Dette arbejde beskriver en trin-for-trin metode til fremstilling af polyphenol-rige ekstrakter fra frysetørret bærpulver. Derudover giver den en grundig beskrivelse af, hvordan man bruger disse polyphenolrige ekstrakter i cellekultur i nærvær af peptidhormon angiotensin II (Ang II) ved hjælp af vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er).
Epidemiologiske undersøgelser tyder på, at øget flavonoid indtagelse korrelerer med nedsat dødelighed på grund af hjerte-kar-sygdomme (CVD) i USA og USA. Bær er meget forbrugt i USA og har et højt polyphenolisk indhold. Polyfenoler har vist sig at interagere med mange molekylære mål og udøve adskillige positive biologiske funktioner, herunder antioxidant, antiinflammatoriske og kardioprotektive virkninger. Polyfenoler isoleret fra blackberry (BL), hindbær (RB) og sort hindbær (BRB) reducerer oxidativ stress og cellulær senescence som svar på angiotensin II (Ang II). Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af protokollen, der anvendes til fremstilling af polyphenolekstrakterne fra frysetørrede bær. Polyphenolekstraktioner fra frysetørret bærpulver blev udført under anvendelse af 80% vandig ethanol og en ultralydassisteret ekstraktionsmetode. Det rå ekstrakt blev yderligere oprenset og fraktioneret under anvendelse af chloroform og ethylacetat,henholdsvis. Virkningerne af både rå og oprensede ekstrakter blev testet på vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) i kultur.
Polyfenoler er forbindelser indeholdende mindst en phenolisk ring i deres struktur og er rigeligt til stede i planteområdet 1 . Mennesker har brugt planter i årtusinder til medicinske formål uden at være opmærksom på eksistensen af sådanne forbindelser 2 . Mange frugter og grøntsager har nogle delte polyphenoliske forbindelser, om end med forskellige mængder, herunder flavonoider, stilbener og phenol syrer 3 . Selvom polyfenoler ofte er forbundet med farverige frugter og grøntsager, er dette ikke strengt sandt. For eksempel er zeaxanthin og xanthin til stede i grøntsager, der ikke er yderst farverige, såsom løg og hvidløg, der er fra familien af scallions og er forbundet med mange sundhedsmæssige fordele 4 . Bortset fra at være forbundet med flere sundhedsmæssige fordele 5 , tjener polyphenoler også planter ved at beskytte dem mod insekterD ultraviolet stråling 2 . Polyfenoler findes almindeligvis i den menneskelige kost og betragtes som kraftige antioxidanter, da de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) 6 , 7 , 8 . De har også antiinflammatoriske 9 , antimikrobielle 10 , antihypertensive 11 og anti-kræftfremkaldende 12 , 13 egenskaber.
Epidemiologiske undersøgelser viser en invers forbindelse mellem forbruget af flavonoider og kardiovaskulær sygdom (CVD) incidensen 16 , 17 og dødelighed 14 , 15 . Bær er meget forbrugt i USA og har store mængder polyphenoler, herunder flavonoider. For eksempel forbrug af blackberry (BL) juice (300 ML / d) i otte uger signifikant nedsat systolisk blodtryk hos dyslipidemiske patienter 18 . Jeong et al. 19 rapporterede, at prehypertensive mænd og kvinder forbruge 2,5 g sort hindbær (BRB) ekstrakt om dagen havde lavere 24-timers og nattt blodtryk sammenlignet med dem, der indtog en placebo. Hindbær (RB) reducerede blodtrykket, mens ekspression af superoxiddismutase (SOD) blev øget hos spontant hypertensive rotter 20 . Det har for nylig vist sig, at BL, RB og BRB reducerer niveauerne af ROS og senescence induceret af angiotensin II (Ang II) i vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) 21 . Desuden reducerede anthocyaninfraktionen fra BL-ekstrakt ekspressionen af inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og inhiberede aktiviteten af Nuclear Factor kappa B (NF-KB) og ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) i lipopolysaccharid (LPS) -stimuleret J774 cellerAss = "xref"> 22. BRB-ekstrakter reducerede NF-KB-aktiveringen og cyclooxygenase 2 (COX-2) -expressionen in vitro 23 , forbedrede lipidprofilen og forhindrede atheroscleroselæsionsdannelse hos mus, der fodrede en fedtholdig diæt 24 . Anthocyaniner, der betragtes som de mest omfattende flavonoider i bær, modulerer det inflammatoriske respons i LPS-stimulerede RAW 264.7-makrofager ved at reducere Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produktion 25 og reducere proliferationen og migreringen af VSMC'er 26 .
Da der har været voksende interesse for at forstå polyphenols rolle i menneskers sundhed og sygdom, er det vigtigt at optimere ekstraktionsmetoden. Opløsningsmiddeludvindingen bruges i vid udstrækning til det formål, da det er omkostningseffektivt og let reproducerbart. I denne undersøgelse blev en opløsningsmiddelekstraktion anvendt med ethanol sammen med en ultralydassisteret ekstraktionN-metode, som blev tilpasset fra Kim og Lee 27 . Rensningen og fraktioneringen af råekstrakter (CE) under anvendelse af chloroform og ethylacetat blev udført for at opnå den oprensede ekstrakt (PE) fraktion, som var tilpasset fra Queires et al. 28 . Endvidere blev effektiviteten af rå versus oprensede polyphenolekstrakter fra BL sammenlignet med BL ved reduktion af den basale phosphorylering af ERK1 / 2 sammenlignet, og repræsentative eksempler på den inhibitoriske virkning af oprenset BL-polyphenolekstrakt på Ang II-inducerede signalreduktioner i VSMC'er blev tilvejebragt.
Polyfenoler isoleret fra bær indeholder tydelige præparater. Den her beskrevne ethanolbaserede ekstraktionsprotokol tillader identifikation af forskellige niveauer af phenol syrer og flavonoider, der findes i rå og rensede polyphenolekstrakter af BL ( tabel 1 ). CE blev beriget i gallinsyre, ferulinsyre, 4-0-caffeoylquininsyre og 5-0-caffeoylquininsyre. Renseprocessen ændrede ikke signifikant niveauerne af gallinsyre og p-coumarsyre. Det øgede imidlertid niveauerne af 3- O- caffeoylquinins…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af American Heart Association (14GRNT20180028) og Florida State University Council for Research and Creativity (COFRS).
Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |