Summary
Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.
Abstract
Autofagie is een catabolische weg waarin normale of disfunctionele cellulaire componenten die tijdens groei en differentiatie accumuleren, worden afgebroken via het lysosoom en worden gerecycled. Tijdens autofagie wordt cytoplasmatisch LC3-eiwit gelipideerd en gewerkt aan de autofagosomale membranen. De autofagosoom versmelt dan met het lysosoom om het autolysosoom te vormen, waar de afbraak van de autofagosoom vesikel en de inhoud ervan voorkomt. Het ubiquitine-geassocieerde eiwit p62, dat bindt aan LC3, wordt ook gebruikt om autofagische flux te controleren. Cellen die autofagie ondergaan, dienen de co-lokalisatie van p62-, LC3- en lysosomale markers aan te tonen. Immunofluorescentiemicroscopie is gebruikt om visueel LC3 puncta, p62 en / of lysosomen op basis van per cel te identificeren. Een objectieve en statistisch strenge beoordeling kan echter moeilijk worden verkregen. Om deze problemen te overwinnen werd multispectrale beeldvormende flowcytometrie gebruikt, samen met een analytische functie die de heldereStaart beelden van drie autofagie markers (LC3, p62 en lysosomale LAMP1) en kwantificeert hun co-lokalisatie, in combinatie met LC3 spot counting om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.
Introduction
Macroautophagy, hierna aangeduid als autofagie, is een catabolische weg waarin beschadigde of disfunctionele componenten, langlevende eiwitten en organellen worden afgebroken via het lysosoom en worden gerecycleerd 1 . Autofagy is een dynamisch, veelzijdig proces dat de vorming van een autofagosoom omvat; De fusie van het autofagosoom met het lysosoom, het vormen van het autolysosoom; En de afbraak van de inhoud van het autolysosoom 2 . De cruciale biologische marker die gebruikt wordt om autofagie bij zoogdierstelsels te identificeren is de microtubule-geassocieerde eiwit 1A / 1B-lichte keten 3 (LC3), die het autofagosomale membraan vormt. Tijdens autofagie wordt cytosolische LC3-1 geconjugeerd aan fosfatidylethanolamine om LC3-II te vormen; LC3-II wordt dan opgenomen in het autophagosomale membraan 3 . Een andere veel gebruikte marker voor autofagische flux is de autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) die fysiek liNx autofagische lading naar het autofagische membraan 4 , 5 .
Methoden die traditioneel zijn gebruikt om autofagie te meten zijn Western blots en fluorescentiemicroscopie 7 . Echter, geen van deze methoden worden beschouwd als de "gouden standaard", 2 , 6 aangezien er uitdagingen zijn die samenhangen met beide van deze technieken. Westerse blots geven alleen een gemiddelde omdat ze een homogenaatmonster gebruiken, dus waarnemers kunnen niet zien wat er gebeurt in individuele cellen. Aan de andere kant geeft de fluorescentiemicroscopie een waarnemerinformatie op het single-celniveau, maar ontbreekt de doorvoermogelijkheden waardoor het moeilijk om objectieve en statistisch nauwkeurige evaluaties te verkrijgen. In de afgelopen jaren is de meting van LC3 en p62 door multispectrale beeldvormende flowcytometrie (MIFC, zie de Tabel van Materialen ) populair gewordenZeldzaamheid als gevolg van zijn kwantitatieve kracht, hoge capaciteit voor capaciteit, multiplexpotentieel en het vermogen om elke cel te maken. Een van de meest gebruikte methoden om autofagie te meten met behulp van MIFC, samen met zijn metgezelanalysesoftware (zie de Tabel van Materialen ), is door middel van de spottelling van LC3 puncta of autofagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Een toename van autofagosomen betekent echter niet dat er een toename van autofagie is, aangezien het ook een blokkade in het proces zou kunnen vormen 2 . LC3-II omzet is een nuttige parameter om autofagische flux te meten door cellen in aanwezigheid en analyse te analyserenAfwezigheid van een lysosomale afbraakremmer, zoals chloroquine. Chloorquine remt de fusie van het autofagosoom tegen het lysosoom, waardoor de kwantificering van de autofagosoomvorming als een maat van de mate van autofagie wordt toegestaan door autofagische flux te stoppen voordat de lysosomale afbraak kan optreden 18 . Bovendien wordt p62 hoofdzakelijk door autofagie afgebroken en als de lysosomale afbraak van het autofagosoom en de inhoud daarvan geblokkeerd wordt, wordt een accumulatie van p62 17 , 19 verwacht.
Autophagy is een multistep proces, en de meting van LC3 of P62 alleen geeft geen volledige beeld van wat er in de cellen gebeurt. Recente publicaties hebben de nadruk gelegd op de noodzaak om de gelijktijdige vorming van de autolysosomen 2 , 17 , 20 , 21 te onderzoeken . MIFC isander in staat de vorming van de autolysosome meten door beeldvorming van de co-lokalisatie van de autophagosome het lysosoom 15-17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Daarnaast is de co-lokalisatie van p62 en LC3 met behulp van MIFC ook onderzocht om autofagische flux 5 te meten. In de verwijzende analysesoftware wordt de 'functie' die co-lokalisatie meet, 'Bright Detail Similarity R3' genoemd (BDS) en werd specifiek ontworpen om de kleine, heldere beelddetails van twee beelden te vergelijken. BDS is de log-getransformeerde Pearson's correlatiecoëfficiënt van de gelokaliseerde heldere plekken met een straal van 3 pixels of minder; Met andere woorden, BDS berekent de mate van oVerlapping pixels uit twee verschillende fluorescerende kanalen. De heldere plekken zijn ofwel gecorreleerd ( dwz dezelfde ruimtelijke locatie) of ongecorreleerde ( dwz verschillende ruimtelijke locaties). Daarom varieert de correlatiecoëfficiënt tussen 0 (uncorrelated) en 1 (perfecte correlatie). De coëfficiënt is log-getransformeerd om het bereik te verhogen tot tussen nul en oneindigheid 26 , 27 . BDS alleen kan niet voldoende zijn; Rajan et al. Bleek dat het gebruik van alleen BDS kan leiden tot false-positieve of false-negative results 21 . BDS evalueert de co-lokalisatie van twee markers van autofagie, maar beschouwt niet het aantal autofagosomen. Om rekening te houden met het aantal autofagosomen, Rajan et al. Inbegrepen spot-counting van de LC3 puncta 21 . Rajan et al. Voorgesteld met behulp van een bivariate scatter plot van LC3 spot count versus BDS. Met behulp van deze bivariate plot, werkten twee populatiesE eerst geïdentificeerd: een met cellen met een hoog niveau van LC3 plekken en een met cellen met een laag niveau van LC3 plekken. De hoge LC3-spotbevolking werd verder ingedeeld in twee populaties: cellen met lage co-lokalisatie (dat wil zeggen accumulatie van autofagosomen) en cellen met hoge co-lokalisatie (dat wil zeggen accumulatie van autolysosomen). Deze bivariate plot maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen cellen met zeer weinig autofagosomen en cellen met een accumulatie van autofagosomen en / of autolysosomen 21 .
Tot nu toe was de gelijktijdige co-lokalisatie van LC3, p62 en LAMP1 (lysosomale marker) niet mogelijk met behulp van een enkele "Feature Type" in de MIFC Companion Analysis Software (zie de Tabel van Materialen ). Echter, een nieuwe functie, die onlangs in versie 6.1 is geïntroduceerd, heet Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergelijkt de heldere detailafbeeldingen van elk van de drie afbeeldingen (in dit geval LC3, p62 en LAMP1) en kwantificeert de co-lokalisatie van de drie probes ( dwz LC3, p62 en LAMP1). De BDC3-functie berekent de correlatiecoëfficiënt van Pearson die is aangepast om uit te breiden naar drie afbeeldingen. Aangezien de felpunten in de drie afbeeldingen gecorreleerd of ongecorreleerd zijn, varieert de correlatiecoëfficiënt tussen 0 (uncorrelated) en 1 (perfecte correlatie). De coëfficiënt is log-getransformeerd om het dynamische bereik tussen 0 en oneindigheid te verhogen. Door de BDS functie uit te schakelen met de BDC3 functie, de analysemethode gepresenteerd door Rajan et al. Kan nu de drie meest gebruikte markers opnemen om autofagie in één systeem tegelijk te meten. De mogelijkheid om deze drie markers van autofagie in een enkele analyse te co-lokaliseren kan leiden tot nieuwe inzichten in de inductie en regulering van autofagie. Het volgende protocol geeft een overzicht van de stappen om autofagie in Jurkat-cellen te veroorzaken; Label de cellen met LC3, p62 en LAMP1 antilichamen; Gegevens verwerven op een multispEctrale beeldvormende flow cytometer; En analyseer de gegevens om autofagische flux te beoordelen.
Protocol
1. Bereiding van culturele medium en lysosomale afbraak inhibitor
- 1.1. Maak ~ 500 ml 1x RPMI kweekmedium. Voeg 5 ml MEM niet-essentiële aminozuren (100x), 5 ml natriumpyruvaat (100 mM), 5 ml penicilline-streptomycine-glutamine (100x) en 25 ml foetale runder serum (FBS) toe aan een 500 ml Fles RPMI - 1640 1x medium. Het medium moet worden voorbereid in een biosafety-kast. Bewaar het RPMI-kweekmedium bij 2-8 ° C. Verhit het RPMI-kweekmedium tot 37 ° C voorafgaand aan het toevoegen aan de Jurkat-cellen.
- Maak 100 mM chloroquine, de lysosomale afbraakremmer. Weeg 0,05 g chloorquinedifosfaatsout op en voeg het toe aan 1 ml water van celkweek in een 15 ml-centrifugebuis. Vortex tot het chlorochine is opgelost.
2. Culturen van cellen
- Kweek 80 ml Jurkatcellen kloon E6-1 in RPMI cultuurmedium bij 37 ° C en 5% CO2.
OPMERKING: Bij het cultiveren van cellenOf werken met de Jurkat-cellen voorafgaand aan fixatie, moet alle werkzaamheden in het biosafety-kabinet worden uitgevoerd. - Voordat autofagie wordt geïnduceerd, tel de Jurkat-cellen met behulp van een hemocytometer of een ander cel tellen apparaat om de cellen / ml te bepalen.
3. Inducing Autophagy in Cells
- Neem de Jurkat-cellen in exponentiële groeifase en verdeel ze in vier monsters van 20 ml elk in 50 ml centrifuge buizen. Benoem de buizen als "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" en "Starved + Chloroquine."
OPMERKING: Jurkat-cellen moeten een concentratie van 2,5-5 x 10 5 cellen / ml hebben. - Was de cellen door 30 ml Hank's Balanced Salt Solution zonder Ca 2+ of Mg 2+ (HBSS) toe te voegen aan elk monster. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 minuten. Giet het supernatant in een afvalbeker.
- Resuspendeer de controle monsters in 20 ml RPMI kweekmedium door pipetteren omhoog en omlaag met behulp van een 25 ml sTerile disposable pipette gevolgd door het uitvoeren van lichte vortexing. Op soortgelijke wijze resuspenderen de verhongerde monsters in 20 ml Earle's Balanced Salt Solution zonder Ca 2+ of Mg 2+ (EBSS).
- Gebruik een 25 ml steriele wegwerppijp, verplaats de controle en verhongerde monsters naar T75 flessen die zijn aangeduid met "Control", "Control + Chloroquine," "Starved" en "Starved + Chloroquine."
- Voeg 20 μl 100 mM chloroquine toe aan het 20 ml celkweekmedium in de "Control + Chloroquine" en de "Starved + Chloroquine" flessen. Meng in het chloroquine door de fles voorzichtig te wervelen. Plaats alle flesjes in een 37 ° C en 5% CO 2 incubator gedurende 2 uur.
4. Bereiding van buffers voor de fixatie en etikettering van LC3, LAMP1 en p62
- Bereid 10 ml 4% formaline fixatieoplossing in PBS op. Voeg 4 ml 10% formalinvoorraad toe aan 1 ml 10x Dulbecco's fosfaatbufferZoutoplossing zonder Ca 2+ of Mg 2+ (PBS) en 5 ml ultraperout water in een 15 ml centrifugebuis.
OPMERKING: VOORZICHTIG. Formalin / formaldehyde is giftig bij inademing of inslikking; Irriterend voor de ogen, ademhalingswegen en huid; En kan overgevoeligheid veroorzaken bij inademing of contact met de huid. Er bestaat gevaar voor ernstige schade aan de ogen. Het is een potentieel kankerverwekkend middel. - Bereid 10 ml 1% formaline uiteindelijke resuspensie oplossing in PBS op. Voeg 1 ml 10% formaline voorraad toe aan 9 ml 1x PBS in een 15 ml centrifuge buis.
- Bereid 500 ml wasbuffer door 10 ml FBS aan een 500 ml fles 1x PBS toe te voegen.
- Bereid 50 ml permeabilisatiebuffer in een 50 ml centrifugebuis door 0,5 ml 10% triton X-100 op te voegen aan de 49,5 ml wasbuffer bereid in stap 4.3.
- Bereid anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) antilichaam / permeabilisatiebuffer werkoplossing door 5 μl anti-SQSTM1 / p62-AF488 tot 495 μl van de door middel van permeabilisatie gemaakte buffer in sTap 4.4. Zorg ervoor dat de uiteindelijke antilichaamconcentratie 5 μg / ml is.
OPMERKING: Maak de antilichaampermeabilisatiebuffer werkoplossing net voor het toevoegen aan het monster. Bescherm de oplossing tegen licht. - Bereid de muis anti-LC3 / permeabiliseringsbuffer werkoplossing door 5 μL muis anti-LC3 toe te voegen aan 495 μL van de permeabilisatiebuffer die is gemaakt in stap 4.4. Zorg ervoor dat de uiteindelijke antilichaamconcentratie 20 μg / ml is.
OPMERKING: Maak werkoplossingen voor antilichaampermeabilisatiebuffer net voor het toevoegen aan het monster. Bescherm de oplossing tegen licht. - Bereid ebben anti-muis-Alexa 647 (AF647) / permeabiliseringsbuffer werkoplossing door 5 μL AF647 gemarkeerde ezel anti-muis-IgG toe te voegen aan 495 μl van de permeabilisatiebuffer die is gemaakt in stap 4.4. Zorg ervoor dat de uiteindelijke antilichaamconcentratie 20 μg / ml is.
OPMERKING: Maak de antilichaampermeabilisatiebuffer werkoplossing net voor het toevoegen aan het monster. Bescherm tHij oplossing van licht. - Bereid anti-humane CD107a (LAMP1) -PE antilichaam / permeabilisatiebuffer werkoplossing door 25 μL anti-CD107a (LAMP1) -PE op te nemen aan 475 μl van de door middel van stap 4.4 gemaakte permeabilisatiebuffer. Zorg ervoor dat de uiteindelijke antilichaamconcentratie 21 μg / ml is.
OPMERKING: Maak de antilichaampermeabilisatiebuffer werkoplossing net voor het toevoegen aan het monster. Bescherm de oplossing tegen licht. - Bereid 10x DAPI nucleaire vlek door 4 μL 5 mg / ml DAPI en 100 μl 10% triton X-100 tot 896 μl 1x PBS toe te voegen.
5. Het labelen van de Jurkat-cellen met LC3, LAMP1 en P62
- Verwijder 2 x 10 6 cellen per monster (tel de cellen zoals in stap 2.2). Plaats elk monster in een 15 ml-centrifugebuis die is gemerkt met de juiste monsternaam ( dwz Control, Control + Chloroquine, Starved of Starved + Chloroquine).
- Voeg wasbuffer toe zodat er iHet totale volume van 15 ml in elke 15 ml centrifuge buis. Centrifugeer de monsters bij 250 xg gedurende 10 minuten. Aspireren van de supernatant.
- Voeg 100 μl 4% formalinfixatieoplossing toe aan elk van de celpellets. Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende de fixatie stap, overbrengen van de monsters naar gelabelde, ge siliconiseerde polypropyleen microcentrifuge buizen.
OPMERKING: Zet de cellen niet over Dit kan leiden tot slechte etiketteringsresultaten. - Na de 10 minuten fixatie stap, voeg 1 ml wasbuffer toe aan elk monster. Pipet omhoog en omlaag met een P1000 pipet om het monster te mengen. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Aspireren van de supernatant.
- Voeg 100 μl anti-SQSTM1 / p62-AF488 antilichaam / permeabilisatie buffer werkoplossing toe aan elk monster. Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Was de cellen door 1 ml vanPermeabilisatiebuffer voor elk monster. Pipet omhoog en omlaag met een P1000 pipet om het monster te mengen. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Aspireren van de supernatant.
- Herhaal stappen 5.4-5.5 voor elk van de antilichaam werkoplossingen.
OPMERKING: De werkzame oplossingen van het antilichaam zijn anti-LC3 / permeabiliseringsbuffer werkende oplossing tegen de muis, anti-muis anti-muis-AF647 / permeabiliseringsbuffer werkoplossing en anti-menselijke CD107a (LAMP1) - PE-antilichaam / permeabilisatiebuffer werkoplossing. Elk antilichaam dient afzonderlijk en in de genoemde volgorde te worden uitgevoerd. De volgorde werd gekozen om ongewenste cross-reactiviteit tussen antilichamen te minimaliseren. - Voeg 100 μl 1% formalinoplossing toe. Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet. Voeg 10 μL van de 10x DAPI kernvlek toe aan elk monster. Vortex elk monster om te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur voordat u een van de monsters op het instrument uitvoert.
OPMERKING: op dit moment kan het monster bE voor maximaal een week tegen 2-8 ° C tegen licht bewaren.
6. Etikettering van enkele kleurencontroles
- Voor elke enkele kleurregeling ( dwz AF488, PE, AF647 en DAPI), neem 1 x 10 6 Jurkat-cellen, die uit een van de steekproefpopulaties kunnen zijn. Zet 1 x 10 6 cellen in 15 ml centrifuge buizen gemerkt als AF488, PE, AF647 of DAPI.
- Voeg wasbuffer toe zodat er een totaal volume van 15 ml in elke 15 ml centrifugebuis is. Centrifugeer de monsters bij 250 xg gedurende 10 minuten. Aspireren van de supernatant.
- Voeg 100 μl wasbuffer toe aan de AF488, PE en AF647 buizen.
OPMERKING: Ga naar stap 6.8 voor de DAPI-buis.- Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet. Overbrengen naar 1,5 ml buizen.
- Voeg 5 μL van respectievelijk respectievelijk anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE of anti-CD45-AF647 toe aan respectievelijk de AF488-, PE- of AF647-buizen. Meng door vortexing lightly.
- Incubeer de AF488, PE en AF647 buizen gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Andere markers kunnen gebruikt worden, zoals LC3, p62 en LAMP-1 antilichamen in plaats van anti-CD45 antilichamen. CD45 is echter een betrouwbare marker voor enkele kleurencontroles. - Was de AF488, PE en AF647 cellen door 1 ml wasbuffer aan elk monster toe te voegen.
- Pipet omhoog en omlaag met een P1000 pipet om het monster te mengen. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Aspireren van de supernatant.
- Voeg 100 μl 1% formalinoplossing toe. Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet.
OPMERKING: op dit moment kan het monster op de MIFC of voor maximaal een week beschermd tegen licht op 2-8 ° C worden opgeslagen. - Voeg 100 μl 1% formaline fixatieoplossing toe aan de DAPI buis.
- Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag met een P200 pipet. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 toe1; L van 10x DAPI nucleaire vlek aan het DAPI monster. Licht vortex om te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur voordat u op het instrument loopt.
OPMERKING: op dit moment kan het monster op de MIFC of voor maximaal een week beschermd tegen licht op 2-8 ° C worden opgeslagen.
7. Starten en kalibreren van de MIFC
- Controleer of de behuizing, het systeemkalibratie-reagens (zie de Tabel van Materialen ), de debilator, de reiniger en de sterilisatorcontainers vol is en de afvalbak leeg is. Zo niet, vul de containers en lege de afvalbak.
- Zet het systeem op en dubbelklik op de software (zie het pictogram Table of Material s) om de applicatie te starten; Dit zal de MIFC-software starten.
- Klik op de knop Opstarten en zorg ervoor dat Start alle kalibraties en tests is geselecteerd. Dit zal het systeem spoelen, laadmantel, systeem kalibratie reagens,En kalibreren het systeem.
8. Het uitvoeren van de monsters en enkele kleurencontroles op de MIFC
- Laad de standaard sjabloon door op het tabblad Bestand te gaan en selecteer Standaard sjabloon laden .
OPMERKING: De standaard sjabloon bevat de ruwe maximale pixelpictogrammen. - Zet de 488 nm, 405 nm, 642 nm en SSC lasers aan door op hun respectieve knoppen te klikken. Stel de laserstroom in door de gewenste stroom naast elke laserknop in te voeren. Zie figuur 1 .
OPMERKING: Voor dit experiment zijn de laserkrachten 200 mW, 20 mW, 150 mW en 5 mW (Ch06) voor respectievelijk 488 nm, 405 nm, 642 nm en SSC. De MIFC standaard sjabloon vergroting het ingesteld op 40X, de standaard gevoeligheid is Hi , en alle kanalen zijn ingeschakeld. - Bevestig dat de vergrotingsschuifregelaar is ingesteld op 40X, de modus voor hoge gevoeligheid is geselecteerd en alle kanalen worden weergegeven in de beeldgalerij; Figuur 1
- Laad het monster "Starved + Chloroquine" door op de Load- knop te klikken en de 1,5 ml buis op het instrument te laden.
OPMERKING: Dit experimentele monster moet het hoogste signaal hebben van alle monsters voor AF488, PE en AF647 (het DAPI-signaal zou ongeveer dezelfde signaalsterkte moeten hebben voor alle experimentele monsters, inclusief het monster "Starved + Chloroquine"). - Gebruik het "Starved + Chloroquine" -monster om te bevestigen dat de juiste laservermogens voor de 488 nm, 405 nm, 642 nm en SSC lasers zijn ingesteld. Gebruik de ruwe pixelpunten van de ruwe pixel van de standaard sjabloon om de laservermogen aan te passen zodat de signalen sterk zijn, maar niet een ruwe maximale pixelwaarde van 4.096 bereiken, wat de CCD-camera op het instrument zou verzadigen. Gebruik deze laserinstelling voor alle experimentele monsters.
- Klik op het pictogram Dot Plots maken om een nieuw punt te maken. Selecteer "Area_M01 "op de X-as en" Aspect Ratio_M01 "op de Y-as voor de" all "-populatie. Klik op het pictogram Creëer veelhoeksgebied . Teken een regio rond de cellen.
OPMERKING: Gebruikers kunnen extra percelen en gebieden toevoegen om de cellen die worden verzameld, te beperken. Een gemeenschappelijke aanvullende plot om toe te voegen zou Gradient RMS zijn om cellen die in focus zijn te identificeren. - Stel de acquisitieparameters in. Geef de bestandsnaam en de bestemmingsmap op, verander het aantal gebeurtenissen naar "5000," en selecteer de "Cell" -collectiepopulatie. Klik op de knop Acquire om het bestand te verwerven. Na het verzamelen van het bestand, retourneer het monster door op de Return knop te klikken. Verwijder de monsterbuis uit het instrument.
- Voor de volgende drie monsters ("Starved", "Control" en "Control + Chloroquine"), laad het monster, voer de voorbeeldnaam in, ontdek het monster en verzend het monster met dezelfde instellingen alsVoor het "Starved + Chloroquine" monster hierboven.
- Nadat de monsters zijn verworven, rijd de monokleuren controle monsters en verwerven gegevens zodat een compensatie matrix kan worden gemaakt. Zet de SSC-laser uit door op de SSC- knop te klikken. Schakel de brightfieldkanalen uit door op de Brightfield- knop te klikken en OFF te selecteren.
OPMERKING: als kanalen uit de beeldgalerij zijn verwijderd voor experimentele steekproeven, moet u alle kanalen opnieuw inschakelen. Als alternatief kunnen enkele kleurencontroles worden verkregen door op het tabblad Vergoeding te klikken en selecteer Matrix maken ; Hiermee wordt de compensatiewizard geopend, die door de stap van het verzamelen van bestanden loopt en een compensatiematrix maakt. - Laad de DAPI single-color control door op de Load-knop te klikken en de 1.5 mL buis in het instrument te laden. Voer de voorbeeldnaam in (alleen DAPI), stel de verzamelpopulatie in op 'Alles' en verander het aantal gebeurtenissenS naar "500."
- Klik op de knop Acquire om het enkelkleurbesturingsbestand te verkrijgen.
- Wanneer de verzameling van bestanden is voltooid, retourneer het monster door op de knop Terug te klikken. Verwijder de monsterbuis uit het instrument.
- Na het DAPI-monster, laad 10% bleekmiddel net als een monster door op de Load- knop te klikken en 100 μL 10% bleekmiddel in een 1,5 ml buis te laden. Laat het monster lopen voor ~ 15 s. Hiermee verwijdert u eventuele resterende DAPI uit de buis.
- Doe 100 μl 1x PBS, zoals gedaan in 8.10.3, om de resterende 10% bleekmiddel te verwijderen. Het instrument is nu klaar om de AF488, PE en AF647 single-color controls uit te voeren.
- Herhaal stappen 8.10-8.10.2 voor elk van de enkele kleurencontroles ( dwz AF488, PE en AF647).
OPMERKING: Er is geen noodzaak om 10% bleekmiddel of PBS tussen deze monsters te laten lopen, pas na de DAPI single-color control.
9. Gegevensanalyse in de MIFC AnAlysis software
- Start de MIFC-analysesoftware (zie de Tabel van Materialen ).
- Klik op Start Analyse om de wizard Open bestand te starten. Selecteer het gegevensbestand dat u wilt openen door naar het raw image bestand (.rif) van het "Starved + Chloroquine" -bestand te gaan. Selecteer het bestand en klik op de knop Openen . Klik op Volgende .
- Vergoed compensatie. Selecteer een eerder gecreëerde compensatiematrix en klik op Volgende . U kunt ook een nieuwe compensatiematrix maken door op de knop Nieuwe Matrix te klikken.
OPMERKING: Stappen 9.2.1.1-9.2.1.2 zijn de stappen om een nieuwe matrix te maken.- Voeg de eenkleurige controle bestanden (dat wil zeggen, DAPI alleen, AF488 alleen, PE, en alleen AF647) om de lijst Controle-bestanden door te klikken op Bestanden toevoegen, de bestanden te selecteren en te klikken op de knop Openen. Klik op Volgende .
- Het venster Create Compensation Matrix verschijnt voor dit experiment. EnsurE dat Ch02, Ch03, Ch07 en Ch11 zijn geselecteerd en klik op Volgende . De compensatiematrix wordt gecreëerd. Klik op Voltooien om de vergoedingsmatrix op te slaan. Voeg het vergoedingsbestand toe aan de Open File Wizard en klik op Next .
- Pas de analyse sjabloon toe. Op dit moment is er geen analyse sjabloon om toe te passen, dus klik op Volgende .
OPMERKING: Voor de andere experimentele bestanden kan dit bestand "Starved + Chloroquine.daf" als sjabloon worden gebruikt. - Noem het bestand (de bestandsnamen die overeenkomen met de "rif" namen worden automatisch gegenereerd) en klik op Next . Stel de eigenschappen van de beeldweergave in door de "02," "03," "07," en "11" kanalen te selecteren; Kanalen 01, 06 en 09 zijn voorgeselecteerd. Klik op Volgende .
- Vergoed compensatie. Selecteer een eerder gecreëerde compensatiematrix en klik op Volgende . U kunt ook een nieuwe compensatiematrix maken door op de knop Nieuwe Matrix te klikken.
- Aan het einde van de wizard Open bestand selecteert u de wizard Apoptose . Klik op het pictogram Apoptosis Wizard en vervolgens opDe knop Wizard Selecteren om de Apoptosis Wizard te openen.
- Selecteer het kernbeeldkanaal (Ch07) en klik op Next . Poort de cellen in de beste focus. Klik op het pictogram Create Line Region en teken een regio op de gradiënt RMS_M01_Ch01 van 60-90. Benoem deze regio 'Focus', klik op OK en klik op Volgende .
- Poort de enkele cellen. Klik op het pictogram Create Polygon Region . Teken een gebied rond de enkele cellen, noem de regio 'Single', klik op OK en klik op Next . Klik op Nee voor "Wil je subpopulaties analyseren?"
- Poort de gecodeerde cellen. Klik op het pictogram Create Line Region en teken een regio met alle nucleaire cellen. Benoem de regio 'Nucleated.' Klik op OK en Volgende .
- Poort de apoptotische cellen. Klik op het pictogram Create Polygon Region . Teken een gebied rond de apoptotische cellen; Dit zijn cellenMet een lage nucleaire oppervlakte_t50% en een hoog lichtveldcontrast. Klik op Voltooien . Voeg een tweede regio toe door op het pictogram Create Polygon Region te klikken en een regio rond de niet-apoptotische cellen te tekenen; Bel deze regio 'cellen'.
- Selecteer cellen die positief zijn voor LAMP1, P62 en LC3. Klik op het pictogram Bouwblokken , selecteer Fluorescentiepositieven - Eén kleur en selecteer de 'Cellen'-populatie en Intensity_MC_Ch03 . Benoem de X-Axis "Intensity LAMP1." Teken een gebied met cellen met intensiteiten groter dan 10.000 door op het pictogram Creëre lijnregio te klikken en de regio te tekenen. Benoem deze regio "LAMP1 +." Volg dezelfde stappen als in 9.4 om cellen die positief zijn voor p62 en LC3 te selecteren.
- Voor p62 + selecteer de 'LAMP1 +' populatie en Intensity_MC_Ch02 . Benoem de X-as "Intensiteit p62" en het gebied van p62 + cellen "LAMP1 + / p62 +."; Voor de LC3 + selecteert u de 'LAMP1 + / p62 +' populatie en Intensity_MC_Ch11. Benoem de X-Axis "Intensity LC3" en het gebied van LC3 + cellen "LAMP1 + / p62 + / LC3 +." Gebruik deze "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" populatie voor de rest van de analyse.
- Maak een spot-count functie om de LC3 spots te tellen.
OPMERKING: dit moet worden gecreëerd met behulp van het monster "Starved + Chloroquine".- Klik op het tabblad Analyse en selecteer Masker . Klik op de knop Nieuw en dan de Functie . Selecteer onder Functie Peak ; Masker , selecteer M11 ; En Channel , selecteer Ch11 . Stel de plek in de achtergrond voor de achtergrond van de cel op 4 . Klik op OK om het venster Definiëren masker te sluiten en OK om deze toe te voegen aan de Maskerlijst . Klik op Sluiten om de Mask Manager te verlaten.
- Klik op het tabblad Analyse en selecteer
OPMERKING: de Spot wizard kan ook worden gebruikt om een spot count functie te maken. De spot-count-functie die in dit experiment wordt gebruikt, is mogelijk niet geschikt voor andere experimenten en / of cellijnen. De gebruiker moet meerdere spot-count maskers / eigenschappen testen bij het bepalen van een masker / functie voor een specifieke dataset. Pugsley 2017 heeft nadere details over spottelling met behulp van de MIFC analyse software 26 . - Klik op het pictogram Nieuw Histogram . Selecteer de populatie 'LAMP1 + / p62 + / LC3 +'. Selecteer de Spot Count LC3-functie en klik op OK .
- Maak de BDC3-functie aan.
- CKlik op het tabblad Analyse en selecteer Functies . Klik op de knop Nieuw . Selecteer onder Helptype Colocalization 3 onder Functietype ; Masker , selecteer MC ; Afbeelding 1 , selecteer Ch02 (p62); Afbeelding 2 , selecteer Ch03 (LAMP1); En ik mag 3 , selecteer Ch11 (LC3). Typ "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" voor de naam en klik op OK en sluit om het menu te verlaten Feature Manager .
- Klik op het pictogram Nieuw Histogram . Selecteer de populatie 'LAMP1 + / p62 + / LC3 +'. Selecteer de functie BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 en klik op OK .
- Klik op het pictogram Nieuwe Scatterplot . Selecteer de populatie 'LAMP1 + / p62 + / LC3 +'. Selecteer BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 voor de X-as. Selecteer de Spot Count LC3- functie voor de Y-as. Klik op OK .
- Sla thE "Starved + Chloroquine" bestand. Klik op Bestand en selecteer Save Data Analysis-bestand (.daf) . Klik op Opslaan en Ja om de vorige versie van het bestand te vervangen; Dit bestand kan nu als sjabloon worden gebruikt.
- Open het bestand "Control". Klik op Bestand en open vervolgens. Selecteer het bestand "Control.rif" en klik op Openen . Selecteer de compensatiematrix uit stap 9.2.1 en het bestand "Starved + Chloroquine.daf" als de sjabloon. Klik op OK .
- Creëer regio's voor autophagosome accumulatie en autolysosoom accumulatie met behulp van het "Control" monster om de regio's in te stellen.
- Klik op het pictogram Reghoek regen maken. Teken een gebied van X-coördinaten van -0,1 tot 3 en Y-coördinaten van 1,5 tot -0,3. Benoem deze regio 'Low Spots.' Klik op de Maak rechthoek regio pictogram. Teken een gebied van X-coördinaten van -0,1 tot 1 en Y-coördinatenAtes van 17,5 tot 1,5. Benoem deze regio "High Spot / Low BDC3."
- Klik op het pictogram Reghoek regen maken. Teken een gebied van X-coördinaten van 1 tot 3 en Y-coördinaten van 17,5 tot 1,5. Benoem deze regio "High Spots / High BDC3."
- Sla het bestand 'Beheer' op. Klik op Bestand en selecteer Save Data Analysis-bestand (.daf ) . Klik op Opslaan en Ja om de vorige versie van het bestand te vervangen; Dit bestand kan nu als sjabloon worden gebruikt.
- Open het bestand "Control + Chloroquine" door op File te klikken en Open dan . Selecteer het bestand "Control + Chloroquine.rif" en klik op Openen . Selecteer de compensatiematrix uit stap 9.2.1 en het bestand "Control.daf" als de sjabloon. Klik op OK . Herhaal dit voor de "Starved" en "Starved + Chloroquine" bestanden.
OPMERKING: De batchfunctie in de analysesoftware kan ook gebruikt worden om de compensa aan te passenMatrix en / of sjabloon naar de andere bestanden. De laatste gatingstrategie is weergegeven in figuur 2 .
Representative Results
Deze analysemethode maakt gebruik van meerdere functies om autofagische flux te bepalen. Om de definitieve bivariate plot volledig te begrijpen, moeten de individuele analyse-eigenschappen eerst worden onderzocht. Het tellen van autofagosomen is een logische manier om autofagie te meten. De grootte / vorm / helderheid van LC3 puncta kan echter drastisch variëren tussen cellen. Variatie kan het moeilijk maken om autofagosomen handmatig te tellen of met behulp van een spot-count functie in de analysesoftware. Daarom zal geen spot-count functie perfect zijn door deze grote variabiliteit in autofagosomen. Echter, een goede spot-count functie zal werken op de meeste cellen 26 . Figuur 3 toont voorbeelden van spotmaskeren van LC3 puncta in Jurkat-cellen met behulp van verschillende spotmaskers. De spot-count-functie die voor deze dataset is geselecteerd, is Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 4) _4, wat betekent dat de spot-count-functie de punten heeft geteld die de peAK masker geïdentificeerd in het standaard kanaal 11 masker (M11) op kanaal 11 (Ch11-LC3-AF647) met een achtergrondverhouding van 4 (Bright, 4). Figuur 4 toont spot-count histogrammen en representatieve afbeeldingen voor de gemiddelde spottelling voor de Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine Jurkat cellen gemarkeerd met anti-LC3-AF647. De Control en Starved gemiddelde spot tellingen zijn niet significant verschillend; Met toevoeging van chloroquine is er een groot verschil in het gemiddelde van de Control + Chloroquine vergeleken met de Starved + Chloroquine.
De volgende functie om te onderzoeken is BDC3. BDC3 is een meting van de co-lokalisatie van drie markers / probes, in dit geval LC3, P62 en LAMP1. Figuur 5A - 5D toont BDC3 histogrammen voor de Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine Jurkat cellen gemerkt met anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE en anti-LC3-AF647. Er is een verschuiving tussen de Control-gemiddelde voor de Starved-gemiddelde, evenals de Control + Chloroquine gemeen op de Starved + Chloroquine-gemiddelde. Kijkend naar de beelden van cellen uit de gemiddelde BDC3 scores in Figuur 5E - 5H , is er echter een groter verschil tussen de monsters dan de histogrammen kunnen leiden tot een geloof. Dit komt doordat BDC3 het aantal autofagieorganellen die co-lokaliseren niet in aanmerking neemt, resulterend in een grote mate van variabiliteit in het aantal autofagosomen voor dezelfde BDC3-score. In de meeste gevallen bestaat er een overlap tussen alle drie de probes, omdat zelfs bij basale niveaus p62, LAMP1 en LC3, in zekere mate co-lokaliseren of verblijven in soortgelijke gebieden in de cellen. In contrast, een voorbeeld van drie probes die niet co-lokaliseren, zijn anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 en DAPI nucleaire kleurstof voor het Starved + Chloroquine-monster, weergegeven in Figuur 6. </ P>
Wanneer de spot-count-functie en de BDC3-functie worden gecombineerd, zijn de aanwezigheid van verschillende subpopulaties die het vermogen om onderscheid te maken tussen de verschillende monsters / condities te verbeteren, duidelijk. Figuur 7 toont de bivariate plot van spottelling van LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 voor de vier monsters: Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine. Het Control-monster werd gebruikt om de poortstrategie voor drie populaties vast te stellen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 en High Spots / High BDC3. De controle monsters aangetoond dat meer dan 98% van de cellen 1 of minder vlekken hadden. De grens tussen de High Spots / Low BDC3 en High Spots / High BDC3 werd vastgesteld op een BDC3 score van 1 omdat meer dan 91% van het Control-monster een BDC3 score van minder dan 1 had. Een samenvatting van de resultaten voor de bivariate plots Is weergegeven in tabel 1 .
leeftijd = "1"> 
Figuur 1: MIFC-instrumentinstelling. Een schermafbeelding van de MIFC-instrumentinstellingen die voor dit experiment worden gebruikt, zoals beschreven in stap 8 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse Software Gating Strategie. Een screenshot van het analyse software gateway schema, beschreven in stap 9 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Fig3.jpg "/>
Figuur 3: LC3 Spot Masking. Jurkat-celbeelden en maskers zijn gebruikt om de spot-count functie te creëren. Getoonde zijn BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 5,3,1) en Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Helder, 6,2,1). Het masker dat het beste werkte voor alle getoonde cellen was Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: LC3 Spot-Count Histogrammen. Met behulp van de spot-count functie Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 en de LC3-AF647 spot-count histogrammen voor Control ( A , lichtblauw), Control + ChloroquinE ( B , blauw), Starved ( C , roze), en Starved + Chloroquine ( D , rood). De gemiddelde puntentellingen voor Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine zijn respectievelijk 0,07, 1,13, 0,10 en 2,77. BF, LC3-AF647 (rood), DAPI-nucleaire kleurstof (blauw) en een composiet van de LC3-AF647- en DAPI-beelden van representatieve cellen voor de gemiddelde spottelling worden getoond voor Control ( E , 0 spots), Control + Chloorquine F , 1 spot), Starved ( G , 0 spots), en Starved + Chloroquine ( H , 3 spots). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: BDC3 Histogrammen van p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogrammen voorControle ( A , lichtblauw), Control + Chloroquine ( B , Blauw), Starved ( C , Roze) en Starved + Chloroquine ( D , rood). De gemiddelde BDC3 score voor Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine zijn respectievelijk 0,57, 0,82, 0,74 en 0,98. B F; P62-AF488 (groen); LAMP1-PE (geel); LC3-AF647 (rood); En een composiet van de p62-AF488, LAMP1-PE en LC3-AF647 afbeeldingen van representatieve cellen voor de gemiddelde BDC3 worden getoond voor Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) en Starved + Chloorquine H ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: BDC3 Histogrammen van p62 / LC3 / DAPI voor de Starved + Chloroquine Sample. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogram voor het Starved + Chloroquine monster wordt getoond. De gemiddelde BDC3 score is 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (groen); LC3-AF647 (rood); DAPI (blauw); En een composiet van de p62-AF488-, LC3-AF647- en DAPI-beelden van representatieve cellen voor de gemiddelde BDC3 wordt getoond voor het Starved + Chloroquine-monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bivariate Plots van LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate plots van LC3 spot count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 voor Control, Control + Chloroquine, Starved en Starved + Chloroquine Jurkat cellen. ( B ) BF; P62-AF488 (groen); LAMP1-PE (geel); LC3-AF647 (rood); En een compositie van de p62-AF488-, LAMP1-PE- en LC3-AF647-beelden van drie regio's ( dwz Low Spots, High Spots / Low BDC3 en High Spots / High BDC3) worden getoond voor het Starved + Chloroquine-monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celtelling | Heldere Detail Colocalisatie 3 Betekenis | Spot Count LC3 Mean | % Lage punt | % High Spot / Low BDC3 | % High Spot / High BDC3 | |
| Controle | 439 | 0.57 | 0.07 | 98.2 | 1.8 | 0.0 |
| Control + Chloorquine | 1432 | 0.82 | 1.13 | 68.9 19.5 | 11.7 | |
| Uitgehongerd | 1204 | 0.74 | 0.10 | 98.4 | 0.6 | 1.0 |
| Starved + Chloroquine | 1811 | 0.98 | 2.77 | 32.1 | 36.9 | 31,0 |
Tabel 1: Samenvatting van Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot
Discussion
Bij het uitvoeren van deze analyse zijn er een paar dingen te overwegen. Het is belangrijk om passende controlemonsters te hebben. Voor dit experiment werden twee verschillende controles gebruikt: Control en Control + Chloorquine. Het controlemonster werd gebruikt om de drempel voor de regio's in te stellen. Het vertegenwoordigt het basale niveau van autofagie zonder het stoppen van lysosomale afbraak en is de controle voor het Starved-monster. Het controlemonster is echter niet een passende controle om te vergelijken met de resultaten van het Starved + Chloroquine-monster, omdat chloroquine zelf het controlemonster beïnvloedt. Daarom was het nodig om een Control + Chloroquine-monster te hebben.
Voorafgaand aan het uitvoeren van een analyse voor autofagie, is het belangrijk om alleen te analyseren / poorten op afzonderlijke cellen die in focus zijn ( dwz gradiënt RMS groter dan 60), aangezien de resultaten kunnen worden beïnvloed als er meer dan één cel of de afbeeldingen zijn onscherp. Het is cruciaal dat de autofagosoomEs en lysosomen zijn in focus voor correcte spottelling en BDC3 analyse. Apoptotische cellen moeten worden verwijderd voor autofagie analyse, omdat ze resultaten kunnen scheiden en niet inbegrepen moeten zijn. Er moet gepast zijn voor alle drie markers ( dwz LC3, p62 en LAMP1). Bijvoorbeeld, alle drie markers zijn intracellulair en moeten een punctaat signaal hebben; Als het signaal niet punctueert of als het op het oppervlak van de cel ligt, zou het vlek niet passend zijn en het experiment / kleuring moet worden hergebruikt. Bovendien, om BDC3 nauwkeurig te zijn, is het essentieel om te poorten op cellen die helder zijn voor alle drie fluorescerende markers van belang. Gating op positieve gebeurtenissen is nodig om de meting van BDC3 op niet-specifieke binding, beeldende artefacten en / of geluid te voorkomen. Dit is van cruciaal belang, aangezien BDC3 potentieel kan versterken artefacten die geen echte signalen zijn. Aangezien BDC3 alleen kan worden uitgevoerd op lichte positieve gebeurtenissen, kunnen veel cellen niet in de uiteindelijke analyse worden opgenomen; Dit is vooralInderdaad waar voor controlecellen die geen accumulatie hebben van LC3, p62 en / of LAMP1. Dus, een beperking van deze analyse is dat BDC3 alleen cellen die positief zijn voor alle drie markers, die niet geschikt zijn voor alle autofagie-experimenten, onderzoekt.
Zoals BDS, die eerder 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 is gemeld, houdt BDC3 alleen geen rekening met het aantal autofagieorganellen die co-lokaliseren, wat in grote mate resulteert Van variabiliteit in het aantal autofagosomen. Daarom wordt de bivariate aanpak die door Rajan et al. Was in dienst. Kijkend naar de bivariate percelen, kan men vragen ofDe cellen moeten positief zijn voor LC3, p62 en LAMP1; Waarom zijn er zo veel cellen die 0 plekken hebben? Dit komt doordat het LC3-signaal helder genoeg kan zijn voor co-lokalisatie, maar het kan wellicht niet voldoen aan de drempel die door het piekmasker is ingesteld (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) nodig om te worden beschouwd als een plek.
Het hier beschreven protocol gebruikte MIFC om LC3 puncta te tellen en de co-lokalisatie van drie autofagie markers om autofagische flux te meten. Onder basale condities (Control sample) was het aantal autofagosomen laag, en er werden weinig cellen gevonden met "High Spots." Met de toevoeging van chloroquine, die autofagosoom / lysosoomfusie remt, is er een toename van het aantal LC3 spots. Aangezien het lysosoom de autofagosoom en de p62, die zich in het autofagosoom bevindt, niet kan afbreken, leidt dit tot een toename van de co-lokalisatie van de accumulatie van LC3-, p62- en LAMP1-autolysosomen. Dit effect werd versterkt onder voedingssterkteIon, die autofagie induceert. Echter, zonder de toevoeging van chloroquine, was er geen significante toename van het aantal autofagosomen, waarschijnlijk door een toename van de snelheid van autofagische omzet. Wanneer cellen in de aanwezigheid van chloroquine werden uitgehongerd, was er een toename van de co-lokalisatie en het aantal autofagosomen, die de conclusie bevestigt dat hongersnood autofagische flux toeneemt. EBSS is bekend als een krachtige inductor van autofagie. Daarom wordt verwacht dat de toename groot zou zijn. Als een andere werkwijze, zoals medicijninductie, wordt gebruikt om autofagie te veroorzaken, kan het verschil tussen de controle en de behandelde monsters subtieler zijn.
Dit specifieke protocol was ontworpen om autofagie in menselijke cellijnen te meten, maar de analyse zou kunnen worden aangepast aan andere soorten door over te schakelen naar antilichamen voor die bepaalde soort. Bovendien kan de analysemethode gebruikt worden voor elke intracellulaire applicatie die co-lokalisatie vereistVan drie probes / markers.
Disclosures
Ik ben werkzaam bij MilliporeSigma, de maker van het Amnis-merk ImageStream, dat in deze studie werd gebruikt.
Acknowledgments
Ik dank mijn collega's bij MilliporeSigma, Philip J. Morrissey en Sherree L. Friend, voor hun steun en begeleiding door de jaren heen. Ik wil ook Vidya Venkatachalam en Bryan R. Davidson bedanken voor hun hulp met de BDC3-functie in de IDEAS-software , Ryan P. Jessup, voor het bewerken van dit manuscript, Raymond Kong voor hulp op de dag van schieten en een speciale dank Naar make-up artiest Cynthia Xamonthiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
References
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
- Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
- Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
- Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
- Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
- Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
- Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
- Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
- Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
- Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
- Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
- Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
- Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
- Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
- Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
- Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
- Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
- Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
- Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
- Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
- Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
- IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).
