Summary
Her har multispektral billeddannelsesflowcytometri med en analytisk funktion, der sammenligner lyse detaljerbilleder af 3 autofagmarkører og kvantificerer deres co-lokalisering sammen med LC3-spottælling, anvendt til at måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måde.
Abstract
Autophagy er en katabolisk vej, hvor normale eller dysfunktionelle cellulære komponenter, som akkumuleres under vækst og differentiering, nedbrydes via lysosomet og genbruges. Under autofag lipideres cytoplasmisk LC3-protein og rekrutteres til de autofagosomale membraner. Autofagosomet smelter derefter sammen med lysosomet for at danne autolysosomet, hvor nedbrydningen af autophagosom vesikel og dens indhold forekommer. Det ubiquitin-associerede protein p62, der binder til LC3, anvendes også til at overvåge autofagisk flux. Celler, der gennemgår autofagi, bør demonstrere co-lokalisering af p62-, LC3- og lysosomale markører. Immunofluorescensmikroskopi er blevet brugt til visuelt at identificere LC3 puncta, p62 og / eller lysosomer pr. Cellebasis. En objektiv og statistisk streng vurdering kan imidlertid være vanskelig at opnå. For at overvinde disse problemer blev multispektral billeddannelses-flowcytometri anvendt sammen med en analytisk funktion, der sammenligner den lyse deHale billeder fra tre autophagy markører (LC3, p62 og lysosomal LAMP1) og kvantificerer deres co-lokalisering i kombination med LC3 spot tælling for at måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måde.
Introduction
Makroautofagi, herefter kaldet autofagi, er en katabolisk vej, hvor beskadigede eller dysfunktionelle komponenter, langlivede proteiner og organeller nedbrydes via lysosomet og genbruges 1 . Autophagy er en dynamisk, multistep-proces, der involverer dannelsen af et autophagosom; Fusionen af autophagosomet med lysosomet, der danner autolysosomet; Og nedbrydning af indholdet af autolysosomet 2 . Den afgørende biologiske markør, der anvendes til at identificere autofagi hos pattedyrsystemer, er den mikrotubulærassocierede protein 1A / 1B-lette kæde 3 (LC3), som udgør autofagosomal membranen. Under autophagy konjugeres cytosolisk LC3-1 til phosphatidylethanolamin til dannelse af LC3-II; LC3-II inkorporeres derefter i den autophagosomale membran 3 . En anden almindeligt anvendt markør for autofagisk flux er autophagy receptor-sekvestosom 1 (SQSTM1, p62), som fysisk liNks autophagic fragt til autophagic membranen 4 , 5 .
Metoder, der traditionelt har været brugt til at måle autophagy, er Western blots og fluorescensmikroskopi 7 . Men ingen af disse metoder anses for at være "guldstandarden" 2 , 6 da der er udfordringer forbundet med begge disse teknikker. Western blots giver kun et gennemsnit, fordi de bruger en homogenatprøve, så observatører ikke kan se, hvad der sker i individuelle celler. På den anden side giver fluorescensmikroskopi observatørinformation på enhedsniveau, men det mangler gennemstrømningsmuligheder, hvilket gør det vanskeligt at opnå objektive og statistisk strenge vurderinger. I de seneste år har måling af LC3 og p62 ved multispektral billedflowcytometri (MIFC, se Materialetabellen ) været ved at vinde popuLighed på grund af dets kvantitative magt, høje gennemstrømningsmuligheder, multiplekspotentiale og evne til at billede hver celle. En af de mest anvendte metoder til måling af autofagi ved hjælp af MIFC, sammen med dets ledsageranalysesoftware (se Materialetabellen ), er gennem stedet tælling af LC3 puncta eller autophagosomer 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En stigning i autofagosomer betyder dog ikke nødvendigvis, at der er en stigning i autofagi, da det også kunne repræsentere en blokade i processen 2 . LC3-II omsætning er en nyttig parameter til måling af autofagisk flux ved analyse af celler i nærvær ogFravær af en lysosomal nedbrydningsinhibitor, såsom chloroquin. Chlorokin inhiberer fusionen af autophagosomet til lysosomet og derved tillader kvantificering af autofagosomdannelsen som et mål for graden af autofag ved at standse autofagisk flux, inden den lysosomale nedbrydning kan forekomme 18 . Derudover nedbrydes p62 primært af autofagi, og hvis den lysosomale nedbrydning af autophagosomet og dens indhold er blokeret, forventes en akkumulering af p62 17 , 19 .
Autophagy er en multistep-proces, og måling af LC3 eller P62 alene giver ikke et komplet billede af, hvad der sker i cellerne. Nylige publikationer har understreget behovet for at undersøge den samtidige dannelse af autolysosom 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC erentydigt stand til at måle dannelsen af autolysosome ved billeddannelse af co-lokalisering af autophagosome til lysosomet 15 - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Derudover er co-lokalisering af p62 og LC3 ved anvendelse af MIFC også blevet undersøgt for at måle autofagisk flux 5 . I den refererede analysesoftware kaldes "funktionen", der måler co-lokalisering, "Bright Detail Similarity R3" (BDS) og blev specifikt designet til at sammenligne de små, lyse billedet detaljer af to billeder. BDS er den log-transformerede Pearsons korrelationskoefficient for de lokaliserede lyse pletter med en radius på 3 pixels eller mindre; Med andre ord beregner BDS graden af oForsinkelse af pixels fra to forskellige fluorescerende kanaler. De lyse pletter er enten korrelerede ( dvs. samme rumlige placering) eller ukorrelerede ( dvs. forskellige rumlige steder). Korrelationskoefficienten varierer derfor mellem 0 (ukorreleret) og 1 (perfekt korrelation). Koefficienten er log-transformeret for at øge området til mellem nul og uendelig 26 , 27 . BDS alene kan ikke være tilstrækkeligt; Rajan et al. Fandt ud af, at brugen af kun BDS kunne føre til falsk-positive eller falsk-negative resultater 21 . BDS evaluerer co-lokalisering af to markører af autofagi, men betragter ikke antallet af autofagosomer. For at tage højde for antallet af autophagosomer, rajan et al. Inkluderet spot-tælling af LC3 puncta 21 . Rajan et al. Foreslået at anvende et bivariat scatter plot af LC3 spot count versus BDS. Ved hjælp af denne bivariate plot, to populationer werE først identificeret: en med celler, der har et højt niveau af LC3 pletter og et med celler, der har et lavt niveau af LC3 pletter. High-LC3-spotpopulationen blev yderligere klassificeret i to populationer: celler med lav co-lokalisering ( dvs. akkumulering af autophagosomer) og celler med høj co-lokalisering ( dvs. akkumulering af autolysosomer). Dette bivariate plot tillader en at skelne mellem celler med meget få autophagosomer og celler med en akkumulering af autophagosomer og / eller autolysosomer 21 .
Indtil nu var den samtidige co-lokalisering af LC3, p62 og LAMP1 (lysosomal markør) ikke mulig ved anvendelse af en enkelt "Feature Type" i MIFC Companion Analysis Software (se Materialetabellen ). En ny funktion, der for nylig blev introduceret i version 6.1, kaldes dog Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 sammenligner de lyse detaljer billeder fra hver af de tre billeder (i dette tilfælde, LC3, p62 og LAMP1) og kvantificerer co-lokalisering af de tre prober ( dvs. LC3, p62 og LAMP1). BDC3-funktionen beregner Pearsons korrelationskoefficient, der er ændret til at omfatte tre billeder. Da lyspunkterne i de tre billeder enten er korrelerede eller ikke-korrelerede, varierer korrelationskoefficienten mellem 0 (ukorreleret) og 1 (perfekt korrelation). Koefficienten er log-transformeret til at øge det dynamiske interval mellem 0 og uendelig. Ved at slukke BDS-funktionen med BDC3-funktionen, analyseres analysemetoden, der er fremlagt af Rajan et al. Kan nu inkorporere de tre mest anvendte markører til måling af autofagi i et system på samme tid. Evnen til at lokalisere disse tre markører af autofagi i et enkelt assay kunne føre til ny viden om induktion og regulering af autofagi. Den følgende protokol beskriver trinene til at inducere autophagy i Jurkat-celler; Mærke cellerne med LC3-, p62- og LAMP1-antistoffer; Erhverve data på en multispEktral billeddannelses flow cytometer; Og analysere dataene til vurdering af autofagisk flux.
Protocol
1. Fremstilling af kulturmedium og lysosomal nedbrydningsinhibitor
- 1.1. Lav ~ 500 ml 1x RPMI dyrkningsmedium. Tilsæt 5 ml MEM ikke-essentielle aminosyrer (100x), 5 ml natriumpyruvat (100 mM), 5 ml penicillin-streptomycin-glutamin (100x) og 25 ml føtalt bovint serum (FBS) til en 500 ml Flaske RPMI - 1640 1x medium. Mediet bør fremstilles i et biosikkerhedsskab. Opbevar RPMI-kulturmediet ved 2-8 ° C. Opvarm RPMI-kulturmediet til 37 ° C, inden det tilsættes til Jurkat-cellerne.
- Lav 100 mM chloroquin, den lysosomale nedbrydningsinhibitor. Afvej 0,05 g chloroquindiphosphatsalt og tilsæt det til 1 ml cellekultivitetsvand i et 15 ml centrifugerør. Vortex indtil chloroquinen er opløst.
2. Kultivering af celler
- Kultur 80 ml Jurkat-celler klon E6-1 i RPMI-dyrkningsmedium ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Ved dyrkning af cellerEller arbejder med Jurkat-cellerne forud for fiksering, skal alt arbejde udføres i biosikkerhedskabinet. - Før du inducerer autofagi, tæl Jurkat-cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller en anden celleberegnende enhed for at bestemme cellerne / ml.
3. Inducerende Autophagy in Cells
- Tag Jurkat-cellerne i eksponentiel vækstfase og opdel dem i fire prøver på 20 ml hver i 50 ml centrifugerør. Mærk rørene som "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" og "Starved + Chloroquine."
BEMÆRK: Jurkat-celler skal have en koncentration på 2,5-5 x 10 5 celler / ml. - Vask cellerne ved at tilsætte 30 ml Hank's Balanced Salt Solution uden Ca 2+ eller Mg 2+ (HBSS) til hver prøve. Centrifuge ved 250 xg i 10 minutter. Hæld supernatanten i et affaldsbæger.
- Resuspender kontrolprøverne i 20 ml RPMI-dyrkningsmedium ved pipettering op og ned under anvendelse af en 25 ml sTerile engangspipette efterfulgt af udførelse af let vortexing. Tilsvarende resuspender de sultede prøver i 20 ml Earle's Balanced Salt Solution uden Ca 2+ eller Mg 2+ (EBSS).
- Brug en 25 ml steril engangspipette, overfør kontrollen og sultede prøver til T75-flasker, der er mærket "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" og "Starved + Chloroquine."
- Tilsæt 20 μl 100 mM chloroquin til 20 ml cellekulturmedium i "Control + Chloroquine" og "Starved + Chloroquine" kolberne. Bland i chloroquinen ved forsigtigt at svirme kolben. Placer alle kolber i en 37 ° C og 5% CO 2 inkubator i 2 timer.
4. Fremstilling af buffere til fastgørelse og mærkning af LC3, LAMP1 og p62
- Tilbered 10 ml 4% formalinfixeringsopløsning i PBS. Tilsæt 4 ml 10% formalinlager til 1 ml 10x Dulbecco's phosphatbufferSalinopløsning uden Ca 2+ eller Mg 2+ (PBS) og 5 ml ultrapure vand i et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: FORSIGTIG. Formalin / formaldehyd er giftig ved indånding eller indtagelse Er irriterende for øjnene, åndedrætsorganerne og huden; Og kan forårsage sensibilisering ved indånding eller hudkontakt. Der er risiko for alvorlig skade på øjnene. Det er et potentielt kræftfremkaldende stof. - Tilbered 10 ml 1% formalin endelig resuspensionsopløsning i PBS. Tilsæt 1 ml 10% formalinlager til 9 ml 1x PBS i et 15 ml centrifugerør.
- Forbered 500 ml vaskebuffer ved at tilsætte 10 ml FBS til en 500 ml flaske 1x PBS.
- Forbered 50 ml permeabiliseringsbuffer i et 50 ml centrifugerør ved at tilsætte 0,5 ml 10% triton X-100 til den 49,5 ml vaskebuffer fremstillet i trin 4.3.
- Forbered anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) antistof / permeabiliseringspuffer-arbejdsløsning ved at tilsætte 5 μl anti-SQSTM1 / p62-AF488 til 495 μl af permeabiliseringspufferen fremstillet i sTep 4.4. Sørg for, at den endelige antistofkoncentration er 5 μg / ml.
BEMÆRK: Lav antistofpermeabiliseringspuffer arbejdsløsning lige før tilsætning af det til prøven. Beskyt opløsningen mod lys. - Forbered mus anti-LC3 / permeabiliseringsbuffer arbejdsløsning ved at tilsætte 5 μL mus anti-LC3 til 495 μl af permeabiliseringspufferen fremstillet i trin 4.4. Sørg for, at den endelige antistofkoncentration er 20 μg / ml.
BEMÆRK: Lav antistoffpermeabiliseringspuffer arbejdsløsninger lige før tilsætningen til prøven. Beskyt opløsningen mod lys. - Fremstil æsel-anti-mus-Alexa 647 (AF647) / permeabiliseringspuffer-arbejdsløsning ved at tilsætte 5 μl AF647-mærket æsel-anti-mus-IgG til 495 μl af permeabiliseringspufferen fremstillet i trin 4.4. Sørg for, at den endelige antistofkoncentration er 20 μg / ml.
BEMÆRK: Lav antistofpermeabiliseringsbufferens arbejdsløsning lige før tilsætning af det til prøven. Beskyt tHan løsning fra lys. - Forbered anti-human CD107a (LAMP1) -PE antistof / permeabiliseringspuffer-arbejdsløsning ved at tilsætte 25 μl anti-CD107a (LAMP1) -PE til 475 μl af permeabiliseringspufferen fremstillet i trin 4.4. Sørg for, at den endelige antistofkoncentration er 21 μg / ml.
BEMÆRK: Lav antistofpermeabiliseringsbufferens arbejdsløsning lige før tilsætning af det til prøven. Beskyt opløsningen mod lys. - Forbered 10x DAPI-nuklear plet ved at tilsætte 4 μl 5 mg / ml DAPI og 100 μl 10% triton X-100 til 896 μl 1x PBS.
5. Mærkning af Jurkat-cellerne med LC3, LAMP1 og p62
- Fjern 2 x 10 6 celler pr. Prøve (tæl cellerne som i trin 2.2). Placer hver prøve i et 15 ml centrifugerør, der er mærket med det passende prøvenavn ( dvs. Control, Control + Chloroquine, Starved eller Starved + Chloroquine).
- Tilføj vaskebuffer, så der iEt totalt volumen på 15 ml i hvert 15 ml centrifugerør. Centrifuger prøverne ved 250 xg i 10 minutter. Aspirer fra supernatanten.
- Tilsæt 100 μl 4% formalinfixeringsopløsning til hver af cellepellets. Resuspenderes ved pipettering op og ned med en P200 pipette. Inkubér i 10 minutter ved stuetemperatur. Under fikseringstrinnet overføres prøverne til mærkede siliciumiserede polypropylenmikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Overtæt ikke cellerne; Dette kan resultere i dårlige mærkning resultater. - Efter 10 minutters fixeringstrin tilsættes 1 ml vaskebuffer til hver prøve. Pipetter op og ned med en P1000 pipette for at blande prøven. Centrifuge ved 250 xg i 5 minutter. Aspirer fra supernatanten.
- Tilsæt 100 μl anti-SQSTM1 / p62 - AF488 antistof / permeabiliseringsbuffer arbejdsløsning til hver prøve. Resuspenderes ved pipettering op og ned med en P200 pipette. Inkubér i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Vask cellerne ved at tilføje 1 mlPermeabiliseringsbuffer til hver prøve. Pipetter op og ned med en P1000 pipette for at blande prøven. Centrifuge ved 250 xg i 5 minutter. Aspirer fra supernatanten.
- Gentag trin 5.4-5.5 for hver af antistoffets arbejdsløsninger.
BEMÆRK: Arbejdsløsningerne til antistoffer er anti-LC3 / permeabiliseringspuffer, anti-mus-AF647 / permeabiliseringspuffer og anti-human CD107a (LAMP1) - PE-antistof / permeabiliseringspuffer-arbejdsløsning. Hvert antistof skal udføres separat og i den angivne rækkefølge. Ordren blev valgt for at minimere uønsket krydsreaktivitet mellem antistoffer. - Tilsæt 100 μl 1% formalinopløsning. Resuspenderes ved pipettering op og ned med en P200 pipette. Tilsæt 10 μL af den 10x DAPI-nukleare plet til hver prøve. Vortex let hver prøve for at blande. Inkuber i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur, før du kører nogen af prøverne på instrumentet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøven enten bE køre på MIFC eller opbevares beskyttet mod lys ved 2-8 ° C i op til en uge.
6. Mærkning af enkeltfarvekontroller
- For hver enkeltfarvekontrol ( dvs. AF488, PE, AF647 og DAPI) skal du tage 1 x 10 6 Jurkat-celler, som kan være fra nogen af prøvepopulationerne. Sæt 1 x 10 6 celler i 15 ml centrifugerør mærket som enten AF488, PE, AF647 eller DAPI.
- Tilsæt vaskebuffer, så der er et totalt volumen på 15 ml i hvert 15 ml centrifugerør. Centrifuger prøverne ved 250 xg i 10 minutter. Aspirer fra supernatanten.
- Tilsæt 100 μl vaskebuffer til AF488, PE og AF647 rørene.
BEMÆRK: For DAPI-slangen skal du gå til trin 6.8.- Resuspenderes ved pipettering op og ned med en P200 pipette. Overfør til 1,5 ml rør.
- Tilsæt 5 μL af enten anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE eller anti-CD45-AF647 til henholdsvis AF488-, PE- eller AF647-rørene. Bland ved vortexing lightly.
- Inkuber AF488, PE og AF647 rørene i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Andre markører kan anvendes, såsom LC3, p62 og LAMP-1 antistoffer i stedet for anti-CD45 antistoffer. CD45 er dog en pålidelig markør til enkeltfarvekontroller. - Vask AF488, PE og AF647 cellerne ved at tilsætte 1 ml vaskebuffer til hver prøve.
- Pipetter op og ned med en P1000 pipette for at blande prøven. Centrifuge ved 250 xg i 5 minutter. Aspirer fra supernatanten.
- Tilsæt 100 μl 1% formalinopløsning. Resuspenderes ved pipettering op og ned med en P200 pipette.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøven enten køres på MIFC eller opbevares beskyttet mod lys ved 2-8 ° C i op til en uge. - Tilsæt 100 μl 1% formalinfixeringsopløsning til DAPI-røret.
- Resuspenderes ved pipettering op og ned med en P200 pipette. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj 101; L af 10x DAPI-nuklear plet til DAPI-prøven. Let hvirvel at blande. Inkuber i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur, inden du kører på instrumentet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøven enten køres på MIFC eller opbevares beskyttet mod lys ved 2-8 ° C i op til en uge.
7. Start og kalibrering af MIFC
- Kontroller, at kappen, systemkalibreringsreagenset (se materialebordet ), debubbler, rengørings- og steriliseringsbeholdere er fyldt, og affaldstanken er tom. Hvis ikke, skal du fylde beholderne og tømme affaldstanken.
- Tænd for systemet og dobbeltklik på softwaren (se ikonet Table of Material s) for at starte programmet. Dette vil starte MIFC-softwaren.
- Klik på knappen Start og sørg for at Start alle kalibreringer og test er valgt. Dette vil spyle systemet, laste kappe, systemkalibreringsreagens,Og kalibrere systemet.
8. Kørsel af prøverne og enkeltfarvekontrolerne på MIFC
- Indlæs standardskabelonen ved at gå til fanen Filer og vælge Load Default Template .
BEMÆRK: Standardskabelonen indeholder de røde maks pixel punkter. - Tænd for 488 nm, 405 nm, 642 nm og SSC lasere ved at klikke på deres respektive knapper. Indstil laserkraften ved at indtaste den ønskede effekt ved siden af hver laserknap. Se figur 1 .
BEMÆRK: For dette eksperiment er laserkræfterne 200 mW, 20 mW, 150 mW og 5 mW (Ch06) for henholdsvis 488 nm, 405 nm, 642 nm og SSC. MIFC-standardskabelonforstørrelsen er sat til 40X, standardfølsomheden er Hej , og alle kanaler er aktiveret. - Bekræft, at forstørrelsesskyderen er indstillet til 40X, høj følsomhedstilstand er valgt, og alle kanaler vises i billedgalleriet; figur 1
- Indlæs prøven "Starved + Chloroquine" ved at klikke på Load- knappen og lægge 1,5 ml rør på instrumentet.
BEMÆRK: Denne forsøgsprøve skal have det højeste signal for alle prøver for AF488, PE og AF647 (DAPI-signalet skal have omtrent samme signalstyrke for alle forsøgsproever, herunder "Starved + Chloroquine" -prøven). - Brug "Starved + Chloroquine" -prøven for at bekræfte, at passende laserstyrker til 488 nm, 405 nm, 642 nm og SSC lasere er indstillet. Brug de rå maks pixel punktplotter fra standardskabelonen til at justere laserstyrken, så signalerne er stærke, men når ikke en rå maks pixelværdi på 4.096, som vil mætte CCD-kameraet på instrumentet. Brug denne laserindstilling til alle eksperimentelle prøver.
- Klik på ikonet Create Dot Plots for at oprette en ny prikplade. Vælg "Area_M01 "på X-aksen og" Aspect Ratio_M01 "på Y-aksen for" hele "populationen. Klik på ikonet Create Polygon Region . Tegn en region omkring cellerne. Navngiv denne region" Cell. "
BEMÆRK: Brugere kan tilføje flere plotter og regioner for at indsnævre de celler, der indsamles. Et fælles ekstra plot at tilføje ville være Gradient RMS for at identificere celler, der er i fokus. - Indstil overtagelsesparametrene. Angiv filnavnet og destinationsmappen, ændrer antallet af begivenheder til "5.000", og vælg "Celle" -opsamlingspopulationen. Klik på knappen Acquire for at hente filen. Når du har hentet filen, skal du returnere prøven ved at klikke på Retur- knappen. Fjern prøverøret fra instrumentet.
- For de næste tre prøver ("Starved", "Control" og "Control + Chloroquine"), skal du indlæse prøven, indtaste prøvenavnet, erhverve prøven og returnere prøven med de samme indstillinger somFor "Starved + Chloroquine" -prøven, ovenfor.
- Når prøverne er erhvervet, skal du køre enkeltfarvekontrolprøverne og erhverve data, så der kan laves en kompensationsmatrix. Sluk SSC-laseren ved at klikke på SSC- knappen. Sluk brightfield kanalerne ved at klikke på Brightfield knappen og vælge OFF .
BEMÆRK: Hvis kanaler blev fjernet fra billedgalleriet til prøveudtagning, skal du genaktivere alle kanaler. Alternativt kan enkeltfarvekontroller erhverves ved at klikke på fanen Kompensation og vælge Create Matrix ; Dette åbner kompensationsguiden, som vil gå igennem trinnet med at samle filer og lave en kompensationsmatrix. - Indlæs DAPI-enkeltfarvekontrollen ved at klikke på Load-knappen og lægge 1,5 ml rør i instrumentet. Indtast prøveeksemplet (kun DAPI), indstil samlingspopulationen til "Alle" og ændre antallet af begivenhederS til "500."
- Klik på knappen Acquire for at erhverve enkeltfarve kontrolfilen.
- Når filen samlingen er færdig, prøven tilbage ved at klikke på knappen Retur. Fjern prøverøret fra instrumentet.
- Efter DAPI-prøven indlæses 10% blegemiddel ligesom en prøve ved at klikke på Load- knappen og indlæse 100 μL 10% blegemiddel i et 1,5 ml rør. Lad prøven køre i ~ 15 s. Dette fjerner eventuelt resterende DAPI fra røret.
- Kør 100 μl 1x PBS som færdig i 8.10.3 for at fjerne resterende 10% blegemiddel. Instrumentet er nu klar til at køre AF488, PE og AF647 enkeltfarvekontroller.
- Gentag trin 8.10-8.10.2 for hver enkelt farvekontrol ( dvs. AF488, PE og AF647).
BEMÆRK: Der er ikke behov for at køre 10% blegemiddel eller PBS mellem disse prøver, først efter DAPI single-color kontrol.
9. Data analyse i MIFC AnAlysis software
- Start MIFC analyse software (se Materialetabellen ).
- Klik på Start analyse for at starte guiden Åbn fil . Vælg den datafil, der skal åbnes, ved at gå til "Starved + Chloroquine" råbilledfilen (.rif). Vælg filen og klik på knappen Åbn . Klik på Næste .
- Ansøg kompensation. Vælg en tidligere oprettet kompensationsmatrix, og klik på Næste . Alternativt kan du lave en ny kompensationsmatrix ved at klikke på knappen New Matrix .
BEMÆRK: Trin 9.2.1.1-9.2.1.2 er trinene til oprettelse af en ny matrix.- Tilføj de enkeltfarvede kontrolfiler ( dvs. kun DAPI, AF488, Kun PE og AF647) til listen Kontrolfiler ved at klikke på Tilføj filer , vælge filerne og klikke på knappen Åbn . Klik på Næste .
- Vinduet Opret kompensationsmatrix vises for dette eksperiment. ensurE at Ch02, Ch03, Ch07 og Ch11 er valgt, og klik på Næste . Kompensationsmatrixen oprettes. Klik på Udfør for at gemme kompensationsmatrixen. Tilføj kompensationsfilen til Åbn filguiden og klik på Næste .
- Anvend analysemalen. På dette stadium er der ingen analyse skabelon at anvende, så klik på Næste .
BEMÆRK: For de andre eksperimentelle filer kan denne "Starved + Chloroquine.daf" -fil bruges som en skabelon. - Navngiv filen (filnavnene der svarer til "rif" -navnet genereres automatisk) og klikker på Næste . Indstil billeddisplayegenskaberne ved at vælge "02," "03," "07," og "11" kanalerne; Kanaler 01, 06 og 09 er forudvalgt. Klik på Næste .
- Ansøg kompensation. Vælg en tidligere oprettet kompensationsmatrix, og klik på Næste . Alternativt kan du lave en ny kompensationsmatrix ved at klikke på knappen New Matrix .
- I slutningen af Åbn filguiden skal du vælge Apoptosis-guiden . Klik på Apoptosis Wizard- ikonet og derefter påVælg Wizard- knappen for at åbne Apoptosis-guiden .
- Vælg den nukleare billedkanal (Ch07), og klik på Næste . Port cellerne i bedste fokus. Klik på ikonet Create Line Region og tegn en region på Gradient RMS_M01_Ch01 fra 60-90. Navngiv denne region "Fokus", klik på OK , og klik på Næste .
- Gate de enkelte celler. Klik på ikonet Create Polygon Region . Tegn en region omkring de enkelte celler, navngiv regionen "Single", klik på OK , og klik på Næste . Klik på Nej for "Vil du analysere underpopulationer?"
- Port de nucleerede celler. Klik på ikonet Opret linjegruppe og tegne en region, der omfatter alle nucleerede celler. Navngiv regionen "Nucleated." Klik på OK og Næste .
- Port de apoptotiske celler. Klik på ikonet Create Polygon Region . Tegn en region omkring de apoptotiske celler; Disse er cellerMed lavt nukleare Area_T50% og høj lysfeltkontrast. Klik på Udfør . Tilføj et andet område ved at klikke på ikonet Create Polygon Region og tegne en region omkring de ikke-apoptotiske celler; Kalder denne region "celler."
- Vælg celler, der er positive for LAMP1, P62 og LC3. Klik på ikonet Building Blocks , vælg Fluorescence Positives - One Color , og vælg "Celler" populationen og Intensity_MC_Ch03 . Mærk X-aksen "Intensity LAMP1." Tegn en region, der indeholder celler med intensiteter større end 10.000 ved at klikke på ikonet Create Line Region og tegne regionen. Mærk denne region "LAMP1 +." Følg de samme trin som i 9.4 for at vælge celler, der er positive for p62 og LC3.
- For p62 + vælg "LAMP1 +" populationen og Intensity_MC_Ch02 . Mærk X-aksen "Intensitet p62" og regionen p62 + celler "LAMP1 + / p62 +."; For LC3 +, vælg "LAMP1 + / p62 +" populationen og Intensity_MC_Ch11. Mærk X-aksen "Intensity LC3" og regionen LC3 + celler "LAMP1 + / p62 + / LC3 +." Brug denne "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" population for resten af analysen.
- Opret en spot-count-funktion til at tælle LC3-spots.
BEMÆRK: Dette skal oprettes ved hjælp af prøven "Starved + Chloroquine".- Klik på fanen Analyse og vælg Mask . Klik på knappen Ny og derefter på funktionen . Under Funktion skal du vælge Peak ; Maske , vælg M11 ; Og kanal , vælg Ch11 . Indstil Spot til Cell Background Ratio til 4 . Klik på OK for at lukke vinduet Definer maskefunktion og OK for at tilføje det til maskeringslisten . Klik på Luk for at forlade Maskemanager .
- Klik på fanen Analyse og vælg
BEMÆRK: Spot- guiden kan også bruges til at oprette en spot-count-funktion. Spot-count-funktionen, der anvendes i dette eksperiment, er muligvis ikke egnet til andre eksperimenter og / eller cellelinjer. Brugeren skal teste flere spot-count masker / funktioner, når de beslutter sig for en maske / funktion til et bestemt datasæt. Pugsley 2017 har yderligere detaljer om spottælling ved hjælp af MIFC analyse software 26 . - Klik på ikonet Ny histogram . Vælg "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" populationen. Vælg Spot Count LC3-funktionen, og klik på OK .
- Opret BDC3-funktionen.
- CLæk fanen Analyse og vælg Funktioner . Klik på knappen Ny . Under Funktionstype skal du vælge Bright Detail Colocalization 3 ; Maske , vælg MC ; Billede 1 , vælg Ch02 (p62); Billede 2 , vælg Ch03 (LAMP1); Og jeg har 3 , vælg Ch11 (LC3). Indtast "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" til navnet og klik på OK og Luk for at afslutte Feature Manager .
- Klik på ikonet Ny histogram . Vælg "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" populationen. Vælg funktionen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 og klik på OK .
- Klik på ikonet New Scatterplot . Vælg "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" populationen. Vælg BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 for X-aksen. Vælg Spot Count LC3- funktionen for Y-aksen. Klik på OK .
- Gem thE "Starved + Chloroquine" -filen. Klik på Filer, og vælg Gem dataanalysefil (.daf) . Klik på Gem og Ja for at erstatte den tidligere version af filen; Denne fil kan nu bruges som en skabelon.
- Åbn filen "Kontrol". Klik på Filer og derefter Åbn . Vælg filen "Control.rif" og klik på Åbn . Vælg kompensationsmatrixen fra trin 9.2.1 og filen "Starved + Chloroquine.daf" som skabelon. Klik på OK .
- Opret regioner for autophagosomakkumulering og autolysosomakkumulering ved hjælp af "Control" -prøven for at indstille regionerne.
- Klik på ikonet Opret rektangelområde . Tegn en region fra X-koordinater på -0,1 til 3 og Y-koordinater på 1,5 til -0,3. Navngiv denne region "Low Spots." Klik på Opret rektangelområdeikon . Tegn en region fra X-koordinater på -0,1 til 1 og y-koordinatAtes på 17,5 til 1,5. Navngiv denne region "High Spot / Low BDC3."
- Klik på ikonet Opret rektangelområde. Tegn en region fra X-koordinater på 1 til 3 og Y-koordinater på 17,5 til 1,5. Navngiv denne region "High Spots / High BDC3."
- Gem filen "Kontrol". Klik på Filer, og vælg Gem dataanalysefil (.daf ) . Klik på Gem og Ja for at erstatte den tidligere version af filen; Denne fil kan nu bruges som en skabelon.
- Åbn filen "Control + Chloroquine" ved at klikke på File og derefter Åbn . Vælg filen "Control + Chloroquine.rif" og klik på Åbn . Vælg kompensationsmatrixen fra trin 9.2.1 og "Control.daf" -filen som skabelonen. Klik på OK . Gentag dette for "Starved" og "Starved + Chloroquine" filer.
BEMÆRK: Batchfunktionen i analysesoftwaren kan også bruges til at anvende kompensatorenMatrix og / eller skabelon til de andre filer. Den endelige gatingstrategi er vist i figur 2 .
Representative Results
Denne analysemetode bruger flere funktioner til at anse autophagic flux. For fuldt ud at forstå det endelige bivariate plot skal de enkelte analysegenskaber først undersøges. Tællingen af autophagosomer er en logisk måde at måle autophagy på; Størrelsen / formen / lysstyrken af LC3 puncta kan imidlertid variere drastisk mellem cellerne. Variation kan gøre det vanskeligt at tælle autofagosomer manuelt eller ved hjælp af en spot-count-funktion i analysesoftwaren. Derfor vil ingen spot-count-funktion være perfekt på grund af denne store variation i autophagosomer. En god spot-count-funktion vil imidlertid fungere på de fleste celler 26 . Figur 3 viser eksempler på spotmaskering af LC3 puncta i Jurkat-celler ved anvendelse af forskellige spotmasker. Spot-count-funktionen valgt til dette datasæt er Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, hvilket betyder at spot-count-funktionen tællede de pletter, som peAK-maske identificeret inden for standardkanal 11-masken (M11) på kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) med et baggrundsforhold på 4 til 4 (Bright, 4). Figur 4 viser spot-count-histogrammer og repræsentative billeder for gennemsnittet af tæller for Control, Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine Jurkat celler mærket med anti-LC3-AF647. Kontrol og Starved gennemsnitlige spot tæller er ikke signifikant forskellige; Med tilsætning af chloroquin er der stor forskel i middelværdien af Control + Chloroquin sammenlignet med Starved + Chloroquine.
Den næste funktion at undersøge er BDC3. BDC3 er en måling af co-lokalisering af tre markører / prober, i dette tilfælde LC3, p62 og LAMP1. Figur 5A - 5D viser BDC3 histogrammer for kontrol-, kontrol + chlorokin-, starved- og starved + chlorokin-Jurkat-celler mærket med anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE og anti-LC3-AF647. Der er en forskydning mellem kontrol-middelværdien til det stjerneede middel, såvel som kontrollen + chloorquin betyder for Starved + Chloroquine-middelværdien. Men når man ser på billederne af celler fra de gennemsnitlige BDC3-score i figur 5E - 5H , er der en større forskel mellem prøverne end histogrammerne kan føre til at man tror. Dette skyldes, at BDC3 ikke overvejer antallet af autofagiske organeller, der co-lokaliserer, hvilket resulterer i en høj grad af variabilitet i antallet af autofagosomer for den samme BDC3-score. I de fleste tilfælde er der overlapning mellem alle tre prober, fordi selv i basale niveauer, p62, LAMP1 og LC3, i en vis grad skal co-lokalisere eller opholde sig i lignende områder i cellerne. Som en kontrast er et eksempel på tre prober, som ikke bør lokaliseres, anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 og DAPI-nukleært farvestof til Starved + Chloroquine-prøven vist i figur 6. </ P>
Når spot-count-funktionen og BDC3-funktionen kombineres, er tilstedeværelsen af forskellige subpopulationer, der forbedrer evnen til at skelne mellem de forskellige prøver / betingelser, tydelige. Figur 7 viser det bivariate plot af spotantal af LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 for de fire prøver: Control, Control + Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine. Kontrolprøven blev brugt til at indstille gatingstrategien for tre populationer: Low Spots, High Spots / Low BDC3 og High Spots / High BDC3. Kontrolprøverne viste, at mere end 98% af cellerne havde 1 eller færre pletter. Grænsen mellem High Spots / Low BDC3 og High Spots / High BDC3 blev sat til en BDC3 score på 1, fordi mere end 91% af kontrolprøven havde en BDC3 score på mindre end 1. En sammenfatning af resultaterne for de bivariate plots Er vist i tabel 1 .
alder = "1"> 
Figur 1: MIFC Instrument Indstilling. Et skærmbillede af MIFC-instrumentindstillingerne, der anvendes til dette eksperiment, skitseret i trin 8 i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse Software Gating Strategy. Et skærmbillede af analyse software gating skema, skitseret i trin 9 i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Fig3.jpg "/>
Figur 3: LC3 Spot Masking. Jurkat celle billeder og masker bruges til at skabe spot-count funktionen. Vist er BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) og Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Den maske, der fungerede bedst for alle viste celler var Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: LC3 Spot-Count Histogrammer. Ved hjælp af spot-count-funktionen Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 og LC3-AF647 spot-count histogrammerne for Control ( A , lyseblå), Control + ChloroquinE ( B , blå), Starved ( C , pink) og Starved + Chloroquine ( D , rød). De gennemsnitlige punkter tæller for Control, Control + Chlorokin, Starved og Starved + Chlorokin er henholdsvis 0,07, 1,13, 0,10 og 2,77. BF, LC3-AF647 (rød), DAPI-nuklearfarvestof (blå) og en sammensætning af LC3-AF647- og DAPI-billederne af repræsentative celler for gennemsnittetallet er vist for Control ( E , 0 spots), Control + Chloroquine F , 1 spot), Starved ( G , 0 pletter) og Starved + Chloroquine ( H , 3 pletter). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: BDC3 histogrammer af p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogrammer foR Kontrol ( A , lyseblå), Control + Chlorokin ( B , Blå), Starved ( C , Pink) og Starved + Chlorokin ( D , Rød). Den gennemsnitlige BDC3-score for Control, Control + Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine er henholdsvis 0,57, 0,82, 0,74 og 0,98. BF; P62-AF488 (grøn); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (rød); Og en sammensætning af p62-AF488-, LAMP1-PE- og LC3-AF647-billederne af repræsentative celler for den gennemsnitlige BDC3 er vist for Control ( E ), Control + Chlorokin ( F ), Starved ( G ) og Starved + Chlorokin ( H ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: BDC3 Histogrammer af p62 / LC3 / DAPI for Starved + Chloroquine Prøven. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogram for Starved + Chloroquine prøven er vist. Den gennemsnitlige BDC3 score er 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grøn); LC3-AF647 (rød); DAPI (blå); Og en sammensætning af p62-AF488, LC3-AF647 og DAPI-billeder af repræsentative celler for den gennemsnitlige BDC3 er vist for Starved + Chloroquine-prøven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Bivariate Plots af LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate plots of LC3 spot count vs. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 for Control, Control + Chloroquine, Starved og Starved + Chloroquine Jurkat cells. ( B ) BF; P62-AF488 (grøn); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (rød); Og en sammensætning af billederne fra p62-AF488, LAMP1-PE og LC3-AF647 fra tre regioner ( dvs. lavspots, high spots / low BDC3 og High Spots / High BDC3) vises for Starved + Chloroquine-prøven. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Cell Count | Bright Detail Colocalization 3 Mean | Spotantal LC3 Mean | % Lav spot | % Høj spot / lav bdc3 | % High Spot / High BDC3 | |
| Kontrollere | 439 | 0,57 | 0.07 | 98,2 | 1.8 | 0,0 |
| Kontrol + Chlorokin | 1432 | 0,82 | 1.13 | 68,9 19.5 | 11.7 | |
| sultede | 1204 | 0,74 | 0,10 | 98,4 | 0,6 | 1,0 |
| Starved + Chlorokin | 1811 | 0,98 | 2,77 | 32,1 | 36,9 | 31,0 |
Tabel 1: Sammendrag af Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot
Discussion
Ved udførelsen af denne analyse er der et par ting at overveje. Det er vigtigt at have passende kontrolprøver. Til dette eksperiment blev to forskellige kontroller brugt: Kontrol og kontrol + chlorokin. Kontrolprøven blev brugt til at indstille tærsklen for regionerne. Det repræsenterer det basale niveau af autofagi uden at stoppe lysosomal nedbrydning og er kontrollen for den sårede prøve. Kontrolprøven er imidlertid ikke en passende kontrol til at sammenligne med resultaterne fra Starved + Chloroquine-prøven, fordi chlorquin selv påvirker kontrolprøven. Derfor var det nødvendigt at have en Control + Chloroquine prøve.
Før du udfører en analyse for autofagi, er det vigtigt kun at analysere / gate på enkelte celler, der er i fokus ( dvs. gradient RMS større end 60), da resultaterne kan blive påvirket, hvis der er mere end en celle eller billederne er Ude af fokus. Det er afgørende at autophagosomEs og lysosomer er i fokus for korrekt spot tælling og BDC3 analyse. Apoptotiske celler skal fjernes forud for autophagy analyse, da de kan ske resultater og ikke medtages. Der bør være passende farvning for alle tre markører ( dvs. LC3, p62 og LAMP1). F.eks. Er alle tre markører intracellulære og skal have et punkteringssignal; Hvis signalet ikke punkterer, eller hvis det er på overfladen af cellen, ville farvningen ikke være passende, og eksperimentet / farvningen skal omdannes. For at BDC3 skal være præcis, er det desuden vigtigt at gate på celler, der er lyse for alle tre fluorescerende markører af interesse. Gating på positive begivenheder er nødvendig for at forhindre måling af BDC3 på ikke-specifik binding, billeddannende artefakter og / eller støj. Dette er afgørende, da BDC3 potentielt kan forstærke artefakter, der ikke er sande signaler. Da BDC3 kun kan udføres på lyse positive hændelser, er mange celler måske ikke inkluderet i den endelige analyse; Dette er isærI sandhed rigtig for kontrolceller, der ikke har nogen akkumulering af LC3, p62 og / eller LAMP1. En begrænsning af dette assay er således, at BDC3 kun undersøger celler, der er positive for alle tre markører, hvilket måske ikke er passende for alle autofagiske forsøg.
Ligesom BDS, som tidligere er blevet rapporteret 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 tager BDC3 alene ikke hensyn til antallet af autofagiske organeller, der co-lokaliserer, hvilket i høj grad resulterer Af variabilitet i antallet af autofagosomer. Derfor er den bivariate tilgang fremlagt af Rajan et al. Blev ansat. Ser man på de bivariate tomter, kan man spørge omCellerne skal være positive for LC3, p62 og LAMP1; Hvorfor er der så mange celler, der har 0 pletter? Dette skyldes, at LC3-signalet kan være lyst nok til co-lokalisering, men det kan muligvis ikke opfylde tærsklen fastsat af topmasken (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)), der er nødvendig for at den kan betragtes som en få øje på.
Protokollen, der blev præsenteret her, brugte MIFC til at tælle LC3 puncta og co-lokalisering af tre autophagy markører til måling af autophagic flux. Under basale betingelser (Kontrolprøve) var antallet af autofagosomer lavt, og få celler blev fundet med "High Spots." Med tilsætningen af chloroquin, som hæmmer autophagosom / lysosomfusion, var der en stigning i antallet af LC3 pletter. Da lysosomet ikke kan nedbryde autofagosomet og p62, som befinder sig i autophagosomet, fører det til en stigning i co-lokalisering af LC3-, p62- og LAMP1-autolysosomakkumuleringen. Denne virkning blev amplificeret under næringsstofstivelseIon, som inducerer autofagi. Imidlertid var der ingen signifikant stigning i antallet af autofagosomer uden tilsætning af chloroquin, sandsynligvis på grund af en stigning i autofagisk omsætning. Når celler blev sultet i nærværelse af chloroquin, var der en forøgelse af co-lokalisering og antal autofagosomer, hvilket understøtter konklusionen om, at sulten øger autofagisk flux. EBSS er kendt for at være en stærk inducer for autophagy. Det forventes derfor, at stigningen ville være stor. Hvis en anden metode, såsom lægemiddelinduktion, anvendes til at inducere autofagi, kan forskellen mellem kontrol og behandlede prøver være subtilere.
Denne særlige protokol blev designet til at måle autophagy i humane cellelinier, men analysen kunne tilpasses til andre arter ved at skifte til antistoffer for den pågældende art. Desuden kan analysemetoden anvendes til en hvilken som helst intracellulær anvendelse, der kræver co-lokaliseringAf tre prober / markører.
Disclosures
Jeg er ansat af MilliporeSigma, maker af Amnis-mærket ImageStream, som blev brugt i denne undersøgelse.
Acknowledgments
Jeg vil gerne takke mine kolleger ved MilliporeSigma, Philip J. Morrissey og Sherree L. Friend, for deres støtte og vejledning gennem årene. Jeg vil også gerne takke Vidya Venkatachalam og Bryan R. Davidson for deres hjælp med BDC3 funktion i IDEAS softwaren, Ryan P. Jessup om hjælp redigering dette manuskript, Raymond Kong for at få hjælp på dagen for skydning, og en særlig tak Til makeup kunstner Cynthia Xamonthiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
References
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
- Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
- Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
- Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
- Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
- Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
- Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
- Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
- Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
- Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
- Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
- Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
- Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
- Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
- Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
- Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
- Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
- Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
- Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
- Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
- Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
- IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).
