Summary
出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。
Abstract
ダイナミック微小管は、多くの細胞プロセスの基本である、と微小管ダイナミクスの正確な測定は、細胞が、これらのプロセスを調節し、どのように遺伝的変異インパクトレギュレーション方法への洞察を提供することができます。後生動物モデルにおける微小管ダイナミクスの定量化は、遺伝子操作上の高い微小管の密度および制限などの関連する課題の番号を持っています。これとは対照的に、出芽酵母のモデルは、これらの課題を克服する利点を提供しています。このプロトコルは、酵母生細胞における単一微小管のダイナミクスを測定する方法を説明しています。蛍光タグ付けされたチューブリンを発現する細胞は、安定したタイムラプス画像の取得を可能にする、組み立てられたスライドチャンバーに接着されます。高速の詳細なガイドは、四次元画像の取得はまた、共焦点画像スタック内の動的微小管の特性を定量化するためのプロトコルと同様に、提供されます。この方法では、従来の酵母の遺伝学と組み合わせて、PROV定量チューブリンサブユニットの活性を変化させる微小管調節剤または変異の効果を評価するための一意に適しているアプローチのIDE。
Introduction
微小管は、αβチューブリンタンパク質サブユニットからなる細胞骨格ポリマーであり、細胞内輸送、細胞分裂、形態形成、および運動性を含む細胞状況、多種多様に使用されています。これらの多様な役割のための微小管ネットワークを構築するために、細胞は、慎重に、いつどこで微小管の形を調整する必要があります。この規則は、遊離のサブユニットに微小管ポリマーまたは逆アセンブル微小管にαβチューブリンサブユニットを組み立てるのいずれかことが反応を制御することによって達成されます。これは、微小管ダイナミクスとして知られています。
微小管分野の主要な目標は、αβチューブリンサブユニットおよび/または微小管にチューブリンと結合する外因性制御因子の研究を含む微小管ダイナミクスを調節する分子メカニズムを解明することです。十分に確立された実験的なアプローチは、多くの場合に、COM、精製αβチューブリンタンパク質を用いてインビトロでこのシステムを再構築することです精製した外因性の規制当局とbination。これは有用なアプローチではあるが、再構成されたシステムでの微小管ダイナミクス生きた細胞で観察されたものから強く異なることは明らかです。例えば、微小管は、より速く成長し、 インビトロよりもインビボにおいても遅い縮小します。これらの違いは、細胞内の既知の外因性調節因子1の可用性、ならびにまだ未定義の要因に起因し得ます。したがって、微小管の規制当局およびネイティブ細胞の状況でのダイナミクスを混乱させる変異体の活性を測定することが重要です。
後生動物モデルは、微小管機能と高次組織を調査するための有力なシステムであることが証明されているが、いくつかの実用的な懸念が厳しく、微小管ダイナミクスの正確な測定のために、これらのモデルの有用性を制限します。まず、数十からセル当たり数千人に及ぶ微小管の高い数は、それが困難な自信を持ってすることができます時間をかけて個々の微小管を追跡します。多くの研究は、エンド結合（EB）家族の中でタンパク質のような選択的に微小管の両端に局在するタンパク質を、画像化することによってこの課題に対処します。しかし、これらのタンパク質は後生動物のみ2で成長している微小管の両端に局在することが知られています。したがって、これらのタンパク質の有用性は間接的にしかそのような破局の周波数と動力学の他の側面を、測定しながら直接、増殖速度を測定するように制限されます。第二に、ゲノム編集技術の進歩にもかかわらず、安定的に蛍光標識したチューブリンを発現するかまたは選択的にチューブリンまたは微小管のレギュレータを操作するために変異を導入した細胞を作成することは重要な課題です。また、後生動物における多くのチューブリンイソ型の存在は、変異は、個々のチューブリン遺伝子に影響を与える方法の研究を混乱させる。
出芽酵母系は、in vivo microtubu に測定するために、いくつかの重要な利点を提供しますルダイナミクス。酵母は、個々の微小管の可視化を可能に簡略化微小管ネットワークを持っています。酵母では、微小管は、核膜3中に埋め込まれている紡錘体極体（のSPB）、として知られているセンターを組織から発します。 SPBは、微小管4,5の核γチューブリン小複合体のための足場として機能します。 SPBは、微小管、スピンドル微小管とアストラル微小管の2つのクラスを核形成します。核質にスピンドル微小管プロジェクトと動原体微小管を経由し、極間微小管6を重ね経由してスピンドルを安定化させるための染色体に取り付けるために重要です。対照的に外側にサイトゾルに、アストラル微小管プロジェクト及び紡錘体微小管の緻密なネットワークに比べて比較的まれです。有糸分裂の際、事前に後期の細胞は、SPBのいずれかから発せられるだけで1-2アストラル微小管を持っています。これらは私のように存在してndividual微小管ではなく、バンドル7のように。有糸分裂時のアストラル微小管の役割は、つぼみネックとして知られている母親とつぼみのコンパートメントとの間の接合部の中に核とスピンドルを移動させることです。この動きは、向かって、最終的に芽ネック8に核とスピンドルを引く、アストラル微小管に力を生成する明確に定義された経路を含みます。
酵母系の別の利点は、比類のない精度で微小管調節剤及びチューブリンサブユニットを調査するために使用することができ、その遺伝学の有用性です。単一βチューブリン遺伝子（TUB2）および2つのαチューブリン遺伝子（TUB1とTUB3）：酵母はまた、チューブリンアイソタイプの簡略化されたレパートリーを有します。変異は、容易にこれらの遺伝子に導入し、それによって均質なチューブリン集団9、10で研究することができます。広くは数多くあります利用できるラベリング微小管のための構造、およびこれらは、安定な発現のための染色体座での統合のために標的とすることができる（説明を参照）。
この方法の全体的な目標は、微小管ダイナミクスの高分解能測定のための4つの次元（X、Y、Z、およびT）で酵母細胞を生きた画像単一微小管です。酵母細胞における蛍光標識チューブリンの恒常、低レベルの発現のための構築物を統合するための方法が記載されています。撮像前に、生きている細胞は、長期的なイメージングのための細胞を安定化するためにレクチンコンカナバリンAで被覆したスライドチャンバーに取り付けられています。画像取得のための最適なパラメータ、ならびにデータ分析のためのワークフローは、また、記載されています。
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Protocol
1.準備-LEUドロップアウトプレート
- 2Lのフラスコに、滅菌脱イオン水（DIH 2 O）の800ミリリットルを加えます。ドロップアウト塩基（DOB）粉末、CSM-Leuの0.69 gおよび寒天20 gを26.71グラムを加えます。磁気撹拌棒で混ぜます。 DIH 2 Oで1Lに持ち込みます
- 121℃でオートクレーブし、30分間19 PSI。
- オートクレーブからフラスコを取り外し、それを穏やかに撹拌しながら〜65°Cまで冷却することができます。
- 直径100mmのプレートに30ミリリットル/プレートを注ぎます。これらは、4℃で保存する前に36~48時間室温で放置します。
2. GFP標識チューブリンの構成的発現のためのGFP-Tub1の統合
- 3分間の10mg / mLの一本鎖DNA（ssDNA）のストック濃度を沸騰。
- 精製されたGFP-Tub1プラスミドDNA 11の400 ngのと煮沸したssDNAの2μLを組み合わせます。
注：安定した、蛍光標識のために使用することができるプラスミドの様々なものがあります別のフルオロフォアおよび選択マーカーを利用する酵母における微小管の。これらの選択肢のうちのいくつかは、議論の項に記載されています。 - 有能な酵母細胞の50μLアリコートにDNAの混合物を追加します。
注：ソルビトール溶液（SORB; 100mMのLiOAc、10mMのトリス-HCl pHが8、1mMのEDTA pHが8、およびpH 8に希酢酸を用いて調整し、1Mソルビトール）を用いてコンピテント酵母細胞を準備します。コンピテント酵母細胞を作製する詳細な説明については、参照12参照。 - ボルテックス徹底的に。
- DNA細胞混合物にポリエチレングリコール（PEG）溶液（100mMのLiOAc、10mMのトリス-HCl pHが8、1mMのEDTA / NaOHでのpHが8、および40％PEG3350）の総体積6X加えます。
- ボルテックス徹底的に。
- 穏やかに攪拌しながら30℃で少なくとも1時間インキュベートします。
- 総体積と渦の10重量％ジメチルスルホキシド（DMSO）を加えます。
- 15分間42℃でインキュベートします。
- 5分間2,500×gで遠心します。
- -LEUドロップアウトプレート上のプレートの細胞。
注：他の構築物は、代替マーカーを使用することができながら、GFP-Tub1構築物は、ロイシン栄養要求性マーカーが含まれています。ドロップアウト培地は、構築体の栄養要求性マーカーに特異的であるべきです。 - 形質転換された細胞は、30℃で3-5日間増殖することを許可します。
- オートクレーブ爪楊枝を用いてコロニーを転送することにより、新鮮な-LEUドロップアウトプレート上に再ストリーク単一形質転換コロニー。 30°Cで一晩プレートをインキュベートします。
- 視覚的に清浄なスライド上の水の2μLにステップ2.14でプレートから単一コロニーからの細胞の約1μLを懸濁させることによってGFP信号の各形質転換体をスクリーニングします。カバーガラスで懸濁した細胞を覆い、蛍光顕微鏡を使って観察します。
- 488nmの光を用いて形質転換体を励起し、GFP信号の存在を探し。
- 488nmの光を用いて形質転換体を励起し、GFP信号の存在を探し。
3.成長液体酵母培養
- 合成完全培地3mLにプレート上に単一コロニーからの酵母細胞の約1μLを接種。細胞は、250rpmで振盪しながら30℃で一晩成長させます。
- 培地中の0.1 <のOD 600に翌日、飽和培養物を希釈します。 3-4時間、または細胞がイメージングのためのチャンバーにロードする準備ができているときにOD 600が 0.4と0.8の間になるまで、30℃のシェーカーに希釈した培養液を戻します。
4.フローチャンバースライドの準備します
- カット長いにおいてワイド及び7に片4にパラフィンフィルムのシート。
- パラフィンフィルムの4インチ幅に縦標準顕微鏡スライドを配置し、スライドが3~4層の厚さのフィルムで覆われている3~4回ように、スライドの周囲にフィルムを包みます。合理的なシールがあることを確認するために一緒に層を押します。これはカットすることが容易になります。あまりにもハードを押すか、しわにフィルムを引き起こして避けてください。
- クリーンボックスカッター剃刀を用いて、スライドの外側縁に沿ってパラフィンフィルムを切断します。切断のための直線エッジを提供するために別のスライドを使用します。
- 皮をむき作業スライドと廃棄オフ余分なフィルム。フィルムの残りのスタックは、スライドの一方の面をカバーすると撮像チャンバ間の壁を作るために使用されます。
- ストレートエッジと第2のスライドを使用して、約10片、幅がそれぞれ2〜4ミリメートルにスライドの長軸に沿って積層されたフィルム層を切断します。
- に垂直に積み重ねられたパラフィンフィルム層をカットカットはストリップ幅2-4ミリメートル、長さ23〜24ミリメートル、及び3~4層厚さを作成するために、スライドの短軸に沿って、ステップ4.5で作製します。
- 45°の角度でカミソリを使って皮をむき、カットストリップ。鉗子を使用して、均等チャンバの所望の数を作成するために、清浄な顕微鏡スライド上に切断されたフィルムストリップを分配します。 3室（4パラフィンフィルムストリップで作られた）までのスライド上で作成することができます。
- フィルムのストリップの上に単一のカバースリップを置き、鉗子を用いて所定の位置に移動します。
- （これは約最もホットプレート上の低〜中設定です）、プレパラートを置き〜95°Cに設定したホットプレート上で、アップカバースリップ。フィルムストリップが半透明になるまでスライドを加熱する（約3分間）、次いでスライドを密閉し、穏やかにピンセットを用いてカバースリップを押すことによって一緒にカバースリップ。
注：これは、Cの上に領域を引っ掻くよう、直接パラフィンフィルムストリップの上にあるカバースリップの領域上のみプレスに重要ですhambersは、画像品質を低下させることができます。スライドを過熱しないように注意してください。気化膜意志コート付着細胞を阻止する疎水性フィルムと室内。 - （スライドが熱くなります）ホットプレートからスライドを削除し、カバースリップ側を上に向けて冷却するために脇に置き鉗子を使用します。スライドが冷えると、フィルムは白、不透明な着色に戻ります。
注：この時点で、スライドを培養した酵母細胞をロードする準備ができています。余分なスライドは、この点に作られ、無期限に清潔で乾燥した場所に格納することができます。
調製したフローチャンバースライドに5読み込み酵母細胞
- コンカナバリンA（無菌のDIH 2 O中の2mg / ml）を凍結し、200μLのアリコートを解凍。
- 開放端の一方にピペッティングすることによって調製されたスライドの各チャンバーに解凍したコンカナバリンAの約100μLを加えます。チャンバーを満たすのに十分なコンカナバリンAを追加します。これは秒間TEP、コンカナバリンAは、毛管作用を介してチャンバを通して引っ張られます。
- コンカナバリンAは、カバースリップ（ 即ち、室）に付着することを可能にするために5分のための2つのマイクロチューブのラックまたはペンとの間のスライド、カバースリップダウンを、ハングアップ。
- カバースリップアップ位置にスライドを返します。コンカナバリンAを除去するために、合成完全培地; 2Xとチャンバ容積チャンバを洗浄（約200μL上記ステップ5.2で決定されました）
- ペーパータオルの角又は同時に他に新鮮な流体をピペッティングしながら、チャンバの一端から流体を引き出すために半分に折り畳まれたろ紙のいずれかを使用して、チャンバを通って媒体を流します。あるいは、他に新鮮な流体をピペッティングしながら注意深く一端から流体を引き出すために、真空吸引器を使用しています。
- 2Xに向かう流れメトを使用して（ステップ3.4からの）細胞懸濁液のチャンバ容積（約200μL）を流すことにより、ロードセルDは、ステップ5.4.1で説明しました。
注：目標は画像にカバースリップで細胞の単層です。したがって、彼らが互いの上に重ねないように十分に小さいが、十分な細胞が画像取得あたりのデータの最大量を収集するフィールドに存在することが十分に大きい細胞の濃度をロードすることが重要です。チャンバ内の細胞の最適濃度は変化することができ、経験的に決定されるべきです。フローチャンバー中の細胞の濃度を増加させるために、穏やかに2分間、1000×gで細胞培養物をペレット化し、上清の一部を除去します。細胞の濃度を減少させるために、細胞懸濁液に新鮮な合成完全培地を加えます。細胞の濃度は、位相差顕微鏡でチャンバを検査することにより（以下）ステップ5.7の後に評価することができます。この時点で、追加の細胞が複数の細胞懸濁液中に流すことによってチャンバーに添加することができます。しかし、この時点で細胞密度を減少させることは現実的ではありませんし、最高の達成され、希釈した細胞懸濁液を新たなチャンバをロードすることによって。 - 細胞はカバーガラスに付着できるようにするために10分間、ステップ5.3で説明したように、スライドカバースリップダウンを掛けます。
- 4Xを介して合成完全培地のチャンバ容積（約400μL）を流すことにより、任意の未接着細胞を洗い流します。これは、画像取得を汚染する可能性がチャンバ内に自由に浮遊細胞を排除します。
- 慎重にカバースリップの縁部にメニスカスをもたらす、ペーパータオルのクリーンコーナーを有するチャンバの各端部を乾燥させます。
- 温かい（75℃）シーラントと、チャンバの各端部をシール（ 例えば、VALAP;等分ワセリン、羊毛ワックス、パラフィンワックス）。
注：この時点で、スライド画像に準備ができています。チャンバは、各チャンバ内の細胞の密度に応じて、最大9時間画像化することができます。細胞は、徐々に細胞を変位気泡を作成した、時間をかけて二酸化炭素（CO 2）を生成します。
- 1.45 NA 100X CFIプランアポ対物レンズ、圧電ステージ、スピニングディスク共焦点スキャナユニット、照明レーザー、EMCCDカメラを装備した倒立顕微鏡にスライドをもたらします。取得中に、室温（25℃）でのステージの温度を維持します。
注記：高開口数が大きい画像解像度を可能にし、ピエゾステージは、高速Zスタックの取得を可能にします。最小顕微鏡要件は100X対物レンズ、照明用レーザ、およびEMCCDカメラです。 - 焦点に細胞を持参してください。取得フィールドが一緒にグループ化された細胞のためのスライドを検索することによって一緒にクラスタ化された少なくとも5-6のセルを有していることを確認してください。
注：一度に複数の細胞画像に必要ではないが、同じフィールド内の複数のセルを画像化することは、データの品質を損なうことなく、データ取得の効率を向上させることができます。しかし、それはその重要です細胞は、同じ焦点面上にあり、互いの上に積み重ねられていません。 - プログラムの時間をかけて複数のzシリーズを収集するための多次元買収。
- 以下に、アクティブ取得の設定内の設定を調整する：合計Z-深さ=6μmで、全体の酵母細胞を包含すること。 Z-ステップサイズ= 300nmでは、オーバーサンプリングなしで集光を最大にします。総持続時間= 10分。時間間隔= Z-シリーズ毎に4秒。露光時間=各z平面90ミリ。
注：最適露光時間は、カメラ、励起光源、及び他の要因に応じて変化するであろう。 EMCCDによって測定された画素値に基づいて、細胞質からの信号にGFP標識アストラル微小管からの信号の1比：一般的に、最適露光時間が3を達成するのに必要な最小限の時間であろう。
- 以下に、アクティブ取得の設定内の設定を調整する：合計Z-深さ=6μmで、全体の酵母細胞を包含すること。 Z-ステップサイズ= 300nmでは、オーバーサンプリングなしで集光を最大にします。総持続時間= 10分。時間間隔= Z-シリーズ毎に4秒。露光時間=各z平面90ミリ。
- 「ファイル名を指定して実行」をクリックして取得を開始します。それは完全な10分の期間のために実行することを許可します。画像などのデータを保存シリーズ（.TIFFまたは.nd2）。
- チャンバー内の画像に新しいフィールドを選択し、手順6.2から6.4を繰り返します。
注：単一のチャンバは、チャンバ内の細胞密度に依存して、細胞の15〜20フィールドを生じるはずです。チャンバ内のCO 2が速く構築するように、より高い細胞密度は、低い全フィールドをもたらします。
7.画像解析
- ImageJの（画像ファイル開きhttps://imagej.nih.govバイオフォーマットインポートプラグインを使用してhyperstackように）。
- ImageJのを開いて、コントロールパネル上に直接部6から取得した画像スタックをドラッグ。バイオフォーマットのインポートが自動的に開始されます。 hyperstackとして画像スタックをロードするために「OK」を選択します。
注：「バイオフォーマットのインポートオプション」プロンプトが開き、下の「スタックの表示」、「持つビュースタックが：」ことを保証します「Hyperstack」に設定されています;そして「スタック順序は：」に設定されている「XYCZT。」
- ImageJのを開いて、コントロールパネル上に直接部6から取得した画像スタックをドラッグ。バイオフォーマットのインポートが自動的に開始されます。 hyperstackとして画像スタックをロードするために「OK」を選択します。
- Zプロジェクトの機能を使用して、最大強度、2次元投影に各Zシリーズを折りたたみます。
- 「画質」メニュー、「スタック」サブメニュー、および「Z-プロジェクト」機能を選択します。ドロップダウンリストから「最大投影」を選択し、「OK」をクリックします。
- 「プロセス」メニュー、「フィルタ」サブメニュー、および「中央値」機能を選択することにより、スペックルノイズを低減する画像スタックにメディアンフィルタを適用します。半径ボックスに2.0ピクセルを入力し、「OK」をクリックします。
- フィールドに事前後期細胞を識別します。
注：これらは中型芽及び短い紡錘体、長さが1〜1.5ミクロン（ 図1;短い紡錘体に矢印ポイント）によって特徴付けられます。彼らは通常、Feのみを示すので、この段階では、細胞を微小管ダイナミクスを分析するための理想的です紡錘体極7を発しワットアストラル微小管。アストラル微小管は、細胞質に、プラス端に、SPBで、マイナス端から均一なGFP信号強度を示す線状フィラメントとして同定することができます。 - プラス端に、アストラル微小管とより強く標識されたスピンドル微小管との接合部に位置するマイナス端から、単一アストラル微小管に沿った線を描画するためにセグメント化されたラインツールを使用し、画像系列の第1の時点から始まります、細胞質にある（ 図1の赤い線を参照）。セグメント化されたラインを完了するために、微小管の端にダブルクリックします。
- キーボードの「M」ボタンを押して、「測定」機能を使用して、結果テーブルに測定値を記録。
注：このようグレー強度などの追加機能は、「分析」メニューと「設定測定」サブメニューでの測定値を設定することにより、記録することができます。 - いずれかのZ-スライダバーの右矢印をクリックするか、キーボードの「./>」キーを押して、次の時点に進みます。繰り返しは、画像シーケンス内のすべての時点7.5および7.6ステップ。
- 結果テーブルからデータをコピーし、スプレッドシートに貼り付けます。選択して、データを保存し、「名前を付けて保存を。」
注：ライン（ すなわち、アストラル微小管）の長さを示しシリーズの時点を示し、スライス、および長さを、これらの測定値は、いくつかの値が含まれますが、最も重要な値です。他の測定値を含む列を保持または廃棄することができるいずれか（ 例えば、領域は、画素値、角度、 等を意味します）。 - 右クリックし、「挿入」機能を使って、スプレッドシートに新しい列を作成します。入力各時点の時間（秒）。
- 「行挿入を使用して、時間（秒）の関数としての微小管の長さ（μm）とのXY散布図を作成します。チャート」機能;などの長さの測定を選択 『X『』として、時間列』 Yを
- ステップ7.10から散布図で経時的長さは、正および負の変化を探すことによって重合、解重合、及びポーズの領域を同定します。
注記：重合イベントは3つの時点の最小横切っ0.5μm以上により微小管の長さを増加させ、R 2≥0.9とR値> 0（ 図1BおよびD、緑点）と線形回帰を適合。解重合のイベントは3つの時点の最小横切っ0.5μm以上により微小管の長さを減少させ、R 2≥0.9とR値<0（ 図1BおよびD、ピンクの点）との線形回帰にフィット。一時停止イベントは、重合と脱重合とは別のものです。休止は、0.5μm未満3つの時点の最小横切って微小管の長さの正味の変化として定義されます。-0.4と0.4の間のR値を持つ線形回帰フィット;及びF検定により決定されるように、ゼロからの統計学的に異ならない傾斜を有しています。 - ガイドとして散布図を使用して、長さの変化が正である時のセクションを識別し、緑色でそれらをハイライト。長さの変化はピンク色で負の場合、時間の領域をハイライト。
- それぞれの線形回帰を計算する部分を強調し、領域の近位列の各セクションのR-及びR 2 -値を記録します。重合イベントまたは解重合イベントのいずれかとして、各着色領域を分類します。
- ステップ7.10から散布図で経時的長さは、正および負の変化を探すことによって重合、解重合、及びポーズの領域を同定します。
- 各成長イベントの時間の変化による長さの純変化を分割することにより重合速度を計算します。ステップ7.10.3から線形回帰値に隣接する列にこれらの結果を記録します。
- 各shrinkinのための時間の変化により長さの純変化を分割することによって解重合率を計算Gイベント。ステップ7.11から重合速度値に隣接する列にこれらの結果を記録します。
- すべての成長イベント13の合計時間によって重合ツー解重合遷移の数を割ることによって破局周波数を計算します。ステップ7.12から解重合速度値に隣接する列にこれらの結果を記録します。
- 全て収縮イベント13の合計時間によって解重合対重合の遷移の数を割ることによってレスキュー周波数を計算します。ステップ7.13から破局周波数値に隣接する列にこれらの結果を記録します。
- ステップ7.10.1で算出された画像取得の全持続時間の全長さの変化の絶対値の和を除算し、第14あたりのチューブリンサブユニットを得るために、27.0833を掛けることによって動的性を計算します。レスキュー周波数のvalに隣接した列に、これらの結果を記録ステップ7.14からのUEとは、結果の表を保存します。
注：これは、カスタムメイドのプログラム使用して手順7.10から7.15に記述分析プロセスを自動化することが可能である（。Estremらが 、原稿が提出します）。プログラムは、上記の詳細なパラメータに従うことによって長さ測定における重合および脱重合の期間を識別するように設計されています。
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Representative Results
生きた酵母細胞において微小管ダイナミクスを測定する遺伝子の変異は、微小管調節剤またはチューブリンサブユニット衝撃重合及び解重合速度、ならびにこれらの状態間の遷移の周波数をエンコードする方法を評価するための魅力的なツールを提供します。 図1ディスプレイ野生型細胞におけるアストラル微小管ダイナミクスの時系列と（430Δtub2-）βチューブリンに変異を有する変異体細胞。微小管は、微小管の長さを可視化するためにGFPタグ付きαチューブリンで標識されます。赤い矢印は、各画像（Figure1A及び1 C）にアストラル微小管の長さを追跡します。微小管の長さは8分間の各時点で測定し、そしてこれらのコンパイルされた長さは寿命プロット（ 図1B及び1 D）に示されています。これらのデータは、重合速度、解重合率、重合duratiを決定するために使用されました解重合時間、レスキュー周波数、大災害の頻度、およびダイナミックさ、上。
GFPで標識された微小管とアストラル微小管動力学の測定の図1タイムラプスイメージング。 （AおよびC）野生型およびtub2-430Δ変異体細胞についてのタイムラプス撮影の最初の5枚の連続画像。微小管は、GFP-Tub1で標識し、細胞周期の前後期に結像されます。各画像は、共焦点Zシリーズからの最大強度の投影です。スケールバー：1μmです。タイムスタンプは各フレーム取得時の合計時間を示しています。赤い矢印は、矢印のプラス端を示すと、アストラル微小管の全長に沿って従います。 （B及びD）微小管の寿命のプロットは、経時的に単一アストラル微小管の長さを表示します。緑の点sが重合を表し、ピンクの点が解重合を示します。矢印は、大惨事のイベントを指します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図1は、野生型株及びC末端にβチューブリンの27個のアミノ酸を欠く変異株の間で変化した微小管動態、以前より安定した微小管15を有することが示された変異体を示します。微小管の寿命プロットに表示されているように、tub2の -430Δ変異体における微小管は長く、野生型の微小管より展示少ない災害（ 図1BおよびD矢頭; 表1）。また、重合及び解重合速度は、上昇の傾きから決定し、微小管LENG降順THSは、野生型（; 表1、 図1Bおよび1D）と比較して、変異体において減少されます。最後に、tub2-430Δ突然変異細胞における微小管の重合および脱重合の状態でより多くの時間を費やしていると野生型（ 表1）と比較して動的性を減少しています。
| 歪み | 動的性（サブユニット/ S） | 重合速度（ミクロン/分） | ％重合における時間 | Depolym率（ミクロン/分） | Depoly-における％の時間 merization | ％一時停止中の時間 | レスキュー周波数（イベント/分） | 災害頻度（EVエント/分） |
| 野生型のn = 1 | 54 | 1.8±0.5 | 48 | 3.0±0.3 | 29 | 3 | 1.8 | 1.4 |
| tub2-430ΔN = 1 | 40 | 1.4±0.1 | 41 | 1.5±0.2 | 32 | 0 | 0.8 | 0.7 |
| 略語は次の通りである：μmで、ミクロン;分、分。第2のS; nは、微小管の寿命プロット（Fig1B、D）から分析単一の微小管。値は平均±平均の標準誤差です。 | ||||||||
表1：図1中の細胞のための微小管動力学測定の値は、 図1に示される単一の微小管の測定値からの平均の平均±標準誤差です。
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Discussion
出芽酵母モデルは、経時画像単一微小管に能力および酵母遺伝学のツールを使用してチューブリン及び微小管調節を操作する能力を含む、 インビボ設定において微小管ダイナミクスの高分解能測定値を収集するための主要な利点を提供します。
コンカナバリンAでコーティングされたチャンバーは、溶融寒天パッドを含む前述の装置、より多くの利点を提供します。チャンバを有するスライドを予め作製し、長期間保存するか、またはすぐに使用することができることができます。また、コンカナバリンAでコーティングされたチャンバーは、細胞が元々培養した同じ培地中で> 6時間の酵母細胞を培養することが可能です。チャンバ内の細胞の数は、チャンバを画像化することができるどのくらいの期間を指示することに注意することが重要です。コーティングされたチャンバは、酵母細胞の単層のみがカバースリップに付着することを確実。最後に、複数のチャンバを作成することを可能にします同じスライド上に結像するためのいくつかの異なる酵母株。
比較的低い信号レベルとプロセスの非常に動的な性質を含む出芽酵母における微小管ダイナミクスを画像化するための主要な課題があります。広視野顕微鏡は、標識された微小管のシングル時点の画像を取り込むために十分です。しかし、広視野顕微鏡は、焦点外の光で長い露光時間やサンプルの衝撃による退色速くなります。同様に、レーザー走査型共焦点顕微鏡が原因速い光退色には不十分です。ディスク共焦点顕微鏡を回転することは、出芽酵母で微小管ダイナミクスを撮像するための一意に適しています。ここで使用するスピニングディスク共焦点顕微鏡システムは、念頭に置いて、これらの要件に設計されました。
顕微鏡システムは、高速かつ高感度のために設計されなければなりません。顕微鏡システムの様々な適し証明するかもしれないが、いくつかのコンポーネントが必要不可欠です。 100X高開口数（1.45NA）対物は、100nmのオーダーで個々の微小管と長さの変化を解消する必要があります。スピニングディスク共焦点スキャナはピンボケ光を遮断することによって、光退色および毒性最小限にするために、唯一の合焦光を収集することにより、解像度と感度を最大にするために必要です。 EMCCDカメラは、タイムラプス取得の各90ミリ秒の間に十分なGFP-Tub1信号を収集するために、高速かつ高感度でなければなりません。現在、EMCCDカメラは、このアプリケーションに最適です。現在のCMOSセンサーカメラは、ハイエンドのEMCCDsの感度が不足しています。しかし、この技術は大幅に改善していると、すぐに適切であり得ます。最後に、圧電ステージは、4次元画像取得における律速段階であることができるZにおける迅速かつ正確な移動のために必要とされます。
同様の機器が容易に入手できない場合は、このプロトコルに記載されている特定の顕微鏡システムは、障壁を提示することができます。変更C異なる撮像システムに適応させることが、これらの変更は、時間的および/または空間分解能を犠牲にして来るかもしれません。スピンドル駆動のステージモータは、圧電ステージの代わりに使用することができます。しかし、これらのモータは、低速の精度が低いと、ドリフトしやすいです。ポスト取込み画像安定化プラグインは、これらの電動ステージに関連付けられたXY寸法の変動を最小化するために使用することができます。加えて、より遅い読み出し速度の代替のカメラを使用することができます。低速の取得率に対応するために、Zシリーズはそれほど頻繁に収集することができ（すなわち、Zシリーズの間に多くの時間を）。しかし、時点間で発生する可能性が遷移を欠落しているZシリーズのリスクの間の時間を増加させます。あるいは、Z-平面間の距離は、Zシリーズごとに収集された画像の数を減少させる方法として、増加させることができます。しかし、この間隔を大きくすると、accurする実験者の能力を損なうであろう、プレーン間の画像情報を失うリスクately微小管の両端を識別する。明らかに、変化は、別の撮像システムに適応させることができるが、これらの変化は、画像情報の潜在的な損失を比較検討されなければなりません。
このプロトコルの他の制限は、三次元画像スタックは、二次元画像投影に変換された空間情報の損失です。前後期酵母細胞における個々のアストラル微小管は、細胞質の三次元空間を横切る長さとプロジェクトに典型的には0.5〜2.0μmです。個々の微小管のすべての空間情報を収集するために、Z位置の一連の画像を取得することが重要です。タイムラプス取得では、これは3,000画像の合計、150回の時点のそれぞれにおける20 Zスライスと、複雑なデータセットを生成することができます。この課題に対処するために画像解析を簡単にするために、Z-スタックの空間情報は、分析中に圧縮されます。このbenefながらその分析は、それがZ-次元からの空間情報のコストがかかります。 Z次元が圧縮されたときにどのように多くの情報が失われていますか？この損失を推定するために、実験をSpc110-GFP標識のSPBは、高い信号対雑音比を有する球形病巣を示すために測定するのが比較的容易であるプレ後期細胞でのSPBの間の距離を測定するために行きました。スピンドルはアストラル微小管よりもZに異なる変位を示すかもしれないが、平均長さが類似している（〜1.5ミクロン）、したがって、有用なプロキシを提供します。スピンドルの長さは、平均して、15％より長い、同じスピンドルを二次元投影（JM、未発表の結果）で測定された場合よりも完全な3次元画像スタックで測定される場合。このように、簡略化されたデータセットと測定の利点は、廃棄されたZ情報のコストと比較検討されなければなりません。
酵母細胞生物学のコミュニティは、撮像微小管networのための多目的ツールキットを開発しました。KS。これは、/ Tub1-チューブリンαに融合し、様々な栄養要求性マーカーでマークされた蛍光タンパク質の多様を含みます。これらの構築物は、染色体LEU2座において統合LEU2 :: GFP-TUB1（pSK1050）11、およびURA3を含むURA3遺伝子座に統合GFPおよび他のフルオロフォアにはいくつかの融合、:: GFP-TUB1（pAFS125）16を含みますURA3 :: CFP-TUB1（pAFS125-CFP）、及びURA3 :: pHIS3-mCherryを-TUB1（pAK011）17。加えて、多様な蛍光タンパク質にTub1融合のセットは、最近、染色体URA3遺伝子座のいずれか、またはネイティブTUB1座 18に隣接する遺伝子座に組込みを標的と作成されています。フルオロフォアおよびマーカーのこの大規模なパレットは差別タグ付けされたタンパク質との共局在化実験のために非常に有用です。 GFP-Tub1融合はmicrotuのタイムラプスイメージングのための最適なツールのままその明るさと光安定のためにBULEダイナミクス。ソング・リー（pSK1050）11によって作成されたGFP-Tub1融合はαチューブリン/ Tub1のアミノ末端にGFPの融合を含み、ロイシン栄養要求性を救済するためにLEU2座において統合します。したがって、融合タンパク質は、天然のαチューブリンに加えて、異所的に発現し、細胞9における総αチューブリンの〜20％を含みます。重要なことは、GFP-Tub1の融合は、ネイティブαチューブリン/ Tub1（JM、未発表の結果）の機能を救出しません。また、これは他のTUB1融合の真実である18を構築します。
微小管とその結合タンパク質を可視化するための利用可能なツールを使用すると、出芽酵母は、チューブリンおよび他の微小管の規制当局に変異を研究するための理想的なシステムです。さらに、チューブリン遺伝子の限られた数の変異チューブリンの均一なプールの直接研究を可能にします。の変異に加え、チューブリン遺伝子は、出芽酵母は後生動物の対応物と相同である微小管結合タンパク質（MAP）の数を有しています。これらのマップは、直接研究することができ、そして変異は、単一の微小管フィラメントに与える影響を調べることもできます。ここでの詳細なプロトコルは、微小管ダイナミクスに影響を与える内因性および外因性のプロセスの両方の調査が可能になります。
要約すると、微小管は、多くの細胞プロセスの間、正常に機能するには、ダイナミックでなければなりません。チューブリンに固有の要因と微小管ダイナミクスを制御する外因性関連タンパク質を理解することが必要です。出芽酵母は、直接、単一の微小管のダイナミクスを定量化することにより、これらの要因の影響を研究するための理想的なシステムです。上記の詳細なプロトコールは、安定酵母ゲノムへの蛍光融合タンパク質を統合し、どのように共焦点画像を取得して分析するために、in vivoでの微小管の動態を定量化するためにスタックする方法について説明します
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、様々なFP-TUB1プラスミドを共有するためのケリー・ブルーム（ノースカロライナ大学）、カイアング・リー（NCI）、スティーブン・マーカス（コロラド州立大学）、およびエルマー・シーベル（理学部ハイデルベルク）を感謝します。私たちは、スライドチャンバーの調製方法で私たちを訓練するためのメリッサ・ガードナー（ミネソタ大学）に感謝しています。この作品は、国立衛生研究所（NIH）（JKM）にR01GM112893-01A1と（CE）はT32GM008730を付与することにより、サポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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