Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Метод «все на кристалле» для быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов непосредственно из капли крови

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

В этой статье представлен подробный метод проведения быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов путем интеграции изоляции нейтрофилов на кристалле из цельной крови и теста на хемотаксис на одном микрожидкостном чипе.

Abstract

Нейтрофильная миграция и хемотаксис являются критическими для иммунной системы нашего организма. Микрофлюидные устройства все чаще используются для исследования миграции нейтрофилов и хемотаксиса из-за их преимуществ в визуализации в реальном времени, точного контроля образования градиента концентрации химических веществ и снижения потребления реагентов и проб. В последнее время микрофлюидные исследователи предпринимают все более активные усилия по разработке интегрированных и легко управляемых систем микрофлюидного хемотаксиса непосредственно из цельной крови. В этом направлении был разработан первый метод «все на кристалле» для интеграции магнитной отрицательной очистки нейтрофилов и анализа хемотаксиса с образцами небольших объемов крови. Этот новый метод позволяет быстро провести анализ хемотаксиса нейтрофилов с образцом к результату через 25 мин. В этой статье мы предлагаем подробный метод построения, эксплуатации и анализа данных для этого анализа хемотаксиса на чипе с обсуждением стратегий устранения неисправностей, limiИ будущие направления. Показаны репрезентативные результаты анализа хемотаксиса нейтрофилов, в которых анализируется определенный хемоаттрактант, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) и мокрота у пациента с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с использованием этого метода «все на кристалле». Этот метод применим ко многим исследованиям, связанным с миграцией клеток и клиническим применениям.

Introduction

Хемотаксис, процесс направленной миграции клеток в растворимый градиент концентрации химических веществ, критически участвует во многих биологических процессах, включая иммунный ответ 1 , 2 , 3 , развитие тканей 4 и метастазы рака 5 . Нейтрофилы являются наиболее распространенным подсемейством лейкоцитов и играют решающую роль в обеспечении врожденных функций защиты организма в целом, а также в опосредовании адаптивных иммунных реакций 6 , 7 . Нейтрофилы снабжены высокорегулируемым хемотаксическим механизмом, позволяющим этим подвижным иммунным клеткам реагировать как на хемоаттрактанты, вызванные патогеном ( например, fMLP), так и на хетоаттрактанты хозяина ( например, интерлейкин-8) через хемотаксис 8 . Нейтрофильная миграция и хемотаксис опосредуют различные физиологические проблемыИ такие заболевания, как воспаление и рак 1 , 9 . Таким образом, точная оценка хемотаксиса нейтрофилов является важным функциональным показанием для изучения биологии нейтрофилов и связанных с ними заболеваний.

По сравнению с широко используемыми традиционными методами хемотаксиса ( например, анализ трансмуазы 10 ) микрофлюидные устройства демонстрируют большие перспективы для количественной оценки миграции клеток и хемотаксиса благодаря точно контролируемой генерации химического градиента и миниатюризации 11 , 12 , 13 . В течение последних двух десятилетий или около того были разработаны различные микрожидкостные устройства для изучения хемотаксиса различных типов биологических клеток, особенно нейтрофилов 11 . Значительные усилия были посвящены характеристике миграции нейтрофилов в пространственно-временном комплексе че Которые были сконфигурированы в микрожидкостных устройствах 14 , 15 . Были также разработаны интересные стратегии для изучения направленного принятия решений нейтрофилами с использованием микрожидкостных устройств 16. Помимо исследований, основанных на биологических исследованиях, применение микрожидкостных устройств было расширено для тестирования клинических образцов для оценки состояния 17 , 18 , 19 . Однако использование многих микрожидкостных устройств ограничено специализированными исследовательскими лабораториями и требует длительной изоляции нейтрофилов от большого объема образцов крови. Таким образом, наблюдается растущая тенденция разработки интегрированных микрожидкостных устройств для быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов непосредственно из капли цельной крови 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

В этом направлении был разработан метод «все на кристалле», который объединяет магнитную отрицательную очистку нейтрофилов и последующий анализ хемотаксиса на одном микрожидкостном устройстве 25 . Этот метод «все на кристалле» имеет следующие новые особенности: 1) в отличие от предыдущих стратегий на чипе, которые изолируют нейтрофилы от крови путем адгезионной фиксации клеток или фильтрации на основе клеток 20 , 22 , этот новый метод позволяет Чистота, магнитное разделение нейтрофилов на кристалле от небольших объемов цельной крови, а также измерение хемотаксиса при стимуляции хемоаттрактанта; 2) структура док-станции ячейки позволяет выровнять начальные положения нейтрофилов близко к каналу химического градиента и позволяет провести простой анализ хемотаксиса без одноцелевого отслеживания; 3) интеграция изоляции нейтрофилов и хемотовОсевой анализ на одном микрожидкостном устройстве позволяет проводить быстрый анализ хемотаксиса с результатом до 25 мин, когда нет прерывания между экспериментальными стадиями.

В настоящем документе представлен подробный протокол для метода построения, эксплуатации и анализа данных этого хемотаксиса на основе кристаллов. В статье показано эффективное использование разработанного метода для проведения нейтрофильного хемотаксиса путем тестирования известного рекомбинантного хемоаттрактанта и сложных хемотактических образцов у пациентов, а затем обсуждение стратегий устранения неполадок, ограничений и будущих направлений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы сбора образцов человека были одобрены советом по этике научных исследований в Университете Манитобы, Виннипег.

1. Изготовление микрожидкостного устройства ( рисунок 1А )

  1. Маска прозрачности и печати.
    1. Создайте устройство, как описано ранее 25 . См. Рисунок 1A .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Устройство включает два слоя. Первый слой (максимум 4 мкм) определяет канал барьерного стыковки ячеек для захвата ячеек рядом с каналом градиента. Второй слой (высота 60 мкм) определяет канал генерации градиента, порт и канал для загрузки ячеек, резервуары с химическим входом и выход для отходов. Выравнивающие метки предназначены для двух слоев. Для второго слоя длина и ширина входного канала серпентина вверх по потоку составляют соответственно 60 мм и 200 мкм; Длина и ширина нисходящего потокаСерпентиновый входной канал составляет 6 мм и 280 мкм, соответственно.
    2. Распечатайте свойства первого и второго слоев в маске прозрачности с помощью принтера с высоким разрешением.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Разрешение печати зависит от минимальных возможностей дизайна. В текущем проекте было выбрано 32 000 точек на дюйм для минимальной функции 10 мкм.
  2. Очистите кремниевую пластину.
    1. Поместите 3 в кремниевую пластину в плазменный очиститель. Нанести вакуум в течение 3 мин.
    2. Включите питание плазмы и установите уровень HIGH. Используйте кислородную плазму для обработки кремниевой пластины в течение 30 мин.
    3. Выключите пылесос и выньте кремниевую пластину; Кремниевая пластина готова к изготовлению пресс-формы устройства.
  3. Создайте первый слой с помощью фотолитографии в чистом помещении.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Точные параметры изготовления могут варьироваться в зависимости от производственного объекта.
    1. Разбавляют 10 мл SU-8 2025 с 10 мл SU-8 2000 в стеклянном прерывателе для подготовки спроектированного фоторезиста. Оставьте смесь в вытяжном шкафу в течение 10 минут, пока пузырьки не исчезнут.
    2. Осторожно поместите очищенную кремниевую пластину на счетчике подходящим патроном и примените вакуум для фиксации кремниевой пластины.
    3. Тщательно вылейте 3 мл смеси фоторезиста в центр кремниевой пластины. Спин при 500 об / мин в течение 5 с. Затем вращают со скоростью 3000 об / мин в течение 30 с, чтобы получить окончательное фоторезистивное покрытие толщиной 4 мкм на кремниевой пластине.
    4. Осторожно удалите кремниевую пластину со спиннера и выпекайте кремниевую пластину на конфорке в течение 4 минут при 95 ° C.
    5. Осторожно поместите кремниевую пластину на выравниватель маски и установите время экспозиции UV на 6 с. Аккуратно приложите прозрачную маску первого слоя на прозрачную стеклянную пластину с помощью клейкой ленты.
    6. Аккуратно поместите прозрачную стеклянную пластину с прикрепленной маской на выравниватель и совместите маску с кремниевой пластиной. Выставить siLicon для ультрафиолетового излучения, чтобы создать структуру док-станции.
    7. Осторожно удалите стеклянную пластину и выньте открытую кремниевую пластину. Выпекать кремниевую пластину на конфорке в течение 4 минут при 95 ° C.
    8. Перенесите кремниевую пластину на вытяжной шкаф и поместите его в стеклянный поддон, содержащий устройство SU-8. Аккуратно встряхните это в течение 30 с.
    9. Очистите кремниевую пластину, используя свежий проявитель SU-8 с последующим изопропиловым спиртом (IPA) внутри вытяжного шкафа. Высушите кремниевую пластину газообразным азотом внутри вытяжного шкафа; Первый слой готов.
  4. Создайте второй слой на первом слое.
    1. Используйте клейкую ленту для покрытия меток выравнивания на первом слое. Осторожно поместите кремниевую пластину с первым слоем на вакуумный патрон вращающегося и примените вакуум для иммобилизации кремниевой пластины.
    2. Залейте 3 мл фоторезиста SU-8 2025 на кремниевую пластину. Вращайте кремниевую пластину при 500 об / мин в течение 5 с. Затем вращение при 2000 об / мин для 30С, чтобы получить окончательное фоторезистивное покрытие толщиной 60 мкм на кремниевой пластине.
    3. Аккуратно удалите кремниевую пластину со счетчика и перенесите ее на конфорку; Запекать при 65 ° С в течение 2 мин.
    4. Аккуратно удалите клейкую ленту, чтобы выставить отметки выравнивания на первом слое. Поместите кремниевую пластину на конфорку и запекайте при температуре 95 ° C в течение 6 минут.
    5. Осторожно поместите кремниевую пластину на выравниватель маски и установите время воздействия ультрафиолетового излучения на 18 с.
    6. Осторожно прикрепите прозрачную маску второго слоя на прозрачную стеклянную пластину с помощью клейкой ленты.
    7. Осторожно поместите стеклянную пластину с прикрепленной маской к выравнивателю и выровняйте маску и первый слой на кремниевой пластине с помощью меток пересечения с помощью контрольного микроскопа выравнивателя.
    8. Выставить кремниевую пластину, покрытую фоторезистом, на УФ, чтобы сформировать каналы загрузки ячейки и градиента.
    9. Осторожно удалите стеклянную пластину и выньте кремний wАВЭС. Выпекать кремниевую пластину на конфорке при 65 ° C в течение 2 минут, а затем перенести кремниевую пластину на другую горячую тарелку 95 ° C и выпекать в течение 6 минут.
    10. Перенесите кремниевую пластину в вытяжной шкаф и поместите его в стеклянный поддон, содержащий устройство SU-8. Аккуратно встряхните это в течение 6 мин.
    11. Очистите кремниевую пластину с помощью нового SU-8-детектора, а затем IPA внутри вытяжного шкафа.
    12. Высушите кремниевую пластину, используя газообразный азот внутри вытяжного шкафа. Поместите кремниевую пластину на конфорку и тщательно выпекайте форму при температуре 150 ° C в течение 30 минут; Второй слой готов.
  5. Модификация поверхности пресс-формы.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Стадию модификации поверхности силанизации наносят на форму SU-8, чтобы облегчить выпуск полидиметилсилоксана (PDMS) из формы в мягкой литографии.
    1. Возьмите 10 мкл раствора тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктила (трихлорсилана) в кончике микропипетки. Поместите наконечник микропипетки в 15 мл пластиковую трубку aИ ослабьте колпачок трубки.
    2. Поместите трубку и кремниевую пластину SU-8 в эксикатор и примените вакуум в течение 1 часа; Форма маски готова для изготовления устройства PDMS.
  6. Создайте устройство PDMS.
    1. Подготовьте раствор PDMS путем смешивания 40 г основания PDMS и 4 г отвердителя в пластиковом стакане. Поместите подготовленную основную форму SU-8 в чашку Петри и тщательно вылейте 44 г раствора PDMS на форму.
    2. Поместите чашку Петри в эксикатор и примените вакуум для дегазации раствора PDMS в течение 20 мин. Затем поместите чашку Петри в духовку и вылечите PDMS при 80 ° C в течение 2 часов.
    3. После выпечки выньте чашку Петри и положите ее на чистую скамью. Тщательно отрежьте и очистите плиту PDMS от пресс-формы SU-8.
    4. Удалите порт загрузки ячейки, используя перфоратор диаметром 3 мм. Вытащите химические впускные резервуары и выпускное отверстие для отходов с помощью перфоратор диаметром 6 мм.
    5. Удалите пыль сПоверхность плиты PDMS с использованием липкой ленты. Поместите плиту PDMS и чистый стеклянный предмет в плазменную машину. Нанесите вакуум на 3 мин.
    6. Включите питание плазмы и установите уровень HIGH. Аккуратно отрегулируйте воздушный клапан и плазматируйте плиту PDMS и стеклянную полку в течение 3 мин.
    7. Выключите питание плазмы и выпустите вакуум. Осторожно выньте плиту PDMS и стекло с помощью пинцета.
    8. Немедленно поместите плиту PDMS (с канальными структурами лицевой стороной вниз) поверх стекла; Аккуратно нажмите плиту PDMS, чтобы связать ее со стеклом. Немедленно заполните микрофлюидный канал деионизированной водой; Завершаются изготовление и сборка микрожидкостного устройства.

2. Подготовка к анализу миграции микрофлюидных клеток

  1. Подготовка микрофлюидных устройств.
    1. Подготовьте 50 мкг / мл раствора фибронектина путем разбавления 50 мкл раствора фибронектина (1 мг / мл) до 95081; L забуференный фосфатом физиологический раствор Dulbecco (DPBS) внутри шкафа для биобезопасности.
    2. Подготовьте среду для миграции, смешав 9 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) и 1 мл RPMI-1640 с 4% бычьим сывороточным альбумином (BSA).
    3. Удалите деионизированную воду с устройства.
    4. Добавьте 100 мкл раствора фибронектина к устройству из розетки. Подождите 3 мин, чтобы убедиться, что все каналы заполнены раствором фибронектина. Поместите микрожидкостное устройство в закрытую чашку Петри в течение 1 часа при комнатной температуре.
    5. Удалите раствор фибронектина из устройства. Добавьте 100 мкл среды миграции из розетки. Подождите 3 минуты, чтобы убедиться, что все каналы заполнены миграционным носителем.
    6. Инкубируйте устройство еще 1 час при комнатной температуре; Устройство затем готово к эксперименту по хемотаксису.
  2. Подготовка раствора хемоаттрактанта для эксперимента по хемотаксису.
    1. Подготовьте решение 100 мМ fMLP в tОтальной 1 мл среды миграции. Смешайте 5 мкл FITC-декстрана (10 кДа, 1 мМ) с раствором fMLP в пробирке объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FITC-декстран используется для измерения градиента. Альтернативно, используйте Rhodamine в качестве индикатора градиента. Затем раствор хемоаттрактанта fMLP готов к эксперименту по хемотаксису.
  3. Подготовка образцов мокроты.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Нейтрофильный хемотаксис, индуцированный градиентом образца мокроты у пациентов с ХОБЛ, был протестирован как клиническое диагностическое применение этого метода «все на кристалле».
    1. Получите протокол по этике человека для сбора образцов мокроты у пациентов с ХОБЛ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Мы получили разрешения на сбор образцов в больнице Севен Оукс в Виннипеге (утверждена Университетом Манитобы).
    2. Получите информированные формы письменного согласия от всех предметов.
    3. Соберите образцы спонтанной мокроты пациентов с ХОБЛ. Поместите 500 мкл образца мокроты в пробирку объемом 1,5 мл.
    4. Добавить 500 мкл 0,1% диТиотрейтола в пробирке объемом 1,5 мл и осторожно перемешать. Поместите пробирку в водяную баню при 37 ° C в течение 15 минут.
    5. Центрифугируйте образец при 753 × g в течение 10 минут, а затем собирайте супернатант. Центрифугируют супернатант при 865 × g в течение 5 мин, а затем собирают конечный супернатант. Храните собранный супернатант внутри морозильника -80 ° C перед использованием.
    6. Когда готов к эксперименту по хемотаксису, оттаивайте раствор мокроты; Переносить 900 мкл среды для миграции в трубку объемом 1,5 мл и смешивать с 100 мкл раствора мокроты внутри шкафа для биобезопасности; Раствор мокроты затем готов к эксперименту с хемотаксисом.
  4. Сбор образцов крови.
    1. Получите протокол по этике человека для сбора образцов крови от здоровых доноров. Получите информированные формы письменного согласия от всех доноров крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь образцы были получены в Большом госпитале Виктории в Виннипеге (одобрено Советом по этике научных исследований в Университете МанитаОБА).
    2. Соберите образец крови венепункции и поместите образец в пробирку с ЭДТА. Перед экспериментом держите трубку в шкафу для биобезопасности.

3. Операция по анализу хемотаксиса на чипе

  1. Изоляция на кристалле ( рис. 1B ).
    1. Поместите 10 мкл цельной крови в пробирку объемом 1,5 мл внутри шкафа для биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Подробная информация о сборе образцов крови содержится в разделе 2.4.
    2. Добавьте 2 мкл антитела (Ab) и 2 мкл магнитных частиц (MP) из набора изоляции нейтрофилов (см. Таблицу материалов) в пробирку объемом 1,5 мл и осторожно перемешайте; Это будет обозначать клетки крови, кроме нейтрофилов.
    3. Инкубируйте смесь крови-Ab-MP в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это магнитно маркирует клетки, помеченные антителом в крови.
    4. Присоедините два небольших магнитных диска к двум сторонам загрузки ячейки pOrt устройства. Аспирируйте среду со всех портов устройства.
    5. Медленно пипетируйте 2 мкл смеси крови-Ab-MP в микрожидкостное устройство из порта загрузки ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Магнитно маркированные ячейки захватываются на боковые стенки порта загрузки ячейки, в то время как нейтрофилы будут поступать в устройство и попадать в ловушку в док-структуре ячейки.
    6. Подождите несколько минут, пока достаточное количество нейтрофилов не будет захвачено в зоне стыковки клеток.
  2. Анализ хемотаксиса ( фиг. 1С ).
    1. Поместите микрожидкостное устройство на контролируемую температуру микроскопа при 37 ° C.
    2. Добавьте 100 мкл раствора хемоаттрактанта (раствор fMLP или мокроты) и миграционную среду 100 мкл в их обозначенные входные резервуары с использованием двух пипеток; Это будет генерировать градиент хемоаттрактанта в канале градиента путем непрерывного химического смешения на основе ламинарного потока с помощью давленияБалансирующую структуру.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Детали сбора мокроты у пациентов с ХОБЛ приведены в разделе 2.3.
      1. Для эксперимента управления средой добавьте только миграционную среду в оба входных резервуара.
    3. Получите флуоресцентное изображение FITC-декстрана в канале градиента.
    4. Импортируйте изображение в программное обеспечение ImageJ с помощью команды «Файл | Открыть».
    5. Измерьте профиль интенсивности флуоресценции по каналу градиента, используя команду «Анализ | Профиль участка».
    6. Экспортируйте данные измерений в электронную таблицу для дальнейшего построения графика.
    7. Инкубируйте устройство на стадии микроскопа с контролируемой температурой или в обычном инкубаторе клеточной культуры в течение 15 мин.
    8. Изобразите канал градиента, используя цель 10X, чтобы записать конечные позиции ячеек для анализа данных.
    9. При необходимости регистрируйте миграцию клеток в устройстве с помощью микроскопии с временной задержкой.

4. Миграция клеток DAta Анализ ( рисунок 1C )

  1. Проанализируйте анализ хемотаксиса, вычислив расстояние миграции клеток от стыковочной структуры, как описано ниже. См. Рис. 1C .
  2. Импортируйте изображение в программное обеспечение NIH ImageJ (версия 1.45).
  3. Выберите центр каждой ячейки, который переместился в канал градиента.
  4. Измерьте координаты выбранных ячеек для их конечных позиций. Измерьте координату точки на краю стыковочной структуры в качестве начальной опорной позиции.
  5. Экспортируйте измеренные данные координат в программное обеспечение для работы с электронными таблицами ( например, Excel). Рассчитайте расстояние миграции клеток как разницу между конечным положением ячейки и начальным исходным положением вдоль направления градиента.
  6. Откалибруйте расстояние до микрометра. Вычислите среднее и отклонение расстояния миграции всех клеток в качестве меры хемотаксиса.
  7. Сравните миграциюРации в присутствии градиента хемоаттрактанта к эксперименту контроля среды с использованием t- теста Стьюдента.
  8. Если регистрируются временные изображения миграции клеток, миграция клеток и хемотаксис могут быть дополнительно проанализированы анализом отслеживания клеток 15 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Материалы, необходимые для создания и проведения анализа хемотаксиса на чипе, подробно описаны в таблице материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Нейтрофилы отрицательно выбраны из капли цельной крови непосредственно в микрожидкостное устройство. Чистота изолированных нейтрофилов была подтверждена окрашиванием на кристалле Гимса, и результаты показали типичные кольцеобразные и лопастные ядра нейтрофилов ( рис. 2А ) 25 . Это указывает на эффективную изоляцию нейтрофилов на кристалле при высокой чистоте из небольшого объема цельной крови. Кроме того, стыковочная структура может эффективно выравнивать ячейки рядом с каналом градиента перед применением химического градиента ( рисунок 2B ) 25 .

Генерация градиента основана на непрерывном химическом перемешивании с ламинарным потоком, а потоки приводятся в результате разницы давлений с разных уровней входных и выходных растворов. Никаких внешних насосов не требуется. Химический градиентT устанавливается в течение нескольких минут в микрожидкостном устройстве, которое характеризуется профилем интенсивности флуоресценции FITC-декстрана по каналу градиента. Градиент стабилен в течение по крайней мере 1 ч, что является достаточным временем для текущего эксперимента по хемотаксису нейтрофилов ( рис. 1С ).

Чтобы продемонстрировать использование метода «все на кристалле» для исследования миграции клеток, сравнивали хемотаксис нейтрофилов в среде отдельно или в градиенте fMLP. Результаты испытаний показали, что в эксперименте по контролю среды несколько каналов просканировали через барьерный канал. Напротив, многие нейтрофилы быстро перемещались через барьерный канал и мигрировали к градиенту 100 мМ fMLP ( рис. 2B ) 25 . Тест миграции клеток количественно измеряется расстоянием миграции, которое значительно выше для градиента fMLP, чем контроль среды ( 25 .

Кроме того, метод «все на кристалле» был продемонстрирован для потенциальных клинических применений путем сравнения миграции нейтрофилов в среде только с градиентом образца мокроты у пациентов с ХОБЛ. Результаты показали сильную миграцию клеток на градиент мокроты ХОБЛ, что количественно указано значительно более высоким расстоянием миграции по сравнению с контролем среды ( рисунок 2B- C ) 25 .

Рисунок 1
Рисунок 1: Иллюстрация метода «все на кристалле» для анализа хемотаксиса нейтрофилов. ( A ) Иллюстрация микрожидкостного устройства. Устройство включает два слоя. Первый слой (максимум 4 мкм) определяет cel1, чтобы задержать ячейки рядом с каналом градиента. Второй слой (высота 60 мкм) определяет канал генерации градиента, порт и канал для загрузки ячеек, резервуары с химическим входом и выходное отверстие для отходов. Маркеры выравнивания предназначены для двух слоев. Для второго слоя длина и ширина входного канала серпентина вверх по потоку составляют соответственно 60 мм и 200 мкм; Длина и ширина входного канала зенитного канала ниже по потоку 6 мм и 280 мкм соответственно; ( B ) Иллюстрация метода изоляции клеток на кристалле; ( C ) Иллюстрация теста на хемотаксис. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Представительские результатыАнализ хемотаксиса нейтрофилов на чипе 25 . ( A ) изображение окраски гемзы (с использованием объектива 60X) изолированных на чипе изолированных клеток в микрожидкостном канале; ( B ) Сравнение распределения клеток в контроле среды, градиента 100 мМ fMLP и градиента мокроты COPD; ( C ) Усредненное расстояние миграции клеток в канале градиента в управлении средой, градиент fMLP и градиент мокроты COPD. Шкалы ошибок указывают стандартную ошибку среднего (SEM). * Указывает p <0,05 от t- теста ученика. Данные были адаптированы из ссылки 25 с разрешения World Scientific Publishing. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье был описан подробный протокол для непосредственного выделения нейтрофилов из цельной крови, за которым следует тест хемотаксиса, все на одном микрожидкостном чипе. Этот метод предлагает полезные функции в его простой работе, отрицательный отбор высокочистых нейтрофилов, быстрый анализ хемотаксиса с образцом к результату, уменьшенные реагенты и потребление проб и точный анализ данных миграции клеток. По приблизительной оценке, по крайней мере 25% нейтрофилов из входного образца цельной крови эффективно вошли в структуру стыковки в устройстве, и мы обнаружили, что чистота нейтрофилов высока за счет окрашивания по Гемзе на кристалле.

Этот разработанный метод анализа хемотаксиса на основе кристалла имеет большой потенциал в различных исследованиях миграции клеток и клинических применениях. Исследование этого метода было продемонстрировано путем сравнения хемотаксиса нейтрофилов в среде только с градиентом fMLP. Аналогичным образом, этот метод может быть использован для проверки хемотаксиса нейтрофилов в COPD spuВ качестве примера развития функционального биомаркера клеток для клинического диагноза. С помощью этого метода исследователь может легко протестировать хемотаксис нейтрофилов различным хемоаттрактантам индивидуально или в комбинации. Исследователи также могут тестировать хемотаксис нейтрофилов на сложные хемотаксические факторы у пациентов или тестировать нейтрофилы у больных пациентов с потенциально измененным хемотаксисным ответом с использованием этого метода. Этот интегрированный метод «все на кристалле» особенно полезен для проведения теста в исследовательских или клинических лабораториях, которые не имеют специализированных клеточных культур и средств визуализации живых клеток. Тест может быть легко использован исследователями или клиницистами в соответствии с этим протоколом. Для более продвинутых исследовательских приложений этот метод позволяет проводить временную микроскопию для отслеживания движения отдельных клеток.

В общем, этот метод «все на кристалле» прост в эксплуатации, и результат является надежным. Несколько технических напоминаний дополнительно обеспечат успешный эксперимент. Во-первых,E Реплика ПДМС должна быть мягко прижата к кластерной подложке во время плазменной связи, чтобы не повредить очень тонкий барьерный канал. Во-вторых, испарение среды в порте загрузки ячейки может нарушить химический градиент. Во время теста хемотаксиса рекомендуется закрывать порт для загрузки клеток с помощью уплотнительного язычка. В-третьих, образец крови следует осторожно загружать на устройство, чтобы избежать высокого давления, которое может подтолкнуть клетки к барьерному каналу перед экспериментом хемотаксиса. В-четвертых, в текущей настройке мы рекомендуем держать магниты прикрепленными к порту загрузки ячейки во время анализа хемотаксиса, чтобы предотвратить попадание нежелательных ячеек в канал. Альтернативно, отдельная часть PDMS с сквозным отверстием и прикрепленными магнитными дисками может быть выровнена с портом загрузки ячейки устройства. В этом случае верхняя часть PDMS с магнитными дисками и захваченными ячейками может быть удалена из устройства после выделения клетки.

Это все в одномIp-метод может быть дополнительно разработан для преодоления существующих ограничений и улучшения и расширения его функциональных возможностей. Во-первых, текущее устройство допускает только один анализ за раз, что ограничивает пропускную способность. Дальнейшая разработка устройства с несколькими параллельными тестовыми блоками улучшит требования к экспериментальной пропускной способности. Во-вторых, текущий генератор градиента на основе потока ограничивает генерацию градиента в 1D. Дальнейшая разработка двумерных или трехмерных генераторов градиента без потерь лучше будет имитировать условия физиологического градиента. В-третьих, в дополнение к нейтрофилам этот метод «все на кристалле» в принципе может быть использован для тестирования других типов белых кровяных телец, таких как Т-клетки, В-клетки и NK-клетки, с использованием аналогичных наборов для изоляции магнитных клеток. Будет важно изучить, можно ли эффективно использовать этот метод для тестирования популяций клеток крови на более низкой частоте и тех клеток, которые требуют активации и культивирования на чипе перед проведением теста на хемотаксис. Затем метод изоляции ячейки «все на кристалле» caN дополнительно расширяться для некоторых других приложений. Были испытаны различные толщины барьерного канала, и результаты показали, что 3-4 мкм наиболее подходит для эксперимента по миграции нейтрофилов; То есть он достаточно улавливал не стимулированные клетки и позволял клеткам проходить через барьерный канал при стимуляции. Размер барьерного канала должен быть оптимизирован для разных типов ячеек. Наконец, этот комплексный и быстрый хемотаксис-тест позволит исследователям исследовать соответствующие клинические применения. Для обеспечения практического тестирования в клиниках была разработана портативная система, которая объединяет микрожидкостное устройство, температуру и контроль ступени, а также модули оптического изображения и анализа данных на основе смартфонов. В дополнение к исследованию, связанному с ХОБЛ, как показано в этом документе, миграция клеток для других соответствующих заболеваний, таких как хроническое заболевание почек, тестируется с использованием этого метода «все на кристалле».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов не раскрывается.

Acknowledgments

Эта работа частично поддерживается грантами из Совета по исследованиям естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC) и Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR). Мы благодарим Клинический институт прикладных исследований и образования в Большом госпитале Виктории в Виннипеге и Госпитале Семь Оукс в Виннипеге для управления клиническими образцами от людей. Мы благодарим доктора Хагита Переца-Сороку за полезную дискуссию о стратегиях операции анализа. Мы благодарим профессора Каролин Рен и доктора Сяоминя (Коди) Чена из Университета Ватерлоо за их щедрую поддержку в процессе съемок.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

Tags

Иммунология выпуск 124 микрожидкостный чип нейтрофил изоляция клеток хемотаксис кровь микрофлюиды
Метод «все на кристалле» для быстрого анализа хемотаксиса нейтрофилов непосредственно из капли крови
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y.,… More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter