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Immunology and Infection

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Abstract

Neutrophile Migration und Chemotaxis sind entscheidend für das Immunsystem unseres Körpers. Mikrofluidische Geräte werden zunehmend zur Untersuchung von Neutrophilenmigration und Chemotaxis aufgrund ihrer Vorteile in der Echtzeit-Visualisierung, der präzisen Kontrolle der chemischen Konzentrationsgradientenerzeugung und des reduzierten Reagenz- und Probenverbrauchs eingesetzt. In jüngster Zeit wurde von den mikrofluidischen Forschern zunehmend Anstrengungen unternommen, integrierte und leicht bedienbare mikrofluidische Chemotaxis-Analysesysteme direkt aus Vollblut zu entwickeln. In dieser Richtung wurde das erste All-on-Chip-Verfahren zur Integration der magnetischen Negativreinigung von Neutrophilen und des Chemotaxis-Assays aus kleinen Blutvolumenproben entwickelt. Diese neue Methode erlaubt einen schnellen Stichproben-Neutrophilen-Chemotaxis-Test in 25 min. In diesem Papier bieten wir detaillierte Bau-, Betriebs- und Datenanalyseverfahren für diesen All-on-Chip-Chemotaxis-Assay mit einer Diskussion über Strategieschutzstrategien, LimiUnd zukünftige Richtungen. Repräsentative Ergebnisse des Neutrophilen-Chemotaxis-Assays, die ein definiertes Chemoattraktant, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) und Sputum von einem chronisch obstruktiven Lungenkrankheit (COPD) -Patienten unter Verwendung dieses All-on-Chip-Verfahrens untersuchen, werden gezeigt. Diese Methode gilt für viele zellmigrationsbezogene Untersuchungen und klinische Anwendungen.

Introduction

Chemotaxis, ein Prozess der gerichteten Zellmigration zu löslichem chemischen Konzentrationsgradienten, ist kritisch in viele biologische Prozesse involviert, einschließlich Immunantwort 1 , 2 , 3 , Gewebeentwicklung 4 und Krebsmetastase 5 . Neutrophile sind die häufigsten weißen Blutzellen-Untergruppe und spielen entscheidende Rollen in der Ermöglichung der körpereigenen Gastgeber Verteidigung Funktionen, sowie bei der Vermittlung der adaptiven Immunantwort 6 , 7 . Neutrophile sind mit hochregulierten chemotaktischen Maschinen ausgestattet, die es ermöglichen, dass diese beweglichen Immunzellen sowohl auf Pathogen-abgeleitete Chemoattraktanten ( zB fMLP) als auch auf Wirts-abgeleitete Chemoattraktanten ( zB Interleukin-8) durch die Chemotherapie 8 reagieren. Neutrophile Migration und Chemotaxis vermitteln verschiedene physiologische ProblemeUnd Krankheiten wie Entzündungen und Krebs 1 , 9 . So liefert die genaue Beurteilung der neutrophilen Chemotaxis eine wichtige funktionelle Auslesung für das Studium der Neutrophilenbiologie und der damit verbundenen Erkrankungen.

Im Vergleich zu den weit verbreiteten konventionellen Chemotaxis-Assays ( zB Transwell-Assay 10 ) zeigen die mikrofluidischen Geräte ein großes Versprechen für die quantitative Auswertung von Zellmigration und Chemotaxis aufgrund der präzise kontrollierten chemischen Gradientenbildung und Miniaturisierung 11 , 12 , 13 . In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene mikrofluidische Geräte entwickelt, um die Chemotaxis verschiedener biologischer Zelltypen, insbesondere der Neutrophilen, zu untersuchen. Es wurde erhebliche Anstrengungen zur Charakterisierung der Neutrophilen-Migration in räumlich-zeitlich komplexem Che gegeben Mischen Gradienten, die in den mikrofluidischen Vorrichtungen 14 , 15 konfiguriert wurden. Interessante Strategien wurden auch entwickelt, um eine direktionale Entscheidungsfindung durch Neutrophile unter Verwendung der mikrofluidischen Vorrichtungen zu untersuchen. An der biologisch orientierten Forschung wurden die Anwendungen von mikrofluidischen Vorrichtungen erweitert, um klinische Proben für die Krankheitsauswertung 17 , 18 , 19 zu testen. Allerdings ist die Verwendung von vielen mikrofluidischen Geräten auf spezialisierte Forschungslaboratorien beschränkt und erfordert eine lange neutrophile Isolierung aus großen Mengen an Blutproben. Daher hat es einen wachsenden Trend der Entwicklung integrierter mikrofluidischer Vorrichtungen zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Tropfen Vollblut 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

In dieser Richtung wurde ein All-on-Chip-Verfahren entwickelt, das die magnetische Negativ-Neutrophilen-Reinigung und den darauffolgenden Chemotaxis-Assay auf einer einzigen mikrofluidischen Vorrichtung 25 integriert . Diese All-on-Chip-Methode hat die folgenden neuartigen Merkmale: 1) Im Gegensatz zu früheren On-Chip-Strategien, die Neutrophile aus dem Blut durch adhäsionsbasierte Zellaufnahme oder zellgrßenbasierte Filterung 20 , 22 isolieren, erlaubt diese neue Methode hohe Reinheit, On-Chip-Magnettrennung der Neutrophilen aus kleinen Volumina von Vollblut sowie Chemotaxis-Messung bei chemoattraktiver Stimulation; 2) Die Zell-Docking-Struktur hilft, die Anfangspositionen der Neutrophilen in der Nähe des chemischen Gradientenkanals auszurichten und ermöglicht eine einfache Chemotaxisanalyse ohne Einzelzellverfolgung; 3) die Integration der Neutrophilen-Isolation und des ChemotsAchsen-Assay auf einer einzigen mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Proben-zu-Ergebnis-Chemotaxis-Analyse in 25 min, wenn es keine Unterbrechung zwischen experimentellen Schritten gibt.

Dieses Papier bietet ein detailliertes Protokoll für die Konstruktion, Betrieb und Datenanalyse Methode dieser All-on-Chip-Chemotaxis-Assay. Das Papier zeigt die effektive Verwendung des entwickelten Verfahrens zur Durchführung von Neutrophilen-Chemotaxis durch Testen eines bekannten rekombinanten Chemoattraktans und komplexer chemotaktischer Proben von Patienten, gefolgt von einer Diskussion über Strategien zur Fehlerbehebung, Einschränkungen und zukünftigen Richtungen.

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Protocol

Alle menschlichen Probenahmeprotokolle wurden vom Joint-Faculty Research Ethics Board an der University of Manitoba, Winnipeg, genehmigt.

1. Mikrofluidische Geräteherstellung ( Abbildung 1A )

  1. Design und Druck Transparenz Maske.
    1. Entwerfen Sie das Gerät wie zuvor beschrieben 25 . Siehe Abbildung 1A .
      HINWEIS: Das Gerät enthält zwei Ebenen. Die erste Schicht (4 μm hoch) definiert den Zellen-Docking-Barrier-Kanal, um die Zellen neben dem Gradientenkanal zu fangen. Die zweite Schicht (60 μm hoch) definiert den Gradientenerzeugungskanal, den Port und den Kanal für die Zellenbeladung, die chemischen Einlassreservoirs und den Abfallauslass. Die Ausrichtungsmarkierungen sind für die beiden Schichten ausgelegt. Für die zweite Schicht beträgt die Länge und Breite des vorgeschalteten serpentinen Eingangskanals 60 mm bzw. 200 μm; Die Länge und Breite des DownstreamDer serpentine Eingangskanal beträgt 6 mm bzw. 280 μm.
    2. Drucken Sie die ersten und zweiten Layer-Features auf eine Transparenzmaske mit einem hochauflösenden Drucker.
      HINWEIS: Die Druckauflösung hängt von den minimalen Merkmalen des Designs ab. In der aktuellen Konstruktion wurden 32.000 dpi für 10 μm minimale Funktion gewählt.
  2. Reinigen Sie den Siliziumwafer.
    1. Legen Sie einen 3 in Silizium-Wafer in den Plasma-Reiniger. Vakuum für 3 min auftragen.
    2. Schalten Sie die Plasmaleistung ein und stellen Sie den Pegel auf HIGH. Verwenden Sie das Sauerstoffplasma, um den Siliziumwafer für 30 min zu behandeln.
    3. Schalten Sie den Plasma-Reiniger aus und nehmen Sie den Silizium-Wafer heraus; Der Siliziumwafer ist bereit für die Herstellung der Vorrichtungsform.
  3. Die erste Schicht durch Photolithographie in einer Reinraumanlage herstellen.
    HINWEIS: Die genauen Herstellungsparameter können je nach Fertigungsmöglichkeit variieren.
    1. 10 mL SU-8 2025 mit 10 mL SU-8 2000 in einem Glasbrecher zur Vorbereitung des entworfenen Photoresists. Lassen Sie die Mischung 10 Minuten lang in die Dunstabzugshaube, bis die Blasen verschwinden.
    2. Setzen Sie den gereinigten Siliciumwafer vorsichtig mit dem passenden Spannfutter auf den Spinner und legen Sie das Vakuum an, um den Siliziumwafer zu immobilisieren.
    3. Füllen Sie vorsichtig 3 ml der Photoresistmischung auf die Mitte des Siliziumwafers. Spin bei 500 U / min für 5 s. Dann drehen bei 3.000 U / min für 30 s, um eine endgültige 4 μm dicke Photoresistbeschichtung auf dem Siliziumwafer zu erhalten.
    4. Entfernen Sie vorsichtig den Siliziumwafer aus dem Spinner und backen Sie den Siliziumwafer auf einer Kochplatte für 4 min bei 95 ° C.
    5. Setzen Sie den Siliziumwafer vorsichtig auf einen Maskenausrichter und stellen Sie die UV-Belichtungszeit auf 6 s ein. Die Transparenzmaske der ersten Schicht sorgfältig auf eine transparente Glasplatte mit Klebeband aufbringen.
    6. Legen Sie die transparente Glasplatte vorsichtig mit der angebrachten Maske auf den Ausrichter und richten Sie die Maske mit dem Siliziumwafer aus. Entdecke die siLicon Wafer auf die UV-Muster der Zell-Docking-Struktur.
    7. Entfernen Sie vorsichtig die Glasplatte und nehmen Sie den freiliegenden Siliziumwafer heraus. Den Siliciumwafer auf einer Kochplatte für 4 min bei 95 ° C backen.
    8. Übertragen Sie den Silizium-Wafer auf eine Dunstabzugshaube und legen Sie ihn in eine Glaspfanne mit dem SU-8-Entwickler. Schütteln Sie das seit 30 s.
    9. Reinigen Sie den Silizium-Wafer mit frischem SU-8-Entwickler, gefolgt von Isopropylalkohol (IPA) in der Dunstabzugshaube. Trocknen Sie den Siliciumwafer durch Stickstoffgas in der Dunstabzugshaube. Die erste Schicht ist fertig.
  4. Fabricate die zweite Schicht auf der ersten Schicht.
    1. Verwenden Sie Klebeband, um die Ausrichtungsmarkierungen auf der ersten Schicht zu bedecken. Setzen Sie den Siliziumwafer vorsichtig mit der ersten Schicht auf das Vakuumfutter des Spinners und legen Sie ein Vakuum an, um den Siliziumwafer zu immobilisieren.
    2. Gießen Sie 3 ml SU-8 2025 Photoresist auf den Silizium-Wafer. Drehen Sie den Siliziumwafer bei 500 U / min für 5 s. Dann drehen bei 2000 U / min für 30S, um eine endgültige Photoresistbeschichtung mit einer Dicke von 60 μm auf dem Siliziumwafer zu erhalten.
    3. Entfernen Sie vorsichtig den Siliziumwafer vom Spinner und übergeben ihn auf eine Kochplatte. Bei 65 ° C für 2 min backen.
    4. Entfernen Sie vorsichtig das Klebeband, um die Ausrichtungsmarkierungen auf der ersten Schicht freizulegen. Legen Sie den Silizium-Wafer auf eine Kochplatte und backen Sie bei 95 ° C für 6 min.
    5. Setzen Sie den Siliziumwafer vorsichtig auf einen Maskenausrichter und stellen Sie die UV-Belichtungszeit auf 18 s ein.
    6. Die Transparenzmaske der zweiten Schicht sorgfältig auf eine transparente Glasplatte mit Klebeband aufbringen.
    7. Setzen Sie die Glasplatte vorsichtig mit der befestigten Maske auf die Ausrichteinrichtung und richten Sie die Maske und die erste Schicht auf dem Siliziumwafer durch die Kreuzungsausrichtungsmarkierungen mit dem Inspektionsmikroskop des Ausrichters aus.
    8. Setzen Sie den mit Photoresist beschichteten Silizium-Wafer auf UV, um die Zellenbelastungs- und Gradientenkanäle zu formen.
    9. Entfernen Sie vorsichtig die Glasplatte und nehmen Sie das Silikon w herausAfer Den Siliciumwafer auf eine Heizplatte bei 65 ° C für 2 min backen und dann den Siliciumwafer auf eine weitere 95 ° C heiße Platte übertragen und 6 min backen.
    10. Übertragen Sie den Silizium-Wafer auf die Dunstabzugshaube und legen Sie ihn in eine Glaspfanne mit dem SU-8-Entwickler. Schütteln Sie das für 6 Minuten vorsichtig.
    11. Reinigen Sie den Silizium-Wafer mit frischem SU-8-Entwickler, gefolgt von IPA in der Dunstabzugshaube.
    12. Trocknen Sie den Siliziumwafer mit Stickstoffgas in der Dunstabzugshaube. Legen Sie den Silizium-Wafer auf eine Kochplatte und hart die Form bei 150 ° C für 30 min; Die zweite Schicht ist bereit.
  5. Masterform Oberflächenmodifikation.
    ANMERKUNG: Ein Silanisierungsoberflächenmodifizierungsschritt wird auf die SU-8-Form angewendet, um die Freisetzung von Polydimethylsiloxan (PDMS) aus der Form in Weichlithographie zu erleichtern.
    1. Nehmen Sie 10 μl Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl (trichlorsilan) -Lösung in einer Mikropipettenspitze. Setzen Sie die Mikropipettenspitze in ein 15 ml Plastikrohr einLd die Kappe des Rohres lösen.
    2. Legen Sie den Schlauch und den SU-8 gemusterten Silizium-Wafer in einen Exsikkator und wenden Sie das Vakuum für 1 h an; Die Maskenform ist bereit für die Herstellung der PDMS-Vorrichtung.
  6. Das PDMS-Gerät herstellen.
    1. Bereiten Sie die PDMS-Lösung vor, indem Sie 40 g PDMS-Base und 4 g Härter in einem Plastikbecher mischen. Legen Sie die vorbereitete SU-8-Maske in eine Petrischale und putzen Sie sorgfältig 44 g PDMS-Lösung auf die Form.
    2. Legen Sie die Petrischale in einen Exsikkator und legen Sie Vakuum an, um die PDMS-Lösung für 20 min zu entgasen. Dann legen Sie die Petrischale in einen Ofen und heilen Sie das PDMS bei 80 ° C für 2 h.
    3. Nach dem Backen nehmen Sie die Petrischale und legen Sie sie auf eine saubere Bank. Die PDMS-Platte vorsichtig aus der SU-8-Form schneiden und abziehen.
    4. Stanzen Sie die Zelle Lade-Port mit einem 3 mm Durchmesser Puncher. Stanzen Sie die chemischen Einlassreservoirs und den Abfallauslass mit einem 6 mm Durchmesser Puncher aus.
    5. Entfernen Sie den Staub auf demOberfläche der PDMS-Platte mit Klebeband. Legen Sie die PDMS-Platte und eine saubere Glasrutsche in die Plasmamaschine. Das Vakuum für 3 min auftragen.
    6. Schalten Sie die Plasmaleistung ein und stellen Sie den Pegel auf HIGH. Das Luftventil vorsichtig einstellen und die PDMS-Platte und die Glasrutsche für 3 min plasmatreatieren.
    7. Schalten Sie die Plasmaleistung aus und lassen Sie das Vakuum los. Nehmen Sie sorgfältig die PDMS-Platte und die Glasrutsche mit Pinzette heraus.
    8. Sofort die PDMS-Platte (mit Kanalstrukturen nach unten) auf die Glasrutsche legen; Drücken Sie vorsichtig die PDMS-Platte, um sie an das Glas zu binden. Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal sofort mit entionisiertem Wasser aus. Die Herstellung und Montage der mikrofluidischen Vorrichtung sind abgeschlossen.

2. Mikrofluidische Zellmigrationsassay-Präparation

  1. Mikrofluidische Vorbereitung.
    1. 50 μg / ml Fibronectinlösung durch Verdünnen von 50 & mgr; l Fibronektinlösung (1 mg / ml) auf 950 vorbereiten81; L Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in einem Biosicherheitsschrank.
    2. Bereiten Sie das Migrationsmedium vor, indem Sie 9 ml Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI-1640) und 1 ml RPMI-1640 mit 4% Rinderserumalbumin (BSA) mischen.
    3. Entfernen Sie das entionisierte Wasser vom Gerät.
    4. 100 μL Fibronectin-Lösung dem Gerät aus dem Auslass zugeben. Warten Sie 3 min, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Fibronectin-Lösung gefüllt sind. Legen Sie das mikrofluidische Gerät 1 h bei Raumtemperatur in eine überzogene Petrischale.
    5. Entfernen Sie die Fibronectin-Lösung aus dem Gerät. 100 μl Migrationsmedium aus der Steckdose geben. Warten Sie 3 min, um sicherzustellen, dass alle Kanäle mit Migrationsmedium gefüllt sind.
    6. Inkubieren Sie das Gerät für weitere 1 h bei Raumtemperatur; Das Gerät ist dann bereit für das Chemotaxis-Experiment.
  2. Chemoattraktante Lösungsvorbereitung für das Chemotaxis-Experiment.
    1. 100 nM fMLP-Lösung in t vorbereitenOtal 1 mL Migrationsmedium. Mischen Sie 5 μl des Bestandes FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) mit der fMLP-Lösung in einem 1,5 ml-Röhrchen.
      HINWEIS: FITC-Dextran wird für die Gradientenmessung verwendet. Alternativ verwenden Sie Rhodamin als Gradientenindikator. Die fMLP-Chemoattraktionslösung ist dann für das Chemotaxis-Experiment bereit.
  3. Sputum Probenvorbereitung.
    ANMERKUNG: Neutrophile Chemotaxis, die durch einen Gradienten der Sputumprobe von COPD-Patienten induziert wurden, wurden als klinisch diagnostische Anwendung dieser All-on-Chip-Methode getestet.
    1. Erhalten Sie ein menschliches Ethikprotokoll, um Sputumproben von COPD-Patienten zu sammeln.
      HINWEIS: Wir erhielten Genehmigungen, um Proben im Seven Oaks General Hospital in Winnipeg zu sammeln (von der University of Manitoba genehmigt).
    2. Erhalten Sie die informierten schriftlichen Zustimmungsformulare aus allen Fächern.
    3. Sammle die spontanen Sputumproben der COPD-Patienten. Legen Sie 500 μL Sputumprobe in ein 1,5 mL Röhrchen.
    4. 500 μl 0,1% di hinzufügenThiothreitol in der 1,5 mL Röhre und sanft mischen. Legen Sie den Schlauch in ein Wasserbad bei 37 ° C für 15 min.
    5. Die Probe bei 753 xg für 10 min zentrifugieren und dann den Überstand sammeln. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 865 xg für 5 min und sammeln Sie dann den Endüberstand. Vor dem Gebrauch den gesammelten Überstand in einem Gefrierschrank von -80 ° C aufbewahren.
    6. Wenn bereit für Chemotaxis-Experiment, tauen die Sputum-Lösung; 25 μl Migrationsmedium in ein 1,5 mL Röhrchen überführen und mit 100 μl Sputumlösung in einem Biosicherheitsschrank mischen; Die Sputumlösung ist dann für das Chemotaxis-Experiment bereit.
  4. Blutprobenentnahme.
    1. Erhalten Sie ein menschliches Ethikprotokoll, um Blutproben von gesunden Spendern zu sammeln. Erhalten Sie die informierten schriftlichen Zustimmungsformulare von allen Blutspendern.
      HINWEIS: Hier wurden Proben im Victoria General Hospital in Winnipeg (genehmigt von der Joint-Faculty Research Ethics Board an der University of Manit)Oba).
    2. Sammle die Blutprobe durch Venenpunktion und stelle die Probe in ein EDTA-beschichtetes Röhrchen. Halten Sie den Schlauch vor dem Experiment in einem Biosicherheitsschrank.

3. All-on-Chip-Chemotaxis-Assay-Betrieb

  1. On-Chip-Zellisolation ( Abbildung 1B ).
    1. Legen Sie 10 μl Vollblut in ein 1,5 mL Röhrchen in einem Biosicherheitsschrank.
      ANMERKUNG: Angaben zur Blutprobenentnahme finden Sie in Abschnitt 2.4.
    2. 2 μl Antikörper-Cocktail (Ab) und 2 μl magnetische Partikel (MP) aus dem Neutrophilen-Isolations-Kit (siehe Tabelle der Materialien) in das 1,5 mL-Röhrchen geben und vorsichtig mischen; Dies markiert Zellen im Blut mit Ausnahme der Neutrophilen.
    3. Inkubieren Sie die Blut-Ab-MP-Mischung für 5 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Dies wird magnetisch markieren die Antikörper markierten Zellen im Blut.
    4. Befestigen Sie zwei kleine Magnetplatten an den beiden Seiten der Zellenbelastung pOrt des Gerätes Aspirieren Sie das Medium aus allen Häfen des Gerätes.
    5. Langsam pipettieren Sie 2 μL Blut-Ab-MP-Mischung in die mikrofluidische Vorrichtung aus dem Zell-Lade-Port.
      ANMERKUNG: Die magnetisch markierten Zellen werden an die Seitenwände der Zellenbeladungsöffnung gefangen, während Neutrophile in die Vorrichtung fließen und an der Zell-Andockstruktur gefangen werden.
    6. Warten Sie einige Minuten, bis genügend Neutrophile am Zell-Docking-Bereich gefangen sind.
  2. Chemotaxis-Assay ( Abbildung 1C ).
    1. Legen Sie die mikrofluidische Vorrichtung auf die temperaturgesteuerte Mikroskopstufe bei 37 ° C.
    2. 100 & mgr; l Chemoattraktionslösung (fMLP oder Sputumlösung) und 100 & mgr; l Migrationsmedium zu ihren bezeichneten Einlassreservoirs unter Verwendung von zwei Pipetten hinzufügen; Dies erzeugt einen chemoattraktanten Gradienten in dem Gradientenkanal durch kontinuierliches laminares strömungsbasiertes chemisches Mischen, das durch einen Druck unterstützt wirdE Ausgleichsstruktur.
      HINWEIS: Details der Sputumsammlung von COPD-Patienten finden Sie in Abschnitt 2.3.
      1. Für das mittlere Kontrollexperiment nur Migrationsmedium zu beiden Einlassreservoirs hinzufügen.
    3. Erfasst das Fluoreszenzbild von FITC-Dextran im Gradientenkanal.
    4. Importieren Sie das Bild auf ImageJ Software mit dem Befehl "Datei | Öffnen".
    5. Messen Sie das Fluoreszenzintensitätsprofil über den Gradientenkanal mit dem Befehl "Analysieren | Plotprofil".
    6. Exportieren Sie die Messdaten in eine Kalkulationstabelle für weitere Plotten.
    7. Inkubieren der Vorrichtung auf dem temperaturgesteuerten Mikroskopstadium oder in einem herkömmlichen Zellkulturinkubator für 15 min.
    8. Bild des Gradientenkanals mit einem 10X-Ziel, um die endgültigen Positionen der Zellen für die Datenanalyse aufzuzeichnen.
    9. Falls erforderlich, notieren Sie die Zellmigration im Gerät durch Zeitraffer-Mikroskopie.

4. Zellmigration DAta Analyse ( Abbildung 1C )

  1. Analysieren Sie den Chemotaxis-Assay, indem Sie den Zellmigrationsabstand von der Docking-Struktur wie unten beschrieben berechnen. Siehe Abbildung 1C .
  2. Importiere das Bild in die NIH ImageJ Software (Version 1.45).
  3. Wählen Sie die Mitte jeder Zelle aus, die in den Gradientenkanal verschoben wurde.
  4. Messen Sie die Koordinaten der ausgewählten Zellen für ihre endgültigen Positionen. Messen Sie die Koordinate eines Punktes am Rand der Docking-Struktur als die erste Referenzposition.
  5. Exportieren Sie die gemessenen Koordinatendaten in eine Tabellenkalkulationssoftware ( zB Excel). Berechnen Sie den Migrationsabstand der Zellen als Differenz zwischen der Endposition einer Zelle und der Anfangsreferenzposition entlang der Gradientenrichtung.
  6. Kalibrieren Sie den Abstand zu einem Mikrometer. Berechnen Sie den Mittelwert und die Abweichung der Migrationsdistanz aller Zellen als Maß für die Chemotaxis.
  7. Vergleichen Sie die MigRation-Abstand in Gegenwart eines chemoattraktanten Gradienten zu dem Medium-Kontrolle-Experiment unter Verwendung des Student's t- test.
  8. Wenn die Zeitrafferbilder der Zellmigration aufgezeichnet werden, können die Zellmigration und die Chemotaxis durch die Zellverfolgungsanalyse weiter analysiert werden.
    HINWEIS: Die Materialien, die für den Aufbau und die Durchführung des All-on-Chip-Chemotaxis-Assays erforderlich sind, sind in der Tabelle der Materialien beschrieben.

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Representative Results

Neutrophile werden aus einem Tropfen Vollblut direkt in der mikrofluidischen Vorrichtung negativ ausgewählt. Die Reinheit der isolierten Neutrophilen wurde durch On-Chip-Giemsa-Färbung verifiziert und die Ergebnisse zeigten die typischen ringförmigen und lobenförmigen Kerne von Neutrophilen ( Abbildung 2A ) 25 . Dies deutet auf eine effektive On-Chip-Neutrophilen-Isolation mit hoher Reinheit aus einem kleinen Volumen von Vollblut hin. Weiterhin kann die Andockstruktur die Zellen neben dem Gradientenkanal effektiv ausrichten, bevor der chemische Gradient angewendet wird ( 2B ) 25 .

Die Gradientenerzeugung basiert auf der kontinuierlichen laminaren Strömungs-chemischen Vermischung, und die Ströme werden durch die Druckdifferenz von den verschiedenen Niveaus der Einlass- und Auslasslösungen angetrieben. Es sind keine externen Pumpen erforderlich. Der chemische gradienT wird innerhalb von wenigen Minuten in der mikrofluidischen Vorrichtung festgestellt, die durch das Fluoreszenzintensitätsprofil von FITC-Dextran über den Gradientenkanal gekennzeichnet ist. Der Gradient ist mindestens 1 h stabil, was genügend Zeit für das aktuelle neutrophile Chemotaxis-Experiment ist ( Abbildung 1C ).

Um die Verwendung der All-on-Chip-Methode für die Zellmigrationsforschung zu demonstrieren, wurde die neutrophile Chemotaxis im Medium allein oder in einem fMLP-Gradienten verglichen. Die Testergebnisse zeigten, dass wenige Zellen im Mittelkontrollexperiment durch den Barrierenkanal krochen. Im Gegensatz dazu haben viele Neutrophile schnell durch den Barrierekanal bewegt und in Richtung des 100 nM fMLP-Gradienten ( Fig. 2B ) 25 gewandert. Der Zellmigrationstest wird quantitativ durch den Migrationsabstand gemessen, der für den fMLP-Gradienten signifikant höher ist als die mittlere Kontrolle ( 25 .

Darüber hinaus wurde das All-on-Chip-Verfahren für potentielle klinische Anwendungen durch Vergleich der Neutrophilen-Migration im Medium allein mit einem Gradienten der Sputumprobe von COPD-Patienten nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten eine starke Zellmigration auf den COPD - Sputum - Gradienten, der durch die signifikant höhere Migrationsdistanz im Vergleich zur Mediumkontrolle quantitativ angezeigt wird ( Abbildung 2B - C ) 25 .

Abbildung 1
Abbildung 1: Darstellung der All-on-Chip-Methode zur neutrophilen Chemotaxisanalyse ( A ) Darstellung der mikrofluidischen Vorrichtung. Das Gerät besteht aus zwei Schichten. Die erste Schicht (4 μm hoch) definiert die celL Docking Barrier Channel, um die Zellen neben dem Gradienten Kanal zu fangen. Die zweite Schicht (60 μm hoch) definiert den Gradientenerzeugungskanal, den Port und den Kanal für die Zellenbeladung, die chemischen Einlassreservoirs und den Abfallauslass. Ausrichtungsmarkierungen sind für die beiden Schichten ausgelegt. Für die zweite Schicht beträgt die Länge und Breite des vorgeschalteten serpentinen Eingangskanals 60 mm bzw. 200 μm; Die Länge und Breite des nachgeschalteten serpentinen Eingangskanals beträgt 6 mm bzw. 280 μm; ( B ) Darstellung der All-on-Chip-Zellisolationsmethode; ( C ) Darstellung des Chemotaxistests Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse vonDie All-on-Chip-Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse 25 . ( A ) Giemsa-Färbebild (mit einem 60X-Objektiv) der All-on-Chip-isolierten Zellen im mikrofluidischen Kanal; ( B ) Vergleich der Zellverteilung in der Mediumkontrolle, einem 100 nM fMLP-Gradienten und einem COPD-Sputum-Gradienten; ( C ) Die gemittelte Zellmigrationsdistanz im Gradientenkanal in der Mittelkontrolle, ein FMLP-Gradient und ein COPD-Sputum-Gradient. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes (SEM) an. * Zeigt p <0,05 aus dem t- test des Studenten an. Die Zahlen wurden aus der Referenz 25 mit Genehmigung von World Scientific Publishing angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In diesem Papier wurde ein detailliertes Protokoll zur direkten Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut, gefolgt von dem Chemotaxis-Test, alle auf einem einzigen mikrofluidischen Chip beschrieben. Diese Methode bietet nützliche Merkmale in ihrer einfachen Bedienung, der negativen Auswahl von hochreinen Neutrophilen, dem schnellen Proben-zu-Ergebnis-Chemotaxistest, den reduzierten Reagenzien und dem Probenverbrauch und der genauen Analyse der Zellmigrationsdaten. Als grobe Schätzung traten mindestens 25% der Neutrophilen aus der eingegebenen Vollblutprobe effektiv in die Docking-Struktur in der Vorrichtung ein und wir fanden, dass die Neutrophilen-Reinheit durch eine On-Chip-Giemsa-Färbung hoch ist.

Diese entwickelte All-on-Chip-Chemotaxis-Analyse-Methode hat großes Potenzial in verschiedenen Zell-Migration Forschung und klinischen Anwendungen. Eine Forschungsapplikation dieser Methode wurde durch Vergleich der neutrophilen Chemotaxis im Medium allein mit einem fMLP-Gradienten nachgewiesen. In ähnlicher Weise kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Neutrophilen-Chemotaxis in COPD spu zu testenTum als Beispiel für die Entwicklung eines zellfunktionellen Biomarkers für die klinische Diagnostik. Mit dieser Methode kann ein Forscher die neutrophile Chemotaxis einfach auf verschiedene Chemoattraktanten einzeln oder in Kombinationen testen. Forscher können auch die neutrophile Chemotaxis auf komplexe chemotaktische Faktoren von Patienten oder Testneutrophilen von erkrankten Patienten auf die potenziell veränderte Chemotaxis-Antwort mit dieser Methode testen. Diese integrierte All-on-Chip-Methode eignet sich besonders für die Durchführung des Tests in Forschung oder klinischen Labors, die keine spezialisierten Zellkultur- und Live-Zell-Bildgebungseinrichtungen haben. Der Test kann leicht von Forschern oder Klinikern nach diesem Protokoll betrieben werden. Für fortgeschrittene Forschungsanwendungen ermöglicht diese Methode die Zeitraffer-Mikroskopie, um einzelne Zellenbewegungen zu verfolgen.

Im Allgemeinen ist diese All-on-Chip-Methode einfach zu bedienen und das Ergebnis ist robust. Mehrere technische Erinnerungen sorgen für ein erfolgreiches Experiment. Erstens, thE PDMS Replik sollte vorsichtig auf das Klassensubstrat während der Plasmabindung gedrückt werden, um eine Beschädigung des sehr dünnen Sperrkanals zu vermeiden. Zweitens kann die Verdampfung des Mediums in der Zellenbeladungsöffnung den chemischen Gradienten stören. Es empfiehlt sich, den Zellbeladungshafen mit einer Siegelzunge während des Chemotaxis-Tests zu bedecken. Drittens sollte die Blutprobe sanft auf das Gerät geladen werden, um einen hohen Druck zu vermeiden, der die Zellen vor dem Chemotaxis-Experiment über den Barrierenkanal schieben kann. Viertens empfiehlt es sich, die Magneten während des Chemotaxis-Assays an den Zellenladeanschluss zu halten, um zu verhindern, dass unerwünschte Zellen in den Kanal gelangen. Alternativ kann ein separates Stück PDMS mit einem Durchgangsloch und die befestigten Magnetplatten an die Zellenbelastungsöffnung der Vorrichtung ausgerichtet sein. In diesem Fall kann der obere PDMS-Teil mit den Magnetplatten und den gefangenen Zellen nach der Zellisolation aus dem Gerät entfernt werden.

Dieses All-on-ChIp-Methode weiterentwickelt werden kann, um ihre derzeitigen Einschränkungen zu überwinden und ihre Funktionalitäten zu verbessern und auszubauen. Zuerst erlaubt das aktuelle Gerät nur einen einzigen Test zu einem Zeitpunkt, wodurch der Durchsatz begrenzt wird. Die Weiterentwicklung des Gerätes mit mehreren parallelen Testeinheiten verbessert die experimentelle Durchsatzanforderung. Zweitens begrenzt der Stromfluss-basierte chemische Gradientengenerator die Gradientenerzeugung in 1D. Die Weiterentwicklung von 2D- oder 3D-fließfreien Gradientengeneratoren wird die physiologischen Gradientenbedingungen besser nachahmen. Drittens kann dieses All-on-Chip-Verfahren neben Neutrophilen auch prinzipiell verwendet werden, um andere weiße Blutkörperchen wie T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen unter Verwendung ähnlicher magnetischer Zellisolationskits zu testen. Es wird wichtig sein zu untersuchen, ob diese Methode effektiv verwendet werden kann, um Blutzellpopulationen bei niedrigerer Frequenz zu testen, und jene Zellen, die On-Chip-Aktivierung und Kultur vor dem Chemotaxis-Test erfordern. Dann ist die All-on-Chip-Zellisolationsmethode caN für weitere Anwendungen weiter ausgebaut werden. Es wurde eine unterschiedliche Barrierenkanaldicke getestet und die Ergebnisse zeigten, dass 3-4 μm für das Neutrophilen-Migrationsexperiment am besten geeignet sind; Das heißt, es hat die un-stimulierten Zellen ausreichend gefangen und die Zellen während der Stimulation durch den Barrierekanal kriechen lassen. Die Absperrkanalabmessung sollte für verschiedene Zelltypen optimiert werden. Schließlich wird dieser integrierte und schnelle Chemotaxis-Test es Forschern ermöglichen, relevante klinische Anwendungen zu erforschen. Um die praktische Prüfung in Kliniken zu ermöglichen, wurde ein tragbares System entwickelt, das die mikrofluidische Vorrichtung, die Temperatur- und Stufensteuerung sowie die Smartphone-basierten optischen Bildgebungs- und Datenanalyse-Module integriert. Zusätzlich zu der COPD-bezogenen Studie, wie in diesem Papier gezeigt, wird die Zellmigration für andere relevante Erkrankungen wie chronische Nierenerkrankung mit diesem All-on-Chip-Verfahren getestet.

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Disclosures

Es gibt keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird teilweise durch Stipendien des Naturwissenschaften und Ingenieurforschungsrates von Kanada (NSERC) und der kanadischen Institute of Health Research (CIHR) unterstützt. Wir danken dem Klinischen Institut für Angewandte Forschung und Ausbildung am Victoria General Hospital in Winnipeg und Seven Oaks General Hospital in Winnipeg für die Verwaltung von klinischen Proben von menschlichen Themen. Wir danken Dr. Hagit Peretz-Soroka für eine hilfreiche Diskussion über die Assay-Operationsstrategien. Wir danken Professor Carolyn Ren und Dr. Xiaoming (Cody) Chen von der University of Waterloo für ihre großzügige Unterstützung im Drehprozess.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

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References

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Immunologie Ausgabe 124 Mikrofluidischer Chip Neutrophil Zellisolation Chemotaxis Blut Mikrofluidik
Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen
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Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y.,… More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

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