Summary
여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.
Abstract
Autophagy는 성장 및 분화 과정에서 축적되는 정상 또는 기능 장애 세포 구성 요소가 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 경로입니다. autophagy 동안, cytoplasmic LC3 단백질은 지방화되고 autophagosomal membranes에 보충된다. autophagosome은 lysosome과 융합하여 autolysosome을 형성하는데, autophagosome 소포와 그 내용물의 분해가 일어난다. LC3에 결합하는 유비퀴틴 관련 단백질 p62는 또한 autophagic 플럭스를 모니터하는 데 사용됩니다. autophagy를 수행하는 세포는 p62, LC3 및 리소좀 마커의 동일 지역화를 입증해야합니다. Immunofluorescence 현미경 검사는 세포 단위로 LC3 puncta, p62 및 / 또는 lysosomes를 시각적으로 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가는 얻기가 어려울 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 multispectral imaging flow cytometry와 함께 밝은 de3 개의 autophagy 마커 (LC3, p62 및 lysosomal LAMP1)로부터 꼬리 이미지를 추출하고 객관적이고 정량적이며 통계적으로 견고한 방식으로 자동 계수를 측정하기 위해 LC3 스폿 카운팅과 함께 공동 위치를 정량화합니다.
Introduction
이후 autophagy라고 불리는 Macroautophagy는 손상되었거나 기능 불능 인 성분, 수명이 긴 단백질 및 세포 소기관이 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 과정입니다 1 . Autophagy는 autophagosome의 형성을 포함하는 동적 인 다단계 프로세스입니다. autophagosome과 lysosome의 융합, autolysosome 형성; 및 autolysosome 2 의 내용의 저하. 포유류 시스템에서 autophagy를 확인하는 데 사용되는 중요한 생물학적 마커는 autophagosomal membrane을 구성하는 미세 소관 관련 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)입니다. autophagy 동안, cytosolic LC3-1은 포스파티딜 에탄올 아민에 접합되어 LC3-II를 형성한다; LC3-II는 autophagosomal 막 3에 통합됩니다. autophagic 플럭스에 널리 사용되는 또 다른 마커는 autophagy 수용체 sequestosome 1 (SQSTM1, p62)입니다.autophagic 막에 autophagic화물을 nks 4 , 5 .
전통적으로 자식 작용을 측정하는 데 사용 된 방법은 서양 오 점 및 형광 현미경 (7)이다. 그러나 이들 방법 중 어느 것도이 두 가지 기법과 관련된 문제가 있기 때문에 "황금 표준" 2 , 6 으로 간주되지 않습니다. 웨스턴 블 롯은 균질 샘플을 사용하기 때문에 평균값을 제공하므로 관찰자는 개별 세포에서 일어나는 현상을 볼 수 없습니다. 반면에 형광 현미경 검사는 단일 셀 수준에서 관찰자 정보를 제공하지만 처리량 기능이 부족하여 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가를 얻지 못합니다. 최근 몇 년 동안 multispectral imaging flow cytometry (MIFC, Table of Materials 참조)에 의한 LC3와 p62의 측정이 popu정량 전력, 높은 처리량 기능, 다중화 가능성 및 모든 셀을 이미지화 할 수있는 능력으로 인해 희소성이 희박합니다. (재료의 도표 참조) 컴패니언 분석 소프트웨어와 함께 MIFC를 이용하여 자식 작용을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, LC3의 puncta에 또는 autophagosomes 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 스폿 카운트 통해서 , 15 , 16 , 17 . 그러나, autophagosomes의 증가는 autophagy의 증가가 반드시 과정 2 의 봉쇄를 나타낼 수 있음을 의미하지는 않습니다. LC3 - II 회전율은 세포의 존재와 존재를 분석하여 autophagic 유동을 측정하는 데 유용한 매개 변수입니다.클로로퀸과 같은 리소좀 분해 억제제의 부재. 클로로퀸하여 18 발생할 수 리소좀 분해 전에 autophagic 플럭스 체포하여 자식 작용의 정도의 척도로서 autophagosome 형성의 정량을 허용, 리소좀에 autophagosome의 융합을 억제한다. 또한, p62는 주로 autophagy에 의해 분해되며, autophagosome의 lysosomal 분해와 그 내용물이 차단되면 p62의 축적이 예상됩니다 17 , 19 .
Autophagy는 다단계 프로세스이며 LC3 또는 p62만으로는 세포에서 일어나는 일을 완벽하게 파악할 수 없습니다. 최근의 논문은 autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 의 동시 형성을 조사 할 필요성을 강조했다. MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - 15 리소좀에 autophagosome의 공동 촬상 지역화하여 autolysosome의 형성을 측정 할 수 의적. 또한, MIFC를 사용하여 p62와 LC3의 co-localization 또한 autophagic 플럭스 5 측정하기 위해 탐험되었습니다. 참조 된 분석 소프트웨어에서 동일 지역화를 측정하는 "특징"은 "밝기 정보 유사성 R3"(BDS)라고하며 두 이미지의 작고 밝은 이미지 세부 정보를 비교하도록 특별히 설계되었습니다. BDS는 로그 변환 된 Pearson의 반지름이 3 픽셀 이하인 지역화 된 밝은 점의 상관 계수입니다. 즉, BDS는 o의 정도를 계산합니다.두 개의 다른 형광 채널에서 픽셀을 verlapping. 밝은 지점은 상호 연관되어 있습니다 ( 즉, 동일한 공간 위치) 또는 비 상관 ( 즉, 다른 공간 위치). 따라서 상관 계수는 0 (상관 없음)과 1 (완전 상관) 사이에서 달라집니다. 계수를 로그 변환하여 범위를 0과 무한대 사이에서 26 , 27 로 증가시킵니다. BDS만으로는 충분하지 않을 수 있습니다. Rajan et al. BDS 만 사용하면 위양성 또는 위음성 결과가 발생할 수 있음을 발견했습니다 21 . BDS는 autophagy의 두 마커의 co-localization 평가하지만 autophagosomes의 수를 고려하지 않습니다. autophagosomes의 수를 설명하기 위해, Rajan et al. LC3 puncta 21 의 spot-counting을 포함합니다. Rajan et al. BDS에 비해 LC3 스폿 카운트의 2 변수 스 캐터 플롯을 사용하여 제안되었습니다. 이 두 변수를 사용하여, 두 집단먼저 확인 된 것은 LC3 스폿이 높은 세포와 LC3 스팟이 낮은 세포가있는 것입니다. 고 -LC3 자리 집단은 두 개의 집단으로 분류되었다 : 낮은 공 - 위치 화 ( 즉, 자가 - 포자충의 축적)를 갖는 세포 및 높은 공 - 위치 화 ( 즉, 오토 리소좀의 축적)를 갖는 세포. 이 2 변이 플롯은 극소수의자가 포식 세포와 autophagosomes 및 / 또는 autolysosome 21이 축적 된 세포를 구분할 수있게합니다.
지금까지 LC3, p62 및 LAMP1 (리소좀 마커)의 동시 공동 위치 화는 MIFC 동반자 분석 소프트웨어의 단일 "피처 유형"을 사용하여 가능하지 않았습니다 ( 재료 표 참조). 그러나 최근에 버전 6.1에서 소개 된 새로운 기능은 Bright Detail Colocalization 3 (BDC3)입니다. BDC3은 3 가지 이미지 각각의 밝은 디테일 이미지를 비교합니다 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)를 측정하고 세 가지 프로브 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 지역화를 정량화합니다. BDC3 기능은 Pearson의 상관 계수를 수정하여 세 개의 이미지로 확장합니다. 세 이미지의 밝은 점이 상관되었거나 상관 관계가 없기 때문에 상관 계수는 0 (비 상관)과 1 (완벽한 상관) 사이에서 다릅니다. 계수는 0에서 무한대 사이의 동적 범위를 증가 시키도록 로그 변환됩니다. BDC3 기능을 사용하여 BDS 기능을 전환하면 Rajan et al. 동시에 하나의 시스템에서 자동 학습을 측정하기 위해 가장 많이 사용되는 3 개의 마커를 통합 할 수 있습니다. autophagy의 이러한 3 개의 마커를 단일 분석으로 공동 위치시킬 수있는 능력은 autophagy의 유도와 조절에 대한 새로운 통찰력을 이끌어 낼 수 있습니다. 다음 프로토콜은 Jurkat 세포에서 autophagy를 유도하는 단계를 개략적으로 보여줍니다. LC3, p62 및 LAMP1 항체로 세포를 표지하십시오. 멀티 스피어에서 데이터를 얻다.외과 적 이미징 유동 세포 계측기; autophagic 플럭스를 평가하기 위해 데이터를 분석 할 수 있습니다.
Protocol
1. 배양액 및 리소좀 성 분해 억제제의 제조
- 1.1. 1x RPMI 배양 배지 ~ 500 mL를 만듭니다. 5 mL의 MEM 비 필수 아미노산 (100x), 5 mL의 피루브산 나트륨 (100 mM), 5 mL의 페니실린 - 스트렙토 마이신 - 글루타민 (100 x), 25 mL의 태아 소 혈청 (FBS) RPMI - 1640 1x 배지. 배지는 바이오 안전성 캐비닛에서 준비되어야합니다. RPMI 배지를 2-8 ℃에서 보관하십시오. Jurkat 세포에 첨가하기 전에 37 ° C로 RPMI 배지를 가열하십시오.
- lysosomal 분해 억제제 인 100 mM chloroquine을 만듭니다. chloroquine diphosphate 염 0.05g을 달아 15mL 원심 분리 관에서 세포 배양 등급의 물 1mL에 첨가한다. 클로로퀸이 녹을 때까지 와동.
2. 세포 배양
- 문화 RPMI 문화 매체 37 ° C와 5 % CO 2 에서 Jurkat 세포 클론 E6-1 80 ML.
참고 : 세포 배양시또는 고정하기 전에 Jurkat 세포로 작업 할 경우 모든 작업은 바이오 안전성 캐비닛에서 이루어져야합니다. - autophagy 유도하기 전에 hemocytometer 또는 다른 셀 계수 장치를 사용하여 Jurkat 세포를 계산하여 세포 / mL를 결정합니다.
3. 세포에서 Autophagy 유도하기
- 기하 급수적 인 성장 단계에서 Jurkat 세포를 가져 와서 50 mL 원심 분리 튜브에서 20 mL 씩 4 개 샘플로 나눕니다. 튜브를 "Control", "Control + Chloroquine", "Starved"및 "Starved + Chloroquine"으로 분류하십시오.
참고 된 Jurkat 세포는 2.5-5 × 105 세포 / ml의 농도를 가져야한다. - 각 시료에 Ca 2+ 또는 Mg 2+ (HBSS)가 첨가되지 않은 행크스 평형 염 액 30 mL를 가하여 세포를 씻는다. 10 분 250 XG에서 원심 분리기. 상청액을 폐기 용 비커에 붓는다.
- 25 ML을 사용하여 위아래로 pipetting하여 RPMI 문화 매체 20 ML의 컨트롤 샘플을 Resuspend들terile 일회용 피펫 다음 가벼운 vortexing 수행. 유사하게, 굶주린 시료를 Ca 2+ 또는 Mg 2+ (EBSS)가없는 Earle 's Balanced Salt Solution 20 mL에 재현 탁한다.
- 25 ML 멸균 일회용 피펫을 사용하여 "제어", "Control + Chloroquine", "굶기"및 "굶주린 + Chloroquine."레이블이 T75 flasks에 제어 및 starved 샘플을 전송
- "Control + Chloroquine"및 "Starved + Chloroquine"플라스크의 세포 배양 배지 20 mL에 100 mM chloroquine 20 μL를 첨가합니다. 부드럽게 플라스크를 돌면서 클로로퀸을 넣으십시오. 모든 플라스크를 37 ° C 및 5 % CO 2 배양기에 2 시간 동안 놓습니다.
4. LC3, LAMP1, 및 p62의 고정 및 표지 용 완충제의 제조
- PBS에 4 % 포르말린 고정 용액 10 ML을 준비합니다. 10x Dulbecco 's 인산염 완충액 1 mL에 10 % 포르말린 스톡 4 mL를 넣는다.칼슘 2 + 또는 Mg 2+ (PBS)가없는 생리 식염수와 15 mL 원심 분리 관의 초순수 5 mL.
참고 :주의. 포르말린 / 포름 알데히드는 흡입하거나 삼키면 유독합니다. 눈, 호흡기 및 피부에 자극적입니다. 흡입 또는 피부 접촉시 감작을 초래할 수 있습니다. 눈에 심각한 손상을 줄 수 있습니다. 잠재적 인 발암 물질입니다. - PBS에 1 % 포르말린 최종 resuspension 솔루션 10 ML을 준비합니다. 15 ML 원심 튜브에 1X PBS 9 ML에 10 % 포르말린 주식의 1 ML을 추가합니다.
- 1X PBS 500 ML 병에 FBS 10 ML을 추가하여 세척 버퍼 500 ML를 준비합니다.
- 단계 4.3에서 준비한 49.5 ML 세척 버퍼에 10 % 트리톤 X - 100 0.5 ML을 추가하여 50 ML 원심 튜브에 permeabilization 버퍼 50 ML을 준비합니다.
- 안티 - SQSTM1 / p62 - 알렉사 488 (AF488) 항균 / permeabilization 버퍼 작업 솔루션을 만든 - permeabilization 버퍼의 495 μL에 안티 SQSTM1 / p62 - AF488의 5 μL을 추가하여tep 4.4. 최종 항체 농도가 5 μg / mL인지 확인하십시오.
참고 : 샘플에 첨가하기 바로 전에 항체 permeabilization buffer working solution을 만드십시오. 빛으로부터 용액을 보호하십시오. - 단계 4.4에서 만든 permeabilization 버퍼 495 μL에 마우스 안티 LC3 5 μL를 추가하여 마우스 안티 LC3 / permeabilization 버퍼 작업 솔루션을 준비합니다. 최종 항체 농도가 20 μg / mL인지 확인하십시오.
참고 : 샘플에 첨가하기 바로 전에 항체 permeabilization buffer working solution을 만듭니다. 빛으로부터 용액을 보호하십시오. - 단계 4.4에서 만든 permeabilization 버퍼 495 μL에 AF647 라벨 당나귀 안티 마우스 - IgG 5 μL를 추가하여 당나귀 안티 마우스 - 알렉사 647 (AF647) / permeabilization 버퍼 작업 솔루션을 준비합니다. 최종 항체 농도가 20 μg / mL인지 확인하십시오.
참고 : 샘플에 첨가하기 바로 전에 항체 permeabilization buffer working solution을 만드십시오. 보호빛으로부터의 그 해결책. - 단계 4.4에서 만든 permeabilization 버퍼 475 μL에 안티 CD107a (LAMP1) -PE 25 μL를 추가하여 항 인간 CD107a (LAMP1) -PE 항체 / permeabilization 버퍼 작업 솔루션을 준비합니다. 최종 항체 농도가 21 μg / mL인지 확인하십시오.
참고 : 샘플에 첨가하기 바로 전에 항체 permeabilization buffer working solution을 만드십시오. 빛으로부터 용액을 보호하십시오. - 5X / ML DAPI 4 μL와 1x PBS의 896 μL에 10 % 트리톤 X - 100 100 μL를 추가하여 10 배 DAPI 핵 얼룩을 준비합니다.
5. LC3, LAMP1 및 p62로 Jurkat 세포를 표시
- 샘플 당 2 x 10 6 세포를 제거합니다 (2.2 단계에서와 같이 세포 수를 계산하십시오). 각 샘플을 적절한 샘플 이름 ( 예 : Control, Control + Chloroquine, Starved 또는 Starved + Chloroquine)으로 분류 된 15-mL 원심 튜브에 넣으십시오.
- 거기에 있도록 세척 버퍼를 추가하십시오.각각의 15 mL 원심 분리 튜브에서 총 15 mL의 부피. 10 분 동안 250xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 뜨는에서 대기음.
- 각 세포 알약에 4 % 포르말린 고정 솔루션 100 μL를 추가합니다. P200 피펫으로 위아래로 pipetting하여 Resuspend. 실온에서 10 분 동안 품어 낸다. 고정 단계 중 샘플을 라벨이 부착 된 실리콘 처리 된 폴리 프로필렌 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
참고 : 셀을 너무 많이 고정하지 마십시오. 라벨링 결과가 좋지 않을 수 있습니다. - 10 분 고정 단계 후에, 각 시료에 1 mL의 세척 완충액을 첨가한다. 샘플을 혼합하기 위해 P1000 피펫으로 위아래로 피펫. 5 분 동안 250 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는에서 대기음.
- 각 샘플에 항 SQSTM1 / p62 - AF488 항체 / permeabilization 버퍼 작업 솔루션의 100 μL를 추가합니다. P200 피펫으로 위아래로 pipetting하여 Resuspend. 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 품어.
- 1 mL의투과성 완충액을 각 샘플에 첨가 하였다. 샘플을 혼합하기 위해 P1000 피펫으로 위아래로 피펫. 5 분 동안 250 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는에서 대기음.
- 각 항체 작동 솔루션에 대해 5.4-5.5 단계를 반복하십시오.
참고 : 항체 작동 솔루션은 마우스 anti-LC3 / permeabilization buffer working solution, 당나귀 anti-mouse-AF647 / permeabilization buffer working solution, anti-human CD107a (LAMP1) -PE 항체 / permeabilization buffer working solution입니다. 각 항체는 별도로 나열된 순서로 수행해야합니다. 이 순서는 항체 간의 원하지 않는 교차 반응을 최소화하도록 선택되었습니다. - 1 % 포르말린 용액 100 μL를 넣으십시오. P200 피펫으로 위아래로 pipetting하여 Resuspend. 10x DAPI 핵 염색제 10 μL를 각 시료에 첨가하십시오. 가볍게 볼텍스로 각 시료를 혼합합니다. 장비의 샘플을 실행하기 전에 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 품어 낸다.
참고 :이 시점에서 샘플은 b전자는 MIFC에서 실행되거나 2-8 ° C에서 최대 1 주일 동안 빛으로부터 보호됩니다.
6. 단색 컨트롤의 라벨링
- 각 단색 컨트롤 ( 즉, AF488, PE, AF647 및 DAPI)에 대해 샘플 모집단의 Jurkat 셀을 1 x 10 6 개 가져옵니다. AF488, PE, AF647 또는 DAPI로 표시된 15 mL 원심 분리 튜브에 1 x 10 6 세포를 넣으십시오.
- 각 15 mL 원심 분리 튜브에 총 15 mL가되도록 세척 버퍼를 추가하십시오. 10 분 동안 250xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 뜨는에서 대기음.
- AF488, PE 및 AF647 튜브에 세척 버퍼 100 μL를 추가하십시오.
참고 : DAPI 튜브의 경우 단계 6.8로 이동하십시오.- P200 피펫으로 위아래로 pipetting하여 Resuspend. 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
- anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE 또는 anti-CD45-AF647 중 하나를 AF488, PE 또는 AF647 튜브에 각각 5 μL 씩 넣으십시오. 보텍스로 혼합ightly.
- 상온에서 30 분 동안 어둠 속에서 AF488, PE 및 AF647 튜브를 품어.
참고 : 항 -CD45 항체 대신 LC3, p62 및 LAMP-1 항체와 같은 다른 마커를 사용할 수 있습니다. 그러나 CD45는 단색 컨트롤에 대한 신뢰할 수있는 마커입니다. - AF488, PE 및 AF647 세포를 각각의 샘플에 1 mL의 세척 완충액을 가해 세척하십시오.
- 샘플을 혼합하기 위해 P1000 피펫으로 위아래로 피펫. 5 분 동안 250 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는에서 대기음.
- 1 % 포르말린 용액 100 μL를 넣으십시오. P200 피펫으로 위아래로 pipetting하여 Resuspend.
참고 :이 시점에서 샘플을 MIFC에서 실행하거나 2-8 ° C에서 최대 1 주일 동안 빛으로부터 보호하여 보관할 수 있습니다. - DAPI 튜브에 1 % 포르말린 고정 솔루션 100 μL를 추가합니다.
- P200 피펫으로 위아래로 pipetting하여 Resuspend. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다.
- 10 추가1, DAPI 핵 염색 10x의 DAPI 샘플. 가볍게 혼합하여 혼합하십시오. 악기를 실행하기 전에 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 품어.
참고 :이 시점에서 샘플을 MIFC에서 실행하거나 2-8 ° C에서 최대 1 주일 동안 빛으로부터 보호하여 보관할 수 있습니다.
7. MIFC 시작 및 교정
- 시스, 시스템 교정 시약 ( 표 2 참조), 디퓨져, 세정제 및 멸균 제 용기가 가득차 있고 폐액 탱크가 비어 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 용기를 채우고 폐 탱크를 비 웁니다.
- 시스템의 전원을 켜고 소프트웨어를 두 번 클릭하면 ( Table of Material 의 아이콘 참조) 아이콘이 나타납니다. 그러면 MIFC 소프트웨어가 시작됩니다.
- 시작 버튼을 클릭하고 모든 교정 및 테스트 시작 이 선택 되어 있는지 확인하십시오. 이것은 시스템을 플러싱하고 시스 (sheath), 시스템 보정 시약 (system calibration reagent)시스템을 보정하십시오.
8. MIFC에서 샘플 및 단일 색상 컨트롤 실행
- 파일 탭에서 기본 템플리트로드를 선택하여 기본 템플리트 를 로드 하십시오.
참고 : 기본 템플릿에는 원시 최대 픽셀 점 플롯이 포함됩니다. - 해당 버튼을 클릭하여 488 nm, 405 nm, 642 nm 및 SSC 레이저를 켭니다. 각 레이저 버튼 옆에 원하는 전원을 입력하여 레이저 전원을 설정하십시오. 그림 1을 참조하십시오.
참고 :이 실험에서 레이저 출력은 각각 488 nm, 405 nm, 642 nm 및 SSC의 경우 200 mW, 20 mW, 150 mW 및 5 mW (Ch06)입니다. MIFC 기본 템플리트 배율은 40X로 설정되고 기본 감도는 Hi 이며 모든 채널 이 활성화됩니다. - 확대 / 축소 슬라이더가 40X로 설정되고 고감도 모드가 선택되고 모든 채널이 이미지 갤러리에 표시되는지 확인합니다. 그림 1
- 로드 버튼을 클릭하고 악기에 1.5 ㎖의 튜브를로드하여 "굶주린 + 클로로퀸"샘플을로드합니다.
참고 :이 실험 샘플은 AF488, PE 및 AF647 (DAPI 신호는 "Starved + Chloroquine"샘플을 포함하여 모든 실험 샘플에 대해 거의 동일한 신호 강도를 가져야 함)에 대한 모든 샘플의 최고 신호를 가져야합니다. - "Starved + Chloroquine"샘플을 사용하여 488 nm, 405 nm, 642 nm 및 SSC 레이저의 적절한 레이저 출력이 설정되어 있는지 확인하십시오. 기본 템플릿의 원시 최대 픽셀 도트 플롯을 사용하여 신호가 강하지 만 원시 최대 픽셀 값 인 4,096에 도달하지 않도록 레이저 출력을 조정합니다. 그러면 CCD 카메라가 장비에 포화됩니다. 모든 실험 샘플에이 레이저 설정을 사용하십시오.
- 도트 플롯 만들기 아이콘을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만듭니다. "Area_M"을 선택하십시오.01 "을 선택하고"모든 "모집단의 경우 Y 축에서"Aspect Ratio_M01 "을 선택하고 다각형 영역 만들기 아이콘을 클릭 한 다음 셀 주위에 영역을 그립니다.
참고 : 사용자는 수집 할 셀의 범위를 좁히기 위해 플롯 및 영역을 추가 할 수 있습니다. 추가 할 일반적인 추가 플롯은 포커스가있는 셀을 식별하기위한 Gradient RMS입니다. - 획득 매개 변수를 설정하십시오. 파일 이름 및 대상 폴더를 지정하고 이벤트 수를 "5,000"으로 변경하고 "셀"모음 채우기를 선택하십시오. 가져 오기 단추를 클릭하여 파일을 가져 옵니다. 파일을 수집 한 후 Return 버튼을 클릭하여 샘플을 반환하십시오. 장비에서 샘플 튜브를 제거하십시오.
- 다음 3 개의 샘플 ( "Starved", "Control"및 "Control + Chloroquine")의 경우 샘플을로드하고 샘플 이름을 입력 한 다음 샘플을 획득하고 다음과 같은 설정을 사용하여 샘플을 반환합니다.위의 "Starved + Chloroquine"샘플 용.
- 샘플을 수집 한 후 단색 컨트롤 샘플을 실행하고 보상 매트릭스를 만들 수 있도록 데이터를 수집합니다. SSC 버튼을 클릭하여 SSC 레이저를 끕니다. 시야 버튼을 클릭하고 OFF를 선택하여 시야 채널을 끕니다.
참고 : 실험 샘플 수집을 위해 이미지 갤러리에서 채널을 제거한 경우 모든 채널을 다시 활성화하십시오. 또는 보상 탭을 클릭하고 매트릭스 만들기를 선택하여 단색 컨트롤을 얻을 수도 있습니다. 그러면 보상 마법사가 열리고 파일 수집 및 보상 매트릭스 작성 단계를 거칩니다. - DAPI 단색 컨트롤을로드하려면로드 버튼을 클릭하고 1.5 mL 튜브를 장비에로드하십시오. 샘플 이름을 입력하고 (DAPI 만), 수집 모집단을 "All"로 설정하고 이벤트 수를 변경하십시오s에서 "500"
- Acquire 버튼을 클릭하여 단색 제어 파일을 가져 옵니다.
- 파일 수집이 완료되면 Return 버튼을 클릭하여 샘플을 반환하십시오. 장비에서 샘플 튜브를 제거하십시오.
- DAPI 샘플 후, 로드 버튼을 클릭하고 10 mL 표백제를 1.5 mL 튜브에 넣음으로써 샘플처럼 표백제를 10 % 적재하십시오. 샘플을 ~ 15 초 동안 작동 시키십시오. 이렇게하면 잔류 DAPI가 튜브에서 제거됩니다.
- 잔류 10 % 표백제를 제거하기 위해 8.10.3에서와 같이 1x PBS 100 μL를 실행하십시오. 이제 장비에서 AF488, PE 및 AF647 단색 컨트롤을 실행할 준비가되었습니다.
- 단일 색상 컨트롤 ( 예 : AF488, PE 및 AF647) 각각에 대해 8.10-8.10.2 단계를 반복하십시오.
참고 : DAPI 단색 컨트롤 후에 만 이들 샘플 사이에 10 % 표백제 또는 PBS를 실행할 필요가 없습니다.
9. MIFC의 데이터 분석alysis 소프트웨어
- MIFC 분석 소프트웨어를 실행하십시오 ( 재료 표 참조).
- 분석 시작을 클릭하여 파일 열기 마법사 를 시작하십시오. "Starved + Chloroquine"원시 이미지 파일 (.rif)을 열어서 열 데이터 파일을 선택하십시오. 파일을 선택하고 열기 버튼을 클릭하십시오. 다음을 클릭하십시오.
- 보상을 적용하십시오. 이전에 작성한 보상 매트릭스를 선택하고 다음을 클릭하십시오. 또는 New Matrix 버튼을 클릭하여 새로운 보상 매트릭스를 만드십시오.
참고 : 9.2.1.1-9.2.1.2 단계는 새 행렬을 만드는 단계입니다.- 파일 추가 를 클릭하고 파일 을 선택한 다음 열기 버튼을 클릭하여 단일 색상 제어 파일 ( 즉, DAPI 만, AF488 만, PE 만 및 AF647 만)을 제어 파일 목록에 추가하십시오 . 다음을 클릭하십시오.
- 이 실험을 위해 보상 매트릭스 생성 창이 나타납니다. 앙 수르e Ch02, Ch03, Ch07 및 Ch11을 선택하고 다음을 클릭합니다. 보정 매트릭스가 생성됩니다. 마침 을 클릭하여 보정 매트릭스를 저장하십시오. 파일 열기 마법사에 보정 파일을 추가하고 다음을 클릭하십시오.
- 분석 템플릿을 적용하십시오. 이 단계에서는 적용 할 분석 템플릿이 없으므로 다음을 클릭하십시오.
참고 : 다른 실험 파일의 경우이 "Starved + Chloroquine.daf"파일을 템플릿으로 사용할 수 있습니다. - 파일 이름을 지정하고 ( "rif"이름과 일치하는 파일 이름이 자동으로 생성됩니다) 다음을 클릭하십시오. "02," "03," "07,"및 "11"채널을 선택하여 이미지 디스플레이 등록 정보를 설정하십시오. 채널 01, 06 및 09가 사전 선택됩니다. 다음을 클릭하십시오.
- 보상을 적용하십시오. 이전에 작성한 보상 매트릭스를 선택하고 다음을 클릭하십시오. 또는 New Matrix 버튼을 클릭하여 새로운 보상 매트릭스를 만드십시오.
- 파일 열기 마법사 의 끝에서 Apoptosis 마법사를 선택하십시오. Apoptosis Wizard 아이콘을 클릭 한 다음Apoptosis 마법사 를 열 려면 마법사 선택 버튼을 누릅니다.
- 핵 이미지 채널 (Ch07)을 선택하고 다음을 클릭하십시오. 최상의 초점으로 세포를 문지르십시오. 선 영역 만들기 아이콘을 클릭하고 60-90에서 Gradient RMS_M01_Ch01에 영역을 그립니다. 이 영역의 이름을 "포커스"로 지정하고 확인 을 클릭 한 후 다음을 클릭하십시오.
- 단일 세포를 게이트하십시오. 다각형 영역 작성 아이콘을 클릭하십시오. 단일 셀 주위에 영역을 그리고 "단일"영역 이름을 지정하고 확인 을 클릭 한 후 다음을 클릭하십시오. "하위 집단을 분석 하시겠습니까?"에 대해 아니오 를 클릭하십시오.
- 핵 생성 된 세포를 문지르십시오. 선 영역 만들기 아이콘을 클릭하고 모든 유 핵화 된 셀을 포함하는 영역을 그립니다. "핵으로." 확인 및 다음을 클릭하십시오.
- 게이트 apoptotic 세포. 다각형 영역 작성 아이콘을 클릭하십시오. apoptotic 세포의 주위에 지역을 그립니다; 이들은 세포들입니다.낮은 핵 면적 _T50 % 및 높은 명 시야 대비. Finish를 클릭하십시오. Create Polygon Region 아이콘을 클릭하고 비 apoptotic 세포 주변의 영역을 그려서 두 번째 region을 추가하십시오; 이 영역을 "셀"이라고 부릅니다.
- LAMP1, p62 및 LC3 양성인 세포를 선택하십시오. Building Blocks 아이콘을 클릭하고 Fluorescence Positives - One Color 를 선택한 다음 "Cells"모집단과 Intensity_MC_Ch03을 선택하십시오. X 축 "강도 램프 1"에 레이블을 지정하십시오. 선 영역 만들기 아이콘을 클릭하고 영역을 그려서 10,000보다 큰 강도를 가진 셀을 포함하는 영역을 그립니다. 이 영역에 "LAMP1 +"라벨을 지정하십시오. 9.4에서와 같은 단계에 따라 p62와 LC3 양성인 세포를 선택하십시오.
- p62 +의 경우 "LAMP1 +"모집단과 Intensity_MC_Ch02를 선택하십시오. X 축 "강도 p62"와 p62 + 세포 "LAMP1 + / p62 +"의 영역에 라벨을 붙이십시오.; LC3 +의 경우 "LAMP1 + / p62 +"모집단과 Intensity_MC_Ch11을 선택하십시오. X 축 "Intensity LC3"과 LC3 + 세포 "LAMP1 + / p62 + / LC3 +"의 영역에 라벨을 붙이십시오. 나머지 분석에는이 "LAMP1 + / p62 + / LC3 +"모집단을 사용하십시오.
- LC3 지점 수를 계산하는 스폿 카운트 기능을 만듭니다.
참고 :이 "Starved + Chloroquine"샘플을 사용하여 만들어야합니다.- 분석 탭을 클릭하고 마스크를 선택하십시오. 새 기능 단추를 클릭하십시오. 기능 에서 피크를 선택하십시오; 마스크 , M11 선택; 및 채널 에서 Ch11을 선택하십시오. 스팟 셀 배경 비율 을 4 로 설정하십시오. 마스크 목록에 추가 마스크 기능을 정의 창 확인을 닫으려면 확인을 클릭하십시오. 닫기 를 클릭하여 마스크 관리자 를 종료하십시오.
- 분석 탭을 클릭하고
참고 : 스폿 마법사를 사용하여 스폿 카운트 기능을 만들 수도 있습니다. 이 실험에서 사용 된 spot-count 기능은 다른 실험 및 / 또는 세포주에 적합하지 않을 수 있습니다. 사용자는 특정 데이터 세트에 대한 마스크 / 피처를 결정할 때 여러 스폿 카운트 마스크 / 피쳐를 테스트해야합니다. Pugsley 2017에는 MIFC 분석 소프트웨어 26을 사용하여 스폿 카운팅에 대한 자세한 내용이 있습니다. - 새 히스토그램 아이콘을 클릭하십시오. "LAMP1 + / p62 + / LC3 +"모집단을 선택하십시오. 스폿 카운트 LC3 기능을 선택하고 확인을 클릭하십시오.
- BDC3 기능을 만듭니다.
- 기음분석 탭을 핥고 기능을 선택하십시오. 새로 만들기 버튼을 클릭하십시오. Feature Type 에서 Bright Detail Colocalization 3을 선택합니다 . 마스크 를 선택하고 MC를 선택합니다 . 이미지 1 , Ch02 선택 (p62); 이미지 2 , Ch03 (LAMP1)을 선택하십시오; 나는 마법사 3 , Ch11 (LC3)을 선택한다. 이름에 "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3"을 입력 하고 확인을 클릭 하고 닫기 를 클릭하여 기능 관리자 .
- 새 히스토그램 아이콘을 클릭하십시오. "LAMP1 + / p62 + / LC3 +"모집단을 선택하십시오. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 기능을 선택하고 확인을 클릭하십시오.
- New Scatterplot 아이콘을 클릭하십시오. "LAMP1 + / p62 + / LC3 +"모집단을 선택하십시오. X 축에 대해 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 을 선택하십시오. Y 축의 스팟 카운트 LC3 기능을 선택하십시오. 확인을 클릭하십시오.
- th를 저장하십시오.e "Starved + Chloroquine"파일. 파일을 클릭하고 데이터 분석 파일 저장 (.daf)을 선택 하십시오 . 이전 버전의 파일을 바꾸려면 저장 및 예 를 클릭 하십시오 . 이 파일을 이제 템플릿으로 사용할 수 있습니다.
- "제어"파일을 엽니 다. 파일을 클릭 한 다음 열기를 클릭하십시오. "Control.rif"파일을 선택하고 열기를 클릭하십시오. 9.2.1 단계의 보상 매트릭스와 "Starved + Chloroquine.daf"파일을 템플릿으로 선택하십시오. 확인을 클릭하십시오.
- autophagosome 축적 및 autolysome 축적을위한 영역을 "Control"샘플을 사용하여 영역을 설정하십시오.
- 사각형 영역 만들기 아이콘을 클릭하십시오. X 좌표가 -0.1에서 3, Y 좌표가 1.5에서 -0.3 인 영역을 그립니다. 이 영역의 이름을 "Low Spots"로 지정하십시오. 클릭 사각형 영역 만들기 아이콘. X 좌표 -0.1에서 1 및 Y 좌표에서 영역 그리기17.5 ~ 1.5의 ates. 이 영역의 이름을 "High Spot / Low BDC3"으로 지정하십시오.
- 사각형 영역 만들기 아이콘을 클릭하십시오. 1에서 3의 X 좌표와 17.5에서 1.5의 Y 좌표로 영역을 그립니다. 이 영역의 이름을 "High Spots / High BDC3"이라고 지정하십시오.
- "Control"파일을 저장하십시오. 파일을 클릭하고 데이터 분석 파일 저장 (.daf )을 선택 하십시오 . 이전 버전의 파일을 바꾸려면 저장 및 예 를 클릭 하십시오 . 이 파일을 이제 템플릿으로 사용할 수 있습니다.
- 다음 열기를 파일에 클릭하여 "컨트롤 + 클로로퀸"파일을 엽니 다. "Control + Chloroquine.rif"파일을 선택하고 열기를 클릭하십시오. 9.2.1 단계에서 보정 매트릭스를 선택하고 "Control.daf"파일을 템플릿으로 선택하십시오. 확인을 클릭하십시오. "Starved"및 "Starved + Chloroquine"파일에 대해이 작업을 반복하십시오.
참고 : 분석 소프트웨어의 배치 기능을 사용하여 보정 값을 적용 할 수도 있습니다기조 매트릭스 및 / 또는 템플릿을 다른 파일에 추가합니다. 최종 게이팅 전략은 그림 2와 같습니다 .
Representative Results
이 분석 방법은 autophagic 플럭스를 분석하기 위해 여러 기능을 사용합니다. 최종 2 변량 플롯을 완전히 이해하려면 개별 분석 기능을 먼저 조사해야합니다. autophagosomes의 계산은 autophagy를 측정하는 논리적 인 방법입니다; 그러나 LC3 puncta의 크기 / 모양 / 밝기는 세포간에 크게 다를 수 있습니다. 변이로 인해 자동자가 염색체를 수동으로 계산하거나 분석 소프트웨어의 스폿 카운트 기능을 사용하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, autophagosomes의 큰 변화 때문에 spot-count 기능은 완벽하지 않습니다. 그러나, 좋은 장소 카운트 기능은 대부분의 세포 (26)에 작동합니다. 도 3 은 상이한 스폿 마스크를 사용하여 Jurkat 셀에서 LC3 점을 스팟 마스킹하는 예를 도시한다. 이 데이터 세트에 대해 선택된 스폿 카운트 기능은 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4입니다. 즉, 스폿 카운트 기능이spot-to-cell 배경 비율이 4 (Bright, 4) 인 채널 11 (Ch11-LC3-AF647)의 기본 채널 11 마스크 (M11) 내에서 식별 된 마스크. 그림 4 는 대조군, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 평균 스팟 카운트에 대한 스폿 카운트 히스토그램과 대표 이미지를 보여줍니다 (anti-LC3-AF647로 표시). 대조군과 굶주린 평균 자리 수는 크게 다르지 않습니다. chloroquine을 첨가하면 Starved + Chloroquine에 비해 Control + Chloroquine의 평균값에 큰 차이가 있습니다.
조사 할 다음 기능은 BDC3입니다. BDC3은 세 개의 마커 / 프로브 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 위치 측정 값입니다. 그림 5A - 5D 는 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 BDC3 히스토그램을 보여줍니다. anti-p62-AF488, 항 -LAMP1-PE 및 항 -LC3-AF647을 포함한다. Control + Chloroquine은 Starved + Chloroquine 평균을 의미합니다. 그러나, 그림 5E - 5H 의 평균 BDC3 점수에서 세포의 이미지를 보면, 히스토그램이 믿을 수있는 것보다 더 큰 차이가 있습니다. 이것은 BDC3가 동일한 BDC3 점수에 대해자가 염색체의 수에 큰 변동성을 초래하는 동시에 공동 위치하는자가 작용 세포 소기관의 수를 고려하지 않기 때문입니다. 대부분의 경우, 기초 수준 에서조차, p62, LAMP1 및 LC3은 어느 정도까지는 세포의 유사한 영역에 공동 위치하거나 상주해야하기 때문에 세 가지 프로브 사이에 중첩이 존재합니다. 대조적으로, 그림 6 과 같이 Starved + Chloroquine 샘플에 대해 anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 및 DAPI 핵 염료가 공존하지 않아야하는 세 가지 프로브의 예 </ p>
스폿 카운트 기능과 BDC3 기능이 결합되면 다양한 샘플 / 조건을 구별하는 기능을 향상시키는 하위 모집단의 존재가 분명합니다. 그림 7 은 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 네 가지 샘플에 대한 LC3 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 스팟 카운트의 이변 변수 플롯을 보여줍니다. Control 샘플은 Low Spots, High Spots / Low BDC3 및 High Spots / High BDC3의 세 가지 집단에 대한 게이팅 전략을 설정하는 데 사용되었습니다. 대조군 샘플은 세포의 98 % 이상이 1 개 이하의 반점을 갖는 것으로 나타났다. High Spots / Low BDC3과 High Spots / High BDC3 사이의 경계는 대조 샘플의 91 % 이상이 1 미만의 BDC3 스코어를 가졌기 때문에 BDC3 스코어가 1로 설정되었습니다. bivariate 플롯에 대한 결과 요약 표 1 에 나타냈다 .
age = "1"> 
그림 1 : MIFC 악기 설정. 이 실험에 사용 된 MIFC 기기 설정의 스크린 샷으로 프로토콜의 8 단계에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 분석 소프트웨어 게이팅 전략. 프로토콜 9 단계에서 설명한 분석 소프트웨어 게이팅 구성표의 스크린 샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
fig3.jpg "/>
그림 3 : LC3 스폿 마스킹. 스폿 카운트 기능을 만드는 데 사용되는 Jurkat 셀 이미지 및 마스크. BrightField (BF), LC3-AF647, 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 2), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647 Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) 및 Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1) 표시된 모든 셀에서 가장 잘 작동하는 마스크는 Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : LC3 스폿 카운트 히스토그램. 컨트롤 ( A , 연한 파란색), 스팟 카운트 기능 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4) _4 및 LC3-AF647 스폿 카운트 히스토그램을 사용하여 Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색) 및 Starved + Chloroquine ( D , 빨간색). Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 스팟 카운트는 각각 0.07, 1.13, 0.10 및 2.77입니다. (spot) 수에 대한 대표적인 세포의 LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 복합체 인 BF, LC3-AF647 (적색), DAPI 핵 염료 (청색) 및 대조군 ( E , 0 스팟), 대조 + 클로로퀸 F , 1 지점), Starved ( G , 0 지점), Starved + Chloroquine ( H 지점, 3 지점). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : p62 / LAMP1 / LC3의 BDC3 히스토그램. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 히스토그램 fo( A , 연한 파란색), Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색), Starved + Chloroquine ( D , 빨간색 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 BDC3 점수는 각각 0.57, 0.82, 0.74 및 0.98입니다. BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ), 및 Starved + Chloroquine에 대한 대표적인 세포의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3- H ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : p62 / L의 BDC3 히스토그램굶주린 + 클로로퀸 시료의 경우 C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine 샘플에 대한 BDC3 p62 / LC3 / DAPI 히스토그램이 표시됩니다. 평균 BDC3 점수는 0.07입니다. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LC3-AF647 (적색); DAPI (파란색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 평균 BDC3에 대한 대표 세포의 p62-AF488, LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 합성이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 3 개 영역 ( 즉, 낮은 스폿, 하이 스팟 / 로우 BDC3 및 하이 스팟 / 하이 BDC3)의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3-AF647 이미지가 합성되어 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 수 | 밝은 세부 Colocalization 3 평균 | 스팟 카운트 LC3 평균 | 낮은 곳 (%) | 높음 높음 / 낮음 BDC3 | 높은 반점 / 높음 BDC3 | |
| 제어 | 439 | 0.57 | 0.07 | 98.2 | 1.8 | 0.0 |
| 대조 + 클로로퀸 | 1432 년 | 0.82 | 1.13 | 68.9 19.5 | 11.7 | |
| 굶주린 | 1204 | 0.74 | 0.10 | 98.4 | 0.6 | 1.0 |
| 굶주린 + Chloroquine | 1811 년 | 0.98 | 2.77 | 32.1 | 36.9 | 31.0 |
표 1 : Jurkat LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 2 변량 플롯의 요약
Discussion
이 분석을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 적절한 컨트롤 샘플을 갖는 것이 중요합니다. 이 실험을 위해 두 개의 다른 컨트롤이 사용되었습니다 : Control + Control + Chloroquine. Control 샘플을 사용하여 영역의 임계 값을 설정했습니다. 그것은 리소좀 분해를 멈추지 않으면 서 autophagy의 기초 수준을 나타내며 Starved 샘플의 컨트롤입니다. 그러나, Control 샘플은 Starved + Chloroquine 샘플의 결과와 비교할 수있는 적절한 컨트롤이 아닙니다. 왜냐하면 클로로퀸 자체가 컨트롤 샘플에 영향을 미치기 때문입니다. 그러므로 Control + Chloroquine 샘플이 필요했습니다.
autophagy에 대한 분석을 수행하기 전에 하나 이상의 셀이 있거나 이미지가있는 경우 결과에 영향을 줄 수 있으므로 포커스가있는 단일 셀 ( 즉, 60보다 큰 그래디언트 RMS)에서만 분석 / 게이트를 분석하는 것이 중요합니다. 초점없는. 자궁이 중요하다.es와 lysosome은 적절한 spot count와 BDC3 분석에 초점을 맞추고있다. Apoptotic 세포는 autophagy 분석 전에 제거해야합니다, 그들은 결과를 왜곡 할 수 있으므로 포함되어서는 안됩니다. 세 가지 마커 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1) 모두에 대해 적절한 염색이 있어야합니다. 예를 들어, 3 개의 마커 모두는 세포 내 (intracellular)이며 점선 신호가 있어야합니다. 신호가 점을 찍지 않았거나 세포 표면에 있다면 염색이 적절하지 않아 실험 / 염색을 다시해야합니다. 또한 BDC3가 정확하려면 3 개의 형광 마커 모두에 밝은 셀을 게이트하는 것이 필수적입니다. 비특이적 결합, 이미징 인공물 및 / 또는 소음에 대한 BDC3 측정을 방지하려면 양성 반응에 대한 게이팅이 필요합니다. BDC3은 실제 신호가 아닌 인공물을 증폭시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다. BDC3은 밝은 양성 반응에서만 수행 할 수 있으므로 많은 세포가 최종 분석에 포함되지 않을 수 있습니다. 이것은 특별하다.LC3, p62 및 / 또는 LAMP1의 축적이없는 대조군 세포에 대해서는 사실이다. 따라서,이 분석법의 한계는 BDC3가 세 가지 마커 모두에 대해 양성인 세포를 검사한다는 것인데, 이는 모든 자동 운동 실험에 적합하지 않을 수 있습니다.
이전에 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26으로 보고 된 BDS와 마찬가지로 BDC3만으로는 공동 위치를 결정하는 autophagy organelles의 수를 고려하지 않았기 때문에 autophagosomes의 수에있는 가변성의. 따라서, Rajan et al. 고용되었다. bivariate plot을 보면, if세포는 LC3, p62 및 LAMP1에 대해 양성이어야합니다. 0 점이있는 셀이 왜 그렇게 많습니까? 이는 LC3 신호가 동일 위치에 충분히 밝을 수 있기 때문에 피크 마스크 (피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4))로 설정된 임계 값을 충족시키지 못하기 때문입니다 자리.
여기에 제시된 프로토콜은 LC3 puncta를 계산하기 위해 MIFC를 사용하였고, autophagic 플럭스를 측정하기 위해 세 개의 autophagy 마커의 co-localization을 사용했습니다. 기초 조건 (Control sample) 하에서,자가 형광체의 수가 적었고, "High Spot"으로 세포가 거의 발견되지 않았다. autophagosome / lysosome 융합을 억제하는 chloroquine의 첨가로 LC3 spot의 수가 증가했다. 리소좀이 autophagosome과 autophagosome에있는 p62를 파괴 할 수 없기 때문에 LC3, p62 및 LAMP1 autolysosome 축적의 공존이 증가합니다. 이 효력은 영양이되는 starvat이온, autophagy를 유도합니다. 그러나 chloroquine을 첨가하지 않으면 autophagosom의 수는 현저히 증가하지 않았고, autophagos turnover의 속도가 증가했기 때문인 것으로 보인다. 세포가 chloroquine의 존재 하에서 굶어 죽었을 때, autophagosomes의 co-localization과 수의 증가가 있었는데, 기아가 autophagic 플럭스를 증가 시킨다는 결론을지지한다. EBSS는 강력한 autophagy 유도제로 알려져 있습니다. 따라서 증가가 클 것으로 예상됩니다. 약물 유도와 같은 다른 방법을 사용하여 autophagy를 유도하는 경우, 대조군과 치료 된 시료의 차이는 미묘합니다.
이 특정 프로토콜은 인간 세포주에서 autophagy를 측정하도록 고안되었지만 특정 종에 대한 항체로 전환하여 다른 종에 적용 할 수 있습니다. 또한, 분석 방법은 공동 지역화를 필요로하는 모든 세포 내 응용에 사용될 수있다3 개의 프로브 / 마커로 구성됩니다.
Disclosures
저는이 연구에서 사용 된 Amnis 브랜드 ImageStream의 제작자 인 MilliporeSigma에 고용되었습니다.
Acknowledgments
필자는 MilliporeSigma, Philip J. Morrissey 및 Sherree L. Friend의 동료들에게 수년 간 도움과지도를 해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 책을 편집하는 데 도움을 준 IDEAS 소프트웨어의 BDC3 기능 , Ryan P. Jessup, 촬영 당일 도움을 준 Raymond Kong 및 특별 감사의 도움을 주신 Vidya Venkatachalam 및 Bryan R. Davidson에게도 감사드립니다. 메이크업 아티스트 Cynthia Xamonthiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
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