electrodo conduce a fin de preparar "topes de plomo" (plástico carcasa aislada), tal como se describe en el paso 1.9. En el paso 3, los cables de transmisor se insertan a través del músculo, de modo y la parte distal, expuesta de los alambres deben ser mantenidos en su sitio y aislados usando tapones de plomo. - Utilice un bisturí para cortar 0,5 cm de la cubierta de plástico sin necesidad de cortar el alambre en sí. Utilice las herramientas reservados fomanipulación de cable r para estirar los extremos de los cables 4 - 5 veces su longitud original para que se ajusten fácilmente dentro de una aguja de calibre 25 (Figura 1B-B ''). Recorte el cable expuesto de los cables de forma que son de 0,5 cm de longitud.
- Preparar capuchones de plomo (tubos de plástico para cubrir los extremos del cable) antes de la cirugía. Utilice un bisturí para cortar tubos de 0,25 cm de largo de la carcasa de plástico que rodea los segmentos de electrodo leads salvado de paso 1.7.
NOTA: Se requieren cuatro tapas de plomo para cada ratón que serán sometidos a la implantación, pero lo mejor es para preparar el doble de la cantidad requerida de tapas. Después de haber preparado estéril adicional plomo CAPS es útil en caso de obtención una ventaja de la tapa no tiene éxito en el primer intento. - Registre el número de serie del transmisor insertado y guardar el embalaje original con la información de calibrado. Cada transmisor tiene diferentes calibraciones de frecuencia para la grabación EMG; introducirlos en el software de adquisición para obtener EMG aceptablesgrabaciones.
2. Preparación del ratón para la cirugía
- Elige el ratón deseada para la implantación (es decir, SOD1 (G93A) o control) y pesar el animal.
NOTA: La edad recomendada y el peso para un ratón (macho o hembra) sometidos a esta cirugía es P56 - P120 y ≥ 24 g, respectivamente. - Anestesiar al ratón bajo 3,5% de isoflurano con una tasa de 2 L / min de oxígeno de flujo. Realizar una pizca dedo del pie y una pizca de cola para asegurarse de que el ratón está totalmente anestesiado.
- Una vez anestesiados, retire el ratón en el cuadro desplegable y mantener la anestesia a través de un cono de la nariz estableciendo el nivel de isoflurano al 1,5% y la tasa de flujo de oxígeno a 1 L / min. Realizar una pizca dedo del pie y / o pellizcar la cola para asegurarse de que la anestesia se mantiene.
- Aplicar pomada oftálmica lubricante para evitar que los ojos se sequen durante la cirugía.
- Afeitar el ratón para exponer un sitio quirúrgico entre la oreja y el hombro (Figura 1C).
- Alternate limpiando el sitio quirúrgico, primero con desinfectante y luego con isopropanol. Repetir 2 veces más.
3. La implantación del dispositivo de telemetría al Registro escaleno y trapecio EMG Actividad
- Colocar el animal debajo de un microscopio de disección, en su lado en la parte superior de una almohadilla estéril que cubre una almohadilla de calefacción, y asegurar el cono de la nariz en su lugar con cinta adhesiva. Tenga en cuenta que es mejor para implantar el lado derecho de reducir la señal de ECG se origina en el corazón.
NOTA: Controlar la respiración y ajustar los niveles de isoflurano, si es necesario, para mantener una tasa de respiración regular y plano quirúrgico apropiado de anestesia. - Tirar de la extremidad anterior hacia el pie ipsilateral a lo largo del torso.
NOTA: Esta posición desplaza la escápula en sentido caudal, proporcionando acceso quirúrgico a los sCalene y trapecio músculos.- Tome las pinzas curvas romos, contener la pata delantera ipsilateral al sitio quirúrgico, y la cinta de la pata en su lugar (Figura 1C). Utilice cinta adhesiva fuerte adhesivo quirúrgico para asegurarse de que la pata es seguro para la duración del procedimiento.
- Póngase un par de guantes quirúrgicos. Utilice el bisturí para realizar una incisión oblicua, aproximadamente 2 cm de largo, entre el hombro y la oreja (línea roja en la Figura 1C).
- El uso de dos # 2 fórceps laminectomía, una en cada mano, tire hacia atrás la almohadilla de grasa y se extendió aparte los músculos trapecios y platisma para exponer la fascia que cubre los músculos esternocleidomastoideo y escaleno (Figura 1D y E).
- Utilizar el músculo esternocleidomastoideo pálido y nervio frénico como puntos de referencia para identificar los músculos escalenos. Tenga en cuenta que el nervio frénico corre paralela a los músculos escalenos, mientras que el esternocleidomastoideo se encuentra inferior. Los músculos escalenos corren oblicuamente desde las vértebras cervicales a las costillas bajo el músculo trapecio. Cables biopotenciales serán insertados en el músculo escaleno anterior, que puede ser identificado como el músculo que va adyacente al nervio frénico (Figura 1F y G).
NOTA: Precaución. Esta zona es muy vascularizado, y se debe tener cuidado para evitar el corte de la arteria subclavia. Evitar daños en el nervio frénico y el plexo braquial. - Una vez que los músculos escalenos y trapecio se han identificado (Figura 1G), hacer un bolsillo subcutáneo para el transmisor en la parte posterior del animal, entre las escápulas.
- Utilice la tijera de separación de tejido, insertar las puntas romas de las tijeras justo debajo de la piel y se extendió hasta que la apertura de un bolsillo que es de aproximadamente 1,25x la anchura del transmisor se forma (Figura 1H).
NOTA: El transmisor debe insertarse con mínima resistencia, pero la viruelay no debe ser tan grande que el transmisor puede moverse por sí mismo. Si el bolsillo es demasiado pequeño, el transmisor podría roce contra la piel, causando irritación que puede llevar al animal para arañar la piel y / o tirar de los cables fuera. Si el bolsillo es demasiado grande, seromas podrían forman, o el transmisor podrían migrar a una posición desfavorable.
- Utilice la tijera de separación de tejido, insertar las puntas romas de las tijeras justo debajo de la piel y se extendió hasta que la apertura de un bolsillo que es de aproximadamente 1,25x la anchura del transmisor se forma (Figura 1H).
- Enjuague con agua tibia solución salina, estéril e inserte el transmisor con el lado más plano contra el músculo. Coloque el transmisor de modo que quede plana y los cables emergen del bolsillo, paralelos entre sí en lugar de trenzado (Figura 1I). Curl cualquier exceso de longitud de cable por debajo del dispositivo y ponerla plana.
- Ejecutar los cables del transmisor a los músculos escalenos y trapecio de manera que los dos juegos de cables bipotenciales queden planas y paralelas entre sí.
- Usa los fórceps laminectomía para separar el escaleno anterior de los músculos que rodean e insertar una aguja de calibre 25 a través de la mus escalenoCLE, perpendicular a las fibras musculares.
- Inserte un plomo en la punta de la aguja y luego tirar de la aguja hacia fuera del músculo, dejando atrás el plomo insertado en el músculo hasta el aislamiento del cable (Figura 1J y K). Registro que conductores de color se insertan en la cual el músculo.
- Coloque una pequeña gota de adhesivo de cianoacrilato en el extremo expuesto del alambre, cerca del músculo donde se inserta el plomo, y deslice rápidamente la tapa de plomo sobre el alambre de modo que no hay ningún cable está expuesto entre la tapa de plomo y el músculo (Figura 2A y B).
NOTA: Aunque es una práctica aceptada para garantizar EMG conduce con cianoacrilato 17, 18, un método alternativo es para asegurar la tapa de plomo en su lugar mediante un nudo de sutura de seda alrededor de ella. - Recorte el exceso distal de alambre a la tapa y aplicar una gota de adhesivo de cianoacrilato para el extremo del conductor de la tapa / alambre. Dará el pegamentotiempo para polimerizar antes de la liberación (Figura 2C y D).
- Siga los mismos pasos (pasos 03/10 a 03/12) para insertar la opuesta polaridad de los cables en paralelo a la primera en el mismo músculo, 1 - 2 mm de distancia de la primera plomo.
- Repetir los pasos 03/10 a 03/12 para insertar cables en el músculo trapecio, ubicadas justo anterior al músculo escaleno (Figura 1L y M).
- Asegúrese de que los conductores de cables se fijan en su lugar y que sólo hay suficiente holgura en los cables para el animal para llevar a cabo los movimientos del cuerpo sin tirar de los cables. Asegúrese de que cualquier exceso de longitud de plomo no empuja contra la piel, ya que esto podría causar irritación que puede incitar al animal a cero o tirar de los cables fuera. Volver a colocar los cables, si es necesario, para evitar las posibles molestias.
- Retire con cuidado la cinta manteniendo pulsada la extremidad anterior. Tire de la almohadilla de grasa de la espalda sobre el músculo y lo utilizan para cubrir los cables insertados. Cerrar la incisión con adhesivo de cianoacrilato por burlaslos colgajos de piel de nuevo juntos de modo que las líneas de incisión hacia arriba. Pellizcar una porción de los colgajos de piel junto con las pinzas curvas y aplicar una pequeña línea de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de esta línea.
- Inyectar por vía subcutánea 0,1 ml de carprofeno para aliviar el dolor post-operatorio mientras el animal está todavía bajo anestesia.
NOTA: Continuar para administrar 0,1 ml de carprofeno vez al día durante 1 - 2 días después de la cirugía y, a continuación, según sea necesario después de eso. - Retire el animal de la ojiva y colocarlo en una jaula limpia en la incubadora pre-calentado hasta que el animal está despierto y moviéndose alrededor de la jaula voluntariamente. Mantenga el animal en la incubadora durante al menos 15 min después, el seguimiento de sus movimientos y estado de alerta.
4. Cuidado posoperatorio
- animales de la casa después de la cirugía por separado. Proporcionar animales de curación con gel de dieta y una botella de agua.
- Monitorear el animal para el primero 30 min después de la cirugía. Compruebe en el animal al menos cada hora fo 5 h después de la cirugía. En los días siguientes a la cirugía, marcar al menos dos veces al día.
- Mira para la necrosis, la infección a lo largo de la incisión y dentro de la cavidad del cuerpo que contiene el implante (es decir, calor, hinchazón y enrojecimiento), y la formación de seroma.
NOTA: Estas señales se producen en la primera semana después de la cirugía. Un saludable curado animales un mes después de la cirugía se muestra en la figura 1N. Aunque registros de EMG pueden realizarse inmediatamente después de la implantación, los animales se les da al menos una semana para curar antes de grabar EMG y la pletismografía, como señales de ECG pueden ser altos inmediatamente después de la implantación.
5. La adquisición de señales simultáneas electromiografía y la pletismografía
- Encienda todos los equipos de adquisición, incluyendo el flujo de sesgo.
NOTA: La velocidad de flujo para los ratones se establece típicamente a 1,0 L / min. - Calibre la cámara (s) pletismografía utilizando un medidor de flujo.
NOTA: Compruebe periódicamente el chambe pletismografíaRS para asegurar que los sellos no están agrietadas o rotas. Escudo una semana las juntas de goma con un lubricante tal como grasa de vacío una vez para mantener su buen estado. - calibración del transmisor de entrada según lo especificado por el fabricante.
- Coloque el ratón en la cámara de pletismografía durante al menos 1 h para aclimatarse que antes de la grabación de EMG y la pletismografía. El uso de múltiples cámaras, es posible grabar de un ratón mientras que el siguiente ratón se aclimatando en una segunda cámara. No encienda el transmisor durante el periodo de aclimatación, a fin de conservar la energía de la batería (Figura 1O).
- Antes de la grabación (pero después de la calibración), gire en el transmisor mediante la colocación de un imán fuerte dentro de 1 en del animal implantado; una luz roja en la parte frontal del receptor indicará cuando el transmisor está encendido.
- Comience la adquisición usando el menú desplegable con la etiqueta "Adquisición" y elegir la opción "iniciar la adquisición." Aunque la duración de la grabación puedevariar de experimento, una pletismografía típico y grabación de EMG dura de 1 - 3 h.
NOTA: El transmisor tiene una velocidad de muestreo intrínseca de 240 Hz. Un ritmo más rápido de 500 Hz se encuentra en el software para interpolar entre los puntos y para proporcionar una forma de onda suave. El filtro de paso bajo (que sirve como un filtro anti-alias) y el filtro de paso alto en el implante especifican el ancho de banda de 1 a 50 Hz para este dispositivo de telemetría. 60-Hz A / C interferencia no contribuye a un exceso de ruido en la señal EMG debido a que los implantes son alimentado por batería y el animal protege el implante y conduce de campos eléctricos. Pletismografía, EMG, y el vídeo se sincronizan automáticamente en tiempo real a través del software de adquisición. - Cuando se termina la adquisición, apagar el transmisor con un imán y eliminar el animal de la cámara.
- Si iniciar otra grabación, limpiar la cámara, introduzca en las nuevas calibraciones del transmisor de la siguiente animal, y comenzar la segunda grabación. Si la aletaISHED con adquisición para el día, apagar el transmisor, limpiar la cámara de la pletismografía, y apague todos los equipos de adquisición y el flujo de sesgo.
Figura 1. Implantación de telemetría Dispositivo para Medir EMG músculos respiratorios. Transmisores (A) de telemetría con dos pares de biopotencial conduce a medir EMG. Leads pueden recortarse a la longitud deseada (parte inferior) o enrolladas y metidas debajo del transmisor (parte superior). (B) del transmisor conduce. (B') conduce con aislamiento de plástico recortada para exponer los cables y para hacer tapones de plomo (recuadro). (B '') conduce con alambres estirados 4 - 5 veces su longitud original. Leads deben ser recortadas de manera que son de 0,5 cm de largo (no mostrado). (C) de ratón preparado para la cirugía, con el sitio quirúrgico afeitado y correctamentepata posicionado. La línea de puntos rojo indica el sitio de la incisión. (D) los músculos superficiales situadas por debajo de la almohadilla de grasa y la fascia, visto después de la incisión inicial. T = trapecio. S = esternocleidomastoideo. P = platisma. Flecha amarilla = nervio frénico. Diagrama (E) de la historieta de los músculos y del nervio frénico se muestran en (D). Fórceps deben utilizarse para difundir aparte los músculos trapecios y platisma para alcanzar el músculo profundo escaleno, mostrada en (F) y (G). (F) Señales utiliza para identificar la ubicación de la escaleno y el trapecio. Esta imagen muestra la arteria subclavia (flecha blanca), el plexo nervioso / braquial frénico (flecha negro), y el músculo esternocleidomastoideo pálido (flecha amarilla). (G) la historieta que representa la ubicación de los músculos más profundos (es decir, escaleno medio, escaleno anterior, y SCM), la arteria subclavia, y el nervio frénico. El escaleno posterior no es visible. Se puede acceder sólo cuando la superficiAL músculos (en D y E) se separan. (H) Hacer un bolsillo para el transmisor con las tijeras de punta roma. (I) transmisor insertado en la cavidad subcutánea, con los cables en paralelo posicionado emergentes del bolsillo. (J) La inserción de la aguja de calibre 25 en el escaleno, perpendicular a las fibras musculares, para hacer un túnel para el conductor de cable. (K) Ambos cables insertados en el músculo escaleno. tapas de plomo son posicionados en el extremo y pegadas en su lugar. (L) de inserción de la aguja de calibre 25 en el trapecio, perpendicular a las fibras musculares, para hacer un túnel para el conductor de cable. (M) Todos los cuatro conductores insertados en los músculos trapecios y escalenos y en posición plana antes del cierre de la incisión. (N) se recuperaron completamente de ratón, con la vía subcutánea transmisor colocado en la parte posterior. (O) pletismografía grabar simultáneamente, la actividad EMG del músculo, unand vídeo utilizando una cámara de pletismografía (flecha amarilla), telemetría almohadilla de recepción (flecha roja), y la cámara (flecha negro), respectivamente. Un flujo de sesgo multifunción está conectada a la cámara de pletismografía a través de un tubo de plástico (flecha azul) para suministrar oxígeno al ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Asegurando Caps de plomo con cianoacrilato adhesivo. (A) Aplicar una pequeña gota de cianoacrilato (círculo púrpura) al cable expuesta de la proximal de alambre de electrodos y cables (E) al músculo. (B) rápidamente deslice la tapa de plomo preparada (LC) en el cable expuesto sobre el adhesivo de cianoacrilato de manera que la tapa de plomo se sitúa directamente adyacente al músculo. (C) Se quita una pequeña porción del extremo distal de la tapa de plomo y alambre de modo que no hay electrodo expuesta presente que no está aislado con plástico. (D) Aplicar una pequeña gota de adhesivo de cianoacrilato para el extremo de la tapa de plomo. Retire el extremo distal recortado-off de la tapa de plomo del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Análisis de ARM EMG y la pletismografía
- Abra el software de análisis y revisar el archivo de interés (ir a "Archivo" y seleccionar "Abrir archivo de revisión"). Filtrar las señales EMG utilizando un filtro de paso alto de 30 Hz con un clic derecho en el trazado EMG, la elección de "Analizar Atributos", destacando la "Atributos avanzados 1" ficha y cambiar el filtro de paso alto de 30 Hz.
NOTA: Este paso filtrado elimina no discriminatoria, información de baja frecuencia. Localizar áreas de inactividad ratón mediante inspección visual basado en la falta de movimiento en el archivo de video sincronizado y la falta de cambios grandes e irregulares de presión debido al movimiento en la traza pletismografía (cuadro rojo en la Figura 3A); la inactividad se produce cuando el ratón está dormido o despierto, pero todavía. - Identificar combates EMG independientemente para cada músculo.
- Rectificar e integrar la señal de EMG se filtró sobre 30 ms (Figura 4).
Nota: debido a ratones respiran a una velocidad de 3 Hz, cada respiración está representada por aproximadamente 11 valores integrados. - Determinar la amplitud de línea de base EMG promediando los valores rectificados y integrados asociados con la señal de EMG durante un período de 3 s cuando el ratón está inactivo y la traza pletismografía muestra eupnea (respiración normal) (Figura 4).
- Identificar "episodios" de actividad definido por al menos 3 valores rectificados e integrados consecutivos que son al menos un 5aumento 0% por encima de la señal de línea de base EMG (determinado en la etapa 6.3.2).
NOTA: tres valores consecutivos representan una ventana de 90 ms, pero algunos episodios contendrán más de 3 valores por encima del umbral y tendrán una duración de más de 90 ms. - Utiliza el vídeo y la pletismografía traza sincronizada para excluir episodios que se producen durante suspiros (Figura 3B); sniffing (Figura 3C); o los movimientos del ratón volitivas, tales como giro de la cabeza o de la preparación.
- Repita los pasos 6.3.1 - 6.3.4 para el segundo muscular.
- Rectificar e integrar la señal de EMG se filtró sobre 30 ms (Figura 4).
- Calcular la frecuencia de combate para cada músculo. Record a) el tiempo de tiempo y extremo de comienzo de cada periodo inactivo y b) el tiempo de cada combate se produjo usando los criterios anteriores. Suma el tiempo de inactividad total. Se divide el número total de episodios por el total de minutos de tiempo inactivo en el transcurso de la sesión de grabación para calcular la frecuencia de combate.
- Determinar si los cambios en la ventilación se asocian con la activación de la m grabadauscles.
- Seleccionar los parámetros de respiración que se desea medir (por ejemplo, el pico de flujo inspiratorio, el volumen corriente, el volumen minuto, y respiraciones por min).
NOTA: Todas las selecciones posibles se pueden encontrar en el menú desplegable de configuración P3 en "parámetros derivados." - Identificar las respiraciones que se producen durante la actividad EMG combate y de las respiraciones que se producen durante la actividad de referencia EMG (Figura 4).
- Crear segmentos que abarcan analizador respiraciones pletismografía que se asocian con la actividad EMG combate y crean segmentos analizador independientes que están asociados con la actividad EMG basal. Asegúrese de establecer el tipo de análisis a "Analizador Seg."
NOTA: Esta selección se encuentra en el menú desplegable de configuración P3 en "Configuración de reducción de datos." - Marcar el comienzo de cada segmento analizador con un evento haciendo clic derecho en la traza de pletismografía. Especificar un combate que contiene segmentos analizador como "Evento 1" en el menú desplegable y specify los segmentos de analizador de línea de base como "Evento 2" para distinguir las dos clases de segmentos.
- En el menú "Funciones", salvo la "Sección de Marcas" y "marcas derivadas de datos." Bajo el menú Datos Analizador, salvar el "Archivo Analizada opinión" y "Analizada Derivado de datos."
NOTA: Los parámetros de respiración seleccionados para cada respiración individuales se encuentran en la hoja de datos derivado marcas en la pestaña "derivaciones". - Comparación de los parámetros respiratorios para las respiraciones que se producen durante los episodios brazo (marcados como Evento 1) frente a respiraciones que se producen durante la actividad de línea de base (marcado como Evento 2) para determinar si la actividad muscular se asocia con cambios en la ventilación.
- Seleccionar los parámetros de respiración que se desea medir (por ejemplo, el pico de flujo inspiratorio, el volumen corriente, el volumen minuto, y respiraciones por min).
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Representative Results
El protocolo descrito se usó para implantar un dispositivo de telemetría y para grabar escaleno y trapecio EMG, WBP, y el vídeo de un ratón SOD1 (G93A) modelo ALS. Períodos en los que el animal es inactivo (por ejemplo, no se mueve) se identificaron utilizando la grabación de vídeo y confirmados por la falta de actividad de movimiento relacionada en la traza WBP (Figura 3A). Períodos inactivos incluyen tiempo pasado en REM o no REM del sueño, así como el tiempo gastado despierto pero todavía (Figura 3A). Actividad EMG durante este tiempo inactivo se puntuó como un combate cuando los valores de al menos 3 consecutivos rectificados y integrados (más de 30 ms) tenían amplitudes con al menos un aumento del 50% sobre los niveles de EMG de referencia (Figura 4). Bouts de actividad que se produjeron durante suspiros o sniffing (determinado mediante pletismografía), o movimientos volitivos (evaluada por vídeo) se excluyeron del análisis (Figura 3B-C). SOD1 (G93A) ratones a early- a las etapas mediados-sintomática (Tabla 1) combates de exhibición de mayor actividad de ARM en reposo que duran una a varias respiraciones (Figura 4). Bouts de actividad ARM son raros en SOD1 pre-sintomática (G93A) (Figura 3A) o ratones de tipo salvaje 10.
| Escenario | Estado | etapa inicio | Presentación de las extremidades posteriores |
| 0 | Presintomático | <P100 | No hay diferencias notables en comparación con wildtypes. |
| 1 | inicio de la enfermedad | ~ P100 | colapso del miembro posterior cuando el ratón se suspende de cola. |
| 2 | paresia | ~ P120 | colapso total o parcial de las extremidades posteriores con aparición de temblor. | </ Tr>
| 3 | inicio de la parálisis | ~ P140 | Dificultad para caminar, curling dedo del pie y / o arrastrando los pies. |
| 4 | parálisis avanzada | ~ P150 | Minimal movement conjunta, las extremidades posteriores no se utiliza para el movimiento hacia adelante. |
| 5 | Etapa final | ~ P160 | Ratón no puede enderezarse de un lado dentro de los 30 segundos. |
Tabla 1. Neurological Scoring de ALS-como progresión de la enfermedad en SOD1 ratones (G93A).
Figura 3. Representante WBP y EMG Traces. (A - C) WBP y EMG de músculos escalenos y trapecio a partir de un SOD1 pre-sintomática (G93A) de ratón (P98 edad). Periodos (A) cuando t que animal es en reposo (caja roja) se utilizó para el análisis. Traces fuera de la caja roja muestran picos grandes e irregulares en la actividad trazas de pletismografía y músculo en el EMG traza, típico cuando un animal está en movimiento, como se determina por las grabaciones de vídeo sincronizadas (no mostrados). El cuadro rojo muestra EMG traza que carecen de combates EMG, característico de un ratón pre-sintomática. (B) Bouts de actividad EMG con frecuencia se producen inmediatamente anterior a un suspiro (como se muestra en la traza pletismografía). Suspiros se caracterizan por la inspiración de alta amplitud seguido de caducidad dramático. Los negros punta de flecha apunta a una señal de ECG característico. (C) Bouts de actividad EMG con frecuencia se producen mientras que el ratón está oliendo. Oler se refleja en la traza pletismografía por un aumento prolongado en frecuencia y amplitud a través de múltiples respiraciones (co-produciendo con ráfagas de actividad EMG).color = "# 0066CC"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Scoring Bouts de EMG Actividad. (A y B) Dos ejemplos de WBP, se filtraron trazas trapecio EMG, y rectificadas y las señales de trapecio EMG integrados de un SOD1 sintomática (G93A) de ratón (P126 edad). Líneas de puntos azules indican el nivel de EMG de referencia, determinado por un promedio de señales rectificadas e integrados en un período de tiempo de 3 s. líneas de puntos rojas indican un aumento del 50% en la amplitud sobre la actividad basal EMG. Un ataque de actividad se obtuvo cuando por lo menos 3 valores rectificados e integrados consecutivas superen el umbral de base 50%. Haga clic aquí para ver alArger versión de esta figura.
| PIF (ml / s) | TV (ml) | MV (ml / min) | Frecuencia respiratoria (respiraciones / min) | |
| Naive (n = 5) | 4,4 ± 0,7 | 0,27 ± 0,04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Implantado (n = 4) | 4,1 ± 0,2 | 0,27 ± 0,11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P-valor | 0,439 | 1,000 | 0,893 | 0,410 |
| Los valores mostrados reflejan media ± SD. Los valores de P se calcularon con la prueba t de Student. | ||||
Tabla 2. Comparación de la respiración Entre 4 SOD1 ratones sin tratamiento previo (no implantados) y se implantaron Etapa (G93A). No se encontraron diferencias significativas en el flujo máximo inspiratorio (PIF), el volumen tidal (TV), el volumen minuto (MV), o respiraciones por minuto entre los dos grupos. Los valores mostrados reflejan la media ± SD. Los valores de P se calcularon con la prueba t de Student.
Las mediciones repetidas de EMG y / o WBP se pueden hacer en el mismo ratón durante varios meses, con muy poco cambio en la señal EMG o línea de base después de un período de recuperación de 1 a 2 semanas después de la cirugía. El transcurso del tiempo es típicamente limitada por la duración de la batería y por lo tanto será determinado por la frecuencia y la duración de las grabaciones individuales. Los investigadores deben ser conscientes de que los eventos adversos debido a que el dispositivo implantado puede ocurrir de vez en cuando. El ratón puede sacar los cables del músculo implantado o cero / chew en la piel si los cables o transmitirter están incorrectamente colocado. En la mayoría de los casos, las consideraciones éticas exigen que estos animales sean sacrificados. El transmisor se puede eliminar, esterilizar, y re-implantado en otro ratón.
Para verificar que dispositivo de implantación no afecta a la respiración, se compararon las mediciones de pletismografía entre SOD1 ingenuo (G93A) ratones (no implantada) a ALS etapa 4 y ratones implantados SOD1 (G93A) en ALS etapa 4. No se encontraron diferencias significativas en el flujo máximo inspiratorio (PIF), el volumen tidal (TV), el volumen minuto (MV), o respiraciones por minuto entre los dos grupos (Tabla 2). El escaleno y trapecio son adyacentes entre sí y están directamente en contacto uno con el otro. Aunque combates EMG simultáneas a veces se observan en ambos músculos, fuertes combates EMG también se detectan en el trapecio cuando combates EMG están ausentes en el escaleno (y viceversa), lo que demuestra que hay una mínima diafonía entre los electrodos i implantadon cada músculo. También se observan episodios independientes de la actividad EMG cuando los cables se colocan en los músculos trapecio y esternocleidomastoideo (datos no mostrados).
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Discussion
El procedimiento ha demostrado aquí permite la medición no invasiva (después de la implantación quirúrgica inicial del transmisor) de la actividad de los músculos respiratorios y la ventilación durante muchos meses en el mismo animal. Esta técnica tiene varias ventajas sobre técnicas estándar EMG en ratones anestesiados: 1) los experimentos requieren un menor número de ratones y proporcionan la capacidad de grabar datos del mismo sitio en un solo ratón a través de etapas de la enfermedad (en lugar de utilizar varios ratones en diferentes estadios de la enfermedad); 2) análisis de los datos se puede realizar con las pruebas estadísticas más potentes (es decir, usando medidas repetidas en lugar de comparar los grupos experimentales separados); 3) la grabación simultánea de EMG y WBP permite la evaluación directa de los efectos de la actividad ARM de la ventilación; y 4) los experimentos se pueden realizar en los ratones en diferentes estados de sueño / vigilia. Por otra parte, debido a ratones sanos tienen una muy baja frecuencia de los episodios de ARM en reposo, esta técnica es caPable de detectar incluso pequeños cambios en la frecuencia de la actividad ARM en ratones modelo de ALS en las primeras etapas sintomático de la enfermedad 10. Sin embargo, ya que esta técnica mide la actividad de un gran pero desconocido número de fibras musculares durante el comportamiento natural, en lugar de después de la estimulación del nervio a intensidades experimentalmente controladas, que no es adecuado para la estimación de tamaño de la unidad de motor o número. Otra limitación es que los transmisores basados en telemetría adecuado para la implantación en los ratones se limitan actualmente a dos conjuntos de cables de biopotenciales; Por lo tanto, sólo dos sitios se pueden grabar desde el mismo ratón. Para los experimentos que requieren la grabación simultánea de más de dos músculos en el mismo ratón, múltiples cables EMG pueden ser implantados y conectados a un sistema de adquisición usando una correa de sujeción de alambre, como se ha descrito previamente 14, 15. Sin embargo, se requerirían modificaciones a la cámara de pletismografía o sellos para permitirpara la grabación simultánea de la actividad muscular y la ventilación si está atado un ratón.
Cuando se aplica esta técnica, ciertas etapas del protocolo deben llevarse a cabo con cuidado. biopotenciales cables deben estar colocados de forma que no impidan el movimiento o irritan la piel que lo recubre. Además, el transmisor debe estar colocado de manera que no afecta el movimiento o la postura normal del ratón. Se recomienda que la colocación adecuada de los cables (es decir, totalmente incrustados en el músculo correcto y no en contacto músculos adyacentes) y la falta de daño muscular o la infección son verificados por autopsia después del experimento se ha terminado. Además, es imprescindible que el transmisor se apaga después de cada sesión de grabación para conservar la vida de la batería.
Una consecuencia inevitable de la medición de EMG de los músculos en el área del pecho y el cuello es la alta probabilidad de que las señales de electrocardiograma (ECG) de grabación, que aparecen como regular clava dentro de la traza EMG (Figura 3B, punta de flecha). señales de ECG pueden minimizarse mediante la cuidadosa colocación de los cables de tal manera que todo el metal está inserta completamente en el músculo y evitando la colocación cerca de los principales vasos sanguíneos. El implante del electrodo en los músculos en el lado derecho del cuerpo en vez de la izquierda, que está más cerca del corazón, también puede reducir las señales de ECG. Aunque la señal ECG puede filtrarse fuera de EMG trazas utilizando algoritmos computacionales o restando una señal grabada independientemente ECG 19, 20, 21, no es normalmente necesario. La señal de ECG se puede distinguir fácilmente a partir de la señal EMG por su regular de forma, frecuencia y amplitud.
La técnica descrita se ha utilizado para medir los cambios en la actividad de ARM en reposo en la SOD1 (G93A) modelo de ratón de ALS 10. músculos respiratorios accesorios también son reclutados en otsus enfermedades neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular, atrofia muscular espinal, neuropatías periféricas, etc.) y siguiendo nerviosas o lesiones de médula espinal. por lo tanto, la actividad de ARM puede servir como un proxy para medir el deterioro funcional de la membrana y medir la gravedad de la enfermedad, seguimiento de la recuperación de una lesión, o evaluar los posibles beneficios del tratamiento para mejorar la respiración en una variedad de modelos de enfermedad animal o de lesiones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El apoyo a este trabajo fue proporcionado por el administrador Premio Hospital Medical Center de Niños de Cincinnati a SAC y una beca de formación de los NIH (T32NS007453) a VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
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