Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1 को मापकर आटोफैजिक फ्लक्स का मूल्यांकन करना मल्टी-स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55637
Automatic Translation
1
1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

Summary

यहां, एक विश्लेषणात्मक विशेषता के साथ बहु-स्तरीय इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री जो 3 भोजी मार्करों की उज्ज्वल विस्तृत छवियों की तुलना करती है और एलसी 3 स्पॉट काउंटींग के साथ-साथ उनके सह-स्थानीयकरण का मात्रामान करती है, एक उद्देश्य, मात्रात्मक और सांख्यिकीय रूप से मजबूत तरीके से भोजी को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Abstract

आटोफ़ाजी एक अपाचे पथ है जिसमें सामान्य या बेकार सेलुलर घटकों जो वृद्धि और भेदभाव के दौरान जमा होती हैं, लियोसोम के माध्यम से अपमानित होती हैं और पुनर्नवीनीकरण की जाती हैं। भोजी के दौरान, साइटोप्लाज्मिक एलसी 3 प्रोटीन लिपिडेटेड है और ऑटोफॉगोसॉमल झिल्ली को भर्ती किया जाता है। Autophagosome तो lysosome साथ फ़्यूज़ autolysosome बनाने के लिए, जहां autophagosome पुटिका और इसकी सामग्री का टूटना होता है। Ubiquitin- जुड़े प्रोटीन पी 62, जो एलसी 3 से जुड़ा हुआ है, का उपयोग आक्सीकारक फ्लक्स की निगरानी के लिए भी किया जाता है। भोजीभन के माध्यम से चलने वाली कोशिकाओं को पी 62, एलसी 3, और लाइसोसोमल मार्कर के सह-स्थानीयकरण का प्रदर्शन करना चाहिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल प्रति सेल के आधार पर एलसी 3 पॉंक्टा, पी 62, और / या लियोसोमों की पहचान करने के लिए किया गया है। हालांकि, एक उद्देश्य और सांख्यिकीय रूप से कठोर मूल्यांकन प्राप्त करना कठिन हो सकता है इन समस्याओं पर काबू पाने के लिए, बहुआयामी इमेजिंग प्रवाह cytometry का प्रयोग एक विश्लेषणात्मक सुविधा के साथ किया गया था जो कि चमकदार डे की तुलना करता हैतीन फार्मेसी मार्करों (एलसी 3, पी 62 और लियोसोम्मल एलएएमपी 1) की पूंछ चित्रों और उद्देश्य, मात्रात्मक, और सांख्यिकीय रूप से मजबूत तरीके से भोजी को मापने के लिए एलसी 3 स्पॉट गणना के संयोजन के साथ, उनके सह-स्थानीयकरण का मात्रा बढ़ाता है।

Introduction

मैक्रोउोटोफैजी, जिसे बाद में आटोफॉजी कहा जाता है, एक अपाचे पथ है जिसमें क्षतिग्रस्त या बेकार घटक, दीर्घकालिक प्रोटीन और ऑर्गेनल्स को लियोसोम के माध्यम से अपमानित किया जाता है और पुनर्नवीनीकरण 1 होता है । भोजी एक गतिशील, मल्टीस्टिप प्रक्रिया है जिसमें एक ऑटोफॉगोओसोम का गठन होता है; लियोसोम के साथ autophagosome के संलयन, autolysosome बनाने; और autolysosome 2 की सामग्री के क्षरण स्तनधारी प्रणालियों में फार्मेसी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला महत्वपूर्ण जैविक मार्कर माइक्रोट्यूब्यूले से जुड़े प्रोटीन 1 ए / 1 बी-लाइट चेन 3 (एलसी 3) है, जो ऑटोफॉगोसॉमल झिल्ली बनाता है। भोजी के दौरान, साइटोसोलिक एलसी 3-1 एलसी 3-II बनाने के लिए फॉस्फेटिडेलेथेनॉलमाइन को संयुग्मित किया जाता है; एलसी 3-द्वितीय को फिर से ऑटोग्राजासोमल झिल्ली 3 में शामिल किया जाता है ऑटोग्राजिक फ्लक्स के लिए एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मार्कर ऑटोजी रिसेप्टर सीक्वेस्टोमोम 1 (एसकेएसटीएम 1, पी 62) है जो शारीरिक रूप से ली गई हैAutophagic झिल्ली 4 , 5 में nks autophagic कार्गो

पारस्परिक रूप से फार्मेसी को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीके पश्चिमी ब्लोट्स और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 7 हैं । हालांकि, इन दोनों तरीकों को "सोना मानक" माना जाता है, 2 , 6 क्योंकि इन दोनों तकनीकों से जुड़े चुनौतियां हैं पश्चिमी ब्लॉट केवल एक औसतन देते हैं क्योंकि वे एक समरूप नमूना का उपयोग करते हैं, इसलिए पर्यवेक्षक यह नहीं देख सकते कि व्यक्तिगत कोशिकाओं में क्या हो रहा है। दूसरी ओर, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एकल-सेल स्तर पर एक पर्यवेक्षक जानकारी देता है, लेकिन इसमें थ्रुपुट क्षमताओं की कमी होती है, जिससे उद्देश्य और सांख्यिकीय रूप से कठोर मूल्यांकन प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। हाल के वर्षों में, बहुआयामी इमेजिंग प्रवाह cytometry (एमआईपी, सामग्री की तालिका देखें) द्वारा एलसी 3 और पी 62 का माप पॉपु को प्राप्त कर रहा हैइसकी मात्रात्मक शक्ति, उच्च क्षमता के कारण, बहुसंकेतन क्षमता, और हर कोशिका को चित्रित करने की क्षमता के कारण लारीता एमआईपी के उपयोग से फास्टफोजी को मापने के लिए सर्वाधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों में से एक, इसके साथी विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ, एलसी 3 पॉन्काटा या ऑटोफॉगोओसोम 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 की जगह की गणना के माध्यम से है। , 15 , 16 , 17 हालांकि, ऑटोफॉगोओसोम में वृद्धि का मतलब यह नहीं है कि भोजी में वृद्धि हुई है, क्योंकि यह प्रक्रिया 2 में नाकाबंदी का प्रतिनिधित्व कर सकती है। एलसी 3-द्वितीय कारोबार उपस्थिति में कोशिकाओं का विश्लेषण करके आंशिक प्रवाह को मापने के लिए एक उपयोगी पैरामीटर हैएक लियोसोमल डिग्रेडेशन अवरोधक की अनुपस्थिति, जैसे क्लोरोक्वाइन। क्लोरोक्विन लाइयोसोम में ऑटिफेगोसोम के संलयन को रोक देता है, जिससे लाइसोजोमल डिग्रेडेशन 18 से पहले ऑटोग्राजिक फ्लक्स को गिरफ्तार करके आंतों की डिग्री के रूप में ऑटिग्रोगोसोम गठन की मात्रा को अनुमति दी जा सकती है। इसके अलावा, पी 62 मुख्य रूप से भोजी द्वारा अवगुणित हो गया है, और यदि आटोफॉगोसोम के लियोसोमल डिग्रेडेशन और इसकी सामग्री को अवरुद्ध कर दिया गया है, तो पी 62 का संचय 17 , 1 9 की अपेक्षा है।

भोजी एक बहुस्तृत प्रक्रिया है, और अकेले एलसी 3 या पी 62 का माप केवल कोशिकाओं में क्या हो रहा है की पूरी तस्वीर नहीं प्रदान करता है। हाल के प्रकाशनों ने ऑटोोलिओसोम 2 , 17 , 20 , 21 के समवर्ती गठन की जांच करने की आवश्यकता पर जोर दिया है। एमआईपी है17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - विशिष्ट लाइसोसोम से 15 autophagosome के सह स्थानीयकरण इमेजिंग द्वारा autolysosome के गठन को मापने में सक्षम। इसके अलावा, एमओपी का उपयोग कर पी 62 और एलसी 3 के सह-स्थानीयकरण का भी पता चला है कि ऑटोग्राजिक फ्लक्स 5 को मापने के लिए संदर्भित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में "सुविधा" जो सह-स्थानीयकरण को उपायों को "उज्ज्वल विस्तार समानता आर 3" (बीडीएस) कहते हैं और विशेष रूप से दो छवियों के छोटे, उज्ज्वल छवि विवरण की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। बीडीएस 3-पिक्सल या उससे कम के दायरे वाले स्थानीयकृत उज्ज्वल स्पॉटों के लॉग-ट्रांसज्ज्ज्ड पियरसन के सहसंबंध गुणांक है; दूसरे शब्दों में, बीडीएस ओ की डिग्री की गणना करता हैदो अलग-अलग फ्लोरोसेंट चैनलों से सपोर्टिंग पिक्सेल उज्ज्वल स्पॉट या तो सहसंबंधित होते हैं ( यानी, एक ही स्थानिक स्थान) या असंगठित ( यानी, विभिन्न स्थानिक स्थान)। इसलिए, सहसंबंध गुणांक 0 (असंबद्ध) और 1 (पूर्ण सहसंबंध) के बीच भिन्न होता है। गुणांक शून्य और अनन्तता 26 , 27 के बीच सीमा को बढ़ाने के लिए लॉग-ट्रांसफ़ॉर्म किया गया है। केवल बीडीएस पर्याप्त नहीं हो सकते हैं; राजन एट अल पाया गया कि केवल बीडीएस का उपयोग करने से झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक परिणाम 21 हो सकता है । बीडीएस भोजी के दो मार्करों के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन करता है, लेकिन ऑटिफेगोसोम की संख्या पर विचार नहीं करता है ऑटोफॉगोओसोम्स की संख्या के लिए खाता, राजन एट अल एलसी 3 के 21 अंक की स्पॉट-गिनती भी शामिल है राजन एट अल एलसी 3 स्पॉट काउंटी बनाम बीडीएस का एक बिवेरेट स्कैटर प्लॉट का उपयोग करने का प्रस्ताव इस बिविकेट प्लॉट का उपयोग करना, दो जनसंख्या वालेई पहले की पहचान की: एक कोशिका के साथ जो उच्च स्तर के एलसी 3 स्पॉट और एक कोशिका है जिसमें कम स्तर का एलसी 3 स्पॉट होता है। कम सह स्थानीयकरण (यानी, autophagosomes का संचय) और कोशिकाओं उच्च सह स्थानीयकरण (यानी, autolysosomes का संचय) के साथ साथ कोशिकाओं: उच्च LC3 स्थान जनसंख्या आगे दो आबादी में वर्गीकृत किया गया था। इस बिविकेट प्लॉट से कोशिकाओं के बीच बहुत अंतरफोजोसोम और कोशिकाओं के बीच भेद करने की सुविधा मिलती है, जो कि ऑटोफॉगोओसोम और / या ऑटोोलोसोसोम 21 के संग्रह के साथ होती हैं।

अब तक, एमसीईसी सहयोगी विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में एकल "सुविधा प्रकार" का उपयोग करके एलसी 3, पी 62 और एलएएमपी 1 (लियोसोमल मार्कर) के एक साथ सह-स्थानीयकरण संभव नहीं था। हालांकि, एक नया फीचर, जिसे हाल ही में संस्करण 6.1 में पेश किया गया है, को ब्राइट डिक्शन कॉलोकलाइजेशन 3 (बीडीसी 3) कहा जाता है। बीडीसी 3 की तीन छवियों में से प्रत्येक की उज्ज्वल विस्तृत छवियों की तुलना करती है (इस मामले में, एलसी3, पी 62, और एलएएमपी 1) और तीन जांचों ( यानी, एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1) के सह-स्थानीयकरण को मात्राबद्ध करता है। बीडीसी 3 की सुविधा पीयरसन के सहसंबंध गुणांक को तीन छवियों तक विस्तारित करने के लिए संशोधित करता है। चूंकि तीन छवियों में उज्ज्वल स्पॉट्स या तो सहसंबद्ध या असंसठित होते हैं, सहसंबंध गुणांक 0 (असंबद्ध) और 1 (पूर्ण सहसंबंध) के बीच भिन्न होता है। गुणांक 0 और अनंत के बीच गतिशील रेंज को बढ़ाने के लिए लॉग-ट्रांसफ़ॉर्म किया गया है। बीडीसी 3 सुविधा के साथ बीडीएस सुविधा को बदलकर, राजन एट अल द्वारा प्रस्तुत विश्लेषण विधि एक ही समय में एक प्रणाली में भोजी को मापने के लिए अब तीन सबसे अधिक उपयोग किए गए मार्करों को शामिल कर सकते हैं। एक एकल परख के इन तीन मार्करों को सह-स्थानीयकरण करने की क्षमता के कारण प्रेरण और भोजी के विनियमन में उपन्यास अंतर्दृष्टि हो सकती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल जर्कट कोशिकाओं में भोजी को प्रेरित करने के लिए कदम की रूपरेखा; एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1 एंटीबॉडी वाले कोशिकाओं को लेबल करें; एक multisp पर डेटा प्राप्त करेंइक्ट्र्रल इमेजिंग प्रवाह cytometer; और आंशिक फ्लक्स का आकलन करने के लिए डेटा का विश्लेषण करें।

Protocol

1. संस्कृति माध्यम और लियोसोमल डिग्रेडेशन इन्हिबिटर की तैयारी

  1. 1.1। 1x आरपीएमआई संस्कृति माध्यम के ~ 500 एमएल बनाओ 5 एमएल एमईएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (100x), 5 एमएल सोडियम प्यूरवेट (100 मिमी), 5 एमएल ऑफ पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन (100 एक्स), और 25 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) 500 एमएल तक जोड़ें आरपीएमआई की बोतल - 1640 1x मध्यम माध्यम एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में तैयार किया जाना चाहिए। RPMI संस्कृति माध्यम को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें आरपीएमआई संस्कृति माध्यम को जर्कट कोशिकाओं को जोड़ने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से पहले ही गरम करें।
  2. 100 मिमी क्लोरोक्वाइन बनायें, लियोसोमल डिग्रेडेशन इनहिबिटर। क्लोरोक्वाइन डीफ़ोस्फेट नमक के 0.05 ग्राम वजन और 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल संस्कृति-ग्रेड पानी के 1 एमएल में जोड़ें। क्लोरोक्वाइन भंग होने तक भंवर

2. कोशिकाओं का संवर्धन

  1. संस्कृति में 80 एमएल का जीराकैट कोशिकाएं एलपीएमआई संस्कृति माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में क्लोन ई 6-1 है।
    नोट: जब संवर्धन कोशिकाओंया निर्धारण के पहले जर्कट कोशिकाओं के साथ काम करना, सभी कार्य जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
  2. ऑटॉग्जी को प्रेरित करने से पहले कोशिकाओं / एमएल को निर्धारित करने के लिए एक हेमोसाइटेटोमीटर या किसी अन्य सेल काउंटीिंग डिवाइस का उपयोग करके जर्कक कोशिकाओं की गणना करें।

3. कोशिकाओं में आतिशबाजी भक्षण

  1. झुरकट कोशिकाओं को घातीय वृद्धि चरण में ले लीजिए और उन्हें 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 20 मिलीलीटर के चार नमूनों में विभाजित किया गया। ट्यूबों को "नियंत्रण", "नियंत्रण + क्लोरोक्वीन," "भूखे," और "भूखे + क्लोरोक्विन" लेबल करें।
    नोट: जिर्कट कोशिकाओं में 2.5-5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता होनी चाहिए।
  2. सीए 2 + या एमजी 2 + (एचबीएसएस) के बिना हर नमूना के हांक के संतुलित नमक समाधान के 30 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। 10 मिनट के लिए 250 xg पर अपकेंद्रित्र एक अपशिष्ट बीकर में सतह पर तैरनेवाला बंद करें
  3. आरपीएमआई संस्कृति माध्यम के 20 एमएल में 25 मिलीलीटर का उपयोग कर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नियंत्रण नमूने Resuspendटेरेस डिस्पोजेबल पिपेट, जो कि प्रकाश भंवराई कर रहा है। इसी तरह, सीए 2 + या एमजी 2 + (ईबीएसएस) के बिना अर्ल के बैलेंस्ड नमक समाधान के 20 एमएल में भूखे नमूने को फिर से खोलें।
  4. 25 एमएल बाँझ डिस्पोजेबल विंदुक का प्रयोग करके, नियंत्रण और भूखे नमूने टी 75 फ्लास्क को स्थानांतरित करें, जिन्हें "कंट्रोल," "कंट्रोल + क्लोरोक्वीन," "भूखे," और "भूखे + क्लोरोक्विन" लेबल किया गया है।
  5. "कंट्रोल + क्लोरोक्विन" और "भूखे + क्लोरोक्विन" बोतल में 20 मिलीलीटर सेल संस्कृति माध्यम के 20 एमएल को 100 एमएम क्लोरोक्विन के 20 μL जोड़ें। फ्लास्क को धीरे-धीरे घूमते हुए क्लोरोक्वाइन में मिलाएं। 2 घंटे के लिए सभी फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।

4. एलसी 3, एलएएमपी 1 और पी 62 के निर्धारण और लेबलिंग के लिए बफर तैयार करना

  1. पीबीएस में 10 एमएल का 4% फॉरमेटरीन निर्धारण समाधान तैयार करें। फॉस्फेट-बफर्ड 10 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर फॉस्फेट-बीफ़र्ड में 4 एमएल जोड़ें।सीए 2 + या एमजी 2 + (पीबीएस) और 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 एमएल का अतिरक्त पानी के बिना खारा समाधान।
    नोट: सावधानी फास्फोरिक / फॉर्मलाडीहाइड जहरीली है अगर साँस या निगल लिया हुआ है; आंखों, श्वसन तंत्र और त्वचा को परेशान कर रहा है; और साँस लेना या त्वचा संपर्क से संवेदनशीलता का कारण हो सकता है। आँखों को गंभीर नुकसान का एक जोखिम है यह एक संभावित कैसरजन है
  2. पीबीएस में 1% औपचारिक फॉण्ट रिसासपन्शन समाधान के 10 एमएल तैयार करें। 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 9 एमएल 1x पीबीएस में 10% फॉम्रिनरी स्टॉक में 1 एमएल जोड़ें।
  3. 1 एमबी की बोतल 1x पीबीएस में 10 मिलीलीटर एफबीएस जोड़कर 500 एमएल धो धो बफर तैयार करें।
  4. 50 एमएल ट्रांसमिशन बफर में 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.5 एमएल 10% ट्रिपन एक्स -100 को 49.5 एमएल वॉश बफर के चरण 4.3 में तैयार करके तैयार करें।
  5. एंटी-एसक्यूटीएम 1 / पी 62-एलेक्सा 488 (एएफए 488) एंटीबॉडी / ट्रांसएबिलाइज़ेशन बफर काम करने का समाधान तैयार करें जिसमें 5 μ एल एंटी-एसक्यूटीएम 1 / पी 62-एएफए 488 से 495 μ एल ट्रांसमिलेज़ेशन बफर शामिल है।टीप 4.4 सुनिश्चित करें कि अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता 5 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    नोट: एंटीबॉडी permeabilization बफर काम कर समाधान बनाने से पहले नमूना को जोड़ने के लिए। प्रकाश से समाधान की रक्षा करें
  6. माउस एन्टी-एलसी 3 / ट्रांसएबिलाइज़ेशन बफर काम कर समाधान तैयार करें ताकि चरण 4 में बने ट्रांसएबिलाइजेशन बफर के 5 5 एलएलएल माउस एलसी 3-एलसी 3 को जोड़कर तैयार किया जा सके। सुनिश्चित करें कि अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता 20 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    नोट: एंटीबॉडी ट्रांसएबिलाइज़ेशन बफर काम करने वाले समाधान को नमूने में जोड़ने से पहले ही करें। प्रकाश से समाधान की रक्षा करें
  7. कदम 4.4 में किए गए permeabilization बफर के 495 μL के आईजीजी - एबी 647 लेबल गधा विरोधी माउस के 5 μL जोड़कर गधा विरोधी माउस-एलेक्सा 647 (एएफ 647) / permeabilization बफर काम कर समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता 20 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    नोट: एंटीबॉडी permeabilization बफर काम करने का समाधान केवल नमूने को जोड़ने से पहले करें। टी को सुरक्षित रखेंवह प्रकाश से समाधान
  8. चरण 4 में किए गए पारिएबलाइज़ेशन बफर के 475 μL के लिए एंटी-सीडी 10 7 ए (एलएएमपी 1) -पीपी के 25 μL जोड़कर मानव-मानव CD107a (LAMP1) -PE एंटीबॉडी / परमेजिलिफिकेशन बफर काम समाधान का समाधान करें। सुनिश्चित करें कि अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता 21 माइक्रोग्राम / एमएल है।
    नोट: एंटीबॉडी permeabilization बफर काम करने का समाधान केवल नमूने को जोड़ने से पहले करें। प्रकाश से समाधान की रक्षा करें
  9. 5 एमजी / एमएल डीएपीआई के 4 μL और 10% ट्रिपन एक्स-100 से 896 μL 1x पीबीएस के 100 μL जोड़कर 10x डीएपीआई परमाणु दाग ​​तैयार करें।

5. एलसी 3, एलएएमपी 1, और पी 62 के साथ जिर्कैट सेल लेबलिंग

  1. प्रति नमूना 2 x 10 6 कोशिकाओं को निकालें (चरण 2.2 में कोशिकाओं की गणना करें)। प्रत्येक नमूना को 15-एमएल सेंट्रीव्यूज ट्यूब में रखें, जिसे उचित नमूना नाम ( यानी, नियंत्रण, नियंत्रण + क्लोरोक्वीन, भूखे, या भूखे + क्लोरोक्वाइन) के साथ लेबल किया गया है।
    1. वॉश बफर जोड़ें ताकि मैं वहां जा सकूंप्रत्येक 15-एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 15 एमएल की कुल मात्रा। 10 मिनट के लिए 250 xg पर नमूनों को अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला बंद आकांक्षा
  2. प्रत्येक सेल छर्रों के लिए 100 μL का 4% फॉर्टलिन निर्धारण समाधान जोड़ें। एक P200 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं निर्धारण चरण के दौरान, नमूनों को लेबल, सिलिकॉनिज्ड पॉलीप्रोपीलेन माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    नोट: कोशिकाओं को अधिक सुधार न करें; इससे खराब लेबलिंग परिणाम हो सकते हैं।
  3. 10 मिनट के निर्धारण चरण के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए धोने बफर के 1 एमएल जोड़ें। नमूना मिश्रण करने के लिए एक P1000 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें। 5 मिनट के लिए 250 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला बंद आकांक्षा
  4. प्रत्येक नमूने के लिए 100 μL विरोधी SQSTM1 / p62 - AF488 एंटीबॉडी / permeabilization बफर काम समाधान जोड़ें। एक P200 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 1 एमएल का जोड़कर कोशिकाओं को धो लेंप्रत्येक नमूने के लिए permeabilization बफर। नमूना मिश्रण करने के लिए एक P1000 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें। 5 मिनट के लिए 250 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला बंद आकांक्षा
  6. हर एंटीबॉडी कार्य समाधान के लिए चरणों 5.4-5.5 दोहराएं।
    नोट: एन्टीबॉडी काम करने वाले समाधान माउस विरोधी LC3 / permeabilization बफर काम कर रहे समाधान, गधा विरोधी माउस - AF647 / permeabilization बफर काम कर रहे समाधान, और विरोधी मानव CD107a (LAMP1) - पीई एंटीबॉडी / permeabilization बफर काम कर रहे समाधान है। प्रत्येक एंटीबॉडी को अलग से और सूचीबद्ध क्रम में किया जाना चाहिए। आदेश को एंटीबॉडीज के बीच अवांछित क्रॉस-एटिबिलिटी को कम करने के लिए चुना गया था।
  7. 1% औपचारिक समाधान के 100 μL जोड़ें। एक P200 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend प्रत्येक नमूने के 10x डीएपीआई परमाणु दाग ​​के 10 μL जोड़ें। हल करने के लिए प्रत्येक नमूना हल्के भंवर। उपकरण पर किसी भी नमूने को चलाने से पहले कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट सेते हैं।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूना या तो बी हो सकता हैई एम आई पी पर चलती है या प्रकाश से 2-8 डिग्री सेल्सियस तक एक सप्ताह तक बचाया जाता है।

6. सिंगल-रंग नियंत्रण लेबलिंग

  1. प्रत्येक एकल-रंग नियंत्रण ( यानी, AF488, पीई, एएफ 647 और डीएपीआई) के लिए, 1 x 10 6 जर्कट कोशिकाओं को लेते हैं, जो नमूना आबादी में से किसी से हो सकता है। 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1 x 10 6 कोशिकाओं को या तो AF488, पीई, एएफ 647, या डीएपीआई के रूप में चिह्नित करें।
  2. वॉश बफर जोड़ें ताकि प्रत्येक 15 एमएल के अपकेंद्रित्र ट्यूब में 15 एमएल की कुल मात्रा हो। 10 मिनट के लिए 250 xg पर नमूनों को अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला बंद आकांक्षा
  3. एएफए 488, पीई और एएफ 647 ट्यूबों में 100 μL धोने बफर जोड़ें।
    नोट: डीएपीआई ट्यूब के लिए, चरण 6.8 पर जाएं।
    1. एक P200 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण
  4. क्रमशः 5 μL या तो एंटी-सीडी 45-एएफए 488, सीडी 45-पीई या एंटी-सीडी 45-एएफ 647 एएफ 488, पीई या एएफ 647 ट्यूबों में जोड़ें। मरोड़ द्वारा भंवरightly।
  5. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए AF488, पीई, और एएफ 647 ट्यूबों सेते हैं।
    नोट: अन्य मार्करों का इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी -1 एंटीबॉडी ऐन्डी-सीडी 45 एंटीबॉडीज़ के बजाय। हालांकि, CD45 एकल रंग नियंत्रणों के लिए एक विश्वसनीय मार्कर है।
  6. प्रत्येक नमूने के लिए 1 एमएल की वॉश बफर जोड़कर AF488, पीई, और एएफ 647 कोशिकाओं को धो लें।
    1. नमूना मिश्रण करने के लिए एक P1000 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें। 5 मिनट के लिए 250 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला बंद आकांक्षा
  7. 1% औपचारिक समाधान के 100 μL जोड़ें। एक P200 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend
    नोट: इस बिंदु पर, नमूना या तो एमआईपीसी पर चलाया जा सकता है या प्रकाश से 2-8 डिग्री सेल्सियस तक एक सप्ताह तक बचाया जाता है।
  8. डीपीआई ट्यूब में 1% औपचारिक फिक्सेशन समाधान के 100 μL जोड़ें।
    1. एक P200 विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा Resuspend कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 10 जोड़ें1; डीएपीआई नमूने के लिए 10x डीएपीआई परमाणु दाग़ का एल। मिश्रण करने के लिए हल्के भंवर उपकरण पर चलने से पहले कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: इस बिंदु पर, नमूना या तो एमआईपीसी पर चलाया जा सकता है या प्रकाश से 2-8 डिग्री सेल्सियस तक एक सप्ताह तक बचाया जाता है।

7. एमआईपीसी शुरू करना और कैलिब्रेट करना

  1. यह सुनिश्चित करने के लिए जांच करें कि म्यान, सिस्टम कैलिब्रेशन अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें), डिबबबलर, क्लीनसर्स और स्टेरिलिज़र कंटेनर भरा हुआ है और कचरे का टैंक रिक्त है। यदि नहीं, तो कंटेनर भरें और अपशिष्ट टैंक खाली करें।
  2. सिस्टम को पावर करें और एप्लिकेशन लॉन्च करने के लिए सॉफ़्टवेयर पर डबल-क्लिक करें ( सामग्री की तालिका देखें) आइकन; यह एमपीईसी सॉफ्टवेयर शुरू करेगा
  3. स्टार्टअप बटन पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि सभी कैलिब्रेशन्स प्रारंभ करें और टेस्ट्स चुने गए हैं। यह सिस्टम फ्लश करेगा, लोड शीथ, सिस्टम कैलिब्रेशन अभिकर्मक,और सिस्टम को जांचना

8. MIFC पर नमूने और सिंगल-रंग नियंत्रण चलाते हुए

  1. फ़ाइल टैब पर जाकर और डिफ़ॉल्ट टेम्पलेट को लोड करके डिफ़ॉल्ट टेम्पलेट लोड करें ।
    नोट: डिफ़ॉल्ट टेम्पलेट में कच्चे अधिकतम पिक्सेल डॉट प्लॉट शामिल हैं
  2. अपने संबंधित बटन पर क्लिक करके 488 एनएम, 405 एनएम, 642 एनएम, और एसएससी लेसरों को चालू करें। प्रत्येक लेजर बटन के बगल में वांछित शक्ति में प्रवेश करके लेज़र पावर सेट करें। चित्र 1 देखें
    नोट: इस प्रयोग के लिए, लेजर शक्तियां क्रमशः 488 एनएम, 405 एनएम, 642 एनएम और एसएससी के लिए 200 मेगावाट, 20 मेगावाट, 150 मेगावाट और 5 मेगावाट (सी 060) हैं। यह MIFC डिफ़ॉल्ट टेम्पलेट बढ़ाई 40X पर सेट है, डिफ़ॉल्ट संवेदनशीलता है हाय , और सभी चैनल सक्षम हैं
  3. पुष्टि करें कि आवर्धक स्लाइडर को 40X पर सेट किया गया है, उच्च संवेदनशीलता मोड चुना गया है, और सभी चैनल छवि गैलरी में दिखाए जा रहे हैं; आकृति 1
  4. लोड बटन पर क्लिक करके और 1.5 एमएल ट्यूब को उपकरण पर लोड करके "भूखे + क्लोरोक्विन" नमूना लोड करें।
    नोट: इस प्रायोगिक नमूने में AF488, पीई और एएफ 647 के लिए सभी नमूनों का उच्चतम संकेत होना चाहिए (डीएपीआई संकेत में "भूखे + क्लोरोक्विन" नमूना सहित सभी प्रयोगात्मक नमूनों के लिए लगभग समान संकेत ताकत होनी चाहिए)।
  5. 488 एनएम, 405 एनएम, 642 एनएम, और एसएससी लेज़रों के लिए उपयुक्त लेजर शक्तियां निर्धारित करने के लिए "भूखे + क्लोरोक्विन" नमूना का प्रयोग करें। लेजर शक्तियों को समायोजित करने के लिए डिफ़ॉल्ट टेम्प्लेट से कच्चे अधिकतम पिक्सेल डॉट प्लॉट का प्रयोग करें ताकि सिगनल मजबूत हो लेकिन 4,0 9 6 के अधिकतम पिक्सेल मूल्य तक नहीं पहुंच पाएं, जो सीसीडी कैमरा को उपकरण पर भरेगा। सभी प्रायोगिक नमूनों के लिए इस लेजर सेटिंग का उपयोग करें
  6. नया डॉट साजिश बनाने के लिए बनाएं डॉट प्लॉट्स आइकन पर क्लिक करें। चुनें "Area_M"01 "एक्स-अक्ष और" पहलू अनुपात_M01 "पर" सभी "आबादी के लिए Y- अक्ष पर। बहुभुज क्षेत्र बनाएँ आइकन पर क्लिक करें। कक्षों के आसपास एक क्षेत्र बनाएं। इस क्षेत्र का नाम" सेल। "
    नोट: उपयोगकर्ता एकत्र किए जाने वाले कक्षों को कम करने के लिए अतिरिक्त भूखंडों और क्षेत्रों को जोड़ सकते हैं जोड़ने के लिए एक आम अतिरिक्त साजिश ग्रेडिएंट आरएमएस होगी जो फोकस में हैं।
  7. अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें फ़ाइल नाम और गंतव्य फ़ोल्डर निर्दिष्ट करें, घटनाओं की संख्या "5,000" पर बदलें और "सेल" संग्रह आबादी का चयन करें। फ़ाइल प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें। फ़ाइल एकत्र करने के बाद, लौटें बटन पर क्लिक करके नमूना वापस करें उपकरण से नमूना ट्यूब निकालें
  8. अगले तीन नमूनों ("भूखे," "नियंत्रण" और "नियंत्रण + क्लोरोक्विन") के लिए, नमूना लोड करें, नमूना नाम दर्ज करें, नमूना प्राप्त करें, और उसी सेटिंग का उपयोग करके नमूना वापस करेंऊपर "भूखे + क्लोरोक्विन" नमूना के लिए, ऊपर
  9. नमूनों का अधिग्रहण करने के बाद, एकल-रंग नियंत्रण नमूने चलाएं और डेटा प्राप्त करें ताकि मुआवजा मैट्रिक्स बनाया जा सके। एसएससी बटन पर क्लिक करके एसएससी लेजर बंद करें। ब्राइटफील्ड बटन पर क्लिक करके और बंद का चयन करके उज्ज्वलित चैनल को बंद करें ।
    नोट: अगर प्रायोगिक नमूना अधिग्रहण के लिए छवि गैलरी से चैनल हटा दिए गए थे, तो सभी चैनल पुन: सक्षम करें। वैकल्पिक रूप से, मुआवजा टैब पर क्लिक करके और मैट्रिक्स बनाकर एकल-रंग नियंत्रण प्राप्त कर सकते हैं; यह मुआवजा विज़ार्ड खोलता है, जो फ़ाइलों को इकट्ठा करने और क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स बनाने के चरण के माध्यम से चलेंगे।
  10. भार बटन पर क्लिक करके और उपकरण में 1.5 एमएल ट्यूब लोड करके डीएपीआई सिंगल-रंग नियंत्रण लोड करें। नमूना नाम (DAPI केवल) दर्ज करें, संग्रह आबादी को "सभी" पर सेट करें और ईवेंट की संख्या को बदल देंएस "500."
    1. सिंगल-रंग नियंत्रण फ़ाइल प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें।
    2. जब फ़ाइल संग्रह पूरा हो गया है, तो लौटें बटन पर क्लिक करके नमूना वापस करें उपकरण से नमूना ट्यूब निकालें
    3. डीएपीआई नमूने के बाद, लोड बटन पर क्लिक करके और 1.5 एमएल ट्यूब में 10% ब्लीच के 100 μL लोड करने पर नमूना जैसा 10% ब्लीच लोड करें। नमूना ~ 15 एस के लिए चलें यह ट्यूब से किसी भी अवशिष्ट डीएपीआई को निकाल देगा।
    4. अवशिष्ट 10% ब्लीच को हटाने के लिए, 810.3 में 100 μL का 1x पीबीएस चलाएं। उपकरण अब AF488, पीई, और एएफ 647 एकल-रंग नियंत्रण चलाने के लिए तैयार है।
    5. प्रत्येक एकल-रंग नियंत्रण ( यानी, AF488, पीई और एएफ 647) के लिए चरण 8.10-8.10.2 दोहराएं।
      नोट: डीपीआई सिंगल-रंग नियंत्रण के बाद ही इन नमूनों के बीच 10% ब्लीच या पीबीएस चलाने की कोई जरूरत नहीं है।

9. एमआईपीएएन में डेटा विश्लेषणएलीसिज़ सॉफ्टवेयर

  1. MIFC विश्लेषण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें ( सामग्री की तालिका देखें)
  2. ओपन फाइल विज़ार्ड शुरू करने के लिए प्रारंभ विश्लेषण पर क्लिक करें। "भूखे + क्लोरोक्वीन" कच्चे छवि फ़ाइल (। आरआईएफ) पर ब्राउज़ करके खोलने के लिए डेटा फ़ाइल चुनें। फ़ाइल चुनें और ओपन बटन पर क्लिक करें। अगला क्लिक करें
    1. मुआवजा आवेदन करें पहले बनाए गए क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स का चयन करें और अगला क्लिक करें वैकल्पिक रूप से, नया मैट्रिक्स बटन पर क्लिक करके एक नया मुआवजा मैट्रिक्स बनाएं
      नोट: चरण 9.2.1.1- 9.2.1.2 एक नया मैट्रिक्स बनाने के लिए चरण हैं।
      1. एकल रंग नियंत्रण फ़ाइलें जोड़ें (यानी, DAPI केवल, AF488 केवल, केवल पीई, और केवल AF647), फ़ाइलें जोड़ें पर क्लिक फ़ाइलों का चयन, और खोलें बटन क्लिक करके नियंत्रण फ़ाइलें सूची में। अगला क्लिक करें
      2. इस प्रयोग के लिए मुआवजा मैट्रिक्स विंडो बनाएं दिखाई देगा ensurई कि Ch02, Ch03, Ch07, और Ch11 चयनित हैं और अगला क्लिक करें मुआवजा मैट्रिक्स बनाया जाएगा। क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स को बचाने के लिए समाप्त करें क्लिक करें । मुआवजे फ़ाइल को ओपन फाइल विज़ार्ड में जोड़ें और अगला क्लिक करें।
    2. विश्लेषण टेम्प्लेट को लागू करें। इस स्तर पर, लागू करने के लिए कोई विश्लेषण टेम्प्लेट नहीं है, तो अगला क्लिक करें।
      नोट: अन्य प्रायोगिक फाइलों के लिए, यह "भूखे + क्लोरोक्विन डीएएफ" फ़ाइल को एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. फ़ाइल को नाम दें ("राइफ" नामों के अनुरूप फ़ाइल नाम स्वतः उत्पन्न होते हैं) और अगला क्लिक करें। "02," "03," "07," और "11" चैनलों को चुनकर छवि प्रदर्शन गुण सेट करें; चैनल 01, 06, और 09 को पूर्व-चयन किया गया है। अगला क्लिक करें
  3. ओपन फाइल विज़ार्ड के अंत में, अपोप्टोसिस विज़ार्ड चुनें । अपोप्टोसिस विज़ार्ड आइकन पर क्लिक करें और उसके बादअपोप्टोसिस विज़ार्ड खोलने के लिए विज़ार्ड बटन का चयन करें ।
    1. परमाणु छवि चैनल (Ch07) का चयन करें और अगला क्लिक करें। सर्वश्रेष्ठ फोकस में कोशिकाओं को गेट। लाइन क्षेत्र बनाएं आइकन पर क्लिक करें और 60-90 से ग्रेडिएंट RMS_M01_Ch01 पर एक क्षेत्र खींचें। इस क्षेत्र को नाम दें "फोकस," ठीक पर क्लिक करें, और अगला क्लिक करें।
    2. सिंगल सेल गेट बहुभुज क्षेत्र बनाएँ आइकन पर क्लिक करें। एकल कक्षों के आस-पास एक क्षेत्र बनाएं, क्षेत्र "एकल" नाम दें, ठीक पर क्लिक करें, और अगला क्लिक करें। कोई के लिए क्लिक करें "आप उप आबादी का विश्लेषण करना चाहते हैं?"
    3. नाभिक कोशिकाओं के द्वार। बनाएँ लाइन क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें और उस क्षेत्र को आकर्षित करें जिसमें सभी न्यूक्लेयीटेड कक्ष शामिल हों इस क्षेत्र का नाम "न्यूक्लिअएटेड।" ठीक है और अगला क्लिक करें
    4. एपोपोटिक कोशिकाएं गेट। बहुभुज क्षेत्र बनाएँ आइकन पर क्लिक करें। एपोपोटिक कणों के आस-पास एक क्षेत्र बनाएं; ये कोशिकाएं हैंकम परमाणु क्षेत्र के साथ_50% और उच्च उज्ज्वल कंट्रास्ट समाप्त क्लिक करें बहुभुज क्षेत्र बनाएँ आइकन पर क्लिक करके और गैर-अपोप्टीटिक कोशिकाओं के आस-पास एक क्षेत्र खींचकर दूसरा क्षेत्र जोड़ें; इस क्षेत्र को कॉल करें "सेल।"
  4. उन कोशिकाओं का चयन करें जो LAMP1, p62 और LC3 के लिए सकारात्मक हैं। भवन ब्लॉकों आइकन पर क्लिक करें, प्रतिदीप्ति पॉजिटिव्स का चयन करें - एक रंग , और "सेल" जनसंख्या और तीव्रता_एमसीसीएच 0 03 का चयन करें। एक्स-एक्सिस "तीव्रता LAMP1" लेबल करें। एक क्षेत्र बनाएं जिसमें 10,000 से अधिक तीव्रता वाली कोशिकाओं को शामिल करें , बनाएँ लाइन क्षेत्र आइकन पर क्लिक करके क्षेत्र को रेखांकित करें। इस क्षेत्र को लेबल करें "LAMP1 +।" पी -62 और एलसी 3 के लिए पॉज़िटिव पॉज़िटिव का चयन करने के लिए 9.4 के समान चरणों का पालन करें।
    1. P62 के लिए + "LAMP1 +" जनसंख्या और Intensity_MC_Ch02 का चयन करें। एक्स-एक्सिस "तीव्रता पी 62" और पी 62 + कोशिकाओं का क्षेत्र "एलएएमपी 1 + / पी 62 +" लेबल करें।; LC3 + के लिए, "LAMP1 + / p62 +" आबादी और तीव्रता_MC_Ch11 चुनें एक्स-एक्सिस "तीव्रता एलसी 3" और एलसी 3 + कोशिकाओं का क्षेत्र "एलएएमपी 1 + / पी 62 + / एलसी 3 +" लेबल करें। बाकी के विश्लेषण के लिए इस "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" आबादी का उपयोग करें
  5. एलसी 3 स्पॉट की गणना करने के लिए स्थान-गिनती सुविधा बनाएं।
    नोट: यह "भूखे + क्लोरोक्वाइन" नमूना का उपयोग करके बनाया जाना चाहिए।
    1. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और मुखौटा चुनें। नया और फिर फ़ंक्शन बटन पर क्लिक करें। फ़ंक्शन के अंतर्गत, पीक चुनें; मास्क , M11 का चयन करें; और चैनल , Ch11 चुनें स्पॉट से सेल की पृष्ठभूमि अनुपात 4 सेट करें ठीक पर क्लिक करें मास्क सूची में जोड़ने के लिए मास्क समारोह को परिभाषित करें खिड़की और ठीक बंद हुआ। मास्क प्रबंधक से बाहर निकलने के लिए बंद करें पर क्लिक करें ।
    2. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और चुनें नए बटन पर क्लिक करें फ़ीचर प्रकार के तहत, चयन करें स्पॉट गणना और मास्क के तहत, पीक चुनें (एम 11, सीएच 11, ब्राइट, 4)। नाम के लिए "स्पॉट काउंट LC3" टाइप करें और फ़ीचर मैनेजर से बाहर निकलने के लिए ओके और बंद पर क्लिक करें ।
      नोट: स्पॉट विज़ार्ड का इस्तेमाल स्पॉट-कैटल सुविधा बनाने के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली स्पॉट-कैटल सुविधा अन्य प्रयोगों और / या सेल लाइन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है। किसी विशिष्ट डेटा सेट के लिए मुखौटा / सुविधा पर निर्णय लेने पर उपयोगकर्ता को कई स्थान-गणना मास्क / सुविधाओं का परीक्षण करना चाहिए। पग्सली 2017 में एमआईटीसी विश्लेषण सॉफ्टवेयर 26 का उपयोग करते हुए मौके पर गिनती के बारे में अधिक जानकारी दी गई है।
    3. न्यू हिस्टोग्राम आइकन पर क्लिक करें। "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" जनसंख्या का चयन करें स्पॉट काउंट LC3 सुविधा का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें।
  6. बीडीसी 3 सुविधा बनाएं
    1. सीविश्लेषण टैब चाटना और सुविधाओं का चयन करें। नए बटन पर क्लिक करें फीचर प्रकार के तहत, ब्राइट फ़ेंटेवल कॉलोकलाइज़ेशन 3 चुनें ; मुखौटा , MC चुनें ; छवि 1 , Ch02 का चयन करें (पी 62); छवि 2 , चुनें Ch03 (LAMP1); और मैं 3 दांव लगाता हूं , Ch11 (एलसी 3) का चयन करें। नाम के लिए "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" टाइप करें और बाहर निकलने के लिए ठीक और बंद पर क्लिक करें फ़ीचर प्रबंधक
    2. न्यू हिस्टोग्राम आइकन पर क्लिक करें। "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" जनसंख्या का चयन करें BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 सुविधा का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें।
  7. नए स्कैटरप्लॉट आइकन पर क्लिक करें "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" जनसंख्या का चयन करें एक्स-अक्ष के लिए बीडीसी 3 पी 62 / एलएएमपी 1 / एलसी 3 चुनें। Y- अक्ष के लिए स्पॉट काउंट LC3 विशेषता का चयन करें ठीक क्लिक करें
  8. वें बचाओई "भूखे + क्लोरोक्विन" फ़ाइल फ़ाइल पर क्लिक करें और सहेजें डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf) चुनें । फ़ाइल के पिछले संस्करण को बदलने के लिए सहेजें और हाँ क्लिक करें ; यह फ़ाइल अब एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है
  9. "नियंत्रण" फ़ाइल खोलें फाइल पर क्लिक करें और फिर ओपन करें । "Control.rif" फ़ाइल को चुनें और ओपन पर क्लिक करें। चरण 9.2.1 से मुआवजा मैट्रिक्स और टेम्पलेट के रूप में "भूखे + क्लोरोक्विन डैफ" फ़ाइल का चयन करें। ठीक क्लिक करें
  10. क्षेत्रों को सेट करने के लिए "नियंत्रण" नमूना का उपयोग करके ऑटोग्राजासोमिक संचय और आटोलिसिसोम संचय के लिए क्षेत्रों को बनाएं।
    1. आयत क्षेत्र बनाएं आइकन पर क्लिक करें एक्स से निर्देशांक -0.1 से 3 और 1.5 से -0.3 के वाई-निर्देशांक से एक क्षेत्र बनाएं। इस क्षेत्र को नाम दें "कम स्पॉट।" पर क्लिक करें आयत क्षेत्र आइकन बनाएं -0.1 से 1 और वाई-समन्वय के एक्स-निर्देशांक से एक क्षेत्र बनाएं17.5 से 1.5 के एटीएस इस क्षेत्र का नाम "हाई स्पॉट / लो बीडीसी 3।"
    2. आयत क्षेत्र बनाएं आइकन पर क्लिक करें 1 से 3 के एक्स-निर्देशांक से क्षेत्र आकर्षित करें और 17.5 से 1.5 के वाई-निर्देशांक। इस क्षेत्र को "उच्च स्पॉट / उच्च बीडीसी 3" नाम दें।
  11. "नियंत्रण" फ़ाइल को सहेजें फ़ाइल पर क्लिक करें और सहेजें डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf ) चुनें । फ़ाइल के पिछले संस्करण को बदलने के लिए सहेजें और हाँ क्लिक करें ; यह फ़ाइल अब एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है
  12. फ़ाइल और उसके बाद ओपन पर क्लिक करके "नियंत्रण + क्लोरोक्वीन" फ़ाइल खोलें । "नियंत्रण + Chloroquine.rif" फ़ाइल को चुनें और ओपन पर क्लिक करें। चरण 9.2.1 से मुआवजा मैट्रिक्स और टेम्पलेट के रूप में "Control.daf" फ़ाइल का चयन करें। ठीक क्लिक करें "भूखे" और "भूखे + क्लोरोक्वीन" फाइलों के लिए इसे दोहराएं।
    नोट: विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में बैच फ़ंक्शन का उपयोग मुआवजे के लिए भी किया जा सकता हैTion मैट्रिक्स और / या अन्य फ़ाइलों के लिए टेम्पलेट। अंतिम गेटिंग रणनीति को चित्र 2 में दिखाया गया है।

Representative Results

इस विश्लेषण विधि गधे के लिए कई विशेषताओं का उपयोग करता है autophagic प्रवाह। अंतिम बिवरीट प्लॉट को पूरी तरह से समझने के लिए, व्यक्तिगत विश्लेषण विशेषताओं की जांच पहले की जानी चाहिए। स्वस्थता को मापने के लिए ऑटोफॉगोओसोम की गणना एक तार्किक तरीका है; हालांकि, एलसी 3 पॉन्काटा का आकार / आकार / चमक कोशिकाओं के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। विविधता autophagosomes मैन्युअल रूप से गणना या विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक स्थान-गिनती सुविधा का उपयोग करना मुश्किल बना सकता है। इसलिए, ऑटोफॉगोसॉम्स में इस बड़ी परिवर्तनशीलता के कारण कोई स्पॉट-कैटल सुविधा सही नहीं होगी। हालांकि, एक अच्छी जगह-गणना सुविधा 26 से अधिक कोशिकाओं पर काम करेगी। चित्रा 3 चित्रा 3 अलग स्थान मास्क का उपयोग कर Jurkat कोशिकाओं में LC3 puncta के स्थान मास्किंग के उदाहरण दिखाता है। इस डेटा सेट के लिए चयनित स्पॉट-कंट्री फीचर स्पॉट काउंटयूजीक (एम 11, सीएच -11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 4) _4 है, जिसका अर्थ है कि स्पॉट-गिन फीचर ने उन स्थानों की गिनती की है जो कि पे4 (उज्ज्वल, 4) के स्पॉट-टू-सेल पृष्ठभूमि अनुपात के साथ चैनल 11 (च 11-एलसी 3-एएफ 647) पर डिफॉल्ट चैनल 11 मुखौटा (एम 11) के भीतर एके मुखौटा की पहचान की गई। चित्रा 4 नियंत्रण, नियंत्रण + क्लोरोक्वीन, भूखे, और भूखे + क्लोरोक्वीन जर्कट कोशिकाओं के लिए औसत स्थान की गिनती के लिए स्थान-गिनती हिस्टोग्राम और प्रतिनिधि छवियों को दिखाती है- एलसी 3-एएफ 647 विरोधी लेबल। नियंत्रण और भूखे मतलब स्पॉट की गणना काफी अलग नहीं है; क्लोरोक्वाइन के अलावा, भूरा + क्लोरोक्वीन के मुकाबले नियंत्रण + क्लोरोक्वाइन के मध्य में एक बड़ा अंतर है।

जांच करने वाली अगली विशेषता है बीडीसी 3। बीडीसी 3 तीन मार्कर / जांच के सह-स्थानीयकरण का एक माप है, इस मामले में, एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1। चित्रा 5 ए - 5 डी नियंत्रण के लिए बीडीसी 3 हिस्टोग्राम दिखाता है, नियंत्रण + क्लोरोक्वीन, भूखे, और भूखे + क्लोरोक्वीन जर्कट कोशिकाओं को एंटी-पी 62-एएफ -488, एंटी-एलएएमपी 1-पीई, और एंटी-एलसी 3-एएफ 647। नियंत्रण के बीच में एक बदलाव भूखा मतलब से मतलब है, साथ ही नियंत्रण + क्लोरोक्वाइन का मतलब भूखे + क्लोरोक्वीन मतलब है। हालांकि, चित्रा 5 ई -5 एच में औसत बीडीसी 3 के स्कोर से कोशिकाओं की छवियों को देखते हुए, हिस्टोग्राम से नमूनों के बीच एक बड़ा अंतर हो सकता है कि वह विश्वास करने वाला हो। यह इसलिए है क्योंकि बीडीसी 3 भोजी ऑर्गेनेल की संख्या पर विचार नहीं करता है, जो सह-स्थानीयकृत होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक ही बीडीसी 3 स्कोर के लिए ऑटोफॉगोओसोम की संख्या में परिवर्तनशीलता की एक बड़ी मात्रा होती है। ज्यादातर मामलों में, सभी तीन जांचों के बीच ओवरलैप होता है क्योंकि यहां तक ​​कि बेसल स्तर, पी 62, एलएएमपी 1 और एलसी 3 पर भी, कुछ हद तक सेल में समान क्षेत्रों में सह-स्थानीयकरण या निवास करना चाहिए। इसके विपरीत, तीन जांचों का उदाहरण जो सह-स्थानीयकरण नहीं करना चाहिए- पी 62-ए 488 एंटी-एलसी 3-एएफ 647, और डीएपीआई परमाणु डाई भूरा + क्लोरोक्वाइन नमूना के लिए, चित्रा 6 में दिखाया गया है।/ P>

जब स्थान-गिनती सुविधा और बीडीसी 3 सुविधा एकत्रित की जाती है, तो विभिन्न उप-प्रजातियां मौजूद हैं जो विभिन्न नमूनों / परिस्थितियों के बीच भेद करने की क्षमता को सुधारते हैं स्पष्ट हैं। चित्रा 7 चित्रा 7 चार नमूनों के लिए एलसी 3 बनाम बीसीडी 3 पी 62 / एलएएमपी 1 / एलसी 3 की जगह की गणना का बीवीयेट प्लॉट दिखाता है: नियंत्रण, नियंत्रण + क्लोरोक्वीन, भूखे, और भूखे + क्लोरोक्वीन। नियंत्रण नमूना का उपयोग तीन आबादी के लिए गेटिंग रणनीति निर्धारित करने के लिए किया गया था: निम्न स्थान, उच्च स्पॉट / कम बीडीसी 3, और उच्च स्पॉट / उच्च बीडीसी 3 नियंत्रण के नमूने दर्शाते हैं कि 98% से अधिक कोशिकाओं में 1 या उससे कम स्थान थे। उच्च स्पॉट / कम बीडीसी 3 और उच्च स्पॉट / उच्च बीडीसी 3 के बीच की सीमा 1 के बीडीसी 3 स्कोर पर सेट की गई थी क्योंकि 91% से अधिक नियंत्रण नमूने में 1 से कम का बीडीसी 3 स्कोर था। बीवियेट भूखंडों के लिए परिणामों का सारांश तालिका 1 में दिखाया गया है

उम्र = "1"> आकृति 1
चित्रा 1: MIFC उपकरण सेटिंग प्रोटोकॉल के चरण 8 में उल्लिखित इस प्रयोग के लिए उपयोग किया गया MIFC साधन सेटिंग्स का एक स्क्रीनशॉट। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: विश्लेषण सॉफ्टवेयर Gating रणनीति। प्रोटोकॉल के चरण 9 में उल्लिखित सॉफ्टवेयर सॉफ़्टवेयर गेटिंग स्कीम का एक स्क्रीनशॉट। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Fig3.jpg "/>
चित्रा 3: एलसी 3 स्पॉट मास्किंग। जर्कक सेल की छवियों और मुखौटे को स्पॉट-गेट सुविधा बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ब्रेटफिल्ड (बीएफ), एलसी 3-एएफ 647, पीक (एम 11, सीएच -11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 2), पीक (एम 11, सीएच 11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 4), पीक (एम 11, सीएच -6-एलसी 3-एएफ 647) दिखाया गया है , उज्ज्वल, 5), स्पॉट (एम 11, सीएच 11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 5,3,1), और स्पॉट (एम 11, सीएच 11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 6,2,1)। दिखाए गए सभी कोशिकाओं के लिए सर्वोत्तम काम करने वाले मुखौटा पीक (एम 11, सीएच 11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 4) थे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एलसी 3 स्पॉट-गिन हिस्टोग्राम स्पॉट-कैबिन फीचर स्पॉट कैटलॉगफ़ेक (एम 11, सीएच 11-एलसी 3-एएफ 647, ब्राइट, 4) _4 और नियंत्रण के लिए एलसी 3-एएफ 647 स्पॉट-गिन हिस्टोग्राम का उपयोग करना ( ए , हल्का नीला), नियंत्रण + क्लोरोक्विनई ( बी , नीला), भूखे ( सी , गुलाबी), और भूखे + क्लोरोक्वीन ( डी , लाल)। कंट्रोल, कंट्रोल + क्लोरोक्विन, भूखे और भूखे + क्लोरोक्वीन के क्रम में क्रमशः 0.07, 1.13, 0.10 और 2.77 है। बीएफ़, एलसी 3-एएफ 647 (लाल), डीएपीआई परमाणु डाई (नीला), और औसत स्थान की गणना के लिए प्रतिनिधि कोशिकाओं की एलसी 3-एएफ 647 और डीएपीआई छवियों का एक संयोजन नियंत्रण ( ई , 0 स्पॉट), नियंत्रण + क्लोरोक्वाइन ( एफ , 1 स्पॉट), भूखे ( जी , 0 स्पॉट), और भूखे + क्लोरोक्वीन ( एच , 3 स्पॉट)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: पीडीए / एलएएमपी 1 / एलसी 3 के बीडीसी 3 हिस्टोग्राम। BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 हिस्टोग्राम के लिएनियंत्रण ( ए , हल्का नीला), नियंत्रण + क्लोरोक्वीन ( बी , नीला), भूखे ( सी , गुलाबी) और भूखे + क्लोरोक्वीन ( डी , लाल)। नियंत्रण, नियंत्रण + क्लोरोक्वीन, भूखे और भूखे + क्लोरोक्विन के लिए औसत बीडीसी 3 अंक क्रमशः 0.57, 0.82, 0.74 और 0.98 हैं। बीएफ; P62-AF488 (हरा); LAMP1-PE (पीला); एलसी 3-एएफ 647 (लाल); और पी 62-एएफ 488, एलएएमपी 1-पीई, और एलसी 3-एएफ 647 छवियों का मिश्रित माध्य BDC3 के लिए, नियंत्रण ( ई ), नियंत्रण + क्लोरोक्वाइन ( एफ ), भूखे ( जी ), और भूखे + क्लोरोक्वाइन (के लिए दिखाया गया है) एच ) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
6 चित्रा: पीडीएस / एल के बीडीसी 3 हिस्टोग्रामभूखा + क्लोरोक्वीन नमूना के लिए सी 3 / डीएपीआई ( ए ) बीआरडीसी 3 पी 62 / एलसी 3 / डीएपीआई हिस्टोग्राम के लिए भूखे + क्लोरोक्वाइन नमूना दिखाया गया है। माध्य BDC3 स्कोर 0.07 है। ( बी ) बीएफ; P62-AF488 (हरा); एलसी 3-एएफ 647 (लाल); डीएपीआई (नीला); और पी 62-एएफ -488, एलसी 3-एएफ 647, और डीएपीआई छवियों का मिश्रित माध्य BDC3 के लिए प्रतिनिधि कोशिकाओं के मिश्रित + क्लोरोक्वाइन नमूने के लिए दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: बीसीडी 3 पी 62 / एलएएमपी 1 / एलसी 3 के विरूद्ध एलसी 3 स्पॉट गणना के बिवेरेट प्लॉट ( ए ) नियंत्रण, नियंत्रण + क्लोरोक्वाइन, भूखे और भूखे + क्लोरोक्वीन जर्कट कोशिकाओं के लिए एलसी 3 स्पॉट काउंसिस के बीसीडी 3 पी 62 / एलएएमपी 1 / एलसी 3 के बीवरेट प्लॉट। ( बी ) बीएफ; P62-AF488 (हरा); LAMP1-PE (पीला); एलसी 3-एएफ 647 (लाल); और तीन क्षेत्रों ( यानी, कम स्पॉट, उच्च स्पॉट / कम बीडीसी 3, और उच्च स्पॉट / उच्च बीडीसी 3) से पी 62-एएफ 488, एलएएमपी 1-पीई, और एलसी 3-एएफ 647 छवियों का मिश्रित भूरा + क्लोरोक्वाइन नमूना के लिए दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

कोशिका गिनती तेज विस्तार से colocalization 3 मतलब स्पॉट काउंट LC3 मीन % कम स्थान % हाई स्पॉट / लो बीडीसी 3 % हाई स्पॉट / उच्च बीडीसी 3
नियंत्रण 439 0.57 0.07 98.2 1.8 0.0
नियंत्रण + क्लोरोक्वीन 1432 0.82 1.13 68.9 19.5 11.7
भूखे 1204 0.74 0.10 98.4 0.6 1.0
भूखे + क्लोरोक्विन 1811 0.98 2.77 32.1 36.9 31.0

तालिका 1: जर्काक एलसी 3 स्पॉट गणना बनाम बीडीसी 3 पी 62 / एलएएमपी 1 / एलसी 3 बेवायरेट प्लॉट का सारांश

Discussion

इस विश्लेषण के दौरान, विचार करने के लिए कुछ चीजें हैं। उचित नियंत्रण नमूने होना महत्वपूर्ण है इस प्रयोग के लिए, दो अलग-अलग नियंत्रणों का इस्तेमाल किया गया: नियंत्रण और नियंत्रण + क्लोरोक्वीन। नियंत्रण नमूना क्षेत्रों के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह लियोसोमल डिग्रेडेशन को रोकते बिना भोजी के मूल स्तर का प्रतिनिधित्व करता है और भूरा नमूना के लिए नियंत्रण है। हालांकि, नियंत्रण नमूना भूखे + क्लोरोक्वाइन नमूने से परिणाम के साथ तुलना करने के लिए एक उचित नियंत्रण नहीं है क्योंकि क्लोरोक्विन स्वयं नियंत्रण नमूना को प्रभावित करता है। इसलिए, नियंत्रण होना आवश्यक था + क्लोरोक्वाइन नमूना।

भोजी के लिए कोई विश्लेषण करने से पहले, केवल एकल कोशिकाओं पर फ़ोकस ( यानी, ढाल आरएमएस, 60 से अधिक) पर विश्लेषण करना / गेट करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि परिणाम एक से अधिक सेल या छवियों से प्रभावित हो सकते हैं ओझल। यह महत्वपूर्ण है कि autophagosomईएस और लियोसोमस उचित स्थान की गिनती और बीडीसी 3 विश्लेषण के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। अपोपाटिक कोशिकाओं को भोजी विश्लेषण से पहले हटाया जाना चाहिए, क्योंकि वे परिणामों को तिरछा कर सकते हैं और उन्हें शामिल नहीं किया जाना चाहिए। सभी तीन मार्करों के लिए उचित धुंधला होना चाहिए ( यानी, एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1)। उदाहरण के लिए, सभी तीन मार्करें अंतःस्रावीय होती हैं और उन्हें एक विराम संकेत होना चाहिए; अगर सिग्नल ठीक नहीं है, या यह सेल की सतह पर है, तो धुंधला हो जाना उचित नहीं होगा और प्रयोग / धुंधला को फिर से बदला जाना चाहिए। इसके अलावा, बीडीसी 3 के लिए सटीक होना, ब्याज के सभी तीन फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए चमकदार कोशिकाओं पर द्वार के लिए आवश्यक है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी, इमेजिंग कलाकृतियों, और / या शोर पर बीडीसी 3 के माप को रोकने के लिए सकारात्मक घटनाओं पर ध्यान देने की आवश्यकता है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि बीडीसी 3 संभावित रूप से कलाकृतियों को बढ़ाना कर सकता है जो सही संकेत नहीं हैं। चूंकि बीडीसी 3 केवल उज्ज्वल सकारात्मक घटनाओं पर ही प्रदर्शन किया जा सकता है, इसलिए कई कोशिकाओं को अंतिम विश्लेषण में शामिल नहीं किया जा सकता है; यह espec हैनियंत्रण कोशिकाओं के लिए सही है जो कि एलसी 3, पी 62 और / या एलएएमपी 1 के कोई संचय नहीं है। इस प्रकार, इस परख की एक सीमा यह है कि बीडीसी 3 केवल उन तीनों मार्करों के लिए पॉजिटिव सकारात्मक कोशिकाओं की जांच करता है, जो सभी भोजी प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।

बीडीएस की तरह, जिसे पहले 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , बीडीसी 3 की सूचना दी गई है, वह अकेली स्थानीयकृत अंगों की संख्या को ध्यान में नहीं रखता है, जिसके परिणामस्वरूप एक बड़ी डिग्री Autophagosomes की संख्या में परिवर्तनशीलता की। इसलिए, राजीव एट अल द्वारा प्रस्तुत द्विवार्षिक दृष्टिकोण नौकरी कर रहा था। द्विवार्षिक भूखंडों को देखते हुए, कोई पूछ सकता है कि क्याकोशिकाओं को एलसी 3, पी 62 और एलएएमपी 1 के लिए सकारात्मक होना चाहिए; क्यों इतने सारे कक्ष हैं जिनके पास 0 स्पॉट हैं? इसका कारण यह है कि एलसी 3 संकेत सह-स्थानीयकरण के लिए काफी उज्ज्वल हो सकता है, लेकिन यह चोटी मुखौटा (पीक (एम 11, सीएच -11-एलसी -3-एएफ 647, ब्राइट, 4)) द्वारा निर्धारित थ्रेशोल्ड को पूरा नहीं कर सकता है क्योंकि इसके लिए एक मौके।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने LC3 puncta को गणना करने के लिए MIFC का उपयोग किया और स्वस्थ फैलाव को मापने के लिए तीन भोजी मार्करों के सह-स्थानीयकरण का उपयोग किया। मूल स्थितियों (नियंत्रण नमूना) के तहत, ऑटोफॉगोओसोम की संख्या कम थी, और कुछ कोशिकाओं को "उच्च स्पॉट" के साथ मिला। क्लोरोक्वाइन के अलावा, जो ऑटिफेगोसोम / लाइसोसोम फ्यूजन को रोकता है, वहां एलसी 3 स्पॉट की संख्या में वृद्धि हुई थी। चूंकि लियोसोम ऑटोफेगोसोम और पी 62 को तोड़ने में असमर्थ है, जो ऑटिफ़ोगोसोम में रहता है, इसने एलसी 3, पी 62 और एलएएमपी 1 के ऑटोलिसोसोम संचय के सह-स्थानीयकरण में वृद्धि की ओर बढ़ता है। इस आशय को पोषक तत्व सितारावाट के तहत बढ़ाया गया थाआयन, जो भोजी लाती है हालांकि, क्लोरोक्वाइन के अलावा, autophagosomes की संख्या में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हुई थी, सबसे अधिक संभावना है कि ऑटोफैजिक टर्नओवर की दर में वृद्धि हुई है। जब क्लोरोक्वाइन की उपस्थिति में कोशिकाओं को भूख लगी, सह-स्थानीयकरण और ऑटोफॉगोओसोम की संख्या में वृद्धि हुई थी, जो इस निष्कर्ष का समर्थन करता है कि भूख से स्वस्थ फैलाव बढ़ जाता है। EBSS भोजी के एक शक्तिशाली inducer के रूप में जाना जाता है इसलिए, यह उम्मीद है कि वृद्धि बड़ी होगी अगर एक अन्य विधि, जैसे दवा प्रेरण, का प्रयोग भोजी को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, तो नियंत्रण और इलाज के नमूने के बीच का अंतर सूक्ष्म हो सकता है।

यह विशेष प्रोटोकॉल मानव कोशिका लाइनों में भोजी को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इस परख उस विशेष प्रजाति के लिए एंटीबॉडी पर स्विच करके अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, किसी भी इंट्रासेल्युलर एप्लिकेशन के लिए विश्लेषण विधि का उपयोग किया जा सकता है जिसके लिए सह-स्थानीयकरण की आवश्यकता होती हैतीन जांच / मार्करों का

Disclosures

मैं एम्मिनिस ब्रांड इमेस्टस्ट्रीम के निर्माता मिलिपोर सिग्मा द्वारा नियोजित हूं, जिसका इस्तेमाल इस अध्ययन में किया गया था।

Acknowledgments

मैं मिलिपोर सिग्मा, फिलिप जे। मॉरसेसे और शेर्री एल मित्र पर अपने सहकर्मियों का आभार व्यक्त करना चाहता हूं, जिनके वर्षों में उनके समर्थन और मार्गदर्शन के लिए। मैं भी विचारों सॉफ्टवेयर में BDC3 सुविधा के साथ उनकी मदद के लिए विद्या वेंकटचलम और ब्रायन आर डेविडसन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, इस पांडुलिपि संपादन मदद के लिए रयान पी जेसप, रेमंड काँग शूटिंग के दिन पर मदद, और एक विशेष के लिए धन्यवाद श्रृंगार कलाकार सिंथिया एक्समोन्थिएन

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
50 mL centrifuge tube Falcon 352070
AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG  Invitrogen A-31571 Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
anti-human CD107a-PE (LAMP1) BioLegend 328607 Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
anti-human CD45- AF488 BioLegend 304017 Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
anti-human CD45- PE  BioLegend 304008 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-human CD45-AF647  BioLegend 304018 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 MBL International Corporation M152-3 Clone 4E+12.  Concentration 2 mg/mL.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) abcam ab185015 Clone EPR4844.  Concentration 0.5 mg/mL.  http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Chloroquine diphosphate Salt Sigma-Aldrich C6628-25G
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mL MilliporeSigma 508741 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% Isopropanol MilliporeSigma 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x MilliporeSigma BSS-2010-B  Ca++Mg++ Free 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x MilliporeSigma BSS-1006-B PBS Ca++Mg++ Free 
Earle's Balanced Salt Solution 1x Gibco 14155
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Balanced Salt Solution 1x Gibco 14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Non-Essential Amino Acids 100x HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II MilliporeSigma 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS 6.2 MilliporeSigma 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).  IDEAS version 6.2
MIFC software - INSPIRE MilliporeSigma 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 BioLegend 328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x HyClone SV30082.1
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RPMI-1640 Medium 1x HyClone SH30027.01
Sheath - PBS MilliporeSigma BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes Fisherbrand 02-681-320 Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Sodium Pyruvate solution (100 mM) HyClone SH30239.01
Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead MilliporeSigma 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T75 flask Falcon 353136
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered MilliporeSigma 648463-50ML http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Water, Cell Culture Grade  HyClone SH30529.03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  2. Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
  3. Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
  4. Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
  5. Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
  6. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
  7. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
  8. Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
  9. Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
  10. Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
  11. Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
  12. Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
  13. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  14. Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
  15. Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
  16. Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
  17. Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
  18. Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
  19. Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
  20. Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
  21. Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
  22. Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
  23. Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
  24. Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
  25. Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
  26. Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
  27. IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 125 ऑटोफैजी मल्टीस्पैक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमैट्री (एमआईटीसी) इमेस्टस्ट्रीम ऑटोफॉगोओसोम ऑटोलियोसोसोम एलसी 3 पी 62 एलएएमपी 1
एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1 को मापकर आटोफैजिक फ्लक्स का मूल्यांकन करना मल्टी-स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic… More

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55637, doi:10.3791/55637 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter