Summary
在这里，具有分析特征的多光谱成像流式细胞术可以比较3个自噬标记的明亮细节图像，并量化其共定位以及LC3斑点计数，用于以客观，定量和统计学鲁棒的方式测量自噬。
Abstract
自噬是分解代谢途径，其中在生长和分化期间积累的正常或功能失调的细胞组分通过溶酶体降解并被再循环。在自噬过程中，细胞质LC3蛋白被脂质化并引入自噬体膜。然后自噬体与溶酶体融合以形成自体溶质，其中发生自噬体囊泡及其内含物的分解。与LC3结合的泛素相关蛋白p62也用于监测自噬通量。进行自噬的细胞应该证明p62，LC3和溶酶体标记物的共定位。已经使用免疫荧光显微镜来以每细胞为基础目视鉴定LC3斑点，p62和/或溶酶体。然而，客观和统计上严格的评估可能难以获得。为了克服这些问题，使用多光谱成像流式细胞术以及比较光亮度的分析特征来自三个自噬标记（LC3，p62和溶酶体LAMP1）的尾部图像，并量化它们的共定位，结合LC3点计数，以客观，定量和统计学鲁棒的方式测量自噬。
Introduction
Macroautophagy（以下简称自噬）是一种分解代谢途径，其中损伤或功能失调的成分，长寿命蛋白质和细胞器通过溶酶体降解并被回收1 。自噬是一种动态的，多步骤的过程，涉及形成自噬体;自噬体与溶酶体的融合，形成自溶胶体;以及自溶胶体2含量的降解。用于鉴定哺乳动物系统自噬的关键生物学标记是构成自噬体膜的微管相关蛋白1A / 1B-轻链3（LC3）。在自噬过程中，胞质LC3-1与磷脂酰乙醇胺缀合形成LC3-II;然后将LC3-II并入自噬体膜3中 。自噬通量的另一个广泛使用的标记是自噬受体结合体1（SQSTM1，p62）NKS自噬货物到自噬膜4,5。
传统上用于测量自噬的方法是Western印迹和荧光显微术7 。然而，这些方法都没有被认为是“金标准”，2，6为有以两者的这些技术相关联的挑战。因为使用匀浆样品，蛋白质印迹只能给出平均值，所以观察者看不到单个细胞发生了什么。另一方面，荧光显微镜在单细胞水平上给出观察者信息，但缺乏通量能力，难以获得客观和统计学上严格的评估。近年来，通过多光谱成像流式细胞术测定LC3和p62（MIFC，见材料表 ）已经获得了广泛的应用由于其定量功率，高吞吐能力，复用电位以及对每个单元进行成像的能力，因此无法实现。其中最广泛使用的方法使用MIFC，以其伴侣分析软件一起（参见材料的表 ）来测量自噬，是通过LC3斑点或自噬体8，9，10，11，12，13，14的光点计数，15，16，17。然而，自噬体的增加并不一定意味着自噬增加，因为它也可能代表了过程2的封锁。 LC3-II周转量是通过分析细胞存在而测量自噬通量的有用参数没有溶酶体降解抑制剂，如氯喹。氯喹抑制自噬体的融合到溶酶体，由此通过阻止自噬通量溶酶体降解之前，可能会发生18允许自噬体形成，因为自噬的程度的度量的定量。另外，P62主要由自噬降解，并且如果所述自噬体和其内容的溶酶体降解被阻断，P62的累积预期17,19。
自噬是一个多步骤过程，单独测量LC3或p62不能全面了解细胞中发生的情况。最近的出版物强调，有必要检查自溶酶体2，17，20，21的同时形成。 MIFC是唯一能够通过自噬体的共定位成像到溶酶体15以测量自溶酶体的形成- 17，20，21，22，23，24，25，26。此外，还研究了使用MIFC的p62和LC3的共定位以测量自噬通量5 。在参考分析软件中，测量共定位的“特征”被称为“明细相似性R3”（BDS），并且被特别设计为比较两个图像的小而明亮的图像细节。 BDS是半径为3像素或更小的局部亮点的对数转换Pearson相关系数;换句话说，BDS计算o的程度来自两个不同荧光通道的抖动像素。亮点是相关的（ 即相同的空间位置）或不相关的（ 即，不同的空间位置）。因此，相关系数在0（不相关）和1（完全相关）之间变化。的系数是对数转化为增加的范围内的零和无穷大26，27之间。单独的BDS可能不足够; Rajan 等人发现仅使用BDS可能导致假阳性或假阴性结果21 。 BDS评估两种自噬标记的共定位，但不考虑自噬体的数量。为了说明自噬体的数量，Rajan 等包括LC3斑点21的点数计数。 Rajan 等人提出使用LC3点数与BDS的双变量散点图。使用这个双变量的情节，两个人都在e首先确定：一个细胞具有高水平的LC3斑点，一个细胞具有低水平的LC3斑点。高-LC3斑点人口进一步分为两个群体：细胞低共定位（ 即，自噬体的累积）和细胞具有高的共定位（ 即，自体溶酶体的积累）。这种双变量图可以区分具有非常少的自噬体的细胞和具有自噬体和/或自溶质体21的积累的细胞。
到目前为止，使用MIFC伴随分析软件中的单个“特征类型”（参见材料表 ），LC3，p62和LAMP1（溶酶体标记）的同时共定位是不可能的。然而，6.1版中最近推出的一个新功能叫做Bright Detail Colocalization 3（BDC3）。 BDC3比较三个图像中每个图像的明亮细节图像（在本例中为LC）3，p62和LAMP1）并量化三个探针（ 即 LC3，p62和LAMP1）的共定位。 BDC3功能计算修改后的Pearson相关系数以扩展到三个图像。由于三个图像中的亮点是相关或不相关的，相关系数在0（不相关）和1（完全相关）之间变化。系数进行对数转换，以增加0和无穷大之间的动态范围。通过使用BDC3功能切换BDS功能，Rajan 等人提出的分析方法现在可以使用三种最常用的标记来同时测量一个系统中的自噬。在单次测定中将这三种自噬标记共同定位的能力可以导致对自噬的诱导和调节的新见解。以下方案概述了诱导Jurkat细胞自噬的步骤。用LC3，p62和LAMP1抗体标记细胞;获取有关多数据的数据口腔成像流式细胞仪;并分析数据以评估自噬通量。
Protocol
培养基和溶酶体降解抑制剂的制备
- 1.1。制备〜500 mL 1x RPMI培养基。加入5mL MEM非必需氨基酸（100x），5mL丙酮酸钠（100mM），5mL青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（100x）和25mL胎牛血清（FBS）至500mL瓶RPMI - 1640 1x介质。介质应在生物安全柜内准备。将RPMI培养基储存在2-8℃。将RPMI培养基加热至37℃，然后将其加入到Jurkat细胞中。
- 制备100mM氯喹，溶酶体降解抑制剂。称取0.05g氯喹二磷酸盐，并在15 mL离心管中加入1 mL细胞培养级水中。漩涡直到氯喹溶解。
2.细胞培养
- 培养在37℃和5％CO 2的培养基中，将80mL Jurkat细胞克隆E6-1在RPMI培养基中。
注意：培养细胞时或在固定前与Jurkat细胞一起工作，所有工作都应在生物安全柜内完成。 - 在诱导自噬之前，使用血细胞计数器或另一个细胞计数装置计数Jurkat细胞以确定细胞/ mL。
3.诱导细胞中的自噬
- 以指数生长期取Jurkat细胞，并将其分成四个50 mL离心管中的20 mL样品。将管标记为“对照”，“对照+氯喹”，“饥饿”和“饥饿+氯喹”。
注意：Jurkat细胞的浓度应为2.5-5×10 5个细胞/ mL。 - 通过向每个样品中加入30mL不含Ca 2+或Mg 2+ （HBSS）的Hank's平衡盐溶液洗涤细胞。以250 xg离心10分钟。将上清液倒入废烧杯中。
- 通过使用25mL s的上下移液将对照样品重悬于20mL的RPMI培养基中可靠的一次性移液管，然后执行光漩涡。类似地，将饥饿的样品重悬在20毫升不含Ca 2+或Mg 2+ （EBSS）的Earle平衡盐溶液中。
- 使用25 mL无菌一次性移液管，将对照和饥饿样品转移到标有“对照”，“对照+氯喹”，“饥饿”和“饥饿+氯喹”的T75烧瓶中。
- 在“对照+氯喹”和“饥饿+氯喹”烧瓶中的20mL细胞培养基中加入20μL的100mM氯喹。通过轻轻旋转烧瓶，在氯喹中混合。将所有烧瓶置于37℃和5％CO 2培养箱中2小时。
4.制备用于固定和标记LC3，LAMP1和p62的缓冲液
- 在PBS中制备10 mL 4％福尔马林固定液。加入4 mL 10％福尔马林溶液至1 mL 10倍Dulbecco磷酸缓冲液中在15mL离心管中不含Ca 2+或Mg 2+ （PBS）的盐水溶液和5mL超纯水。
注意：小心。吸入或吞咽时，福尔马林/甲醛有毒;对眼睛，呼吸系统和皮肤有刺激性;并可能通过吸入或皮肤接触引起过敏。有眼睛严重受伤的风险。这是一种潜在的致癌物质。 - 在PBS中制备10 mL 1％福尔马林最终重悬浮溶液。在15 mL离心管中加入1 mL 10％福尔马林溶液至9 mL 1x PBS。
- 通过将10mL FBS加入到500mL 1x PBS的瓶中来制备500mL洗涤缓冲液。
- 通过向步骤4.3中制备的49.5mL洗涤缓冲液中加入0.5mL的10％triton X-100，在50mL离心管中制备50mL的透化缓冲液。
- 通过将5μL抗SQSTM1 / p62-AF488加入到495μL的透化缓冲液中，制备抗SQSTM1 / p62-Alexa 488（AF488）抗体/透化缓冲液工作溶液tep 4.4。确保最终抗体浓度为5μg/ mL。
注意：在将样品加入之前，先制作抗体透化缓冲液工作溶液。保护溶液免受光照。 - 通过向步骤4.4中制备的495μL透化缓冲液中加入5μL小鼠抗LC3来制备小鼠抗LC3 /透化缓冲液工作溶液。确保最终抗体浓度为20μg/ mL。
注意：在加入样品之前，先制作抗体渗透缓冲液工作溶液。保护溶液免受光照。 - 通过在步骤4.4中制备的495μL透化缓冲液中加入5μLAF647标记的驴抗小鼠IgG来制备驴抗小鼠Alexa 647（AF647）/透化缓冲液工作溶液。确保最终抗体浓度为20μg/ mL。
注意：将抗体渗透缓冲液的工作溶液加入样品之前。保护t他解决了光。 - 通过在步骤4.4中制备的475μL透化缓冲液中加入25μL抗CD107a（LAMP1）-PE制备抗人CD107a（LAMP1）-PE抗体/透化缓冲液工作溶液。确保最终抗体浓度为21μg/ mL。
注意：将抗体渗透缓冲液的工作溶液加入样品之前。保护溶液免受光照。 - 通过加入4μL5mg / mL DAPI和100μL10％triton X-100至896μL1x PBS来制备10x DAPI核染色。
5.用LC3，LAMP1和p62标记Jurkat细胞
- 每个样品移除2×10 6个细胞（按步骤2.2计数细胞）。将每个样品置于已经用适当样品名称（ 即 Control，Control + Chloroquine，Starved或Starved + Chloroquine）标记的15-mL离心管中。
- 添加洗涤缓冲液，使我在那里在每个15-mL离心管中的总体积为15mL。将样品以250 xg离心10分钟。吸出上清液。
- 向每个细胞颗粒中加入100μL的4％福尔马林固定液。用P200移液管上下移动重悬。在室温下孵育10分钟。在固定步骤中，将样品转移到标记的硅化聚丙烯微量离心管中。
注意：不要过度固定单元格;这可能导致标签结果不良。 - 10分钟固定步骤后，向每个样品加入1 mL洗涤缓冲液。用P1000移液管上下移动以混合样品。以250 xg离心5分钟。吸出上清液。
- 向每个样品加入100μL抗SQSTM1 / p62 - AF488抗体/透化缓冲液工作溶液。用P200移液管上下移动重悬。在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 加入1 mL洗涤细胞透化缓冲液。用P1000移液管上下移动以混合样品。以250 xg离心5分钟。吸出上清液。
- 对每种抗体工作溶液重复步骤5.4-5.5。
注意：抗体工作溶液是小鼠抗LC3 /透化缓冲液工作溶液，驴抗小鼠AF647 /透化缓冲液工作溶液和抗人CD107a（LAMP1）-PE抗体/透化缓冲液工作溶液。每个抗体应该按照列出的顺序进行。选择顺序以减少抗体之间的不需要的交叉反应性。 - 加入100μL1％福尔马林溶液。用P200移液管上下移动重悬。向每个样品加入10μL的10x DAPI核染料。轻轻涡旋每个样品混合。在室温下在黑暗中孵育10分钟，然后再运行仪器上的任何样品。
注意：此时，样品可以是be运行在MIFC或保存在2-8°C的光线下长达一周。
6.单色控件标签
- 对于每个单色控件（ 即 AF488，PE，AF647和DAPI），取1×10 6个 Jurkat细胞，可以来自任何样本群体。将1×10 6个细胞置于标有AF488，PE，AF647或DAPI的15 mL离心管中。
- 加入洗涤缓冲液，使每个15 mL离心管中的总体积为15 mL。将样品以250 xg离心10分钟。吸出上清液。
- 向AF488，PE和AF647管中加入100μL洗涤缓冲液。
注意：对于DAPI管，请转到步骤6.8。- 用P200移液管上下移动重悬。转移至1.5 mL管。
- 分别向AF488，PE或AF647管中加入5μL抗CD45-AF488，anti-CD45-PE或anti-CD45-AF647。通过涡旋混合lightly。
- 在室温下在黑暗中孵育AF488，PE和AF647管30分钟。
注意：可以使用其他标记，如LC3，p62和LAMP-1抗体，而不是抗CD45抗体。然而，CD45是单色控件的可靠标记。 - 通过向每个样品加入1 mL洗涤缓冲液，清洗AF488，PE和AF647细胞。
- 用P1000移液管上下移动以混合样品。以250 xg离心5分钟。吸出上清液。
- 加入100μL1％福尔马林溶液。用P200移液管上下移动重悬。
注意：此时，样品可以在MIFC上运行，也可以在2-8°C保存，避光保存长达一周。 - 向DAPI管中加入100μL1％福尔马林固定液。
- 用P200移液管上下移动重悬。在室温下孵育30分钟。
- 加101; L的10x DAPI核染色到DAPI样品。轻轻涡旋混合。在仪器上运行之前，在室温下在黑暗中孵育10分钟。
注意：此时，样品可以在MIFC上运行，也可以在2-8°C保存，避光保存长达一周。
7.启动和校准MIFC
- 检查以确保护套，系统校准试剂（见材料表 ），脱泡剂，清洁剂和灭菌容器已满，废液箱为空。如果没有，请装满容器并清空废液箱。
- 打开系统电源并双击软件（参见表格材料 ）图标启动应用程序;这将启动MIFC软件。
- 单击启动按钮，并确保选择开始所有校准和测试 。这将冲洗系统，负载护套，系统校准试剂，并校准系统。
8.在MIFC上运行样品和单色控件
- 通过转到文件选项卡并选择加载默认模板加载默认模板 。
注意：默认模板包含原始最大像素点图。 - 通过点击其各自的按钮打开488 nm，405 nm，642 nm和SSC激光器。通过在每个激光按钮旁边输入所需的电源来设置激光功率。参见图1 。
注：对于本实验，激光功率分别为488 nm，405 nm，642 nm和SSC的激光功率分别为200 mW，20 mW，150 mW和5 mW（Ch06）。 MIFC默认模板放大设置为40X，默认灵敏度为Hi ， 所有通道都启用。 - 确认放大滑块设置为40X，选择高感光度模式，所有通道都显示在图像库中; 图1
- 加载“饥饿+氯喹”样品，点击加载按钮并将1.5 mL管装入仪器。
注意：该实验样品应具有AF488，PE和AF647所有样品的最高信号（对于所有实验样品，包括“Starved + Chloroquine”样品），DAPI信号应具有大致相同的信号强度。 - 使用“Starved + Chloroquine”样品确认为488 nm，405 nm，642 nm和SSC激光器设置了适当的激光功率。使用默认模板中的原始最大像素点绘图调整激光功率，使信号强，但不达到原始最大像素值为4096，这将使仪器上的CCD相机饱和。对所有实验样品使用此激光设置。
- 单击创建点绘图图标创建一个新的点图。选择“Area_M”01“，”全部“群体的Y轴上的”Aspect Ratio_M01“单击” 创建多边形区域“图标，在单元格周围绘制一个区域，将该区域命名为”单元格“。
注意：用户可以添加附加的图和区域来缩小正在收集的单元格。添加的常见附加图将是渐变RMS以识别焦点中的单元格。 - 设置采集参数。指定文件名和目标文件夹，将事件数更改为“5,000”，然后选择“单元格”收集人口。单击获取按钮获取文件。收集文件后，点击Return按钮返回样品。从仪器中取出样品管。
- 对于接下来的三个样品（“饥饿”，“控制”和“控制+氯喹”），加载样品，输入样品名称，采集样品，并使用与以上为“饥饿+氯喹”样品。
- 在采集样本之后，运行单色控制样本并获取数据，以便可以进行补偿矩阵。通过点击SSC按钮关闭SSC激光。通过单击Brightfield按钮并选择OFF关闭亮点通道。
注意：如果通道从图像库中删除以进行实验样品采集，请重新启用所有通道。或者，可以通过单击“ 补偿”选项卡并选择“ 创建矩阵”来获取单色控件。这将打开补偿向导，这将通过收集文件和制作补偿矩阵的步骤。 - 通过单击加载按钮并将1.5 mL管装入仪器来加载DAPI单色控件。输入样本名称（仅DAPI），将收集人口设置为“全部”，并更改事件数s到“500”。
- 单击获取按钮获取单色控件文件。
- 文件收集完成后，点击Return按钮返回样品。从仪器中取出样品管。
- 在DAPI样品后，加载10％漂白剂，就像样品一样，点击加载按钮，并加入100μL的10％漂白剂在1.5 mL管中。让样品运行〜15秒。这将从管中除去任何残留的DAPI。
- 运行100μL1x PBS，如8.10.3所示，以除去残留的10％漂白剂。仪器现在可以运行AF488，PE和AF647单色控制。
- 对每个单色控件（ 即 AF488，PE和AF647）重复步骤8.10-8.10.2。
注意：只有在DAPI单色控制后，才能在这些样品之间运行10％漂白剂或PBS。
9. MIFC的数据分析An解析软件
- 启动MIFC分析软件（参见材料表 ）。
- 单击开始分析以启动打开文件向导 。通过浏览到“Starved + Chloroquine”原始图像文件（.rif）选择要打开的数据文件。选择文件，然后单击打开按钮。单击下一步 。
- 申请补偿选择先前创建的补偿矩阵，然后单击下一步 。或者，通过单击“ 新建矩阵”按钮创建新的补偿矩阵。
注意：步骤9.2.1.1-9.2.1.2是创建新矩阵的步骤。- 通过单击添加文件 ，选择文件，然后单击打开按钮，将单色控制文件（ 即，仅限于DAPI，仅限PE和仅AF647）添加到控制文件列表。单击下一步 。
- 此实验将显示“ 创建补偿矩阵”窗口。 Ensure选择Ch02，Ch03，Ch07和Ch11，然后单击下一步 。将创建补偿矩阵。单击完成以保存补偿矩阵。将补偿文件添加到打开文件向导 ，然后单击下一步 。
- 应用分析模板。在这个阶段，没有要应用的分析模板，所以点击Next 。
注意：对于其他实验文件，此“Starved + Chloroquine.daf”文件可用作模板。 - 命名文件（自动生成与“rif”名称相对应的文件名），然后单击“ 下一步” 。通过选择“02”，“03”，“07”和“11”通道设置图像显示属性;通道01,06和09是预选的。单击下一步 。
- 申请补偿选择先前创建的补偿矩阵，然后单击下一步 。或者，通过单击“ 新建矩阵”按钮创建新的补偿矩阵。
- 在打开文件向导的末尾，选择细胞凋亡向导 。单击“ 细胞凋亡向导”图标，然后再打开选择向导按钮打开细胞凋亡向导 。
- 选择核图像通道（Ch07），然后单击下一步 。以最好的焦点门控细胞。单击创建行区域图标，并在60-90渐变RMS_M01_Ch01上绘制一个区域。命名此区域“焦点”，单击确定 ，然后单击下一步 。
- 打开单个单元格。单击创建多边形区域图标。在单个单元格周围绘制一个区域，将区域命名为“单个”，单击“ 确定” ，然后单击“ 下一步” 。点击否 ，“你想分析亚群吗？”
- 打开有核细胞。单击创建行区域图标并绘制一个包含所有有核细胞的区域。命名该区域“有核”。单击确定和下一步 。
- 打开凋亡细胞。单击创建多边形区域图标。在凋亡细胞周围绘制一个区域;这些都是细胞具有低核区域_T50％和高亮场对比度。单击完成 。通过单击创建多边形区域图标并在非凋亡细胞周围绘制区域来添加第二个区域;称这个区域为“细胞”。
- 选择对LAMP1，p62和LC3为阳性的细胞。单击构建块图标，选择荧光阳性 - 单色 ，然后选择“细胞”群体和Intensity_MC_Ch03 。标记X轴“强度LAMP1”。通过单击“ 创建线区域”图标并绘制区域，绘制包含强度大于10,000的单元格的区域。标记该地区“LAMP1 +”。按照与9.4相同的步骤选择p62和LC3阳性的细胞。
- 对于p62 +选择“LAMP1 +”群体和Intensity_MC_Ch02 。标记X轴“强度p62”和p62 +细胞“LAMP1 + / p62 +”的区域。;对于LC3 +，选择“LAMP1 + / p62 +”群体和Intensity_MC_Ch11。标记X轴“强度LC3”和LC3 +细胞“LAMP1 + / p62 + / LC3 +”的区域。使用这个“LAMP1 + / p62 + / LC3 +”人口进行剩余的分析。
- 创建点数功能来计算LC3点。
注意：应使用“Starved + Chloroquine”样品创建。- 单击分析选项卡并选择掩码 。单击新建 ，然后单击功能按钮。在功能下 ，选择峰 ; 面膜 ，选择M11 ;和频道 ，选择Ch11 。将Spot to Cell背景比设置为4 。单击“ 确定”关闭“ 定义掩码功能”窗口，然后单击“确定”将其添加到“ 掩码”列表。单击关闭以退出掩码管理器 。
- 单击分析选项卡，然后选择
注意：“ 点”向导也可用于创建点计数功能。本实验中使用的斑点数特征可能不适用于其他实验和/或细胞系。当决定特定数据集的掩码/功能时，用户应该测试几个点数掩码/特征。 Pugsley 2017有使用MIFC分析软件26进一步详细的点计数。 - 点击新建直方图图标。选择“LAMP1 + / p62 + / LC3 +”人口。选择Spot Count LC3功能，然后单击确定 。
- 创建BDC3功能。
- C舔“ 分析”选项卡并选择“ 功能” 。点击新建按钮。在“ 特征类型”下 ，选择“ 明细细化共定位3” ; 面膜 ，选MC ; 图1 ，选择Ch02 （p62）; 图2 ，选择Ch03 （ LAMP1 ）;和我 法师3 ，选择Ch11 （LC3）。键入“BDC3 p62 / LAMP1 / LC3”作为名称 ，然后单击确定并关闭退出 特务经理 。
- 点击新建直方图图标。选择“LAMP1 + / p62 + / LC3 +”人口。选择BDC3 p62 / LAMP1 / LC3功能，然后单击确定 。
- 点击“ 新建散点图”图标。选择“LAMP1 + / p62 + / LC3 +”人口。为X轴选择BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 。选择Y轴的点计数LC3特征。单击确定 。
- 节省e“饥饿+氯喹”文件。单击文件并选择保存数据分析文件（.daf） 。单击保存并单击是替换以前版本的文件;此文件现在可以用作模板。
- 打开“控制”文件。点击文件 ，然后打开 。选择“Control.rif”文件，然后单击打开 。选择步骤9.2.1中的补偿矩阵和“Starved + Chloroquine.daf”文件作为模板。单击确定 。
- 使用“对照”样本创建自噬体积累和自体脂质体积累的区域来设置区域。
- 单击创建矩形区域图标。从X坐标为-0.1到3，Y坐标为1.5到-0.3绘制一个区域。命名这个地区“低点”。点击 创建矩形区域图标。绘制一个区域从X坐标-0.1到1和Y坐标17.5〜1.5。将此区域命名为“高点/低BDC3”。
- 单击创建矩形区域图标。从X坐标为1到3，Y坐标为17.5到1.5绘制一个区域。将该地区命名为“高点/高BDC3”。
- 保存“控制”文件。单击文件并选择保存数据分析文件（.daf ） 。单击保存并单击是替换以前版本的文件;此文件现在可以用作模板。
- 通过点击文件打开“Control + Chloroquine”文件，然后打开 。选择“Control + Chloroquine.rif”文件，然后单击打开 。选择步骤9.2.1中的补偿矩阵和“Control.daf”文件作为模板。单击确定 。对“饥饿”和“饥饿+氯醌”文件重复此操作。
注意：分析软件中的批处理功能也可用于应用补偿和/或模板到其他文件。最终门控策略如图2所示。
Representative Results
该分析方法使用多个特征来评估自噬通量。为了充分了解最终的双变量图，必须首先对个别分析特征进行调查。自噬的计数是衡量自噬的一种合乎逻辑的方法;然而，LC3斑点的大小/形状/亮度可以在细胞之间显着变化。变异可能使得在分析软件中手动计数自噬体或使用点数特征难以计数。因此，由于自噬体的大变异性，无斑点特征将是完美的。然而，大多数单元格26都能实现良好的点数功能。 图3示出了使用不同的斑点掩模的Jurkat细胞中LC3斑点的斑点掩蔽的实例。为此数据集选择的点计数功能是Spot Count_Peak（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，4）_4，这意味着点计数功能计数为pe在通道11（Ch11-LC3-AF647）上的默认通道11掩码（M11）中标识的ak掩码，点到单元背景比为4（Bright，4）。 图4显示了用反LC3-AF647标记的对照，对照+氯喹，饥饿和饥饿+氯喹Jurkat细胞的斑点计数直方图和代表性图像。控制和饥饿平均斑点数没有显着差异;与氯喹相比，对照+氯喹与饥饿+氯喹相比，平均值差异很大。
下一个调查功能是BDC3。 BDC3是三种标记物/探针的共定位的测量，在这种情况下，LC3，p62和LAMP1。 图5A - 5D显示了用抗p62-AF488标记的对照，对照+氯喹，饥饿和饥饿+氯喹Jurkat细胞的BDC3直方图，抗LAMP1-PE和抗LC3-AF647。控制平均值与饥饿平均值之间存在转移，以及对照+氯喹平均值与饥饿+氯喹平均值之间的偏差。然而，从图5E - 5H中的平均BDC3评分中观察细胞的图像，样本之间的差异比直方图可能导致人们相信更大。这是因为BDC3不考虑自噬细胞器的数量，导致相同BDC3评分的自噬体数量的变化程度很大。在大多数情况下，所有三个探针之间存在重叠，因为即使在基础水平，p62，LAMP1和LC3应在一定程度上共同定位或驻留在细胞中的相似区域。相比之下，不能共定位的三个探针的实例是用于Starved + Chloroquine样品的抗p62-AF488，抗LC3-AF647和DAPI核染料， 如图6所示。/ P>
当点计数特征和BDC3特征相结合时，存在提高区别各种样本/条件的能力的不同亚群的存在是明显的。 图7显示了四个样品的LC3与BDC3 p62 / LAMP1 / LC3的斑点数的双变量图：对照，对照+氯喹，饥饿和饥饿+氯喹。对照样品用于设置三个群体的门控策略：低斑点，高斑点/低BDC3和高斑点/高BDC3。对照样品显示大于98％的细胞具有1个或更少的斑点。高点/低BDC3和高点/高BDC3之间的边界被设置为BDC3得分为1，因为对照样本的91％以上的BDC3得分小于1.双变量图的结果总结如表1所示。
年龄= “1”> 
图1：MIFC仪器设置。本实验步骤8中概述的MIFC仪器设置的屏幕截图。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：分析软件门控策略。分析软件选通方案的屏幕截图，在协议的步骤9中概述。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图3：LC3斑点掩蔽。 Jurkat细胞图像和掩模用于创建点计数功能。显示为BrightField（BF），LC3-AF647，Peak（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，2），Peak（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，4），Peak（M11，Ch11-LC3-AF647 ，Bright，5），Spot（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，5,3,1）和Spot（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，6,2,1）。最适合所有细胞的面膜为Peak（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，4）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：LC3点数直方图。使用点计数功能Spot Count_Peak（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，4）_4和Control（ A ，浅蓝色），Control + Chloroquin的LC3-AF647点计数直方图e（ B ，蓝色），饥饿（ C ，粉红色）和饥饿+氯喹（ D ，红色）。对照，对照+氯喹，饥饿和饥饿+氯喹的平均斑数分别为0.07,1.13,10.10和2.77。 BF，LC3-AF647（红色），DAPI核染料（蓝色）和代表性细胞的LC3-AF647和DAPI图像的平均斑点数的复合物显示为对照（ E ，0个斑点），对照+氯喹F ，1点），饥饿（ G ，0个点）和饥饿+氯喹（ H ，3个点）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：p62 / LAMP1 / LC3的BDC3直方图。 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3直方图对照（ A ，淡蓝色），对照+氯喹（ B ，蓝色），饥饿（ C ，粉红色）和饥饿+氯喹（ D ，红色）。对照，对照+氯喹，饥饿和饥饿+氯喹的平均BDC3评分分别为0.57,0.82,0.74和0.98。 BF; p62-AF488（绿色）; LAMP1-PE（黄色）; LC3-AF647（红色）;对照（ E ），对照+氯喹（ F ），饥饿（ G ），饥饿+氯喹（ F ），饥饿+氯喹H ）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图6：p62 / L的BDC3直方图C3 / DAPI为饥饿+氯喹样品。 （ A ）显示了Starved + Chloroquine样品的BDC3 p62 / LC3 / DAPI直方图。平均BDC3评分为0.07。 （ B ）BF; p62-AF488（绿色）; LC3-AF647（红色）; DAPI（蓝色）;对于Starved + Chloroquine样品，显示了平均BDC3的代表性细胞的p62-AF488，LC3-AF647和DAPI图像的复合物。 请点击此处查看此图的较大版本。
图7：LC3点数与BDC3 p62 / LAMP1 / LC3的双变量图。 （ A ）对照，对照+氯喹，饥饿和饥饿+氯喹Jurkat细胞的LC3斑点数与BDC3 p62 / LAMP1 / LC3的双变量图。 （ B ）BF; p62-AF488（绿色）; LAMP1-PE（黄色）; LC3-AF647（红色）;对于Starved + Chloroquine样品，显示了来自三个区域（ 即，低斑点，高斑点/低BDC3和高斑点/高BDC3）的p62-AF488，LAMP1-PE和LC3-AF647图像的复合物。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 细胞计数 | 亮度细节共定位3平均值 | 点数LC3平均值 | ％低点 | ％高点/低BDC3 | ％高点/高BDC3 | |
| 控制 | 439 | 0.57 | 0.07 | 98.2 | 1.8 | 0.0 |
| 对照+氯喹 | 1432 | 0.82 | 1.13 | 68.9 19.5 | 11.7 | |
| 饥饿 | 1204 | 0.74 | 0.10 | 98.4 | 0.6 | 1.0 |
| 饥饿+氯喹 | 1811 | 0.98 | 2.77 | 32.1 | 36.9 | 31.0 |
表1：Jurkat LC3点数与 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3双变量图的总结
Discussion
执行此分析时，需要考虑几件事情。重要的是要有适当的对照样品。对于该实验，使用两种不同的对照：对照和对照+氯喹。对照样品用于设定区域的阈值。它代表自噬的基础水平，而不会阻止溶酶体降解，并且是饥饿样品的对照。然而，对照样品不是适用于与Starved + Chloroquine样品相比较的对照，因为氯喹本身会影响对照样品。因此，有必要使用Control + Chloroquine样品。
在对自噬进行任何分析之前，重要的是仅对焦点上的单个单元格（ 即，梯度RMS大于60）进行分析/门控，因为如果存在多个单元格或图像是可能会影响结果失焦了自噬体至关重要es和溶酶体正在关注适当的斑点计数和BDC3分析。在自噬分析之前必须去除凋亡细胞，因为它们可能会使结果偏斜，不应包括在内。对于所有三种标记物（ 即 LC3，p62和LAMP1）都应有适当的染色。例如，所有三个标记都是细胞内的，应该有点状信号;如果信号没有点状，或者如果它在细胞表面，则染色不合适，并且重新实验/染色。另外，对于BDC3来说，对于所有三种感兴趣的荧光标记来说，对于对于明亮的细胞是必要的。需要对积极事件进行选择，以防止BDC3对非特异性结合，成像伪像和/或噪声的测量。这是至关重要的，因为BDC3可以潜在地放大不是真实信号的伪像。由于BDC3只能在亮阳性事件上执行，因此许多单元可能不包括在最终分析中;这是espec对于没有LC3，p62和/或LAMP1的任何积累的对照细胞是真实的。因此，该测定的局限性是BDC3仅检测对于所有三种标记物呈阳性的细胞，这可能不适用于所有自噬实验。
像BDS，先前已经报告了15，16，17，20，21，22，23，24，25，26，BDC3本身并没有考虑到自噬细胞器共定位的数量，从而导致很大程度的自噬数量的变异性。因此，Rajan 等人提出的双变量方法被雇用看一下双变量图，可以问一下对于LC3，p62和LAMP1，细胞必须是阳性的;为什么有这么多的细胞有0个点？这是因为LC3信号可能足够亮以进行共定位，但它可能不符合由峰值掩模（Peak（M11，Ch11-LC3-AF647，Bright，4））设置的阈值，它被认为是点。
本文提出的方案使用MIFC来计数LC3点位点和三个自噬标记物的共定位以测量自噬通量。在基础条件（对照样本）下，自噬体数量少，“高点”发现少数细胞。随着加入抑制自噬体/溶酶体融合的氯喹，LC3斑点数量增加。由于溶酶体不能分解自噬体和位于自噬体中的p62，因此导致LC3，p62和LAMP1自体聚集体积累的共定位增加。这种作用在营养物starvat下扩增离子，诱导自噬。然而，没有添加氯喹，自噬体数量没有显着增加，这很可能是由于自噬周转率的增加。当细胞在氯喹存在下饥饿时，自噬体的共定位和数量有所增加，这支持了饥饿增加自噬通量的结论。已知EBSS是自噬的强大诱导剂。因此，预计增幅会很大。如果使用另一种方法，例如药物诱导来诱导自噬，则对照和处理的样品之间的差异可能更为微妙。
该特定方案被设计用于测量人类细胞系中的自噬，但该测定可以通过切换到该特定物种的抗体来适应其他物种。此外，分析方法可用于需要共定位的任何细胞内应用的三个探针/标记。
Disclosures
我是MilliporeSigma的工作，MilliporeSigma是Amnis品牌ImageStream的制造商，在这项研究中使用。
Acknowledgments
感谢MilliporeSigma的同事Philip J. Morrissey和Sherree L. Friend对他们多年来的支持和指导。我还要感谢Vidya Venkatachalam和Bryan R. Davidson在IDEAS软件中的BDC3功能的帮助， Ryan P. Jessup帮助编辑这本手稿，Raymond Kong在拍摄当天的帮助，特别感谢化妆师辛西娅Xamonthiene。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
References
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