Summary
Helecelleoptagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggør måling af spontane mørke humper, kvantebumps, makroskopiske responser til lys og aktuelle spændingsforhold under forskellige forhold. I kombination med D. melanogaster genetiske manipulationsværktøjer muliggør denne metode undersøgelsen af den allestedsnærværende inositol-lipid-signalvej og dens mål, TRP-kanalen.
Abstract
Hele celle spænding clamp optagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret området for invertebrat visuel transduktion, hvilket muliggør brugen af D. melanogaster molekylær genetik til at studere inositol-lipid signalering og transient receptor receptor potentielle (TRP) kanaler på single-molekylen niveau. En håndfuld laboratorier har mestret denne kraftfulde teknik, som gør det muligt at analysere de fysiologiske reaktioner på lys under højt kontrollerede forhold. Denne teknik tillader kontrol over det intracellulære og ekstracellulære medium; Membranspændingen; Og hurtig anvendelse af farmakologiske forbindelser, såsom en række ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et usædvanligt højt signal-til-støjforhold gør denne metode det muligt at måle mørke spontane og lysinducerede enhedsstrømme ( dvs. spontane og quantum humle) og makroskopiske lysinducerede strømme (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokol beskriver detaljeret alle de vigtigste trin, der er nødvendige for at udføre denne teknik, som omfatter både elektrofysiologiske og optiske optagelser. Flyvehindehindefordelingsproceduren til opnåelse af intakt og levedygtig ex vivo- isoleret ommatidia i badekammeret er beskrevet. Det udstyr, der er nødvendigt for at udføre helcelle- og fluorescensbilledmålinger, er også detaljerede. Endelig forklares faldgruberne ved brug af dette delikate præparat under udvidede eksperimenter.
Introduction
Omfattende genetiske undersøgelser af frugtflyve , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , der blev indledt for mere end 100 år siden, har etableret D. melanogaster- flyve som en yderst nyttig eksperimentel model til genetisk dissektion af komplekse biologiske processer. Den nedenfor beskrevne metode kombinerer den akkumulerede effekt af D. melanogaster molekylær genetik med det høje signal-til-støjforhold for fuldcelle patch clamp-optagelser. Denne kombination muliggør undersøgelsen af D. melanogaster- fototransduktion som en model for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering både i det oprindelige miljø og ved den højeste opløsning af enkeltmolekyler.
Anvendelse af helcelleoptagelsesmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret undersøgelsen af invertebratfototransduktion. Denne metode blev udviklet af Hardie 1 og indepEndelig af Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden og var designet til at udnytte de omfattende genetiske manipulationsværktøjer af D. melanogaster og bruge dem til at afdække mekanismer for fototransduktion og inositol-lipid signalering. I starten led denne teknik af en hurtig reduktion i lysfølsomhed og et lavt udbytte af ommatidier under dissektionsprocessen, hvilket forhindrede detaljerede kvantitative undersøgelser. Senere øgede tilsætningen af ATP og NAD til patchpipetten dramatisk hæftelsen af præparatet til længerevarende kvantitative optagelser. Derefter blev omfattende karakterisering af signaltransduktionsmekanismen på molekylniveau realiseret.
I øjeblikket er D. melanogaster- fototransduktion et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekylopløsning. Dette gør D. melanogaster fototransduktion og migThodology udviklet til at studere denne mekanisme et meget følsomt modelsystem. Denne protokol beskriver, hvordan man dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerede ommatidia fra de omgivende pigment (glia) celler. Dette muliggør dannelsen af en giga-tætning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrænset til rhabdomere og diffunderer ikke. Derudover er der en immobil Ca 2+ buffer kaldet calphotin, der er placeret mellem signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et højt ekspressionsniveau for Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen giver proteinindeslutning til rhabdomeren, calphotin-bufferen og den høje ekspression af CalX mulighed for relativt langvarig ( dvs. op til ~ 20 min) helcelleoptagelser uden tab af væsentlige komponenterAf fototransduktionsprocessen og samtidig opretholde høj følsomhed over for lys. Den følgende protokol beskriver, hvordan man får isoleret ommatidia og udfører helcelleoptagelser, der synes at bevare fototransduktionskaskadens native egenskaber. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissocieret kakerlak ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia blev udført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . Desuden blev patch clamp eksperimenter på dissocierede fotoreceptorer af filen clam, ( Lima scabra ) og jakobsmuslinger ( Pecten irradians ) udført på en lidt anden måde end den, der blev udført på D. melanogaster , hvilket tillader både helcelle 8 og enkeltkanal målinger 9 . Her beskrives de vigtigste resultater opnået i D. melanogaster under anvendelse af denne teknik. Diskussionen iHerunder beskrivelse af nogle faldgruber og begrænsninger af denne teknik.
Protocol
1. Reagensfremstilling
BEMÆRK: Forbered alle løsninger i overensstemmelse med instruktionerne i tabel 1-4 .
- Fyld en 10 ml sprøjte med ekstracellulær opløsning (ES eller ES-0Ca 2+ , efter behov, se tabel 1 ) og opbevar den på is.
- Forbered et hætteglas med triturationsopløsning (TS, se tabel 2 , dvs. ES eller ES-0Ca 2+ + FBS og saccharose) og opbevar dette på is.
- Forbered tilstrækkeligt ES til eksperimentet, og hold det på is indtil det er nødvendigt.
BEMÆRK: Kontinuerlig badperfusion er ikke nødvendig, så mængden af ES behøver ikke være mere end et par dusin ml. - Ved anvendelse af et 22 μm PVDF-filter skal den intracellulære opløsning (se tabel 3 eller tabel 4 ) indsættes i en 1 ml sprøjte med en elektrodfyldning aflænget spids. Opbevar dette på is.
2. Generel opsætning af Dissecting Tools
Figur 1: Værktøjer og enheder, der er nødvendige for at gøre den isolerede Ommatidia-forberedelse. Billederne viser de forskellige enheder, der kræves til at skabe det isolerede ommatidia-præparat, som beskrevet i den detaljerede protokol ovenfor. To bægerstykker, en fyldt med vand ( A ) og den anden fyldt med ethanol ( B ) til rengøring af triturationspipetterne ( D ), der er forbundet med slangen ( C ). Dissektionsværktøjerne er: 2 par fine og 1 par grove pincet ( F ) og en nethinden scooper ( E ). For at forberede retina scooper presses en mikrotissionsnål ( H ) mellem to drejeværktøjer, der virker som en skrue ( G ) for at flette toppen af nålen ( I ). Så er det forbundet med en langstrakt pi Ece af metal ved hjælp af lim ( J ) og monteret på en nåleholder ( E ). Razor blade chip og holder: Afbryd og monter en lille trekantet chip af et barberblad med en knivholder ( K ). Dissektionsarbejdsområdet er sammensat af en kikkert ( L ) og en kølig rød lyskilde (( M) ) med to lyskaster ( N ). Disseksionsværktøjerne, herunder pincett ( F ), nethinden scooper ( E ), bæger ( A og B ), en lommelygte med et rødt filter ( Q ) og delikate viskere ( R ) er anbragt på begge sider af kikkerten. En isspand med ES, FBS-ES, intracellulære opløsningssprøjter, 60 mm petriskålen ( S ) og elektrodeholderen ( P ) er også anbragt på bordet. Optagelektroderne trækkes ved hjælp af en vandret træk ( T ).E.com/files/ftp_upload/55627/55627fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
- Konstruer en retina scooper for at isolere retinae.
- Indsæt punktet (1-4 mm) af en mikrotissionsnål (entomologisk nål, 12 mm længde, 0,1 mm diameter) mellem de to skruer og flad den ved at tappe med en lille hammer.
- Monter den udfladte nål på en mikrodisksnålholder (se Materialebordet ).
- Ved hjælp af et par pincet buer du den nipede ende af nålen for at danne en krog med en krumning på ~ 2,5 mm.
- Opret trituration pipetter til ommatidia adskillelse.
- Placer en glasplade på 1,2 x 0,68 mm (OD x ID) over en åben flamme og brand poler for at reducere åbningen.
- Mål kapillærens åbning under et mikroskop. Sorter de dannede ommatidiale trituration pipetter i seveN grupper efter størrelsen af deres åbninger ( dvs. 0,2-0,5 mm). Opbevar dem i separate egnede beholdere ( f.eks. Reagensglas).
- Fyld et lille bægerglas med dobbeltdestilleret vand (DDW) og et andet lille bæger med ethanol 70%. Dæk hvert bægerglas med et parafinfilmark.
- Stans et lille hul i paraffinfilmpladen, der dækker DDW-bægeret (se figur 1A ).
- Punch syv små huller i paraffinfilmarket, der dækker ethanolbægeret og nummer hullerne fra 0 til 6 (se figur 1B ).
- Placer en ommatidisk triturationspipette fra hver størrelsesgruppe i hvert parafinfilmhul, således at pipetten med den største åbning er placeret i 0 hullet, og pipetten med den mindste åbning er placeret i det 6. hul.
- Tilslut en 200 μL pipettespids af plast til en 35 cm lang, 1,57 x 1,14 mm (OD x ID) stykke polyethylenrør. forbinT den anden ende af slangen til en af de ommatidiale triturationspipetter med den største åbning ( dvs. 0,46-0,5 mm), hvilket sikrer, at den spidsede ende af triturationspipetten ikke vender ind i slangen.
- Klargør pipetter med hele celleoptagelsen ved at trække patch clamp pipetter fra et 1 x 0,58 mm (OD x ID) borosilicatfilament indeholdende glaskapillærer.
BEMÆRK: Modstanden af pipetterne skal være 8-15 MΩ, når der anvendes kaliumgluconatbaseret intracellulær opløsning (IS1). Enhver egnet patchpipetteafspiller kan bruges (for eksempel se Materialebordet ). Brandpolering er ikke nødvendig. - Klargør et optagekammer (se figur 2 ) ved at fastgøre et dækslip (se Materialetabellen ) til bunden af badekammeret ved brug af smeltet paraffin eller højvakuum siliconefedt . Brug ethvert egnet hjemmelavet eller kommercielt kammer, der tillader elektrodadgang og perfusion.
- Monter badet på scenen af et inverteret mikroskop. Placer perfusionssystemrøret, sugesystemet og jorden ( dvs. Ag-AgCl wire / pellet) i badet (se Materialebordet og Figur 2 ).
- Placer to par fine # 5 pincet ( figur 1 ) på arbejdsfladen til brug under retina dissektion og ommatidia isoleringstrin.
3. D. melanogasterbearbejdning
- Hæve D. Melanogaster flyver med en lav befolkningstæthed ( dvs. ~ 20 flyver i en 6 oz flaske) i flasker indeholdende standard majsmelmad ved 19-24 ° C.
BEMÆRK: Det er at foretrække at arbejde på mørk-tilpassede fluer. For at opretholde høj følsomhed over for lys reducere mangfoldigheden og forhindre retinal degeneration i mutant fluer. - Bag flyene i mørket i mindst 24 timer før forsøget.
BEMÆRK: De fluer, der anvendes til forsøgene, skal være receNtly eclosed (<2 h) og stadig blød, bleg og vise meconium. Ommatidia kan også let fremstilles fra pupper, selvom deres følsomhed over for lys er så kraftigt afhængig af alderen 10 .
4. Retina Dissektion og Ommatidia Isolation: Mulighed 1
BEMÆRK: Udfør alle de følgende trin under stereoskopisk zoommikroskop ved hjælp af en forstærkning, som er egnet til korrekt visning af præparatet (se figur 1 ).
- Anbring fire dråber ES-0Ca 2+ og en dråbe TS-løsning på en 60 mm petriskål, der er blevet vendt.
- Ved hjælp af grove pincet, fange en nyligt lukket (<2 h efter eclosion) flyve med sine vinger eller krop. Fra dette tidspunkt skal du udføre alle procedurer hurtigt og under svagt rød belysning ved 20 ± 1 ° C.
- Mens du stadig tager fat i fluen med de grove pincet, skal du bruge det første par fine pincet til at løsne flyvehovedet fra kroppen. SubmeRge hovedet i den første ES-0Ca 2+ dråbe.
- Dissect hovedet halvt langs sagittalplanet ved hjælp af det andet par fine pincet. Sørg for, at begge øjne i slutningen af dette trin stadig er intakte.
- Overfør den ene halvdel af hovedet til den anden ES-0Ca 2+ dråbe og den anden halvdel til den tredje ES-0Ca 2+ dråbe.
- Brug den fine pincet, fjern så meget af vævet, der omgiver øjet som muligt, og sørg for, at der ikke sker skade på nethinden.
- Tag fat i kanten af en hornhinde med de fine pincet og skub ud nethinden med scooperen.
BEMÆRK: Efter afslutningen af dette trin vil hornhinden blive efterladt tom og intakt, adskilt fra et intakt nethinden. - Skyl triturationspipetten tilsluttet slangen med DDW og fyld pipetten med en lille mængde ES-0Ca 2+ fra den fjerde dråbe.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres hver gang en ny ommatidia-separerende pipette anvendes og fjernes fraM ethanolbægeret (opløsningen fylder pipetten skal svare til den opløsning, hvor nethinden er nedsænket). - Forsigtigt aspirere gennem munden for at trække det isolerede nethinden ind i pipetten. Brug ekstrem forsigtighed for ikke at strække luftbobler ind i pipetten.
- Overfør det isolerede nethinden til dråben af TS. Udfør også trin 4.6-4.10 på det andet øje.
- Tør dråberne af ES-0Ca 2+ væk ved hjælp af sarte vådeservietter, og lad kun dråben af TS indeholde begge retinae på petriskålen. Tilsæt seks flere dråber TS til toppen af Petri-skålen. Overfør begge retinas til en af de andre TS-dråber.
- Udskift triturationspipetten med en pipette med en åbning med mindre diameter. Skyl det som beskrevet i trin 4.8, ved brug af TS som opløsning til at fylde pipetten.
- Sug og gentag hurtig og gentagne gange begge retinae i opløsningen for at begynde adskillelsen af isolerede ommatidier, der er strippet af pigmentceller fra hele nethinden.
BEMÆRK: Den isolerede ommaTidia er synlige i TS-dråben, og efterhånden som isoleringsprocessen skrider frem, bliver TS-dråben mindre gennemskinnelig. - Overfør den resterende retinae til næste TS drop. Fyld pipetten med hele den tidligere TS-dråbe (indeholdende den isolerede ommatidia) og udløb dråben ind i badekammeret.
- Gentag trin 4.12-4.14 for at opnå maksimal isoleret ommatidia. Vent ca. 1 min for at lade den isolerede ommatidia synke og binde til bunden af badekammeret.
- Ved hjælp af perfusionssystemet starter strømmen af ES-0Ca 2+ med 1,5 mM Ca 2+ i badekammeret. Sørg for, at kammeret er fuldstændigt fyldt med opløsningen, fra bund til top, og at jorden er helt nedsænket i opløsningen. Fortsæt med at vaske badet 4-5x.
5. Retina Dissektion og Ommatidia Isolation: Mulighed 2
Bemærk: Udfør alle de følgende trin under det stereoskopiske zoommikroskop ved hjælp af en ampliFication egnet til korrekt visning af præparatet (se figur 1 ).
- Forbered et knivskarv og holder. Afbryd og monter en lille triangulær chip af et barberblad ved hjælp af en barberbladholder ( figur 1 ).
- Forbered en silikondisseksionsskål / blok i henhold til producentens anvisninger (se materialebordet ).
- Til dissektionen fremstilles en stor dråbe (<0,5 ml) ES-opløsning på siliconedissektionsklokken. Tilsæt to "reservoir" dråber (~ 50 μL hver) af TS-opløsningen til en 60 mm petriskål
- Immobiliser en nyligt lukket (<2 h efter-eclosion) flyve i et glasrør på is og tag det op af sine vinger ved hjælp af pincet. Fra dette tidspunkt skal du udføre alle procedurer hurtigt og under svagt rød belysning ved 20 ± 1 ° C.
- Hold flyve med pincet, afskær flyvehovedet ved hjælp af et knivbladet chip monteret i en holder. Pick up en insektstiften (12 mm lang,0,1 mm i diameter) med pincet og pierce hovedet mellem øjnene.
- Neddyb kortfattet hovedet i 70% ethanol; Dette forhindrer dannelsen af luftbobler på hoved- / øjenfladen. Pin hovedet under ES-dråbet på silicone dissektionsskålen.
- Afskær begge øjne ved hjælp af knivbladets chip ved at bruge en savbevægelse langs linjen på øjets frontmargin.
- Tag fat i kanten af en hornhinde med de fine pincet.
- Skru ud nethinden med scooperen.
BEMÆRK: Efter afslutningen af dette trin vil hornhinden blive efterladt tom og intakt, adskilt fra et intakt nethinden. - Uden at beskadige nethinden, brug pincet og scooper til forsigtigt at fjerne vedhæftede luftsække og overskydende hjernevæv.
BEMÆRK: Fremstillingen af isolerede retinae er også nyttig til Western blot-analyser af ikke-specifikke retinae-proteiner 11 , helmonteret histologi og hel-retina-billeddannelse. Patch clamp optagelser kan også udføres på phOtoreceptorer fra hele nethinden 12 . - Tag triturationspipetten med den største diameter, forbind den til slangen og fyld pipetten med en lille smule TS fra et af reservoirdråberne i petriskålen ved forsigtig sugning ( dvs. ved munden). Udfør dette trin hver gang en ny ommatidia trituration pipette anvendes.
- Blæs forsigtigt TS'en over de to retinae med munden, og træk den isolerede retinae ind i pipetten vha. Mild sugning. Vær forsigtig for at sikre, at ingen luftbobler kommer ind i pipetten.
- Overfør den isolerede retinae til petriskålen, danner en lille dråbe (~ 20 μL) og vask dem en eller to gange med TS fra et af reservoirdråberne.
- Inkuber retinae i mørke i 20-25 minutter.
- Udskift ommatidia trituration pipetten med en pipette med en åbning med mindre diameter (ved hjælp af frisk TS fra en af reservoirdråberne som i trin 4.6 for at fylde pipetten igen).
- hurtigtAspirere og udløb begge retinae i en lille dråbe (~ 20 μL) for at starte separationen af den isolerede ommatidia.
BEMÆRK: I den første fase skal den omgivende pigmenterede glia desintegreres, hvilket efterlader synlige små affald i opløsningen. - Efter at der er oparbejdet betydelige små affaldsmængder, men før mange ommatidier er adskilt, skal du bruge frisk TS fra en af reservoirdråberne og overføre retinae til en ny lille dråbe.
- Vælg en tritureringspipette med mindre diameter, genopfyldning, og fortsæt med at triturere.
BEMÆRK: Da ommatidia nu begynder at adskille, skal deres langstrakte former tydeligt ses under stereomikroskopets højeffekt. Om nødvendigt skal du fortsætte med at ændre triturationspipetterne til mindre diametre, indtil et godt udbytte af ommatidia er synligt - Når et rimeligt udbytte af ommatidia er synligt, og dråben ikke længere er gennemskinnelig, fyld pipetten med hele dråben indeholdende den isolerede ommatidia og udløs forsigtigt dropen ind iBunden af badekammeret forfyldt med ES.
- Vent ca. 1 min for at lade den isolerede ommatidia synke og slå sig ned på badkammerets bund.
- Brug perfusionssystemet, start strømmen af ES i badkammeret. Sørg for, at kammeret er helt fyldt med opløsningen, fra bunden til toppen, og at jorden er helt nedsænket i opløsningen. Fortsæt med at vaske badet 4-5x.
BEMÆRK: Derefter kræves der ikke kontinuerlig perfusion, selvom badet skal skylles kort, inden der indføres en ny patchpipette.
6. Whole-Cell Recording
Figur 2: Oversigt over den elektrofysiologiske og optiske opsætning. Opsætningen indeholder en jern, sortmalet Faraday bur ( F ). Forsiden er dækket ved hjælp af et sort gardin med kobbernet inde. Denne konfigurationUration gør det muligt for præparatet at være fuldstændig forseglet fra ethvert stray lys og er egnet til optagelse af mørke spontane bump. Det inverterede fluorescensmikroskop ( A ) er fastgjort til en anti-vibrationsbord ( E ). Fotoreceptoroptagelsesapparatet består af et hjemmelavet akrylglasbadkammer ( O ) med en perfusionsindgang ( Q ), en sugepipette ( S ) og et sølv-sølvchloridbund ( P ). Badekammeret er monteret på mikroskopfasen ( T ) med en hjemmelavet adapter. Optagelsespipetten er forbundet via sølv-sølvkloridråd til en akrylglasholder, der er forbundet til forstærkerhovedet ( C ). Hovedfasen monteres derefter på en grov mikromanipulator, der er monteret på en fin XYZ mekanisk mikromanipulator ( B ). Perfusionssystemet ( D ) består af et sprøjtesæt, mens strømmen af væskeD styres af klemventiler ( H ). Stativet er elektrisk forbundet med samme centrale grund, som alt udstyr i Faraday-buret er forbundet med og består af en patch-klemforstærker ( N ), et oscilloskop ( J ), en puls / funktionsgenerator ( K ), en A til D-konverter ( L ), en perfusionskontrol ( I ) og et filterhjul og lukkerkontrolenhed ( M ). Til billeddannelsesforsøg er en afkølet (-110 ° C, se materialetabellen ) CCD-kameraet forbundet via en sideport ( G ). Klik her for at se en større version af denne figur.
BEMÆRK: Under alle de følgende trin må du kun bruge lysdæmpning med rødt lys og sikre, at ommatidiens eksponering for lys er minimal ( dvs. arbejde hurtigt ogSluk dissekeringslyskilden og kammerrød belysning, der anvendes til visning af ommatidia, når du udfører opgaver, der ikke kræver at se ommatidiumet). Udfør desuden alle de følgende trin i overensstemmelse med standard elektrofysiologisk protokol.
- Under et inverteret mikroskop (40X objektiv) skal du omhyggeligt inspicere alle ommatidierne i badet og vælge et passende ommatidium til eksperimentet.
- Sørg for, at ommatidiumets ydre membran er glat og intakt, at længdeaksen er ca. i en ret vinkel i forhold til elektrodeangivelsesretningen (som vist i figur 3A ), og at ommatidiumets distale del ikke er omgivet af nogen Overskydende væv. Placer det valgte ommatidium på objektivlinsens optiske akse (i midten af synsfeltet) for at sikre ensartet belysning.
- Fyld en patchpipette med intracellulær opløsning (IS1 eller IS2).
BEMÆRK: Til migSikker på intensitets respons og bump analyse, brug IS1. For at måle reverseringspotentialet for de lysfølsomme kanaler skal du bruge IS2. - Monter patchpipetten på elektrodeholderen.
- Blæs ind i pipetten med munden, gennem røret, der er forbundet med elektrodeholderen, hvilket får det til at fylde med positivt tryk. Luk rørventilen for at opretholde trykket.
- Ved hjælp af micromanipulatoren indsættes elektroden i badkammeret.
- Styr elektroden tæt på ommatidiumets distale del, således at der ikke er nogen kontakt mellem elektroden og ommatidiumet, indtil en lille dæmpning (på grund af det positive tryk i patchpipetten) kan observeres i ommatidiumet.
- Åbn optagelsessoftwaren (se materialetabellen ). Åbn "membrantestmodulet" for at anvende kontinuerlige firkantespændingsimpulser på 2 mV ved en hastighed på 100 Hz.
- Indstil krydspotentialet til "nul" ved at justere den relevante knoB i patch clamp forstærkeren for at indstille bunden af kvadratpulsen til "nul" strøm
BEMÆRK: Den elektrofysiologiske opsætning omfatter et hovedtrin ( dvs. forstærkning i første trin) forbundet til en forstærker ( dvs. forstærkning i anden etape). Det forstærkede analoge signal konverteres til et digitalt signal ved hjælp af A / D-konverteren, som styres af software installeret på en pc-computer. - Slip det positive tryk i pipetten ved at åbne ventilen på røret, der er forbundet med elektrodeholderen. Lav forsigtigt negativt tryk i pipetten ved at sutte ud af røret, hvilket fører til forbindelsen af pipetten til cellemembranen. Luk rørventilen for at opretholde trykket.
- Sørg for, at elektrodemodstanden på computerskærmen er forhøjet til 100 - 150 MΩ. Slip det negative tryk i pipetten ved manuelt at åbne ventilen på røret, der er forbundet med elektrodeholderen.
- Sørg for, at elEctrode modstand er forhøjet til mindst 1-2 GΩ.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er der dannet en tætning mellem elektroden og fotoreceptoren. - Udligner pipettens kapacitive strømninger ved at justere den passende knap i patch-klemforstærkeren.
- Opret hurtige, korte og kraftfulde udfald af negativt tryk i elektroden, der suger munden ud af røret, der er forbundet til elektrodeholderen, for at "bryde" ind i fotoreceptormembranen og skabe en helcellekonfiguration. Alternativt kan du bruge "Zap-knappen" til at anvende korte rektangulære elektriske impulser, der begynder med en varighed på "0,1 ms" eller anvende en kombination af begge metoder.
BEMÆRK: Generationen af helcellekonfigurationen afsløres ved en pludselig stigning i pipetekapacitansen (typisk ~ 60 pF for en wildtype R1-6 fotoreceptor; en kapacitans på kun ~ 20 pF indikerer en optagelse fra en R7 fotoreceptor, en kapacitans over ~ 90 pF indikerer en optagelse fra tofotoreceptorer). - Indstil fotoreceptorens holdpotentiale til den nødvendige spænding (normalt -70 mV) manuelt ved hjælp af den passende knap i patch-klemforstærkeren.
BEMÆRK: Det er muligt at udføre dette trin, efter at der er opnået en segl (trin 6.11), og før hele cellekonfigurationen er opnået. - Forskyd den kapacitive strøm og serieresistens (en målt serieresistensværdi større end 25 MΩ indikerer, at elektrodipipeten er tilstoppet) og, hvis det er nødvendigt ( dvs. for større strømme), anvende seriemodstandsudligning ved hjælp af de relevante knapper i patchklemforstærkeren .
- Luk Faraday burets sorte frontgardin for at opnå maksimal mørkhed og elektrisk isolering.
- Start optagelsesprocessen ved hjælp af softwaren og administrer lysstimuli og / eller farmakologiske stoffer i overensstemmelse med den ønskede forsøgsprocedure.
7. Samtidig WhOle-celleoptagelser og Ca 2+ -billeddannelse
- For genetisk kodede Ca 2+ indikatorer isolerer ommatidia som beskrevet ovenfor under anvendelse af D. melanogaster fluer, der udtrykker GCaMP6f 13 . Brug et CCD-kamera (se Materialebordet ) til fluorescensmåling og sørg for at mikroskopet er udstyret med passende excitations- og emissionsfiltre og et dikroisk spejl (se Materialetabellen ) 4 .
- Til brug af eksogen Ca 2+ indikator ( Figur 4 , se Materialetabellen ) isolerer ommatidia som beskrevet ovenfor. Sørg desuden for, at pipetteopløsningen indeholder en calciumindikator på 20-100 μM.
- Brug billedbehandlingssoftwaren (se Materialetabellen ) til at erhverve billeder med en hastighed på 40 Hz. Udfør billedoptagelse i løbet af en 10 s mørk periode efterfulgt af en intens 2 s lys-stilering.
- Brug billedbehandling software og definere en region af interesse (ROI). Mål florescensintensiteten i ROI. Gennemsnit den mørke fluorescens (F D ) og subtrahere den fra fluorescensoptagelserne under lys (F L ) stimulering (F L- F D ). Normaliser disse målinger i overensstemmelse med fluorescensintensiteten ved begyndelsen af lysstimuleringen (F L 0 ).
Representative Results
Den beskrevne metode har muliggjort den nøjagtige registrering af de grundlæggende enhedsstrømme, som genererer spontane og lysfremkaldte kvantebumps, som summen producerer det makroskopiske respons på lys under definerede betingelser. Det tillod ligeledes sammenligningen mellem vildtype og mutant fluer, der har defekter i kritiske signalmolekyler ( figur 3 og 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Desuden afslørede evnen til at måle reverseringspotentiale under bi-ioniske forhold de grundlæggende biofysiske egenskaber af TRP- og TRP-lignende (TRPL) kanalerne 18 , 19 . Det muliggjorde også måling af virkningerne af aminosyresubstitutioner i poreområdet af TRP, der modificerede dets Ca 2+Permeabilitet 20 .
Det lysrespons, der opnås ved hjælp af patchclamp-helcelleoptagelser afhænger lineært af lysintensiteten i mindst 4 størrelsesordener. Dette kunne ikke løses ved hjælp af ERG og intracellulære optagelsesmetoder. Følgelig afslørede en serie af reaktioner på korte blinkninger med stigende intensitet og en plot af intensitetsresponsfunktionen en streng linearitet af flashresponset med stigende lysintensitet. Den strenge linearitet varer op til mindst flere hundrede pA, men det er diskutabelt, om det derefter er linearitet eller klemkontrol, der bryder sammen ( figur 6 ). Disse resultater tyder på, at de makroskopiske responser på lys er en lineær opsummering af de ensartede responser til lys ( dvs. kvantumstød).
Det har været veletableret ved brug af spændingsoptagelser, som dæmper lysstimulering indUces diskrete spændingsudsving ( dvs. kvantebump) hos de fleste hvirvelløse arter. D. melanogaster kvantebumpene skyldes den samordnede åbning af ~ 15 TRP kanaler og ~ 2 TRPL kanaler ved toppen af bumpen 18 . Hver bump genereres ved absorptionen af en enkelt foton, mens det makroskopiske svar på mere intense lys er summationen af disse elementære reaktioner 14 , 21 . Bumpene varierer betydeligt i latens, tidskurs og amplitude, selvom stimulusbetingelserne er ens. Bump generation er en stokastisk proces beskrevet af Poisson statistikker, hvor hver effektivt absorberet foton udløser kun en bump. Single-foton-enkelt-bump forholdet kræver, at hvert trin i kaskade ikke kun omfatter en effektiv "turn-on" mekanisme, men også en lige så effektiv "off-off" mekanisme. Den funktionelle fordel er produktionen af aMeget følsom fotonetæller med et hurtigt forbigående svar, der er meget velegnet til både følsomheden og den tidsmæssige opløsning, der kræves af det visuelle system. Kravet om en effektiv afbrydningsmekanisme er afsløret, når enten den aktive fotopigment ( dvs. metarhodopsin, M) eller dens mål, G q α, ikke inaktiverer og fører til kontinuerlig produktion af bump, langt efter at lyset er slukket ( figur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 .
Bumpen repræsenterer TRP / TRPL-kanalernes kooperative aktivitet i en microvillus. Som sådan bør enhver hypotese af kanalaktivering også forklare kooperativ kanalaktivering. For nylig har Hardie og kolleger vist at lys fremkalder hurtige sammentrækninger af fotoreceptorerne, hvilket tyder på, at lysfølsomE-kanaler (TRP / TRPL) kan være mekanisk indhegnet 25 . Denne mekaniske aktivering, sammen med de observerede protoner frigivet ved PLC-medieret PIP 2- hydrolyse, fremmer åbningen af TRP / TRPL-kanalerne og forklarer kooperativets karakter af bumpproduktion 26 . I øjeblikket er D. melanogaster fotoreceptorer et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres in vivo , hvilket gør D. melanogaster- fototransduktion og den metodologi, der udvikles til at studere denne mekanisme et yderst værdifuldt model system.
Figur 3: InaC P209 og inaD P215 mutanter afslører langsomme reaktionsterminering af det makroskopiske respons til lys og af enkeltkvantumbumpene. ( A ) Den isolerede ommatidiumprepaRation med en patchpipette fyldt med fluorescerende Lucifer Yellow CH farvestof (excitation: 430 nm, emission: 540 nm) præsenteres under en helcelleoptagelse. Bemærk, at det fluorescerende farvestof diffunderede og mærkede en enkelt fotoreceptorcellekrop, og at fotoreceptorcellekropperne løsnes fra deres aflange axoner, men stadig opretholder levedygtighed. Dette præparat er egnet til samtidige helcelleoptagelser og billeddannelsesforsøg. ( BD ) Øvre paneler: Hele celle spænding clamped quantum bump responser til kontinuerlig dim lys (åben bar) i WT, inaC P209 og inaD P215 mutant fluer. En langsom afslutning af humperne observeres i inaC P209 og inaD P215 mutanter i forhold til WT fluer. Indsnittet nedenfor viser den forstørrede form af enkeltstød. Bundpaneler: Normaliserede helcelle optagne makroskopiske reaktioner på en 500 ms lyspuls (1,5 x 10 5 fotoner pr s) af ovennævnte vildtype Og mutant fluer. (EG) Øvre paneler: Hele celle spænding clamped quantum bump svar på en kort (1 ms), svagt lys fremkalde single-foton svar i vildtype, arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer. Bemærk trinet af humle observeret i arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer som reaktion på en enkelt fotonabsorption. Bundpaneler: Hele-celle spænding fastspændte normaliserede reaktioner på en 500 ms lyspuls (1,5 x 104 fotoner / s) i de tilsvarende mutanter. Bemærk den langsomme afslutning af de makroskopiske reaktioner, der observeres i afsnit 2 Og ninaC P235 mutant fluer i forhold til WT. Klik her for at se en større version af denne figur.
D / 55627 / 55627fig4.jpg "/>
Figur 4: Cellulær Ca 2+ -dynamik Følgende signal-induceret Ca 2+ -tilstrømning påvirkes af Calphotin. En tidsserie af fotoreceptorbilleder af vildtype og Cpn 1% fluer viser fluorescensen af Ca 2+ -indikatoren under lysstimulering. Råintensitetsbilleder tegnes ved hjælp af falskfarvekodning (bar = 10 μm; pilehoveder angiver pipetten). Figur genoptrykt med tilladelse fra Weiss et al. 4 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: De elektrofysiologiske egenskaber af WT-, trp- og trpl-mutanter. ( A ) Helecelle spændingsklemme recoRdings af quantum bumps som svar på kontinuerlig dim lys (åben bar) i WT, trpl 302 og trp P343 null mutant fluer. Meget reducerede amplituder af trp P34 3 bump observeres. Inset: Forstørrede single quantum bumps af wildtype og trp P343 null mutant fluer vises. ( B ) Wholecelle spændingsklemmeoptagelser som reaktion på en 3 s lyspuls af vildtype og de tilsvarende mutanter. Det forbigående steady state respons af trp P343 mutanten observeres. Inset: Forstørrede lysresponser af WT og trp P343 mutant er vist. ( C ) En familie af overlejrede lysinducerede strømme af ovennævnte fluestammer, fremkaldt som reaktion på en 20 ms lyspuls ved spændingstrin på 3 mV målt omkring reverseringspotentialet (E rev ). ( D ) Et histogram der udformer den gennemsnitlige E rev af vildtype og de forskellige mutanerts. Fejlstængerne er SEM Vendingspotentialet (E rev ) for WT er mellem den positive E rev for trpl 302 , som kun udtrykker TRP og E rev for trp P343 null mutanten, som kun udtrykker TRPL. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Flash-responsen er strengt lineær med stigende lysintensitet.
En serie af aktuelle reaktioner på korte blinkninger af stigende lysintensitet og et plot af afhængigheden af toppamplituden af lysresponsen på den stigende intensitet af korte lysflammer. Dette forhold afslører en streng linearitet mellem flash respons og stigende lysintensitet. Denne strenge linearitetRummer op til mindst flere hundrede pA, med lysintensitet på over 4 størrelsesordener, mens det er diskutabelt, om det er linearitet eller klemkontrol, der bryder ned derefter. Klik her for at se en større version af denne figur.
| pH | 7,15 (juster med NaOH) |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| NaCl | 120 |
| KCI | 5 |
| MgCl2 | 4 |
| TES | 10 |
| Proline | 25 |
| alanin | 5 |
| Opbevares ved -20 ° C. | |
| 2+ fri, men har ingen Ca 2+ buffere tilsat og vil derfor have ca. 5 - 10 μM spor Ca 2+ . Ekstracellulær opløsning (ES) = ES-0Ca 2+ med 1,5 mM CaCl2 fremstillet ved at tilsætte CaCl2 fra en 0,5 eller 1 M stamopløsning til ES-0Ca 2+ . |
Tabel 1: Ca + 2- fri ekstracellulær opløsning (ES). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere Ca +2- fri ES.
| Reagens | Beløb |
| FBS | 15 ml |
| saccharose | 1,5 g |
| Opdel i 150 μl alikvoter i 1,5 ml hætteglas og opbevar ved -20 76; C. | |
| Triturationsopløsning (TS) | Fyld 1 hætteglas med 150 ml stamopløsning med 1.350 ml ES eller ES-0Ca 2+ for at matche den opløsning, der blev brugt under dissektionen. |
Tabel 2: Fetal bovint serum (FBS) + saccharose-stamopløsning. Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves til fremstilling af føtalt bovint serum (FBS) + saccharose-stamopløsning.
| pH | 7,15 (juster med KOH) |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| Kaliumgluconat (Kglu) | 140 |
| MgCl2 | 2 |
| TES | 10 |
| ATP magnesiumsalt (MgATP) | 4 |
| GTP natriumsalt (Na2 GTP) | 0,4 |
| P-nicotinamid adenin-dinukleotidhydrat (NAD) | 1 |
| Opbevares ved -20 ° C. |
Tabel 3: Intracellulær Solution (IS1). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere IS1, som hovedsagelig anvendes til intensitetsrespons og kvantumbumpmålinger.
| pH | 7,15 (juster med CsOH) |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| CsCI | 120 |
| MgCl2 | 2 |
| TES | 10 |
| ATP magnesiumsalt (MgATP) | 4 |
| GTP natriumsalt (Na2 GTP) | 0,4 |
| P-nicotinamid adenin-dinukleotidhydrat (NAD) | 1 |
| Tetraethylammoniumchlorid (TAE) | 15 |
| Opbevares ved -20 ° C. |
Tabel 4: Intracellulær Opløsning (IS2). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere intracellulær opløsning IS2, som hovedsagelig anvendes til reversering potentielle målinger af den lysinducerede strøm.
Discussion
Anvendelsen af helcelleoptagelser til D. melanogasterfotoreceptorer tilladt til opdagelsen og funktionel belysning af nye signalproteiner, såsom TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stilladsprotein. Lige siden den indledende introduktion af denne teknik gjorde det muligt at løse langsigtede grundlæggende spørgsmål vedrørende den ioniske mekanisme og spændingsafhængigheden af lysresponsen. Dette skete på grund af den tildelte evne til nøjagtigt at kontrollere membranspændingen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensætning 19 , 28 .
En stor hindring for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har været skrøbelighed hos den isolerede ommatidia preparationere. Detaljerede undersøgelser har afsløret, at fototransduktionsmaskineriets integritet er kritisk afhængig af den kontinuerlige forsyning af ATP, især under lyseksponering, hvilket fører til et stort forbrug af ATP. Desværre eliminerer den mekaniske stripning af pigmentet ( dvs. glia) cellerne, som er nødvendig for at nå fotoreceptormembranen med patchpipetten, den vigtigste kilde til metabolitter, der er nødvendige for ATP-produktion 33 . Anvendelse af exogen ATP i registreringspipetten opfylder kun delvis kravet om store mængder ATP. En kort forsyning af ATP fører til spontan aktivering af TRP-kanalerne og dissociationen af fototransduktionsmaskineriet fra de lysaktiverede kanaler, hvilket forårsager en stor forøgelse af cellulær Ca 2+ og afskaffelsen af det normale respons på lys 34 , 35 . Denne rækkefølge af begivenheder skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved dissektionsproceduren, men snarere til den cellulære udtømning af ATP. For at forhindre denne forekomst af hændelser og for at opretholde normale lysresponser, bør fotoreceptorerne ikke udsættes for intense lys, der forbruger store mængder ATP. NAD skal også inkluderes i registreringspipetten, formodentlig at lette ATP-produktion i mitokondrierne 18 , 36 . Til måling af spontane og kvantumstød er ovennævnte sværhedsgrad minimal, fordi der kun anvendes dimlampe. I praksis kan en stabil helcelleoptagelse opretholdes i ~ 20-25 minutter, selvom der er en tendens til, at reaktionskinetikken sænker over denne periode. Et enkelt præparat af dissocieret ommatidia kan forblive levedygtig i op til 2 timer.
En yderligere mangel på det isolerede ommatidia-præparat er utilgængeligheden af microvilli, som oversætter utilgængeligheden af TRP ogTRPL kanaler til optagelsespipetten, hvilket forhindrer enkeltkanaloptagelser. Ved hjælp af en metode, de udviklede, lykkedes Bacigalupo og kolleger at optage enkanalaktivitet direkte fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktivitet adskiller imidlertid sig fra den af TRPL-kanaler, der heterologt udtrykkes i vævskulturceller 38, og fra TRP-kanalaktivitet afledt af skudstøjanalyse opnået fra isoleret ommatidia 34 . Formentlig beskadigede dissektionsproceduren fotoreceptorcellerne væsentligt ved anvendelse af denne metode.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Den eksperimentelle del af denne forskning blev støttet af tilskud fra den amerikanske og israelske Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israels videnskabsstiftelse (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM) og bioteknologien Og Biologisk Forskningsråd (BBSRC Grant-nummer: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | |||
| 5 mL syringe | |||
| 1 mL syringe with elongated tip | |||
| Petri dish | 60 mm | ||
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
| Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
| 2 small beakers | 50 mL or less | ||
| 2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
| Bath chamber | home-made | ||
| Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
| Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
| Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
| Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
| Micro dissecting needle holder | |||
| Vise | |||
| 2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
| Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
| Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
| Osilloscope | GW | GOS-622G | |
| Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
| Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
| Suction system | |||
| Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
| Head-stage | Molecular Device | CV - 4 | Gain: x 1/100 |
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
| Clampex | Molecular Device | 10 | software |
| pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
| Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
| Light detector | home made | phototransistor | |
| Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
| Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
| Light guide | Quartz | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
| Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
| Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
| Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
| CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
| NIS Element | Nikon | AR | software |
| Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
| Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 - AT - GFP/FITC Longpass set | |
| Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
| Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |
References
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).
- Weiss, S., et al. Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration. J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).
- Wang, T., et al. Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX. Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).
- Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation. J. Physiol. Lond. 440, (1991).
- Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckström, M. Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).
- Nasi, E. Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra. J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).
- Nasi, E., Gomez, M. P. Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians. J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).
- Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).
- Kohn, E., et al. Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo. J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).
- Hevers, W., Hardie, R. C. Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors. Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).
- Scott, K., Zuker, C. S. Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses. Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).
- Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors. J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).
- Katz, B., Minke, B. Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors. J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).
- Hardie, R. C., et al. Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase. Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).
- Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL. Neuron. 19, 1249-1259 (1997).
- Liu, C. H., et al. In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel. J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).
- Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Liu, C. H., et al. Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III. Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).
- Cook, B., et al. Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo. Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).
- Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).
- Shieh, B. H., Niemeyer, B. A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila. Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina. J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).
- Hardie, R. C., Minke, B. Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
- Delgado, R., Muñoz, Y., Peña-Cortés, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors. J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).
- Parnas, M., Katz, B., Minke, B. Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel. J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).
