Summary
הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.
Abstract
Autophagy הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים סלולריים נורמלי או מתפקדת כי לצבור במהלך הצמיחה והבחנה מושפלות באמצעות lysosome ו ממוחזרים. במהלך autophagy, חלבון LC3 cytoplasmic הוא lipidated וגויסו את הממברנות האוטופאגוסומליות. האוטופאגוזום מתמזג עם הליזוזום כדי ליצור את האוטוליזוזום, שם מתרחש התמוטטות שלפוחית האוטופגוזום ותכולתו. חלבון ה- p62 הקשור ל- Ubiquitin, אשר נקשר ל- LC3, משמש גם לניטור השטף האוטופאגי. תאים שעוברים autophagy צריך להדגים את שיתוף לוקליזציה של p62, LC3, ו lysosomal סמנים. מיקרוסקופיה Immunofluorescence נעשה שימוש כדי לזהות חזותית LC3 puncta, p62, ו / או lysosomes על בסיס לכל תא. עם זאת, הערכה אובייקטיבית וסטטיסטית קפדנית יכול להיות קשה להשיג. כדי להתגבר על בעיות אלה, cytometry זרימת multispectral הדמיה שימש יחד עם תכונה אנליטית שמשווה את דה בהירהזנב תמונות של שלושה סמנים autophagy (LC3, p62 ו lysosomal LAMP1) ו לכמת שלהם שיתוף לוקליזציה, בשילוב עם ספירה LC3 ספירת למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.
Introduction
Macroautophagy, המכונה להלן autophagy, הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים פגומים או מתפקדת, חלבונים ארוכי טווח, ואת האברונים מושפלים באמצעות lysosome ו ממוחזרים 1 . Autophagy הוא תהליך דינמי, רב-כיווני הכולל את היווצרותו של אוטופגוזום; את ההיתוך של האוטופגוזום עם הליזוזום, שיצר את האוטוליזוסום; ואת השפלה של התוכן של autolysosome 2 . סמן ביולוגי חיוני המשמש לזיהוי autophagy במערכות יונקים הוא חלבון המשויך microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), המהווה את הממברנה האוטופאגוסומלית. במהלך autophagy, cytosolic LC3-1 הוא מצומדות כדי phosphatidylethanolamine כדי ליצור LC3-II; LC3-II משולב אז לתוך קרום autophagosal 3 . סמן נוסף בשימוש נרחב עבור השטף autophagic הוא autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) אשר פיזית liמטען אוטופאגית אל הממברנה האוטופאטית 4 , 5 .
שיטות אשר שימשו באופן מסורתי למדוד autophagy הם כתמים המערבי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7 . עם זאת, אף אחת משיטות אלה נחשבים "תקן הזהב" , 2 , 6 כמו ישנם אתגרים הקשורים בשתי הטכניקות הללו. כתמים מערביים נותנים רק בממוצע משום שהם משתמשים במדגם הומוגני, כך שצופים לא יכולים לראות מה קורה בתאים בודדים. מצד שני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נותן מידע צופה ברמה אחת התא, אבל זה חסר יכולות התפוקה, מה שהופך אותו קשה להשיג אובייקטיבי הערכות סטטיסטית קפדנית. בשנים האחרונות, את המדידה של LC3 ו p62 על ידי cytometry זרימת multispectral הדמיה (MIFC, ראה טבלה של חומרים ) כבר צובר popuLarity בשל כוח כמותי, יכולות תפוקה גבוהה, פוטנציאל ריבוב, ואת היכולת התמונה כל תא. אחת השיטות הנפוצות ביותר למדידת autophagy באמצעות MIFC, יחד עם תוכנת ניתוח לוויה שלה (ראה טבלה של חומרים ), היא באמצעות ספירת ספוט של LC3 puncta או autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . עם זאת, עלייה autophagosomes לא בהכרח אומר כי קיימת עלייה autophagy, כפי שהוא יכול גם לייצג המצור בתהליך 2 . מחזור LC3-II הוא פרמטר שימושי למדוד שטף autophagic על ידי ניתוח תאים בנוכחות והיעדר מעכב השפלה ליזוזומלית, כגון כלורוקין. Chloroquine מעכב את היתוך של autophagosome כדי lysosome, ובכך לאפשר את quantitation של היווצרות autophagosome כמדד של מידת autophagy על ידי עצירת השטף autophagic לפני השפלה lysosomal יכול להתרחש 18 . בנוסף, p62 הוא מושפל בעיקר על ידי autophagy, ואם השפלה ליזוזומלית של autophagosome ותכולתו חסומה, הצטברות של p62 צפוי 17 , 19 .
Autophagy הוא תהליך multistep, ואת המדידה של LC3 או p62 לבד אינו מספק תמונה מלאה של מה שקורה בתאים. פרסומים אחרונים הדגישו את הצורך לבחון את התהוות בו זמנית של autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC הואבאופן ייחודי מסוגלים למדוד את ההיווצרות של autolysosome ידי הדמית שיתוף הלוקליזציה של autophagosome אל 15 הליזוזום - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. בנוסף, שיתוף לוקליזציה של p62 ו LC3 באמצעות MIFC יש גם נחקרו למדוד שטף autophagic 5 . בתוכנה ניתוח הפניה, "תכונה" זה מודד שיתוף לוקליזציה נקרא "פרט מפורטת הדמיון R3" (BDS) ו תוכנן במיוחד כדי להשוות את הפרטים הקטנים, התמונה בהירים של שתי תמונות. BDS הוא מקדם המתאם של Pearson המתאם ביומן של נקודות האור המצויות עם רדיוס של 3 פיקסלים או פחות; במילים אחרות, BDS מחשבת את מידת oוריקלינג פיקסלים משני ערוצי ניאון שונים. נקודות האור הן מתואמות ( כלומר, מיקום מרחבי זהה) או בלתי מתואמות ( כלומר, מיקומים מרחביים שונים). לכן, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח בין אפס לאינסוף 26 , 27 . BDS לבדה לא יכול להיות מספיק; Rajan et al. נמצא כי שימוש רק BDS יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות או שגויות שלילי 21 . BDS מעריך את שיתוף לוקליזציה של שני סמנים של autophagy אבל לא מחשיב את מספר autophagosomes. כדי להסביר את מספר autophagosomes, Rajan et al. כללה ספירת ספוט של LC3 puncta 21 . Rajan et al. המוצע באמצעות פיזור bivariate העלילה של ספירה LC3 ספוט לעומת BDS. באמצעות העלילה דו-שנתית זו, שתי אוכלוסיותE מזוהה הראשון: אחד עם תאים בעלי רמה גבוהה של כתמים LC3 ואחד עם תאים בעלי רמה נמוכה של כתמים LC3. אוכלוסיית הנקודה הגבוהה של LC3 סווגה לשתי אוכלוסיות: תאים עם לוקליזציה משותפת נמוכה ( כלומר, הצטברות של אוטופגוזומים) ותאים בעלי לוקליזציה גבוהה ( כלומר, הצטברות של אוטוליזוזומים). זו העלילה bivariate מאפשר להבחין בין תאים עם מעט מאוד autophagosoms ותאים עם הצטברות של autophagosomes ו / או autolysosomes 21 .
עד כה, לוקליזציה משותפת של LC3, p62, LAMP1 (סמן lysosomal) לא היה אפשרי באמצעות "סוג תכונה" יחיד בתוכנת ניתוח לוויה MIFC (ראה טבלה של חומרים ). עם זאת, תכונה חדשה, הציג לאחרונה בגירסה 6.1, נקרא Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 משווה את התמונות פירוט בהיר מכל אחת משלוש התמונות (במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1) וכימות co-localization של שלושה בדיקות ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). תכונה BDC3 מחשב את מקדם המתאם של פירסון שונה כדי להאריך עד שלוש תמונות. מאחר והנקודות הבהירות בשלוש התמונות הן מתואמות או בלתי מתואמות, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח דינמי בין 0 ו אינסוף. על ידי החלפת תכונה BDS עם תכונה BDC3, שיטת הניתוח שהוצגו על ידי Rajan et al. יכול כעת לשלב את שלושת הסמנים המשמשים ביותר למדוד autophagy במערכת אחת בעת ובעונה אחת. היכולת co-localize אלה שלושה סמנים של autophagy ב assay אחד יכול להוביל תובנות הרומן לתוך אינדוקציה ו הרגולציה של autophagy. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים כדי לגרום autophagy בתאי Jurkat; תווית התאים עם LC3, p62, ו LAMP1 נוגדנים; לרכוש נתונים על multispEctral זרימת הדמיה cytometer; ולנתח את הנתונים כדי להעריך שטף autophagic.
Protocol
1. הכנת תרבות בינונית ו Lysosomal מעכב השפלה
- 1.1. הפוך ~ 500 מ"ל של 1x תרבות RPMI בינוני. הוסף 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות (100x), 5 מ"ל של pyruvate נתרן (100 מ"מ), 5 מ"ל של פניצילין סטרפטומיצין גלוטמין (100x), ו 25 מ"ל של סרום שור עוברית (FBS) ל 500 מ"ל בקבוק של RPMI - 1640 1x בינוני. המדיום צריך להיות מוכן בתוך ארון biosafety. אחסן את המדיום תרבות RPMI ב 2-8 מעלות צלזיוס. מחממים בינוני תרבות RPMI עד 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת אותו לתאי Jurkat.
- הפוך 100 מ"מ chloroquine, מעכב השפלה ליזוזומלית. לשקול את 0.05 גרם של מלח dlorhosphate chloroquine ולהוסיף אותו 1 מ"ל של תא תרבות כיתה בצינור 15-מ"ל צנטריפוגות. וורטקס עד שהכלורוקין התמוסס.
2. תרבות של תאים
- תרבות 80 מ"ל של תאים Jurkat לשכפל E6-1 במדיום תרבות RPMI ב 37 ° C ו 5% CO 2 .
הערה: כאשר תאים culturingאו עבודה עם תאי Jurkat לפני קיבעון, כל העבודה צריכה להיעשות בארון biosafety. - לפני גרימת autophagy, לספור את התאים Jurkat באמצעות hemocytometer או אחר תא ספירת המכשיר כדי לקבוע את התאים / מ"ל.
3. המעורר autophagy בתאים
- קח את התאים Jurkat בשלב הצמיחה מעריכי ולפצל אותם לארבע דגימות של 20 מ"ל כל 50 צנטריפוגות צינורות מ"ל. תווית צינורות כמו "שליטה", "Control + Chloroquine", "מורעב", ו "מורעב + כלורוקווין".
הערה: תאים Jurkat צריך ריכוז של 2.5-5 x 10 5 תאים / מ"ל. - שטפו את התאים על ידי הוספת 30 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק ללא Ca 2 + או Mg 2 + (HBSS) לכל מדגם. צנטריפוגה ב 250 xg במשך 10 דקות. יוצקים את supernatant לתוך כוס פסולת.
- Resuspend דגימות שליטה 20 מ"ל של המדיום התרבות RPMI ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות 25 מ"ל של Sפיפטה סטרילית סטרילית ואחריו ביצוע vortexing אור. באופן דומה, resuspend דגימות מורעב 20 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של ארל ללא Ca 2 + או Mg 2 + (EBSS).
- באמצעות פיפטה 25 מ"ל סטרילי חד פעמי, להעביר את השליטה דגימות מורעב צלוחיות T75 שכותרתו "שליטה", "Control + Chloroquine", "מורעב", "מורעב + Chloroquine".
- הוסף 20 μL של 100 chloroquine מ"מ ל 20 מ"ל של המדיום תרבות התא "שליטה + Chloroquine" ואת "מורעל Chloroquine" צלוחיות. מערבבים את כלורוקין ידי בעדינות swirling את הבקבוקון. מניחים את כל צלוחיות ב 37 ° C ו 5% CO 2 באינקובטור עבור 2 שעות.
4. הכנת Buffers עבור קיבוע ותוויות של LC3, LAMP1, ו p62
- הכן 10 מ"ל של פתרון קיבוע פורמלי 4% ב PBS. הוסף 4 מ"ל של 10% מניות פורמלין ל 1 מ"ל של 10x Dulbecco של פוספט שנאגרותמיסת מלוחים ללא Ca 2 + או Mg 2 + (PBS) ו 5 מ"ל של מים ultrapure בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
הערה: זהירות. פורמלין / פורמלדהיד הוא רעיל אם בשאיפה או בלע; הוא מעצבן את העיניים, מערכת הנשימה, העור; ועלול לגרום רגישות על ידי שאיפה או מגע עם העור. קיים סיכון של פגיעה חמורה בעיניים. זה פוטנציאל מסרטן. - הכן 10 מ"ל של פתרון% 1 פורמלין resuspension הסופי PBS. הוסף 1 מ"ל של המניה 10% פורמלין ל 9 מ"ל של 1x PBS בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
- הכן 500 מ"ל של חיץ לשטוף ידי הוספת 10 מ"ל של FBS בקבוק 500 מ"ל של 1x PBS.
- הכן 50 מ"ל של חיץ permeabilization בצינור 50 צנטריפוגה מ"ל על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 10% טריטון X-100 למאגר לשטוף 49.5 מ"ל מוכן בשלב 4.3.
- הכן אנטי SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) נוגדנים / permeabilization חיץ פתרון עבודה על ידי הוספת 5 μL של אנטי SQSTM1 / p62-AF488 ל 495 μL של חיץ permeabilization עשה s4.4. ודא ריכוז נוגדנים הסופי הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל.
הערה: להפוך את המאגר permeabilization נוגדנים פתרון עובד רק לפני הוספת אותו המדגם. להגן על הפתרון מן האור. - הכן אנטי עכבר LC3 / permeabilization חיץ פתרון עבודה על ידי הוספת 5 μL של העכבר נגד LC3 ל 495 μL של חיץ permeabilization עשה בשלב 4.4. ודא ריכוז נוגדנים הסופי הוא 20 מיקרוגרם / מ"ל.
הערה: לעשות מאגר נוגדנים permeabilization עבודה פתרונות רק לפני הוספת אותו המדגם. להגן על הפתרון מן האור. - הכן חמור אנטי עכבר Alexa 647 (AF647) / permeabilization חיץ פתרון עובד על ידי הוספת 5 μL של AF647 שכותרתו חמור אנטי עכבר - IgG ל 495 μL של חיץ permeabilization עשה בשלב 4.4. ודא ריכוז נוגדנים הסופי הוא 20 מיקרוגרם / מ"ל.
הערה: להפוך את המאגר permeabilization נוגדנים עובד פתרון רק לפני הוספת אותו המדגם. הגן על tהוא פתרון מן האור. - הכן אנטי אנושי CD107a (LAMP1) -PE נוגדן / חיץ permeabilization פתרון עובד על ידי הוספת 25 μL של אנטי CD107a (LAMP1) -PE ל 475 μL של חיץ permeabilization עשה בשלב 4.4. ודא ריכוז נוגדנים הסופי הוא 21 מיקרוגרם / מ"ל.
הערה: להפוך את המאגר permeabilization נוגדנים עובד פתרון רק לפני הוספת אותו המדגם. להגן על הפתרון מן האור. - הכן 10x כתם גרעיני DAPI על ידי הוספת 4 μL של 5 מ"ג / מ"ל DAPI ו 100 μL של 10% טריטון X-100 ל 896 μL של 1x PBS.
5. תיוג של תאים Jurkat עם LC3, LAMP1, ו p62
- הסר 2 x 10 6 תאים לכל מדגם (לספור את התאים כמו בשלב 2.2). מניחים כל דגימה בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל אשר תויג עם שם המדגם המתאים ( כלומר, שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, או מורעב + כלורוקין).
- הוסף חיץ לשטוף כך שישנפח כולל של 15 מ"ל בכל צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה דגימות ב 250 xg במשך 10 דקות. לשאוב את supernatant.
- הוסף 100 μL של פתרון קיבעון פורמלין 4% לכל אחת כדורי התא. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה P200. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הצעד קיבעון, להעביר את הדגימות כדי שכותרתו, צינורות microcentrifuge פוליפרופילן siliconized.
הערה: אין לתקן את התאים; הדבר עלול לגרום לתוצאות תיוג גרועות. - לאחר 10 דקות קיבעון צעד, להוסיף 1 מ"ל של חיץ לשטוף לכל מדגם. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 לערבב את המדגם. צנטריפוגה ב 250 xg במשך 5 דקות. לשאוב את supernatant.
- הוסף 100 μL של אנטי SQSTM1 / p62 - AF488 נוגדנים / permeabilization חיץ פתרון עובד למדגם זה. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה P200. דגירה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
- שטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל שלחיץ permeabilization לכל מדגם. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 לערבב את המדגם. צנטריפוגה ב 250 xg במשך 5 דקות. לשאוב את supernatant.
- חזור על שלבים 5.4-5.5 עבור כל אחד הפתרונות נוגדן עובד.
הערה: פתרונות עבודה נוגדן הם עכבר אנטי LC3 / permeabilization חיץ פתרון עובד, חמור נגד העכבר - AF647 / permeabilization חיץ פתרון עובד, ו אנטי אדם CD107a (LAMP1) - PE נוגדן / permeabilization חיץ פתרון עובד. כל נוגדן צריך להיעשות בנפרד בסדר המפורט. ההזמנה נבחרה על מנת למזער תגובתיות לא רצויה בין נוגדנים. - הוסף 100 μL של פתרון פורמלין 1%. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה P200. הוסף 10 μL של 10x DAPI כתם גרעיני לכל מדגם. מערבולת קלה כל מדגם לערבב. דגירה של 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר לפני הפעלת כל הדגימות על המכשיר.
הערה: בשלב זה, המדגם יכול או בE לרוץ על MIFC או מאוחסן מוגן מפני אור ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
6. תיוג של פקדי צבע יחיד
- עבור כל אחד צבע שליטה ( כלומר, AF488, PE, AF647, ו DAPI), לקחת 1 x 10 6 תאים Jurkat, אשר יכול להיות מכל אוכלוסיות המדגם. שים 1 x 10 6 תאים ב 15 צינורות מ"ל צנטריפוגה שכותרתו כמו גם AF488, PE, AF647, או DAPI.
- הוסף חיץ לשטוף כך שיש נפח כולל של 15 מ"ל בצינור 15 צנטריפוגה כל 15. צנטריפוגה דגימות ב 250 xg במשך 10 דקות. לשאוב את supernatant.
- הוסף 100 μL של חיץ לשטוף את AF488, PE, צינורות AF647.
הערה: עבור צינור DAPI, עבור לשלב 6.8.- Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה P200. העברה צינורות 1.5 מ"ל.
- הוסף 5 μL של אנטי CD45-AF488, אנטי CD45-PE או נגד CD45-AF647 כדי AF488, PE, או צינורות AF647, בהתאמה. מערבבים על ידי vortexing lIghtly.
- דגירה AF488, PE, צינורות AF647 למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להשתמש בסמנים אחרים, כגון נוגדנים LC3, p62 ו- LAMP-1 במקום נוגדנים נוגדי CD45. עם זאת, CD45 הוא סמן אמין עבור פקדי צבע יחיד. - שטפו את AF488, PE, ותאים AF647 על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ לשטוף לכל מדגם.
- פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 לערבב את המדגם. צנטריפוגה ב 250 xg במשך 5 דקות. לשאוב את supernatant.
- הוסף 100 μL של פתרון פורמלין 1%. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה P200.
הערה: בשלב זה, המדגם יכול להיות מופעל על MIFC או מאוחסן מוגן מפני אור ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. - הוסף 100 μL של פתרון קיבעון פורמלין 1% לצינור DAPI.
- Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה P200. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 101, L של 10x DAPI כתם גרעיני למדגם DAPI. מערבולת קלה לערבב. דגירה במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר לפני ריצה על המכשיר.
הערה: בשלב זה, המדגם יכול להיות מופעל על MIFC או מאוחסן מוגן מפני אור ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
7. החל וכיול MIFC
- בדוק כדי לוודא את נדן, כיול המערכת מגיב (ראה טבלה של חומרים ), debubbler, ניקוי, מכולות מעקר מלאים ומכל הפסולת ריק. אם לא, למלא את המכלים ולרוקן את מיכל הפסולת.
- הפעל את המערכת ולחץ לחיצה כפולה על התוכנה (ראה טבלה של חומר s) כדי להפעיל את היישום; זה יתחיל את תוכנת MIFC.
- לחץ על לחצן האתחול וודא כי בחר את כל הכיולים והבדיקות . זה יהיה לשטוף את המערכת, לטעון נדן, כיול המערכת מגיב,ו לכייל את המערכת.
8. הפעלת הדגימה ובקרות צבע יחיד ב- MIFC
- טען את תבנית ברירת המחדל על ידי מעבר לכרטיסייה קובץ ובחירה באפשרות טען תבנית ברירת מחדל .
הערה: תבנית ברירת המחדל מכילה את מגרשי נקודות הפיקסלים המקסימליים. - הפעל את 488 ננומטר, 405 ננומטר, 642 ננומטר, ו- SSC לייזרים על ידי לחיצה על הכפתורים שלהם. הגדר את כוח הלייזר על ידי הזנת הכוח הרצוי ליד כל כפתור לייזר. ראה איור 1 .
הערה: עבור ניסוי זה, כוחות הלייזר הם 200 mW, 20 mW, 150 mW, ו 5 mW (Ch06) עבור nm 488, 405 ננומטר, 642 ננומטר, SSC, בהתאמה. ברירת המחדל של MIFC להגדרת ברירת המחדל היא 40X, רגישות ברירת המחדל היא היי , וכל הערוצים מופעלים. - ודא שמחוון ההגדלה מוגדר ל- 40X, מצב רגישות גבוהה נבחר, וכל הערוצים מוצגים בגלריית התמונות; איור 1
- טען את המדגם מורעב + Chloroquine על ידי לחיצה על לחצן טען וטעינת צינור 1.5 מ"ל על המכשיר.
הערה: זה מדגם ניסיוני צריך את האות הגבוה ביותר של כל דגימות AF488, PE, ו AF647 (האות DAPI צריך להיות בערך עוצמת האות זהה עבור כל דגימות ניסיוני, כולל מדגם "מורעב + Chloroquine"). - השתמש במדגם "מורעב + Chloroquine" כדי לאשר כי כוחות לייזר המתאימים עבור 488 ננומטר, 405 ננומטר, 642 ננומטר, ו- SSC לייזרים נקבעים. השתמש מגרשים גלם פיקסל מקסימלי נקודות מתוך תבנית ברירת המחדל כדי להתאים את כוחות לייזר כך האותות חזקים אבל לא להגיע ערך פיקסל מקסימלי גלם של 4,096, אשר יהיה להרוות את המצלמה CCD על המכשיר. השתמש בהגדרת לייזר זו עבור כל דגימות הניסוי.
- לחץ על הסמל ' יצירת נקודות חלקות' כדי ליצור עלילה חדשה. בחר "Area_M01 "על ציר ה- X ו-" Aspect Ratio_M01 "על ציר ה- Y עבור האוכלוסייה" All "לחץ על הסמל ' צור מצולע', צייר אזור מסביב לתאים, שם האזור" תא ".
הערה: משתמשים יכולים להוסיף מגרשים ואזורים נוספים כדי לצמצם את התאים הנאספים. מגרש נוסף משותף להוסיף יהיה RMS Gradient לזהות תאים ממוקדים. - הגדר את הפרמטרים הרכישה. ציין את שם הקובץ ואת תיקיית היעד, לשנות את מספר האירועים ל "5,000", ובחר את "Cell" אוסף האוכלוסייה. לחץ על לחצן לרכוש כדי לרכוש את הקובץ. לאחר איסוף הקובץ, החזר את המדגם על-ידי לחיצה על לחצן Return . הסר את הצינור מדגם מהמכשיר.
- עבור שלוש הדגימות הבאות ("מורעב", "שליטה", ו "Control + Chloroquine"), לטעון את המדגם, להזין את שם המדגם, לרכוש את המדגם, ולהחזיר את המדגם באמצעות הגדרות זהותעבור מדגם "מורעב + Chloroquine", לעיל.
- לאחר הדגימות נרכשו, להפעיל את הדוגמאות שליטה צבע אחד לרכוש נתונים, כך מטריצה פיצוי יכול להתבצע. כבה את הלייזר SSC על ידי לחיצה על כפתור ה- SSC . כבה את ערוצי brightfield על ידי לחיצה על כפתור Brightfield ובחירה OFF .
הערה: אם ערוצים הוסרו מגלריית התמונות לצורך רכישה מדגמית ניסיונית, הפעל מחדש את כל הערוצים. לחלופין, פקדי צבע יחיד ניתן לרכוש על ידי לחיצה על הכרטיסייה פיצוי ובחירה יצירת מטריקס ; זה פותח את אשף הפיצויים, אשר ילך דרך שלב של איסוף קבצים ועושה מטריצה פיצוי. - טען את DAPI צבע אחד שליטה על ידי לחיצה על כפתור טען וטעינת צינור 1.5 מ"ל לתוך המכשיר. הזן את שם המדגם (DAPI בלבד), הגדר את אוכלוסיית האיסוף ל - All, ושנה את מספר האירועיםS אל "500."
- לחץ על לחצן לרכוש כדי לרכוש את קובץ הבקרה היחיד-צבע.
- כאשר אוסף הקבצים הושלם, החזר את המדגם על-ידי לחיצה על לחצן Return . הסר את הצינור מדגם מהמכשיר.
- לאחר המדגם DAPI, לטעון אקונומיקה 10% בדיוק כמו מדגם על ידי לחיצה על כפתור טען וטעינה 100 μL של אקונומיקה 10% בצינור 1.5 מ"ל. בואו המדגם לרוץ עבור 15 ~ s. פעולה זו תסיר כל DAPI שיורית מן הצינור.
- הפעל 100 μL של 1x PBS, כפי שנעשה 8.10.3, כדי להסיר את אקונומיקה 10% שיורית. המכשיר מוכן כעת להפעלת הפקדים בצבע AF488, PE ו- AF647.
- חזור על שלבים 8.10-8.10.2 עבור כל אחד הפקדים צבע יחיד ( כלומר, AF488, PE, ו - AF647).
הערה: אין צורך להפעיל 10% אקונומיקה או PBS בין דגימות אלה, רק לאחר שליטה צבע אחד DAPI.
9. ניתוח נתונים ב- MIFC AnAlysis תוכנה
- הפעל את תוכנת ניתוח MIFC (ראה טבלה של חומרים ).
- לחץ על התחל ניתוח כדי להפעיל את אשף קובץ פתוח . בחר את קובץ הנתונים כדי לפתוח על ידי גלישה אל "מורעב + Chloroquine" קובץ תמונה גלם (.rif). בחר את הקובץ ולחץ על הלחצן פתח . לחץ על הבא .
- החל פיצוי. בחר מטריצה פיצוי שנוצרה בעבר ולחץ על הבא . לחלופין, לעשות מטריצה פיצוי חדש על ידי לחיצה על כפתור מטריקס חדש .
הערה: שלבים 9.2.1.1-9.2.1.2 הם השלבים ליצירת מטריצה חדשה.- הוסף את קובצי הבקרה בצבע יחיד ( כלומר, DAPI בלבד, AF488 בלבד, PE בלבד ו- AF647 בלבד) לרשימת קובצי הבקרה על- ידי לחיצה על הוסף קבצים , בחירת הקבצים ולחיצה על הלחצן פתח . לחץ על הבא .
- חלון יצירת פיצוי מטריקס יופיע עבור ניסוי זה. אנסורE כי Ch02, Ch03, Ch07, ו Ch11 נבחרו ולחץ על הבא . מטריצת הפיצויים תיווצר. לחץ על Finish (סיום) כדי לשמור את מטריצת הפיצויים. הוסף את קובץ הפיצויים לאשף קובץ פתוח ולחץ על הבא .
- החל את תבנית הניתוח. בשלב זה, אין תבנית ניתוח להחיל, אז לחץ על הבא .
הערה: עבור קבצים ניסיוניים אחרים, זה "מורעב + Chloroquine.daf" הקובץ יכול לשמש כתבנית. - תן שם לקובץ (שמות הקבצים המתאימים לשמות "ריף" נוצרים באופן אוטומטי) ולחץ על הבא . הגדר את מאפייני התצוגה של התמונה על-ידי בחירה בערוצים "02," "03," "07" ו "- 11"; ערוצי 01, 06 ו- 09 נבחרים מראש. לחץ על הבא .
- החל פיצוי. בחר מטריצה פיצוי שנוצרה בעבר ולחץ על הבא . לחלופין, לעשות מטריצה פיצוי חדש על ידי לחיצה על כפתור מטריקס חדש .
- בסוף אשף הקובץ הפתוח , בחר את אשף האפופטוזיס . לחץ על סמל אפופטוזה אשף ולאחר מכן עללחצן בחר אשף כדי לפתוח את אשף אפופטוזיס .
- בחר את ערוץ התמונה הגרעינית (Ch07) ולחץ על הבא . שער התאים להתמקד בצורה הטובה ביותר. לחץ על הסמל ' צור אזור קו' וצייר אזור ב- RMS_M01_Ch01 של מעבר צבע מ- 60-90. הזן שם "פוקוס", לחץ על אישור ולאחר מכן לחץ על הבא .
- שער תאים בודדים. לחץ על הסמל ' צור מצולע' . צייר אזור מסביב לתאים בודדים, תן לאזור "Single", לחץ על אישור ולאחר מכן לחץ על הבא . לחץ על לא עבור "האם ברצונך לנתח תת-אוכלוסיות?"
- שער את התאים הגרעיניים. לחץ על הסמל ' צור אזור קו' וצייר אזור שכולל את כל התאים הגרעיניים. שם האזור "Nucleated". לחץ על אישור ולאחר מכן .
- שער תאים אפופטוטיים. לחץ על הסמל ' צור מצולע' . צייר אזור סביב תאים אפופטוטיים; אלה תאיםעם נמוך גרעיני Area_T50% ו brightfield גבוהה בניגוד. לחץ על Finish (סיום) . הוסף אזור נוסף על ידי לחיצה על הסמל ' צור מצולע' וציור אזור מסביב לתאים שאינם אפופטוטיים; קוראים לאזור זה "תאים".
- בחר תאים חיוביים עבור LAMP1, p62 ו- LC3. לחץ על סמל אבני הבניין , בחר Fluorescence חיוביים - צבע אחד , ובחר את "תאים" האוכלוסייה ו Intensity_MC_Ch03 . תווית X-Axis "אינטנסיביות LAMP1". צייר אזור הכולל תאים בעלי עוצמות העולות על 10,000 על ידי לחיצה על הסמל ' צור אזור קו' וציור האזור. תווית אזור זה "LAMP1 +." בצע את אותם השלבים כמו ב 9.4 כדי לבחור תאים חיוביים עבור p62 ו LC3.
- עבור p62 + בחר את "LAMP1 +" האוכלוסייה Intensity_MC_Ch02 . תווית X-Axis "אינטנסיביות p62" ואת האזור של p62 + תאים "LAMP1 + / p62 +."; עבור LC3 +, בחר את "LAMP1 + / p62 +" האוכלוסייה Intensity_MC_Ch11. תווית X- ציר "אינטנסיביות LC3" ואת האזור של LC3 + תאים "LAMP1 + / p62 + / LC3 +." השתמש זה "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" האוכלוסייה עבור שאר הניתוח.
- יצירת תכונה ספירת ספירת לספור את נקודות LC3.
הערה: זה צריך להיות שנוצר באמצעות "מורעב + Chloroquine" המדגם.- לחץ על הכרטיסייה ניתוח ובחר מסכה . לחץ על הלחצן New ולאחר מכן על הלחצן Function ( פונקציה) . תחת פונקציה , בחר שיא ; מסכה , בחר M11 ; ואת ערוץ , בחר Ch11 . הגדר את נקודת היחס לתא רקע ל -4 . לחץ על אישור כדי לסגור את תפקוד מסכת גדר חלון אישור כדי להוסיף אותו לרשימת Mask. לחץ על סגור כדי לצאת ממנהל המסכה .
- לחץ על הכרטיסייה ניתוח ובחר
הערה: אשף Spot עשוי לשמש גם ליצירת תכונת ספירת ספוט. התכונה ספירת ספוט המשמשת בניסוי זה עשויה שלא להיות מתאימה לניסויים אחרים ו / או לקו תאים. המשתמש צריך לבדוק כמה ספוט ספירת כתמים / תכונות כאשר מחליטים על מסכה / תכונה עבור קבוצה נתונים ספציפיים. Pugsley 2017 יש פרטים נוספים על ספירת ספוט באמצעות תוכנת ניתוח MIFC 26 . - לחץ על הסמל ' היסטוגרמה חדשה' . בחר את "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" האוכלוסייה. בחר את התכונה ספירת ספירת LC3 ולחץ על אישור .
- צור את התכונה BDC3.
- גליקק את הכרטיסייה ניתוח ובחר תכונות . לחץ על הלחצן ' חדש' . תחת סוג תכונה , בחר Bright Detail Colocalization 3 ; מסכה , בחר MC ; תמונה 1 , בחר Ch02 (p62); תמונה 2 , בחר Ch03 (LAMP1); ואני קוסם 3 , בחר Ch11 (LC3). הקלד "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" עבור השם ולחץ על אישור וסגור כדי לצאת מנהל התכונה .
- לחץ על הסמל ' היסטוגרמה חדשה' . בחר את "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" האוכלוסייה. בחר את התכונה BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 ולחץ על אישור .
- לחץ על הסמל Scatterplot החדש . בחר את "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" האוכלוסייה. בחר BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 עבור ציר ה- X. בחר את התכונה ספירת ספירת LC3 עבור ציר Y. לחץ על אישור .
- שמור את הE "מורעב + Chloroquine" קובץ. לחץ על קובץ ובחר שמור קובץ ניתוח נתונים (.daf) . לחץ על שמירה ועל כן כדי להחליף את הגירסה הקודמת של הקובץ; קובץ זה יכול לשמש כעת כתבנית.
- פתח את הקובץ "Control". לחץ על קובץ ולאחר מכן על פתח . בחר את הקובץ "Control.rif" ולחץ על פתח . בחר את המטריצה פיצוי משלב 9.2.1 ואת "מורעב + Chloroquine.daf" הקובץ כתבנית. לחץ על אישור .
- יצירת אזורים עבור הצטברות autophagosome ו autolysosome הצטברות באמצעות "בקרה" מדגם כדי להגדיר את האזורים.
- לחץ על הסמל ' צור מלבן' . צייר אזור מ X- קואורדינטות של -0.1 ל 3 ו- Y קואורדינטות של 1.5 ל -0.3. תן שם לאזור זה "נקודות נמוכה". הקלק על ה צור סמל אזור מלבן . צייר אזור מ X- קואורדינטות של -0.1 ל 1 ו- Y תיאוםAtes של 17.5-1.5. שם אזור זה "נקודה גבוהה / נמוכה BDC3."
- לחץ על הסמל 'צור מלבן'. צייר אזור מ X- קואורדינטות של 1 ל 3 ו- Y קואורדינטות של 17.5-1.5. תן לאזור זה "נקודות גבוהות / גבוה BDC3".
- שמור את הקובץ "Control". לחץ על קובץ ובחר שמור קובץ ניתוח נתונים (.daf ) . לחץ על שמירה ועל כן כדי להחליף את הגירסה הקודמת של הקובץ; קובץ זה יכול לשמש כעת כתבנית.
- פתח את "Control + Chloroquine" קובץ על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן על פתח . בחר את "Control + Chloroquine.rif" הקובץ ולחץ על פתח . בחר את מטריצת הפיצוי משלב 9.2.1 ואת הקובץ "Control.daf" כתבנית. לחץ על אישור . חזור על זה עבור "מורעב" ו "מורעב + Chloroquine" קבצים.
הערה: הפונקציה אצווה בתוכנה ניתוח עשוי לשמש גם כדי ליישם את פיצוימטריצה ו / או תבנית לקבצים האחרים. האסטרטגיה gating הסופי מוצג באיור 2 .
Representative Results
שיטה זו ניתוח משתמשת תכונות מרובות כדי התחת השטף autophagic. על מנת להבין את המגרש הדו-שנתי הסופי, יש לבחון תחילה את מאפייני הניתוח האינדיבידואליים. ספירת האוטופגוזומים היא דרך הגיונית למדידת אוטופאגי; עם זאת, גודל / צורה / בהירות של LC3 puncta יכול להשתנות באופן דרסטי בין תאים. וריאציה יכולה להקשות על ספירת האוטופגוזומים באופן ידני או באמצעות תכונה ספירת ספוט בתוכנת הניתוח. לכן, לא תכונה ספירת ספוט יהיה מושלם בשל השתנות זו גדולה autophagosomes. עם זאת, תכונה טובה ספירת נקודה יעבוד על רוב התאים 26 . איור 3 מציג דוגמאות של מסיכה ספוט של LC3 puncta בתאי Jurkat באמצעות מסכות ספוט שונים. התכונה ספירת ספוט שנבחרה עבור ערכת נתונים זו היא ספוט ספירת_מספר (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, כלומר התכונה ספירת ספירה ספרה את הנקודות שבהןAk מסומנת במסך ברירת המחדל של ערוץ 11 (M11) בערוץ 11 (Ch11-LC3-AF647) עם יחס רקע ל-תא של 4 (Bright, 4). איור 4 מציג ספירה ספירת היסטוגרמות ותמונות נציג עבור ספוט נקודה ממוצע של שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקין Jurkat שכותרתו אנטי LC3-AF647. שליטה ומורעבת ספירת ספירת ממוצע אינם שונים באופן משמעותי; עם תוספת של chloroquine, יש הבדל גדול בממוצע של כלורוקין + שליטה לעומת כלורוקין מורעב +.
התכונה הבאה לחקור היא BDC3. BDC3 הוא מדידה של שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים / בדיקות, במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1. איור 5A - 5D מציג היסטוגרמות BDC3 עבור שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקווין Jurkat שכותרתו עם אנטי p62-AF488, אנטי LAMP1-PE, ו אנטי LC3-AF647. יש מעבר בין ממוצע שליטה לממוצע מורעב, כמו גם את השליטה + Chloroquine מתכוון למוות מורעב Chloroquine. עם זאת, מסתכל על התמונות של תאים מן הציונים BDC3 ממוצע בתרשים 5E - 5H , יש הבדל גדול יותר בין דגימות מאשר היסטוגרמות עשוי להוביל אחד להאמין. הסיבה לכך היא כי BDC3 אינו מחשיב את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך מידה רבה של השתנות במספר autophagosomes עבור ציון BDC3 אותו. ברוב המקרים, יש חפיפה בין כל שלושת הבדיקות, כי גם ברמות הבסיסיות, p62, LAMP1 ו- LC3 צריכים, במידה מסוימת, לשתף-מקום או להתגורר באזורים דומים בתאים. בניגוד לכך, דוגמה של שלושה בדיקות כי לא צריך שיתוף לוקליזציה הם אנטי p62-AF488, אנטי LC3-AF647, צבע DAPI גרעיני עבור מדגם מורעב + Chloroquine, שמוצג באיור 6. < / P>
כאשר תכונה ספירת ספוט התכונה BDC3 משולבים, נוכחות של subpopulations שונים המשפרים את היכולת להבחין בין הדוגמאות / התנאים השונים ניכרים. איור 7 מציג את חלקה דו-ספרתית של ספירת ספוט של LC3 לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 עבור ארבעת הדגימות: בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעבים, מורעבים + כלורוקין. מדגם הבקרה שימש כדי לקבוע את אסטרטגיית gating עבור שלוש אוכלוסיות: נקודות נמוכה, נקודות גבוהות / נמוך BDC3, ו גבוה כתמים / גבוהה BDC3. הדגימות בקרה הראו כי יותר מ 98% של תאים היו 1 או פחות כתמים. הגבול בין הנקודות הגבוהות / נמוך BDC3 ו גבוה כתמים / גבוה BDC3 נקבעה ציון BDC3 של 1 כי יותר מ 91% של מדגם בקרה היה ציון BDC3 פחות מ 1. סיכום של התוצאות עבור bivariate מגרשים מוצג בטבלה 1 .
גיל = "1"> 
איור 1: MIFC הגדרת מכשיר. צילום מסך של הגדרות מכשיר MIFC המשמש לניסוי זה, המתואר בשלב 8 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח תוכנה Gating אסטרטגיה. צילום מסך של תוכנת ניתוח gating התוכנית, המתואר בשלב 9 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
10"ג them/ />
איור 3: LC3 מסכת ספוט. Jurkat תא תמונות ומסיכות השתמשו כדי ליצור את ספירת ספירת תכונה. מודגשים (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), שיא (M11, Ch11-LC3-AF647) , מוארת, 5), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 5,3,1), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 6,2,1). המסכה שעבדה הכי טוב עבור כל התאים המוצגים היה שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: LC3 ספירת ספירת היסטוגרמות. באמצעות ספירת ספוט תכונה ספוט Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 ו LC3-AF647 ספוט ספירת היסטוגרמות עבור בקרה ( A , כחול בהיר), שליטה + ChloroquinE ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ספירת הנקודות הממוצעת עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקואין הם 0.07, 1.13, 0.10, 2.77, בהתאמה. BF, LC3-AF647 (אדום), צבע DAPI גרעיני (כחול), וכן מורכב של LC3-AF647 ו תמונות DAPI של תאים נציג עבור ספוט נקודה ממוצע מוצגים עבור בקרה ( E , 0 כתמים), שליטה + Chloroquine ( F , 1 נקודה), מורעב ( G , 0 כתמים), מורעב + Chloroquine ( H , 3 כתמים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 היסטוגרמות עבורR שליטה ( A , כחול בהיר), שליטה + Chloroquine ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ציון BDC3 הממוצע עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקווין הם 0.57, 0.82, 0.74, ו 0.98, בהתאמה. BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ו - Composite של P62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות של תאים נציג של BDC3 הממוצע מוצגים שליטה ( E ), שליטה + כלורוקווין ( F ), מורעב ( G ), מורעב + כלורוקווין H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LC3 / DAPI עבור מדגם מורעב + Chloroquine. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI היסטוגרמה עבור מדגם מורעב + Chloroquine מוצג. הציון הממוצע של BDC3 הוא 0.07. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LC3-AF647 (אדום); DAPI (כחול); ואת מורכב של P62-AF488, LC3-AF647, ותמונות DAPI של תאים נציג עבור BDC3 הממוצע מוצג עבור מדגם מורעב + Chloroquine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: מגרשים דו-ספריים של LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( א ) חלקות Bivariate של ספירה LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 לבקרה, שליטה + כלורוקווין, מורעבים, מורעבים + כלורוקווין תאים Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ואת מרוכבים של p62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות משלושה אזורים ( כלומר, נמוך כתמים, כתמים גבוהים / נמוכה BDC3, גבוה כתמים / גבוה BDC3) מוצגים עבור מדגם מורעב + Chloroquine. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ספירת תאים | מוארת פירוט קולוקליזציה 3 ממוצע | ספירת ספוט LC3 ממוצע | נמוך נקודה | נקודה גבוהה / נמוכה BDC3 | נקודה גבוהה / גבוהה BDC3 | |
| לִשְׁלוֹט | 439 | 0.57 | 0.07 | 98.2 | 1.8 | 0.0 |
| שליטה + כלורוקין | 1432 | 0.82 | 1.13 | 68.9 19.5 | 11.7 | |
| מוּרעָב | 1204 | 0.74 | 0.10 | 98.4 | 0.6 | 1.0 |
| מורעבים + כלורוקין | 1811 | 0.98 | 2.77 | 32.1 | 36.9 | 31.0 |
טבלה 1: סיכום Jorkat LC3 ספוט ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 חלקת Bivariate
Discussion
בעת ביצוע ניתוח זה, יש כמה דברים לשקול. חשוב שיהיה דגימות בקרה מתאימות. עבור ניסוי זה, שני בקרות שונות שימשו: שליטה ובקרה + Chloroquine. מדגם הבקרה שימש לקביעת הסף עבור האזורים. הוא מייצג את רמת הבסיס של autophagy מבלי לעצור השפלה ליזוזומלית היא שליטה על המדגם מורעב. עם זאת, מדגם בקרה אינו שליטה נאותה להשוות עם התוצאות מדגם מורעב + כלורוקווין כי chloroquine עצמה משפיעה על מדגם שליטה. לכן, היה צורך להיות מדגם + כלורוקואין בקרה.
לפני ביצוע כל ניתוח עבור autophagy, חשוב לנתח רק / שער על תאים בודדים ממוקדים ( כלומר, RMS שיפוע גדול מ -60), כמו התוצאות יכול להיות מושפע אם יש יותר מתא אחד או התמונות לא ממוקד. זה חיוני כי autophagosomEs ו lysosomes ממוקדים ספירת ספוט הנכון ניתוח BDC3. תאים אפופטוטיים יש להסיר לפני ניתוח autophagy, כפי שהם עשויים להטות תוצאות ולא צריך להיכלל. לא צריך להיות מכתים המתאים לכל שלושת הסמנים ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). לדוגמה, כל שלושת הסמנים הם תאיים, ויש להם אות נקודתי; אם האות לא לדקלם, או אם הוא על פני השטח של התא, מכתים לא יהיה מתאים את הניסוי / מכתים צריך להיות משוחזר. בנוסף, עבור BDC3 להיות מדויק, זה חיוני השער על תאים בהירים עבור כל שלושה סמנים ניאון של עניין. Gating על אירועים חיוביים יש צורך למנוע את המדידה של BDC3 על שאינם ספציפיים מחייב, הדמיה artifacts, ו / או רעש. זה חיוני, כמו BDC3 יכול פוטנציאל להגביר artifacts שאינם אותות אמיתי. מאז BDC3 יכול להתבצע רק על אירועים חיוביים בהירים, תאים רבים עשויים שלא להיכלל בניתוח הסופי; זה especEly נכון לתאי בקרה שאין להם הצטברות של LC3, p62 ו / או LAMP1. לפיכך, הגבלה של assay זה הוא BDC3 רק בוחן תאים חיוביים עבור כל שלושת הסמנים, אשר עשוי שלא להיות מתאים לכל הניסויים autophagy.
כמו BDS, אשר כבר דווחו בעבר 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 לבדו אינו לוקח בחשבון את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך במידה רבה של השתנות במספר האוטופגוזומים. לכן, הגישה הדו-כיוונית שהציג ראג'אן ואח ' היה מועסק. בהסתכלות על המגרשים הדו-פעמיים, אפשר לשאול אםהתאים חייבים להיות חיוביים עבור LC3, p62 ו- LAMP1; למה יש כל כך הרבה תאים שיש להם 0 נקודות? הסיבה לכך היא כי האות LC3 עשוי להיות בהיר מספיק עבור שיתוף לוקליזציה, אבל זה לא יכול לענות על סף שנקבע על ידי מסיכת שיא (שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) זה נחוץ כדי להיחשב לְזַהוֹת.
הפרוטוקול שהוצג כאן השתמשו MIFC לספור LC3 puncta ואת שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים autophagy למדוד שטף autophagic. בתנאים הבסיסיים (מדגם בקרה), מספר האוטופגוזומים היה נמוך, ומעטים נמצאו תאים עם "נקודות גבוהות". עם תוספת של chloroquine, אשר מעכב היתוך אוטופאגוזום / lysosome, חלה עלייה במספר כתמים LC3. מאז lysosome אינו מסוגל לשבור את autophagosome ואת p62, אשר מתגורר autophagosome, זה מוביל לעלייה של לוקליזציה של LC3, p62, ו LAMP1 autolysosome הצטברות. השפעה זו היתה מוגברת תחת starvat מזיןיון, אשר גורם autophagy. עם זאת, ללא תוספת של chloroquine, לא היה גידול משמעותי במספר autophagosomes, ככל הנראה בשל עלייה בשיעור של autophagic מחזור. כאשר התאים רעבו בנוכחות כלורוקין, חלה עלייה בלוקליזציה המשותפת ובמספר האוטופגוזומים, התומכת במסקנה שהרעבה מגבירה את השטף האוטופאגי. EBSS ידוע כגורם חזק של autophagy. לכן, צפוי כי הגידול יהיה גדול. אם שיטה אחרת, כגון אינדוקציה של סמים, משמשת להפקת אוטופאגי, ההבדל בין הדגימה לשליטה והדגימה עשוי להיות מתוחכם יותר.
פרוטוקול מסוים זה נועד למדוד autophagy שורות תאים אנושיים, אבל assay יכול להיות מותאם למינים אחרים על ידי מעבר נוגדנים עבור מינים מסוימים. בנוסף, שיטת הניתוח יכול לשמש עבור כל יישום תאיים הדורש שיתוף לוקליזציהשל שלושה בדיקות / סמנים.
Disclosures
אני מועסק על ידי MilliporeSigma, יצרנית של ImageStream המותג Amnis, אשר שימש במחקר זה.
Acknowledgments
אני רוצה להודות לעמיתים לעבודה במיליפור סיגמה, פיליפ ג 'מוריסי ושרי ל', על תמיכתם והדרכתם לאורך השנים. אני גם רוצה להודות Vidya Venkatachalam ו בריאן ר דוידסון על עזרתם עם תכונה BDC3 בתוכנה IDEAS , ראיין פ Jessup לעזרה בעריכת כתב היד הזה, ריימונד קונג לעזרה ביום הירי, תודה מיוחדת לך האמן סינתיה Xamonthiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
References
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
- Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
- Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
- Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
- Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
- Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
- Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
- Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
- Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
- Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
- Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
- Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
- Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
- Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
- Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
- Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
- Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
- Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
- Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
- Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
- Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
- IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).
