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Biology

उच्च संकल्प इमेजिंग और नवोदित खमीर में व्यक्तिगत एस्ट्रल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण

Published: April 20, 2017 doi: 10.3791/55610
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine

Summary

नवोदित खमीर अपने शक्तिशाली आनुवंशिकी और उसके सूक्ष्मनलिका cytoskeleton की सरलता के कारण विवो में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक लाभप्रद मॉडल है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है को बदलने के लिए कैसे और संस्कृति खमीर कोशिकाओं, कोंफोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के अधिग्रहण, और मात्रात्मक खमीर कोशिकाओं में रहने वाले सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण।

Abstract

गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं कई कोशिकीय प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं, और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के सटीक मापन कैसे कोशिकाओं इन प्रक्रियाओं को विनियमित में और कैसे आनुवंशिक म्यूटेशनों प्रभाव विनियमन अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। metazoan मॉडल में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की मात्रा एक उच्च सूक्ष्मनलिका घनत्व और आनुवंशिक जोड़तोड़ पर सीमाओं सहित जुड़े चुनौतियों, की एक संख्या है। विपरीत, नवोदित खमीर मॉडल लाभ है कि इन चुनौतियों पर काबू पाने के प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल खमीर कोशिकाओं में रहने वाले एक सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। fluorescently टैग ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं को इकट्ठा किया स्लाइड कक्षों का पालन कर रहे हैं, स्थिर समय-अंतराल छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। उच्च गति के लिए एक विस्तृत गाइड, चार आयामी छवि अधिग्रहण भी कोंफोकल छवि के ढेर में गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के गुणों मात्र निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में, प्रदान की जाती है के रूप में अच्छी तरह से। इस विधि, पारंपरिक खमीर आनुवांशिकी के साथ संयुक्त, प्रांतएक दृष्टिकोण है कि विशिष्ट मात्रात्मक सूक्ष्मनलिका नियामकों या म्यूटेशन कि ट्यूबिलिन सब यूनिटों की गतिविधि में परिवर्तन के प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुकूल है इडस।

Introduction

सूक्ष्मनलिकाएं cytoskeletal αβ ट्यूबिलिन प्रोटीन सब यूनिटों से बना पॉलिमर हैं और intracellular परिवहन, कोशिका विभाजन, morphogenesis, और गतिशीलता सहित सेलुलर संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन विविध भूमिकाओं के लिए सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का निर्माण करने के लिए, कोशिकाओं ध्यान से विनियमित कब और कहाँ सूक्ष्मनलिकाएं प्रपत्र चाहिए। इस विनियमन प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने से पूरा किया है कि या तो सूक्ष्मनलिका पॉलिमर या मुफ्त सब यूनिटों जुदा में सूक्ष्मनलिकाएं में αβ ट्यूबिलिन सब यूनिटों को इकट्ठा; इस सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के रूप में जाना जाता है।

सूक्ष्मनलिका क्षेत्र का एक प्रमुख लक्ष्य आणविक तंत्र αβ ट्यूबिलिन सब यूनिटों और बाह्य नियामकों कि बाँध ट्यूबिलिन के लिए और / या सूक्ष्मनलिकाएं के अध्ययन सहित सूक्ष्मनलिका गतिशीलता, विनियमित स्पष्ट करना है। एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण कॉम में शुद्ध αβ ट्यूबिलिन प्रोटीन का उपयोग कर इन विट्रो में इस प्रणाली को पुनर्गठित करने, अक्सर हैशुद्ध बाह्य नियामकों के साथ bination। यद्यपि यह एक उपयोगी तरीका है, यह स्पष्ट है कि पुनर्गठन प्रणालियों में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता जीवित कोशिकाओं में पाया कि से प्रभावशाली ढंग से अलग। उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं तेजी से बढ़ने और इन विट्रो से विवो में धीमी हटना। इन मतभेदों को जाना जाता बाह्य नियामकों 1 की उपलब्धता है, साथ ही के लिए कोशिकाओं में अभी तक अपरिभाषित कारकों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसलिए, यह सूक्ष्मनलिका नियामकों और उत्परिवर्ती कि एक देशी सेलुलर संदर्भ में गतिशीलता को बाधित की गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यद्यपि metazoan मॉडल सूक्ष्मनलिका समारोह और उच्च क्रम संगठन की जांच के लिए प्रचलित प्रणाली साबित हुए हैं, कई चिंताओं व्यावहारिक गंभीर रूप से सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के सटीक माप के लिए इन मॉडलों की उपयोगिता की सीमा। सबसे पहले, सूक्ष्मनलिकाएं की उच्च संख्या, सेल प्रति हजारों दर्जनों से लेकर, आत्मविश्वास से करने के लिए यह कठिन बना देता हैसमय के साथ अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं ट्रैक। कई अध्ययनों से पता इमेजिंग प्रोटीन है कि चुनिंदा ऐसे अंत बाध्यकारी (ईबी) परिवार में प्रोटीन के रूप में सूक्ष्मनलिका समाप्त होता है, करने के लिए स्थानीय बनाना द्वारा यह चुनौती का समाधान करें। हालांकि, इन प्रोटीनों केवल मेटाजोअन 2 में सूक्ष्मनलिकाएं बढ़ रहा के छोर तक स्थानीय बनाना जाना जाता है। इसलिए, इन प्रोटीन की उपयोगिता सीधे, विकास दर को मापने के लिए, जबकि केवल परोक्ष रूप से इस तरह के आपदा की आवृत्ति के रूप में गतिशीलता के अन्य पहलुओं को मापने के लिए सीमित है। दूसरा, जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में प्रगति के बावजूद कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक fluorescently लेबल ट्यूबिलिन या म्यूटेशन चुनिंदा ट्यूबिलिन या सूक्ष्मनलिका नियामकों हेरफेर करने के लिए शुरू करने को व्यक्त कि बनाने एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है। इसके अलावा, मेटाजोअन कई ट्यूबिलिन आइसोटाइप की उपस्थिति कैसे म्यूटेशन व्यक्ति ट्यूबिलिन जीन को प्रभावित के अध्ययन के घालमेल कर दिया है।

नवोदित खमीर प्रणाली विवो microtubu में मापने के लिए कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैle गतिशीलता। खमीर एक सरलीकृत सूक्ष्मनलिका नेटवर्क है कि व्यक्ति सूक्ष्मनलिकाएं के दृश्य परमिट है। खमीर में, सूक्ष्मनलिकाएं धुरी पोल निकायों (SPBs) है, जो परमाणु लिफाफा 3 में एम्बेडेड रहे हैं के रूप में जाना केन्द्रों के आयोजन से निर्गत होना। SPBs γ ट्यूबिलिन छोटे परिसरों कि सूक्ष्मनलिकाएं 4, 5 नाभिक के लिए scaffolds के रूप में सेवा करते हैं। SPBs सूक्ष्मनलिकाएं, धुरी सूक्ष्मनलिकाएं और सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं के दो वर्गों नाभिक बनाना। Nucleoplasm में धुरी सूक्ष्मनलिकाएं परियोजना और kinetochore सूक्ष्मनलिकाएं के माध्यम से गुणसूत्रों के लिए संलग्न के लिए और interpolar सूक्ष्मनलिकाएं 6 ओवरलैपिंग के माध्यम से धुरी स्थिर लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, बाहर की तरफ साइटोसोल में सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं परियोजना और धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के घने नेटवर्क की तुलना में अपेक्षाकृत दुर्लभ रहे हैं। समसूत्री विभाजन के दौरान, पूर्व पश्चावस्था कोशिकाओं केवल 1-2 सूक्ष्म या तो SPB से निकलती सूक्ष्मनलिकाएं है; इन मैं के रूप में मौजूदबल्कि बंडल के रूप में 7 से ndividual सूक्ष्मनलिकाएं। समसूत्री विभाजन के दौरान सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं की भूमिका मां और कली डिब्बों, कली से गर्दन के रूप में जाना के बीच के जंक्शन में नाभिक और धुरी स्थानांतरित करने के लिए है। इस आंदोलन को अच्छी तरह से परिभाषित मार्ग है कि सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं पर बल उत्पन्न, की ओर और कली गर्दन 8 में अंत में नाभिक और धुरी खींच शामिल है।

खमीर प्रणाली का एक और लाभ अपने आनुवंशिकी, जो अद्वितीय परिशुद्धता के साथ सूक्ष्मनलिका नियामकों और ट्यूबिलिन सब यूनिटों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की उपयोगिता है। एक भी β ट्यूबिलिन जीन (TUB2 हैं) और दो α ट्यूबिलिन जीन (TUB1 और TUB3): खमीर भी ट्यूबिलिन आइसोटाइप के एक सरलीकृत प्रदर्शनों की सूची होती है। उत्परिवर्तन आसानी से इन जीनों में पेश किया जा सकता है और इस तरह एक समरूप ट्यूबिलिन जनसंख्या 9, 10 में अध्ययन किया। व्यापक रूप से की एक संख्या हैंलेबलिंग सूक्ष्मनलिकाएं के लिए उपलब्ध निर्माणों, और इन स्थिर अभिव्यक्ति के लिए गुणसूत्र loci पर एकीकरण के लिए लक्षित किया जा सकता (चर्चा देखें)।

इस विधि का समग्र लक्ष्य सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के उच्च संकल्प माप के लिए चार आयाम (एक्स, वाई, जेड, और टी) में खमीर कोशिकाओं में रहने वाले छवि एकल सूक्ष्मनलिकाएं है। संघटित, निम्न स्तर के खमीर कोशिकाओं में fluorescently लेबल ट्यूबिलिन की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों एकीकृत करने के लिए तरीके से वर्णित हैं। इमेजिंग करने से पहले, जीवित कोशिकाओं लंबे समय तक इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को स्थिर करने के लेक्टिन Concanavalin एक साथ लेपित स्लाइड कक्षों में रखा जाता है। छवि अधिग्रहण के लिए इष्टतम मानकों, साथ ही डेटा विश्लेषण करने के लिए एक कार्यप्रवाह, यह भी बताया गया है।

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Protocol

1. तैयार कर रहा है -LEU छोड़ने वालों की प्लेट्स

  1. बाँझ, विआयनीकृत जल के 800 एमएल (Dih 2 ओ) एक 2 एल कुप्पी में जोड़े। छोड़ने वालों आधार (जन्म तिथि) पाउडर के 26.71 ग्राम, CSM-लियू की 0.69 ग्राम है, और अगर की 20 ग्राम जोड़ें। एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ मिक्स। Dih 2 ओ के साथ 1 एल लाओ
  2. 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और 30 मिनट के लिए 19 साई।
  3. आटोक्लेव से कुप्पी निकालें और इसे कोमल सरगर्मी के साथ ~ 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  4. 100 मिमी व्यास प्लेटों में 30 एमएल / प्लेट डालो। इन 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले 36-48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं।

2. GFP लेबल ट्यूबिलिन के विधान अभिव्यक्ति के लिए GFP-Tub1 का घालमेल

  1. 3 मिनट के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल एकल असहाय डीएनए (ssDNA) के एक शेयर एकाग्रता उबालें।
  2. शुद्ध GFP-Tub1 प्लाज्मिड डीएनए 11 के 400 एनजी के साथ उबला हुआ ssDNA की कम्बाइन 2 μL।
    ध्यान दें: यह है कि स्थिर, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्लास्मिड की एक किस्म कर रहे हैंखमीर में सूक्ष्मनलिकाएं कि वैकल्पिक fluorophores और चयन मार्कर का उपयोग की। इन विकल्पों में से कुछ चर्चा खंड में वर्णित हैं।
  3. सक्षम खमीर कोशिकाओं के एक 50 μL विभाज्य डीएनए मिश्रण जोड़ें।
    नोट: सोर्बिटोल समाधान के साथ सक्षम खमीर कोशिकाओं को तैयार (एश, 100 मिमी LiOAc, 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 1 मिमी EDTA पीएच 8, और 1 एम सोर्बिटोल, 8 पीएच को पतला एसिटिक एसिड के साथ समायोजित)। सक्षम खमीर कोशिकाओं बनाने का विस्तृत विवरण के लिए, संदर्भ 12 देखें।
  4. भंवर अच्छी तरह से।
  5. पोलीएथीलीन ग्लाईकोल (पी.ई.जी.) समाधान (100 मिमी LiOAc, 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 1 मिमी EDTA / NaOH पीएच 8, और 40% PEG3350) डीएनए सेल मिश्रण को की कुल मात्रा 6x जोड़ें।
  6. भंवर अच्छी तरह से।
  7. कम से कम 1 कोमल आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर ज के लिए सेते हैं।
  8. डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) कुल मात्रा और भंवर के 10% में जोड़े।
  9. 15 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. 5 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र।
    11. 2 ओ के 100 μL में कोशिकाओं को निलंबित
  11. एक -LEU छोड़ने वालों की थाली पर प्लेट कोशिकाओं।
    नोट: जबकि अन्य निर्माणों एक वैकल्पिक मार्कर का उपयोग कर सकते GFP-Tub1 निर्माण, एक leucine auxotrophic मार्कर होता है। छोड़ने वालों मध्यम निर्माण की auxotrophic मार्कर को विशिष्ट होना चाहिए।
  12. रूपांतरित कोशिकाओं 30 ° C पर 3-5 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।
  13. एक autoclaved दन्तखुदनी का उपयोग कर कालोनियों स्थानांतरित करके एक ताजा -LEU छोड़ने वालों की थाली पर पुन: लकीर एकल परिवर्तन कालोनियों। 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात थाली सेते हैं।
  14. विजुअली कोशिकाओं के लगभग 1 μL एक भी कॉलोनी से एक साफ स्लाइड पर पानी की 2 μL में कदम 2.14 में थाली से निलंबित करके एक GFP संकेत के लिए प्रत्येक transformant स्क्रीन। एक coverslip साथ निलंबित कर दिया कोशिकाओं ढंक दें और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निरीक्षण।
    1. 488 एनएम प्रकाश साथ transformants उत्तेजित और एक GFP संकेत की उपस्थिति के लिए लग रही है।

3. बढ़ते तरल खमीर संस्कृति

  1. सिंथेटिक पूरा मध्यम के 3 एमएल में एक थाली पर एक भी कॉलोनी से टीका लगाने खमीर कोशिकाओं के ~ 1 μL। कोशिकाओं 250 rpm पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने की अनुमति दें।
  2. माध्यम में 0.1 की <एक आयुध डिपो से 600 अगले दिन संतृप्त संस्कृति पतला। 3-4 घंटे या जब तक आयुध डिपो 600 0.4 और 0.8 के बीच है जब कोशिकाओं इमेजिंग के लिए कक्षों में लोड करने के लिए तैयार कर रहे हैं 30 डिग्री सेल्सियस शेकर को पतला संस्कृति लौटें।

4. प्रवाह चैंबर स्लाइड तैयार कर रहा है

  1. कट गयाविस्तृत में पैराफिन फिल्म की एक चादर एक टुकड़ा 4 में और 7 लंबे में।
  2. पैराफिन फिल्म के 4 इंच चौड़ाई पर लंबाई में एक मानक खुर्दबीन स्लाइड रखें और स्लाइड 3-4 बार ऐसा है कि स्लाइड फिल्म है कि 3-4 परत मोटी है में कवर किया जाता है चारों ओर फिल्म लपेट दें। सुनिश्चित करने के लिए एक उचित मुहर नहीं है एक साथ परतों दबाएँ; इस आसान कटौती करने के लिए कर देगा। बहुत कठिन दबाने या शिकन के लिए फिल्म के कारण से बचें।
  3. एक साफ बॉक्स कटर रेजर का उपयोग कर स्लाइड के बाहर किनारों के साथ तेल फिल्म काटें। काटने के लिए एक सीधी बढ़त प्रदान करने के लिए एक और स्लाइड का उपयोग करें।
  4. पील काम कर स्लाइड बंद अतिरिक्त फिल्म और त्यागें। फिल्म के शेष के ढेर स्लाइड में से एक को कवर किया जाएगा चेहरे और इमेजिंग कक्षों के बीच दीवारों करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  5. एक सीधी बढ़त के रूप में दूसरी स्लाइड का उपयोग करना, लगभग दस स्ट्रिप्स, चौड़ाई में प्रत्येक 2-4 मिमी में स्लाइड की लंबी अक्ष के साथ खड़ी फिल्म परतों में कटौती।
  6. के लंबवत खड़ी पैराफिन फिल्म परतों कट, कदम 4.5 में किए गए स्लाइड से कम धुरी के साथ कटौती, स्ट्रिप्स बनाने के लिए चौड़ाई में 2-4 मिमी, लंबाई में 23-24 मिमी, और 3-4 परत मोटी।
  7. कटौती स्ट्रिप्स 45 ° कोण पर एक रेजर का उपयोग कर छील। संदंश का प्रयोग, समान रूप से कक्षों की वांछित संख्या बनाने की एक साफ खुर्दबीन स्लाइड पर कटौती फिल्म स्ट्रिप्स वितरित करें। अप करने के लिए 3 कक्षों (4 पैराफिन फिल्म स्ट्रिप्स के साथ बनाया) एक स्लाइड पर बनाया जा सकता है।
  8. फिल्म के स्ट्रिप्स के शीर्ष पर एक एकल coverslip रखें और उसे स्थिति में ले जाने के संदंश के साथ।
  9. तैयार स्लाइड रखें, ऊपर coverslip, एक hotplate ~ 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट पर (यह लगभग सबसे हॉट प्लेट पर कम मध्यम सेटिंग है)। स्लाइड गरम करें जब तक फिल्म स्ट्रिप्स पारभासी हैं (लगभग 3 मिनट) और उसके बाद स्लाइड सील और धीरे चिमटी के साथ coverslip पर दबाकर एक साथ coverslip।
    ध्यान दें: यह coverslip है कि तेल फिल्म स्ट्रिप्स सीधे ऊपर हैं के क्षेत्रों पर ही प्रेस के लिए महत्वपूर्ण है, ग ऊपर क्षेत्रों खरोंच के रूप मेंhambers छवि गुणवत्ता को कम कर सकते हैं। देखभाल स्लाइड ज्यादा गर्म न लें; वाष्पीकृत फिल्म इच्छा कोट एक हाइड्रोफोबिक फिल्म है कि पालन करने से कोशिकाओं को रोकता के साथ चैम्बर के अंदर।
  10. (स्लाइड गर्म हो जाएगा) हॉटप्लेट से स्लाइड को हटा कर उसे अलग सेट coverslip पक्ष ऊपर की ओर रखते शांत करने के लिए करने के लिए संदंश का उपयोग करें; के रूप में स्लाइड ठंडा, फिल्म को एक सफेद, अपारदर्शी रंगाई में लौट जाएगा।
    नोट: इस बिंदु पर, स्लाइड सुसंस्कृत खमीर कोशिकाओं के साथ लोड किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। अतिरिक्त स्लाइड इस मुद्दे पर बने होते हैं और समय तथा एक अनिश्चित अवधि के लिए एक साफ और सूखी स्थान में संग्रहित किया जा सकता है।

तैयार फ्लो चैंबर स्लाइड में 5. लोड हो रहा है खमीर कोशिकाओं

  1. Concanavalin एक (2 मिलीग्राम / बाँझ Dih 2 हे में एमएल) की एक जमे हुए, 200 μL विभाज्य पहले गला लें।
  2. खुले सिरों में से एक में pipetting द्वारा तैयार स्लाइड के प्रत्येक सदन के लिए thawed Concanavalin एक के लगभग 100 μL जोड़ें। पर्याप्त Concanavalin एक कक्ष को भरने के लिए जोड़ें। इस S के लिएTEP, Concanavalin एक केशिका क्रिया के माध्यम से कक्ष के माध्यम से कर लिया जाएगा।
  3. 5 मिनट के लिए स्लाइड, coverslip-नीचे, दो microfuge ट्यूब रैक या कलम के बीच लटका Concanavalin एक coverslip (यानी, कक्ष) का पालन करने की अनुमति।
  4. एक coverslip-अप स्थिति के लिए स्लाइड लौटें। 2x साथ चैम्बर धो चैम्बर मात्रा (ऊपर चरण 5.2, में निर्धारित; लगभग 200 μL) सिंथेटिक पूरा माध्यम के Concanavalin ए दूर करने के लिए
    1. कक्ष के माध्यम से माध्यम के प्रवाह, चैम्बर के एक छोर से बाहर तरल पदार्थ आकर्षित करने के लिए और साथ ही दूसरे में ताजा तरल पदार्थ pipetting या तो एक कागज तौलिया के कोने या एक फिल्टर पेपर छमाही में मुड़ा हुआ इस्तेमाल करते हैं। वैकल्पिक रूप से, शून्य चूषित्र का उपयोग सावधानी से एक छोर से बाहर तरल पदार्थ को आकर्षित करने के दूसरे में ताजा तरल पदार्थ pipetting जबकि।
  5. सेल निलंबन (कदम 3.4 से) के कक्ष की मात्रा (लगभग 200 μL) 2x बह निर्देशित प्रवाह metho का उपयोग करके लोड कोशिकाओंकदम 5.4.1 में वर्णित d।
    ध्यान दें: लक्ष्य छवि के लिए coverslip पर कोशिकाओं की एक परत है। इसलिए, यह काफी छोटा है कि वे एक दूसरे के शीर्ष पर पाइल नहीं है, लेकिन इतना बड़ा है कि पर्याप्त कोशिकाओं क्षेत्र में मौजूद छवि अधिग्रहण प्रति डेटा की अधिकतम राशि इकट्ठा करने के लिए कर रहे हैं कोशिकाओं के एक एकाग्रता लोड करने के लिए महत्वपूर्ण है। कक्ष के भीतर कोशिकाओं के इष्टतम एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं और अनुभव निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रवाह चैम्बर में कोशिकाओं की एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए, धीरे 2 मिनट के लिए 1,000 XG पर सेल संस्कृति गोली और सतह पर तैरनेवाला में से कुछ को हटा दें। , कोशिकाओं की एकाग्रता में कमी कोशिका निलंबन के लिए नए सिरे से सिंथेटिक पूरा मध्यम जोड़ने के लिए। कोशिकाओं की एकाग्रता एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप पर कक्ष का निरीक्षण करके (नीचे) कदम 5.7 के बाद का मूल्यांकन किया जा सकता है। इस बिंदु पर, अतिरिक्त कोशिकाओं को और अधिक सेल निलंबन में बह द्वारा चैम्बर में जोड़ा जा सकता। बहरहाल, इस बिंदु पर सेल घनत्व कम करने संभव नहीं है और सबसे अच्छा हासिल की हैएक पतला सेल निलंबन के साथ एक नया कक्ष लोड करके।
  6. , स्लाइड coverslip से नीचे लटका कदम 5.3 में वर्णित है, 10 मिनट के लिए कोशिकाओं coverslip का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए के रूप में।
  7. 4x के माध्यम से कृत्रिम पूरा मध्यम के कक्ष की मात्रा (लगभग 400 μL) बहने से किसी भी unadhered कोशिकाओं बाहर फ्लश। इस कक्ष में मुक्त रूप से प्रवाहित कोशिकाओं है, जो छवि अधिग्रहण दूषित कर सकता है समाप्त करेंगे।
  8. ध्यान से coverslip के किनारे करने के लिए नवचंद्रक लाने, एक कागज तौलिया का एक साफ कोने के साथ चैम्बर के प्रत्येक के अंत सूखी।
  9. गर्म (75 डिग्री सेल्सियस) सीलेंट के साथ चैम्बर के प्रत्येक के अंत सील (जैसे, VALAP; बराबर भागों पेट्रोलियम जैली, ऊन मोम, और पैराफिन मोम)।
    नोट: इस बिंदु पर, स्लाइड छवि के लिए तैयार है। कक्षों, अप करने के लिए 9 ज के लिए imaged किया जा सकता है प्रत्येक कक्ष में कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर। कोशिकाओं कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) समय के साथ है, जो धीरे-धीरे बुलबुले कोशिकाओं को विस्थापित पैदा करेगा का उत्पादन करेगा।

  1. उलटे एक 1.45 एनए 100X CFI योजना Apo उद्देश्य, एक पीजोइलेक्ट्रिक मंच, एक कताई डिस्क कोंफोकल स्कैनर इकाई, एक रोशनी लेजर हैं, और एक EMCCD कैमरे के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के लिए स्लाइड ले आओ। अधिग्रहण के दौरान कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर मंच के तापमान को बनाए रखें।
    नोट: उच्च संख्यात्मक एपर्चर एक बड़ा छवि संकल्प के लिए अनुमति देता है, और पीजोइलेक्ट्रिक मंच उच्च गति z के ढेर अधिग्रहण सक्षम बनाता है। न्यूनतम माइक्रोस्कोप आवश्यकताओं 100X उद्देश्य, रोशनी लेजर, और EMCCD कैमरे हैं।
  2. ध्यान में कोशिकाओं ले आओ। सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण क्षेत्र लिए कम से कम 5-6 कोशिकाओं को एक साथ समूहीकृत कोशिकाओं के लिए स्लाइड खोज के द्वारा एक समूह है।
    नोट: हालांकि यह एक समय में एक से अधिक सेल छवि के लिए आवश्यक नहीं है, एक ही क्षेत्र में इमेजिंग कई कक्षों डेटा की गुणवत्ता आई बिना डाटा अधिग्रहण की क्षमता में सुधार। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि हैकोशिकाओं एक ही फोकल हवाई जहाज़ पर हैं और एक दूसरे के शीर्ष पर ढेर नहीं।
  3. एक बहु-आयामी अधिग्रहण कार्यक्रम समय के साथ कई जेड सीरीज इकट्ठा करने के लिए।
    1. निम्नलिखित करने के लिए सक्रिय अधिग्रहण सेटिंग्स के भीतर सेटिंग समायोजित करें: कुल Z गहराई = 6 सुक्ष्ममापी, पूरे खमीर सेल समाहित करने के लिए; जेड कदम आकार = 300 एनएम, oversampling के बिना प्रकाश संग्रह को अधिकतम करने के लिए; कुल समय अवधि = 10 मिनट; समय अंतराल = जेड श्रृंखला हर 4 एस; और जोखिम समय = प्रत्येक z विमान के लिए 90 एमएस।
      ध्यान दें: इष्टतम जोखिम समय कैमरा, उत्तेजना प्रकाश स्रोत, और अन्य कारकों पर निर्भर करती है। कोशिका द्रव्य EMCCD द्वारा मापा पिक्सेल मूल्यों पर आधारित से संकेत करने के लिए GFP लेबल सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं से संकेत के अनुपात 1: सामान्य में, इष्टतम जोखिम समय आवश्यक न्यूनतम समय एक 3 प्राप्त करने के लिए किया जाएगा।
  4. 'भागो' पर क्लिक करके अधिग्रहण शुरुआत करें। यह पूर्ण 10 मिनट अवधि के लिए चलाने की अनुमति दें। एक छवि के रूप डेटा सहेजेंश्रृंखला (.tiff या .nd2)।
  5. कक्ष के भीतर छवि के लिए एक नए क्षेत्र का चयन करें और दोहराने कदम 6.2-6.4।
    ध्यान दें: एक एकल कक्ष, 15 और 20 के बीच कोशिकाओं के क्षेत्र उपज चाहिए कक्ष के भीतर सेल घनत्व के आधार पर। उच्चतर सेल घनत्व कम कुल क्षेत्रों निकलेगा, के रूप में सीओ 2 कक्ष में तेजी का निर्माण होगा।

7. छवि विश्लेषण

  1. ImageJ (में छवि फ़ाइल को खोलने https://imagej.nih.gov जैव प्रारूपों आयातक प्लगइन का उपयोग करके) एक hyperstack के रूप में।
    1. ओपन ImageJ और सीधे नियंत्रण कक्ष पर अनुभाग 6 से अधिग्रहण कर लिया छवि उन्हें खींच। जैव प्रारूपों आयातक स्वचालित रूप से शुरू कर देंगे। एक hyperstack के रूप में छवि ढेर लोड करने के लिए चयन करें "ठीक है"।
      करने के लिए "Hyperstack" पर सेट है नोट:: "जैव स्वरूपों आयात विकल्प" शीघ्र खोलने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि "ढेर देखने" अनुभाग के अंतर्गत होगा "के साथ ढेर देखें"; और "ढेर आदेश:" पर सेट है "XYCZT।"
  2. अधिकतम तीव्रता, जेड परियोजना समारोह का उपयोग कर 2-आयामी प्रक्षेपण में प्रत्येक जेड श्रृंखला को संकुचित करें।
    1. "छवि" मेनू, "ढेर" सबमेनू, और "जेड परियोजना" सुविधा चुनें। ड्रॉप-डाउन सूची से "अधिकतम प्रक्षेपण" का चयन करें और क्लिक करें "ठीक है।"
  3. छवि ढेर करने के लिए एक मंझला फ़िल्टर लागू "प्रक्रिया" मेनू, "फ़िल्टर" सबमेनू, और "माध्य" सुविधा का चयन करके speckling शोर को कम करने। त्रिज्या बॉक्स में 2.0 पिक्सल दर्ज करें और क्लिक करें "ठीक है।"
  4. क्षेत्र में पूर्व पश्चावस्था कोशिकाओं की पहचान करें।
    ध्यान दें: ये मध्यम आकार कलियों और एक छोटी mitotic धुरा, लंबाई में 1-1.5 सुक्ष्ममापी (चित्रा 1, एक छोटी mitotic धुरी के तीर अंक) की विशेषता है। क्योंकि वे आम तौर पर केवल एक फ़े प्रदर्शन इस स्तर पर कोशिकाओं सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण के लिए आदर्श हैंडब्ल्यू सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं धुरी खंभे 7 निकलती। एस्ट्रल सूक्ष्मनलिकाएं रैखिक तंतु कि माइनस छोर से एक समान GFP संकेत तीव्रता प्रदर्शन, SPB में, प्लस अंत तक, कोशिका द्रव्य में के रूप में पहचाना जा सकता है।
  5. छवि श्रृंखला के पहले timepoint पर शुरू, खंडित लाइन उपकरण के साथ साथ अंत करने के लिए, बस एक ही सूक्ष्म सूक्ष्मनलिका साथ एक रेखा आकर्षित करने के लिए उपयोग करने के शून्य से अंत, सूक्ष्म सूक्ष्मनलिका और अधिक तीव्रता से लेबल धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के बीच जंक्शन पर स्थित से है, जो द्रव्य में है (चित्रा 1 में लाल लाइनों देखें)। खंडित लाइन को पूरा करने के सूक्ष्मनलिका के अंत पर डबल क्लिक करें।
  6. कीबोर्ड पर "एम" बटन दबाकर "उपाय" सुविधा का उपयोग परिणाम तालिका में माप रिकॉर्ड।
    नोट: ऐसे ग्रे तीव्रता के रूप में अतिरिक्त सुविधाओं, "विश्लेषण" मेनू में माप की स्थापना और "सेट माप" सबमेनू द्वारा दर्ज की जा सकती है।
  7. या तो जेड स्लाइडर पट्टी में सही तीर पर क्लिक या "./>" कीबोर्ड पर कुंजी दबाकर अगले timepoint के लिए अग्रिम। दोहराएँ 7.5 और 7.6 छवि क्रम में सभी timepoints के लिए कदम दूर है।
  8. परिणाम तालिका से डेटा कॉपी करें और उन्हें एक स्प्रेडशीट में पेस्ट। का चयन करके डेटा सहेजें "इस रूप में सहेजें।"
    नोट: ये माप कई मूल्यों टुकड़ा है, जो श्रृंखला में timepoint इंगित करता है, और लंबाई, जो लाइन (यानी, सूक्ष्म सूक्ष्मनलिका) की लंबाई को इंगित करता है शामिल होंगे, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण मूल्य हैं। अन्य माप वाले कॉलम (जैसे, क्षेत्र, मतलब पिक्सेल मूल्य, कोण, आदि) या रखा जा सकता है या तो खारिज कर दिया।
  9. राइट क्लिक करें और "डालें" फ़ंक्शन का उपयोग करके स्प्रेडशीट में एक नया कॉलम बनाएं। इनपुट प्रत्येक timepoint के समय (ओं)।
  10. सूक्ष्मनलिका लंबाई (सुक्ष्ममापी) समय (रों) के एक समारोह के रूप में की एक XY बिखराव साजिश "डालें रेखा बनाएंचार्ट "सुविधा, के रूप में लंबाई माप का चयन" Y "और के रूप में समय स्तंभ" X "
    1. कदम 7.10 से बिखराव भूखंड पर समय के साथ लंबाई में सकारात्मक और नकारात्मक परिवर्तन की तलाश द्वारा बहुलकीकरण, depolymerization, और ठहराव के क्षेत्रों की पहचान करना।
      नोट: Polymerization घटनाओं 3 timepoints की एक न्यूनतम भर में कम से कम 0.5 सुक्ष्ममापी द्वारा सूक्ष्मनलिका लंबाई बढ़ाने के लिए और एक आर 2 ≥ 0.9 और एक आर-मूल्य> 0 (चित्रा 1 बी और डी, हरी अंक) के साथ एक रेखीय प्रतीपगमन फिट। Depolymerization घटनाओं 3 timepoints की एक न्यूनतम भर में कम से कम 0.5 सुक्ष्ममापी द्वारा सूक्ष्मनलिका लंबाई कम होती है और एक आर 2 ≥ 0.9 और एक आर-मूल्य <0 (चित्रा 1 बी और डी, गुलाबी अंक) के साथ एक रेखीय प्रतीपगमन फिट। रोकें घटनाओं बहुलकीकरण और depolymerization से पृथक होते हैं। विराम कम से कम 0.5 सुक्ष्ममापी 3 timepoints की एक न्यूनतम भर सूक्ष्मनलिका लंबाई में शुद्ध परिवर्तन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं;-0.4 और 0.4 के बीच एक आर-मूल्य के साथ एक रेखीय प्रतीपगमन फिट; और एक ढलान है कि शून्य से सांख्यिकीय अलग रूप में एक एफ परीक्षण करके निर्धारित किया नहीं है, है।
    2. मार्गदर्शक के रूप में बिखराव की साजिश का उपयोग करना, समय के वर्गों की पहचान जब लंबाई परिवर्तन सकारात्मक है और उन्हें एक हरे रंग में प्रकाश डाला। समय के क्षेत्रों को हाइलाइट करें जब लंबाई परिवर्तन एक गुलाबी रंग में नकारात्मक है।
    3. प्रत्येक के रेखीय प्रतीपगमन खंड पर प्रकाश डाला की गणना करें और समीपस्थ क्षेत्रों के लिए कॉलम में प्रत्येक अनुभाग के लिए R- और आर 2 -value रिकॉर्ड है। या तो एक बहुलकीकरण घटना या एक depolymerization घटना के रूप में प्रत्येक रंग क्षेत्र में वर्गीकृत करें।
  11. प्रत्येक विकास घटना के लिए समय में परिवर्तन से लंबाई में शुद्ध परिवर्तन विभाजित करके बहुलकीकरण दरों की गणना। कदम 7.10.3 से रेखीय प्रतीपगमन मूल्यों से सटे कॉलम में इन परिणामों रिकॉर्ड।
  12. प्रत्येक shrinkin के लिए समय में परिवर्तन से लंबाई में शुद्ध परिवर्तन विभाजित करके depolymerization दरों की गणनाजी घटना। कदम 7.11 से बहुलकीकरण दर मूल्यों से सटे कॉलम में इन परिणामों रिकॉर्ड।
  13. सभी विकास घटनाओं 13 के कुल समय से बहुलकीकरण करने वाली depolymerization संक्रमण की संख्या को विभाजित करके तबाही आवृत्ति की गणना। कदम 7.12 से depolymerization दर मूल्यों से सटे कॉलम में इन परिणामों रिकॉर्ड।
  14. सभी संकोचन घटनाओं 13 के कुल समय से depolymerization करने वाली बहुलकीकरण संक्रमण की संख्या को विभाजित करके बचाव आवृत्ति की गणना। कदम 7.13 से तबाही आवृत्ति मूल्यों से सटे कॉलम में इन परिणामों रिकॉर्ड।
  15. छवि अधिग्रहण की कुल अवधि तक सभी लंबाई बदल जाता है, कदम 7.10.1 में गणना का निरपेक्ष मान का योग विभाजित है, और 27.0833 से गुणा प्रति सेकंड 14 ट्यूबिलिन सब यूनिटों प्राप्त करने के लिए द्वारा dynamicity की गणना। स्तंभ में इन परिणामों बचाव आवृत्ति वैल के निकट रिकार्डकदम 7.14 से ues और परिणाम तालिका को बचाने के।
    नोट: यह विश्लेषण प्रक्रिया चरणों 7.10-7.15 एक कस्टम निर्मित प्रोग्राम का उपयोग में वर्णित स्वचालित करने के लिए संभव है (। Estrem, एट अल, पांडुलिपि प्रस्तुत)। कार्यक्रम मापदंडों ऊपर विस्तृत का पालन करते हुए लंबाई मापन में बहुलकीकरण और depolymerization की अवधि की पहचान के लिए बनाया गया है।

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Representative Results

मापने खमीर कोशिकाओं जीने में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता कैसे सूक्ष्मनलिका नियामकों या ट्यूबिलिन एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन सब यूनिटों प्रभाव बहुलकीकरण और depolymerization दरों, साथ ही इन राज्यों के बीच संक्रमण की आवृत्ति का आकलन करने के एक सम्मोहक उपकरण प्रदान करता है। चित्रा 1 प्रदर्शित करता है एक जंगली प्रकार सेल में नक्षत्रीय सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के एक समय श्रृंखला और β ट्यूबिलिन में उत्परिवर्तन के साथ एक उत्परिवर्ती सेल (430Δ tub2-)। सूक्ष्मनलिकाएं सूक्ष्मनलिका लंबाई कल्पना करने के लिए GFP-टैग α ट्यूबिलिन दिया जाता है। लाल तीर प्रत्येक छवि (Figure1A और 1 सी) में सूक्ष्म सूक्ष्मनलिका की लंबाई का पता लगा। सूक्ष्मनलिका लंबाई 8 मिनट के लिए प्रत्येक timepoint पर मापन किया गया, और इन संकलित लंबाई जीवन भूखंडों (चित्रा 1 बी और 1 डी) में चित्रित कर रहे। इन आंकड़ों बहुलकीकरण दर, depolymerization दर, बहुलकीकरण durati निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गयापर, depolymerization अवधि, बचाव आवृत्ति, तबाही आवृत्ति, और dynamicity।

आकृति 1
चित्र 1 GFP लेबल सूक्ष्मनलिकाएं और एस्ट्रल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की माप के समय चूक इमेजिंग। (ए और सी) जंगली प्रकार और tub2 -430Δ उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए समय-अंतराल इमेजिंग के पहले पांच अनुक्रमिक छवियों। सूक्ष्मनलिकाएं GFP-Tub1 के साथ लेबल और कोशिका चक्र के पूर्व पश्चावस्था में imaged कर रहे हैं। प्रत्येक छवि एक कोंफोकल जेड श्रृंखला से एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण होता है। स्केल सलाखों: 1 सुक्ष्ममापी। मुहर प्रत्येक फ्रेम अधिग्रहण पर कुल समय को दर्शाता है। लाल तीर तीर के साथ साथ समाप्त होता है को दर्शाता है, एक सूक्ष्म सूक्ष्मनलिका की कुल लंबाई के साथ पालन करें। (बी और डी) सूक्ष्मनलिका जीवन भूखंडों समय के साथ एक सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं की लंबाई प्रदर्शित करते हैं। हरे रंग की बातरों बहुलकीकरण निरूपित और गुलाबी अंक depolymerization को दर्शाते हैं। तबाही तीर घटनाओं को इंगित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 1 एक जंगली प्रकार तनाव और एक उत्परिवर्ती तनाव सी-टर्मिनल पर β ट्यूबिलिन के 27 अमीनो एसिड की कमी एक उत्परिवर्ती है कि पहले और अधिक स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं 15 होने का पता चला था के बीच बदल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को दर्शाता है। के रूप में सूक्ष्मनलिका जीवन भूखंडों में दिखाया गया है, tub2 -430Δ उत्परिवर्ती में सूक्ष्मनलिका लंबा है और जंगली प्रकार सूक्ष्मनलिका से प्रदर्शित कम आपदाओं (चित्रा 1 बी और डी तीर; तालिका 1)। इसके अलावा, बहुलक और depolymerization दरों, आरोही की ढलानों और उतरते सूक्ष्मनलिका leng से निर्धारितचौथाई, जंगली प्रकार (; तालिका 1 चित्रा 1 बी और 1 डी) की तुलना में उत्परिवर्ती में कम कर रहे हैं। अंत में, tub2 -430Δ उत्परिवर्ती सेल में सूक्ष्मनलिका बहुलकीकरण और depolymerization के राज्यों में अधिक समय बिताने और जंगली प्रकार (तालिका 1) की तुलना में dynamicity कमी आई है।

तनाव Dynamicity (सब यूनिटों / s) बहुलकीकरण दर (सुक्ष्ममापी / मिनट) % Polymerization में समय Depolym दर (सुक्ष्ममापी / मिनट) Depoly- में% समय
merization 		% रोकें में समय बचाव आवृत्ति (घटनाओं / मिनट) तबाही आवृत्ति (EVपिता / मिनट)
जंगली प्रकार n = 1 54 1.8 ± 0.5 48 3.0 ± 0.3 29 3 1.8 1.4
tub2-430Δ n = 1 40 1.4 ± 0.1 41 1.5 ± 0.2 32 0 0.8 0.7
लघुरूप इस प्रकार हैं: सुक्ष्ममापी, माइक्रोन; मिनट, मिनट; रों, दूसरा; n, एकल सूक्ष्मनलिका सूक्ष्मनलिका जीवन साजिश (Fig1B, डी) से विश्लेषण किया। मान मतलब ± मतलब की मानक त्रुटि है।

तालिका 1: चित्र 1 में कोशिकाओं के लिए सूक्ष्मनलिका गतिशीलता माप मूल्यों चित्रा 1 में दिखाया गया है एक सूक्ष्मनलिकाएं की माप से मतलब की मानक त्रुटि ± मतलब है।

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Discussion

नवोदित खमीर मॉडल एक इन विवो में स्थापित करने में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के उच्च संकल्प माप एकत्र करने, समय के साथ छवि एकल सूक्ष्मनलिकाएं करने की क्षमता और tubulins और सूक्ष्मनलिका नियामकों खमीर आनुवंशिकी के उपकरण का उपयोग कर में हेरफेर करने की क्षमता सहित के लिए प्रमुख लाभ प्रदान करता है।

Concanavalin एक में लिपटे कक्षों पिघला हुआ अगर पैड सहित पहले से वर्णित उपकरणों को, अधिक लाभ के एक नंबर प्रदान करते हैं। कक्षों के साथ स्लाइड पूर्व बनाया जा सकता है और लंबी अवधि संग्रहीत या तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता। साथ ही, Concanavalin एक में लिपटे कक्षों में एक ही माध्यम है जिसमें कोशिकाओं मूल रूप से सुसंस्कृत थे में> 6 घंटे के लिए खमीर कोशिकाओं संवर्धन में सक्षम हैं। यह ध्यान रखें कि कक्ष के भीतर कोशिकाओं की संख्या हुक्म होगा कब तक चैम्बर imaged किया जा सकता है महत्वपूर्ण है। लेपित कक्षों सुनिश्चित करना है कि केवल खमीर कोशिकाओं की एक परत coverslip का पालन करता है। अंत में, कई कक्षों के निर्माण के लिए अनुमति देता हैकई अलग अलग खमीर के उपभेदों एक ही स्लाइड पर imaged किया जाना है।

वहाँ एक प्रमुख चुनौती है अपेक्षाकृत कम संकेत स्तर और प्रक्रिया की अत्यधिक गतिशील प्रकृति सहित खमीर, नवोदित में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता इमेजिंग के लिए कर रहे हैं। विदेफीएल्ड सूक्ष्मदर्शी लेबल सूक्ष्मनलिकाएं की एकल timepoint छवियों पर कब्जा करने लिए पर्याप्त हैं। हालांकि, widefield माइक्रोस्कोपी तेजी से देर तक उसके संपर्क बार और आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश के साथ नमूना की बमबारी की वजह से photobleaching कारण बनता है। इसी तरह, लेजर स्कैनिंग कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी तेजी photobleaching के कारण अपर्याप्त हैं। कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी विशिष्ट खमीर नवोदित में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता इमेजिंग के लिए अनुकूल है। कताई डिस्क confocal खुर्दबीन यहां इस्तेमाल किया प्रणाली को ध्यान में इन आवश्यकताओं के साथ डिजाइन किया गया था।

माइक्रोस्कोप प्रणाली उच्च गति और उच्च संवेदनशीलता के लिए तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि माइक्रोस्कोप प्रणाली की एक किस्म से उपयुक्त साबित हो सकता है, कई घटक आवश्यक हैं। एक 100Xएक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (1.45NA) के साथ उद्देश्य 100 एनएम के आदेश पर अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं और लंबाई में परिवर्तन को हल करने के लिए आवश्यक है। एक कताई डिस्क कोंफोकल स्कैनर photobleaching और विषाक्तता, आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को रोकने के द्वारा कम करने के लिए, और संकल्प और संवेदनशीलता को अधिकतम करने के लिए, केवल में फोकस प्रकाश को एकत्र करने पर आवश्यक है। EMCCD कैमरे समय-अंतराल अधिग्रहण से प्रत्येक 90-एमएस के दौरान पर्याप्त GFP-Tub1 संकेत इकट्ठा करने के लिए तेजी से और संवेदनशील होना चाहिए। वर्तमान में, EMCCD कैमरों इस आवेदन के लिए सबसे अच्छा विकल्प है। वर्तमान CMOS संवेदक कैमरों उच्च अंत EMCCDs की संवेदनशीलता की कमी है; हालांकि, इस तकनीक में काफी सुधार हो रहा है और जल्द ही उपयुक्त हो सकता है। अंत में, एक पीजोइलेक्ट्रिक चरण जेड में तेजी से और सटीक आंदोलन है, जो चार आयामी छवि अधिग्रहण दर सीमित कदम हो सकता है के लिए आवश्यक है।

विशिष्ट माइक्रोस्कोप प्रणाली इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक बाधा प्रस्तुत कर सकता है अगर समान उपकरण आसानी से उपलब्ध नहीं है। बदलाव गएक अलग इमेजिंग सिस्टम को समायोजित करने के बनाया जा, लेकिन इन संशोधनों को अस्थायी और / या स्थानिक संकल्प की कीमत पर आ सकते हैं। एक धुरी पर ही आधारित चरण की मोटर पीजोइलेक्ट्रिक चरण के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन मोटर्स, धीमी कम सटीक, और बहाव से ग्रस्त हैं। अधिग्रहण के बाद छवि स्थिर प्लग इन इन मोटर चालित चरणों के साथ जुड़े XY आयामों में बहाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, धीमी गति के साथ रीडआउट वैकल्पिक कैमरों इस्तेमाल किया जा सकता। एक धीमी अधिग्रहण दर जगह बनाने के लिए जेड श्रृंखला कम अक्सर एकत्र किया जा सकता (यानी, जेड श्रृंखला के बीच और अधिक समय)। हालांकि, जेड श्रृंखला के बीच के समय में वृद्धि लापता संक्रमण timepoints के बीच हो सकता है कि जोखिम। वैकल्पिक रूप से, जेड विमानों के बीच की दूरी के अनुसार जेड श्रृंखला एकत्रित की गई छवियों की संख्या कम करने का एक तरीका के रूप में बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, इस अंतर को बढ़ाने के विमानों के बीच छवि जानकारी है, जो प्रयोगकर्ता के accur करने की क्षमता क्षीण होगा खोने जोखिमately सूक्ष्मनलिका समाप्त होता है की पहचान। जाहिर है, परिवर्तन विकल्प इमेजिंग सिस्टम की सुविधा के लिए बनाया जा सकता है, लेकिन इन परिवर्तनों छवि जानकारी होने वाले संभावित नुकसान के खिलाफ तौला जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा स्थानिक जानकारी के नुकसान जब तीन आयामी छवि के ढेर द्वि-आयामी चित्र अनुमानों में बदल जाती है। एक पूर्व पश्चावस्था खमीर सेल में एक व्यक्ति सूक्ष्म सूक्ष्मनलिका 0.5 आम तौर पर के बीच और 2.0 लंबाई और कोशिका द्रव्य की त्रि-आयामी अंतरिक्ष भर में परियोजनाओं में सुक्ष्ममापी है। यह प्राप्त करने के लिए जेड पदों की एक श्रृंखला से छवियों लिए एक व्यक्ति सूक्ष्मनलिका के सभी स्थानिक जानकारी इकट्ठा करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। एक समय-अंतराल अधिग्रहण में, यह एक जटिल डेटा सेट 150 timepoints की दर से 20 जेड स्लाइस के साथ, 3000 छवियों के लिए कुल उत्पादन कर सकते हैं,। इस चुनौती से निपटने के लिए और छवि विश्लेषण आसान बनाने के लिए, जेड के ढेर के स्थानिक जानकारी विश्लेषण के दौरान संकुचित है। हालांकि इस benefइसके विश्लेषण, यह जेड आयाम से स्थानिक जानकारी की कीमत पर आता है। कितना जानकारी जब जेड आयाम संकुचित है खो दिया है? इस नुकसान का अनुमान लगाने के लिए, प्रयोगों पूर्व पश्चावस्था कोशिकाओं है, जो अपेक्षाकृत को मापने के लिए क्योंकि Spc110-GFP लेबल SPBs उच्च संकेत से शोर अनुपात के साथ गोलाकार फोकी प्रदर्शन आसान कर रहे हैं में SPBs के बीच की दूरी को मापने के लिए आयोजित की गई। हालांकि धुरी सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं से जेड में विभिन्न विस्थापन प्रदर्शन कर सकते हैं, औसत लंबाई समान है (~ 1.5 सुक्ष्ममापी) और इसलिए एक उपयोगी प्रतिनिधि प्रदान करता है। स्पिंडल लंबाई, औसत पर, 15% रह गया जब पूरा त्रि-आयामी छवि के ढेर में जब एक ही स्पिंडल दो आयामी अनुमानों (जेएम, अप्रकाशित परिणाम) में मापा जाता है की तुलना में मापा जाता है। इस प्रकार, सरलीकृत डेटा सेट और माप के लाभ के त्याग Z जानकारी की लागत के खिलाफ तौला जाना चाहिए।

खमीर कोशिका जीव विज्ञान समुदाय इमेजिंग सूक्ष्मनलिका networ के लिए एक बहुमुखी टूलकिट विकसित किया गया हैks। यह अल्फा ट्यूबिलिन के लिए / Tub1 जुड़े हुए हैं और विभिन्न auxotrophic मार्कर के साथ चिह्नित फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक किस्म भी शामिल है। इन निर्माणों शामिल LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11 है, जो गुणसूत्र LEU2 लोकस में एकीकृत करता है, और GFP और अन्य fluorophores करने के लिए कई fusions, जो URA3 लोकस में एकीकृत URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16 सहित, URA3 :: सीएफपी-TUB1 (pAFS125-सीएफपी), और URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17। इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के Tub1 fusions का एक सेट हाल ही में या तो गुणसूत्र URA3 ठिकाना करने के लिए या एक ठिकाना देशी TUB1 ठिकाना 18 से सटे करने के लिए कि लक्ष्य एकीकरण बनाया गया है। fluorophores और मार्करों के इस व्यापक पैलेट भिन्न टैग किए गए प्रोटीन के साथ सह स्थानीयकरण प्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी है। GFP-Tub1 संलयन microtu की समय-अंतराल इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा उपकरण बना रहता हैइसकी चमक और photostability के कारण bule गतिशीलता। GFP-Tub1 सांग और ली (pSK1050) 11 के द्वारा बनाई गई संलयन α ट्यूबिलिन / Tub1 के अमीनो टर्मिनस के लिए GFP के एक संलयन होता है और leucine auxotrophy को बचाने के लिए LEU2 लोकस में एकीकृत करता है। इस प्रकार, संलयन प्रोटीन देशी α ट्यूबिलिन के अलावा ectopically व्यक्त और सेल 9 में शामिल ~ कुल α ट्यूबिलिन का 20% है। महत्वपूर्ण रूप से, GFP-Tub1 संलयन देशी α ट्यूबिलिन / Tub1 (जेएम, अप्रकाशित परिणाम) के समारोह बचाव नहीं करता है। यह भी अन्य TUB1 संलयन का सच है 18 निर्माण करती है।

उपलब्ध उपकरणों सूक्ष्मनलिकाएं और उनके बंधनकारी प्रोटीन कल्पना करने के लिए के साथ, नवोदित खमीर tubulins और अन्य सूक्ष्मनलिका नियामकों में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है। साथ ही, ट्यूबिलिन जीन की सीमित संख्या उत्परिवर्ती ट्यूबिलिन के एक समरूप पूल के प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए अनुमति देता है। में परिवर्तन करने के अलावाट्यूबिलिन जीन, नवोदित खमीर सूक्ष्मनलिका जुड़े प्रोटीन (एमएपीएस) कि metazoan समकक्षों की मुताबिक़ हैं की एक संख्या है। इन मानचित्रों सीधे अध्ययन किया जा सकता है, और प्रभाव है कि म्यूटेशन एकल सूक्ष्मनलिका तंतु पर भी जांच की जा सकती। प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत दोनों आंतरिक और बाह्य प्रक्रियाओं है कि सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को प्रभावित की जांच के लिए अनुमति देता है।

सारांश में, सूक्ष्मनलिकाएं कई सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान ठीक ढंग से काम करने के लिए गतिशील होना चाहिए। यह कारकों ट्यूबिलिन के लिए आंतरिक और बाह्य जुड़े प्रोटीन कि सूक्ष्मनलिका गतिशीलता को विनियमित को समझना आवश्यक है। नवोदित खमीर सीधे एक भी सूक्ष्मनलिका की गतिशीलता मात्र निर्धारण द्वारा इन कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है। प्रोटोकॉल ऊपर विस्तृत वर्णन करता है कि स्थिरतापूर्वक खमीर जीनोम में एक फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन एकीकृत करने के लिए और प्राप्त करने और विश्लेषण कोंफोकल छवि विवो में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता अंदाजा लगाना स्टैक्स करने के लिए कैसे

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

हम विभिन्न एफपी-TUB1 प्लास्मिड साझा करने के लिए केरी ब्लूम (उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय), क्‍यूंग ली (NCI), स्टीवन मार्कस (कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय), और इल्‍मार शीबल (यूनिवर्सिटैट हीडलबर्ग) धन्यवाद। हम स्लाइड चैम्बर तैयारी विधि में प्रशिक्षण के लिए मेलिस्‍सा गार्डनर (मिनेसोटा विश्वविद्यालय) के आभारी हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) R01GM112893-01A1 (JKM के लिए) और T32GM008730 (ईस्वी) देने का समर्थन मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOB (dropout bases) Sunrise science  1650
CSM-Leu Sunrise science  1005
Agar Ameresco N833
100 mm polystyrene plates Fisher Scientific FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O Sigma-Aldrich   D7656 resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media  Sunrise science  1459-100
Concanavalin A Sigma-Aldrich  L7647 resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
Microscope Coverslips Fisher Scientific 12-541-B
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) melt at 75 ºC before use
forceps  Fisher Scientific 16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich  202444
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope Nikon Instruments MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective Nikon Instruments MRD01905
Piezo electric stage  Physik Instrumente P-736
Spinning disk scanner Yokogawa CSU10
Laser combiner module Agilent Technologies MCL400B
EMCCD camera Andor Technology iXon Ultra 897 
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elements software Nikon Instruments MQS31100
Microsoft Excel software Microsoft
MATLAB software MathWorks, Inc
ImageJ64 NIH Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in Open Microscopy Environment
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1 pSK1050 reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 122 cytoskeleton सूक्ष्मनलिका गतिशीलता मुकलन खमीर माइक्रोस्कोपी लाइव सेल इमेजिंग
उच्च संकल्प इमेजिंग और नवोदित खमीर में व्यक्तिगत एस्ट्रल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण
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Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J.… More

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).

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