Summary
Здесь для измерения аутофагии объективным, количественным и статистически устойчивым методом была использована мультиспектральная цитометрия проточного изображения с аналитическим признаком, который сравнивает яркие детализированные изображения 3 маркеров аутофагии и количественно их совместную локализацию, а также подсчет пятен LC3.
Abstract
Автофагия - это катаболический путь, при котором нормальные или дисфункциональные клеточные компоненты, которые накапливаются во время роста и дифференцировки, деградируют через лизосому и рециркулируются. Во время аутофагии цитоплазматический LC3-белок липидируется и завербовывается в аутофагосомальные мембраны. Затем аутофагосома сливается с лизосомой, образуя автолизосому, где происходит распад авфагагосомного везикула и его содержимого. Связанный с ЫЦ3 белок ubiquitin p62, который связывается с LC3, также используется для контроля аутофагического потока. Клетки, подвергающиеся аутофагии, должны демонстрировать совместную локализацию p62, LC3 и лизосомных маркеров. Иммунофлуоресцентную микроскопию использовали для визуальной идентификации LC3 puncta, p62 и / или лизосом на основе каждой клетки. Тем не менее, объективная и статистически строгая оценка может быть трудно получить. Чтобы преодолеть эти проблемы, была использована мультиспектральная цитометрия протоков изображений, а также аналитическая характеристика, которая сравнивает яркую де-(LC3, p62 и lysosomal LAMP1) и количественно оценивает их совместную локализацию в сочетании с подсчетом пятна LC3 для измерения аутофагии объективным, количественным и статистически устойчивым образом.
Introduction
Макроаутофагия, именуемая в дальнейшем аутофагия, представляет собой катаболический путь, в котором поврежденные или дисфункциональные компоненты, долгоживущие белки и органеллы деградируют через лизосому и рециркулируются 1 . Autophagy - это динамический, многоступенчатый процесс, который включает в себя формирование аутофагосомы; Слияние аутофагосомы с лизосомой, образующей автолизосому; И деградацию содержимого автолизосомы 2 . Важнейшим биологическим маркером, используемым для идентификации аутофагии в системах млекопитающих, является связанный с микротрубочками белок 1A / 1B-легкая цепь 3 (LC3), который составляет аутофагосомальную мембрану. Во время аутофагии цитозольный LC3-1 конъюгируют с фосфатидилэтаноламином с образованием LC3-II; Затем LC3-II включается в аутофагосомальную мембрану 3 . Другим широко используемым маркером для аутофагического потока является секвестроза 1 рецептора аутофагии (SQSTM1, p62), которая физически лиNks аутофагический груз на аутофагическую мембрану 4 , 5 .
Методы, которые традиционно используются для измерения аутофагию являются западные помарки и флуоресцентной микроскопии 7. Однако ни один из этих методов не считается «золотым стандартом», 2 , 6, поскольку существуют проблемы, связанные с обоими этими методами. Вестерн-блоты дают только среднее значение, потому что они используют образец гомогената, поэтому наблюдатели не могут видеть, что происходит в отдельных клетках. С другой стороны, флуоресцентная микроскопия дает информацию наблюдателя на уровне одной ячейки, но у нее нет пропускной способности, что затрудняет получение объективных и статистически строгих оценок. В последние годы измерение LC3 и p62 с помощью мультиспектральной цитометрии потока изображений (MIFC, см. Таблицу материалов ) набирает популярностьБлагодаря своей количественной мощности, высокой пропускной способности, потенциалу мультиплексирования и способности отображать каждую ячейку. Одним из наиболее широко используемых методов измерения аутофагии с использованием MIFC, а также сопутствующего анализа программного обеспечения (см. Таблицу материалов ) является точечный подсчет LC3 puncta или аутофагосом 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Однако увеличение аутофагосом не обязательно означает, что наблюдается увеличение аутофагии, так как это может также представлять собой блокаду в процессе 2 . Оборот LC3-II является полезным параметром для измерения аутофагического потока путем анализа клеток в присутствии иОтсутствие ингибитора лизосомной деградации, такого как хлорохин. Хлорохин ингибирует слияние аутофагосомы с лизосомой, тем самым позволяя количественно определять образование аутофагосомы как показатель степени аутофагии путем остановки аутофагического потока до того, как может произойти лизосомальная деградация 18 . Кроме того, P62 разлагаются в первую очередь аутофагией, и если деградация лизосомальная из аутофагоса и его содержимого блокируется, накопление p62 , как ожидаются , 17, 19.
Autophagy - это многоэтапный процесс, и измерение только LC3 или p62 не дает полной картины того, что происходит в клетках. Недавние публикации подчеркивали необходимость изучения одновременного формирования автолизосомы 2 , 17 , 20 , 21 . MIFCоднозначно способны измерять образование autolysosome путем визуализации совместной локализации с аутофагосом к лизосом 15 - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Кроме того, была изучена совместная локализация p62 и LC3 с использованием MIFC для измерения аутофагического потока 5 . В упомянутом программном обеспечении анализа «функция», которая измеряет совместную локализацию, называется «Яркая детальность сходства R3» (BDS) и была специально разработана для сравнения небольших ярких деталей изображения двух изображений. BDS - логарифмированный коэффициент корреляции Пирсона локализованных ярких пятен с радиусом 3 пикселя или менее; Другими словами, BDS вычисляет степень oVerlapping пикселей из двух разных флуоресцентных каналов. Яркие пятна либо коррелированы ( т. Е. Одинаковое пространственное местоположение), либо некоррелированы ( т. Е. Разные пространственные местоположения). Следовательно, коэффициент корреляции изменяется от 0 (некоррелированный) и 1 (идеальная корреляция). Коэффициент log-преобразован для увеличения диапазона до нуля и бесконечности 26 , 27 . Только BDS может быть недостаточным; Rajan et al. Что использование только BDS может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам 21 . BDS оценивает совместную локализацию двух маркеров аутофагии, но не учитывает количество аутофагосом. Чтобы учесть количество аутофагосом, Rajan et al. Включал подсчет пятен LC3 puncta 21 . Rajan et al. Предложенный с использованием двумерного графика рассеяния для подсчета пятен LC3 по сравнению с BDS. Используя этот двумерный сюжет, две популяции werE сначала идентифицировали: один с клетками, которые имеют высокий уровень пятен LC3, и один с клетками, которые имеют низкий уровень пятен LC3. Точечная популяция с высоким LC3 была далее разделена на две популяции: клетки с низкой ко-локализацией ( т. Е. Накопление аутофагосом) и клетки с высокой ко-локализацией ( т. Е. Накопление аутолизосом). Этот двумерный график позволяет различать клетки с очень небольшим количеством аутофагосом и клеток с накоплением аутофагосом и / или аутолисосом 21 .
До сих пор одновременная совместная локализация LC3, p62 и LAMP1 (лизосомальный маркер) была невозможна с использованием единого «Тип функции» в программном обеспечении совместного анализа MIFC (см. Таблицу материалов ). Однако новая функция, недавно введенная в версии 6.1, называется Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 сравнивает яркие подробные изображения с каждого из трех изображений (в этом случае LC3, p62 и LAMP1) и количественно оценивает совместную локализацию трех зондов ( то есть LC3, p62 и LAMP1). Функция BDC3 вычисляет коэффициент корреляции Пирсона, модифицированный для расширения до трех изображений. Поскольку яркие пятна на трех изображениях коррелированы или некоррелированы, коэффициент корреляции колеблется между 0 (некоррелированный) и 1 (идеальная корреляция). Коэффициент log-преобразован для увеличения динамического диапазона между 0 и бесконечностью. Выключив функцию BDS с функцией BDC3, метод анализа, представленный Rajan et al. Теперь могут включать три наиболее используемых маркера для измерения аутофагии в одной системе одновременно. Способность локализовать эти три маркера аутофагии в одном анализе может привести к новым представлениям о индукции и регуляции аутофагии. В следующем протоколе излагаются шаги по индукции аутофагии в клетках Jurkat; Маркировать клетки антителами LC3, p62 и LAMP1; Получать данные поЭлектронный проточный цитометр; И проанализировать данные для оценки аутофагического потока.
Protocol
1. Получение среды культивирования и ингибитора лизосомной деградации
- 1.1. Сделайте ~ 500 мл 1x RPMI культуральной среды. Добавьте 5 мл незаменимых аминокислот (100х) МЕМ, 5 мл пирувата натрия (100 мМ), 5 мл пенициллина-стрептомицин-глутамина (100х) и 25 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 500 мл Бутылка RPMI - 1640 1x среда. Среда должна быть подготовлена в шкафу для биобезопасности. Храните культуральную среду RPMI при температуре 2-8 ° C. Нагрейте культуральную среду RPMI до 37 ° C перед добавлением ее в ячейки Jurkat.
- Сделайте 100 мМ хлорохин, ингибитор лизосомальной деградации. Взвешивают 0,05 г соли хлорохиндифосфата и добавляют его в 1 мл воды для культивирования клеток в 15-миллилитровой центрифужной пробирке. Вихрь до растворения хлорохина.
2. Культивирование клеток
- Культура. 80 мл клеток клеток Jurkat E6-1 в культуральной среде RPMI при 37 ° C и 5% CO 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ. При культивировании клетокИли работа с ячейками Jurkat до фиксации, все работы должны выполняться в шкафу биобезопасности. - Перед тем, как индуцировать аутофагию, подсчитайте клетки Jurkat с помощью гемоцитометра или другого устройства подсчета клеток для определения клеток / мл.
3. Выявление аутофагии в клетках
- Возьмите клетки Jurkat в экспоненциальной фазе роста и разделите их на четыре образца по 20 мл каждый в 50-миллилитровых центрифужных пробирках. Назовите трубки как «Контроль», «Контроль + Хлорохин», «Голод» и «Голод + Хлорохин».
ПРИМЕЧАНИЕ. Ячейки Jurkat должны иметь концентрацию 2,5-5 × 10 5 клеток / мл. - Промойте клетки, добавив к каждому образцу 30 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса без Ca 2+ или Mg 2+ (HBSS). Центрифуга при 250 мкг в течение 10 мин. Вылейте супернатант в пустой стакан.
- Ресуспендируют контрольные образцы в 20 мл культуральной среды RPMI путем пипетирования вверх и вниз с использованием 25 мл сОдноразовая пипетка с последующим быстрым ворсингом. Аналогичным образом ресуспендируйте голодные образцы в 20 мл сбалансированного солевого раствора Эрла без Ca 2+ или Mg 2+ (EBSS).
- Используя 25 мл стерильную одноразовую пипетку, перенесите контрольные и голодные образцы в колбы T75, которые были обозначены как «Контроль», «Контроль + Хлорохин», «Голод» и «Голод + Хлорохин».
- Добавьте 20 мкл 100 мМ хлорохина в 20 мл клеточной культуральной среды в «Control + Chloroquine» и колбах «Starred + Chloroquine». Смешайте в хлорохине, осторожно закрутив колбу. Поместите все колбы в 37 ° C и 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 часов.
4. Подготовка буферов для фиксации и маркировки LC3, LAMP1 и p62
- Подготовьте 10 мл 4% раствора фиксации формалина в PBS. Добавить 4 мл 10% -ного раствора формалина в 1 мл 10-кратного фосфат-буфера DulbeccoСолевой раствор без Ca 2+ или Mg 2+ (PBS) и 5 мл сверхчистой воды в 15 мл центрифужной пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ. ВНИМАНИЕ. Формалин / формальдегид является токсичным при вдыхании или проглатывании; Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу; И может вызвать сенсибилизацию при вдыхании или контакте с кожей. Существует риск серьезного повреждения глаз. Это потенциальный канцероген. - Подготовьте 10 мл 1% раствора окончательного ресуспендирования формалина в PBS. Добавьте 1 мл 10% -ного раствора формалина в 9 мл 1x PBS в 15 мл центрифужную пробирку.
- Подготовьте 500 мл промывочного буфера, добавив 10 мл FBS в 500 мл флакон 1x PBS.
- Подготовьте 50 мл пермеабилизирующего буфера в 50 мл центрифужной пробирке, добавив 0,5 мл 10% тритона X-100 в промывочный буфер 49,5 мл, приготовленный на стадии 4.3.
- Подготовьте рабочий раствор анти-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) / пермеабилизирующий буферный раствор, добавив 5 мкл анти-SQSTM1 / p62-AF488 до 495 мкл буфера для пермеализации, сделанного в sТ. П. 4.4. Убедитесь, что конечная концентрация антитела составляет 5 мкг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Создайте рабочее решение для обработки проницаемости для антител перед их добавлением к образцу. Защитите решение от света. - Подготовьте рабочий раствор мышиного анти-LC3 / пермеабилизационного буфера, добавив 5 мкл мышиного анти-LC3 до 495 мкл буфера для проницаемости, сделанного на этапе 4.4. Убедитесь, что конечная концентрация антител составляет 20 мкг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Создавайте рабочие растворы для обработки пермеабилизирующего раствора антитела непосредственно перед добавлением его в образец. Защитите решение от света. - Подготовьте рабочий раствор осла anti-mouse-Alexa 647 (AF647) / пермеабилизационного буфера, добавив 5 мкл меченого AF647 осла антимышино-IgG до 495 мкл буфера для проницаемости, сделанного на этапе 4.4. Убедитесь, что конечная концентрация антител составляет 20 мкг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Создайте рабочее решение для обработки пермеабилизирующего раствора антитела непосредственно перед добавлением его в образец. Защитить tОн решение из света. - Подготовьте анти-человеческий CD107a (LAMP1) -PE антитело / раствор для обработки проницаемости буфером путем добавления 25 мкл анти-CD107a (LAMP1) -PE до 475 мкл буфера для пермеабелизации, сделанного на этапе 4.4. Убедитесь, что конечная концентрация антител составляет 21 мкг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Создайте рабочее решение для обработки пермеабилизирующего раствора антитела непосредственно перед добавлением его в образец. Защитите решение от света. - Подготовьте 10-кратное ядерное пятно DAPI, добавив 4 мкл DAPI 5 мг / мл и 100 мкл 10% тритона Х-100 до 896 мкл 1х PBS.
5. Маркировка клеток Jurkat с помощью LC3, LAMP1 и p62
- Удалите 2 x 10 6 клеток на образец (подсчитайте ячейки, как на этапе 2.2). Поместите каждый образец в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, которая была маркирована соответствующим образцом ( например, Control, Control + Chloroquine, Starved или Starved + Chloroquine).
- Добавьте бункер для стирки, чтобы тамОбщий объем 15 мл в каждой 15-мл центрифужной пробирке. Центрифугируйте образцы при 250 × g в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант.
- Добавьте 100 мкл 4% раствора фиксации формалина к каждому из клеточных гранул. Ресуспендируют путем пипетирования вверх и вниз пипеткой P200. Инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре. Во время этапа фиксации переносите образцы на маркированные силиконизированные пробирки для микроцентрифугирования из полипропилена.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не переустанавливайте ячейки; Это может привести к плохим результатам маркировки. - После стадии фиксации 10 минут добавьте 1 мл промывочного буфера к каждому образцу. Пипеткой вверх и вниз с пипеткой P1000 для смешивания образца. Центрифуга при 250 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
- Добавьте к каждому образцу 100 мкл анти-SQSTM1 / p62 - AF488 антитела / пермеабилизирующего буферного раствора. Ресуспендируют путем пипетирования вверх и вниз пипеткой P200. Инкубируйте в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре.
- Промыть клетки, добавив 1 млБуфер проницаемости для каждого образца. Пипеткой вверх и вниз с пипеткой P1000 для смешивания образца. Центрифуга при 250 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
- Повторите шаги 5.4-5.5 для каждого из рабочих растворов антител.
ПРИМЕЧАНИЕ. Работающими растворами антител являются рабочий раствор мышиного анти-LC3 / пермеабилизационного буфера, рабочий раствор осла для защиты от мыши-AF647 / пермеабилизирующего буфера и работающий раствор анти-человеческого CD107a (LAMP1) - PE-антитела / пермеабилизирующего буфера. Каждое антитело должно выполняться отдельно и в указанном порядке. Заказ был выбран для минимизации нежелательной перекрестной реактивности между антителами. - Добавить 100 мкл 1% раствора формалина. Ресуспендируют путем пипетирования вверх и вниз пипеткой P200. Добавить 10 мкл 10x DAPI ядерного пятна в каждый образец. Слегка встряхните каждый образец для смешивания. Инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре перед тем, как запустить любой образец на приборе.
ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент образец может либо bE запускается на MIFC или хранится в защищенном от света при температуре 2-8 ° C в течение недели.
6. Маркировка одноцветных элементов управления
- Для каждого одноцветного управления ( то есть AF488, PE, AF647 и DAPI) возьмите 1 x 10 6 клеток Jurkat, которые могут быть из любой популяции образцов. Поместите 1 × 10 6 клеток в 15 мл центрифужные пробирки, помеченные как AF488, PE, AF647 или DAPI.
- Добавьте промывочный буфер так, чтобы в каждой 15 мл центрифужной пробирке был общий объем 15 мл. Центрифугируйте образцы при 250 × g в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант.
- Добавьте 100 мкл промывочного буфера в трубки AF488, PE и AF647.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для трубки DAPI перейдите к шагу 6.8.- Ресуспендируют путем пипетирования вверх и вниз пипеткой P200. Перенесите в 1,5-мл пробирки.
- Добавьте соответственно 5 мкл анти-CD45-AF488, анти-CD45-PE или анти-CD45-AF647 в трубки AF488, PE или AF647. Смешать путем встряхивания lightly.
- Инкубируйте трубки AF488, PE и AF647 в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ. Могут использоваться другие маркеры, такие как антитела LC3, p62 и LAMP-1 вместо анти-CD45-антител. Однако CD45 является надежным маркером для одноцветных элементов управления. - Промойте клетки AF488, PE и AF647, добавив 1 мл промывочного буфера к каждому образцу.
- Пипеткой вверх и вниз с пипеткой P1000 для смешивания образца. Центрифуга при 250 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
- Добавить 100 мкл 1% раствора формалина. Ресуспендируют путем пипетирования вверх и вниз пипеткой P200.
ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент образец может быть запущен на MIFC или храниться защищен от света при температуре 2-8 ° C в течение недели. - Добавьте 100 мкл 1% раствора фиксации формалина в трубку DAPI.
- Ресуспендируют путем пипетирования вверх и вниз пипеткой P200. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавить 101; L 10x DAPI ядерного пятна к образцу DAPI. Легко перемешать вихрь. Инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре до начала работы с прибором.
ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент образец может быть запущен на MIFC или храниться защищен от света при температуре 2-8 ° C в течение недели.
7. Запуск и калибровка MIFC
- Убедитесь, что оболочка, системный калибровочный реагент (см. Таблицу материалов ), контейнеры для дебаблера, моющего средства и стерилизатора заполнены, а бак для отходов пуст. Если нет, заполните контейнеры и опорожните резервуар для отходов.
- Включите систему и дважды щелкните значок программного обеспечения (см. Таблицу материалов ), чтобы запустить приложение; Это запустит программное обеспечение MIFC.
- Нажмите кнопку « Автозагрузка» и убедитесь, что выбраны « Начать все калибровки и тесты» . Это запустит систему, загрузочную оболочку, реагент для калибровки системы,И откалибровать систему.
8. Запуск образцов и одноцветных элементов управления на MIFC
- Загрузите шаблон по умолчанию, перейдя на вкладку « Файл » и выбрав « Загрузить шаблон по умолчанию» .
ПРИМЕЧАНИЕ. Шаблон по умолчанию содержит необработанные макс. Пиксельные точки. - Включите лазеры 488 нм, 405 нм, 642 нм и SSC, нажав на соответствующие кнопки. Установите мощность лазера, введя требуемую мощность рядом с каждой лазерной кнопкой. См. Рис. 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого эксперимента мощности лазера составляют 200 мВт, 20 мВт, 150 мВт и 5 мВт (Ch06) для 488 нм, 405 нм, 642 нм и SSC соответственно. Увеличение размера шаблона MIFC по умолчанию составляет 40X, чувствительность по умолчанию - Hi , и все каналы включены. - Убедитесь, что ползунок увеличения установлен на 40X, выбран режим высокой чувствительности, и все каналы отображаются в галерее изображений; Рисунок 1
- Загрузите образец «Голодный + Хлорохин», нажав на кнопку « Загрузить» и загрузив 1,5-миллилитровую трубку на инструмент.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот экспериментальный образец должен иметь самый высокий сигнал для всех образцов для AF488, PE и AF647 (сигнал DAPI должен иметь примерно одинаковый уровень сигнала для всех экспериментальных образцов, включая образец «Голод + Хлорохин»). - Используйте образец «Голод + Хлорохин», чтобы подтвердить, что установлены соответствующие лазерные мощности для лазеров 488 нм, 405 нм, 642 нм и SSC. Используйте макс. Пиксельные пиксельные точки из шаблона по умолчанию, чтобы настроить мощность лазера так, чтобы сигналы были сильными, но не достигли необработанного максимального значения пикселя 4096, которое насытило бы ПЗС-камеру на инструменте. Используйте эту настройку лазера для всех экспериментальных образцов.
- Нажмите на значок « Создать точки точек», чтобы создать новый график. Выберите «Area_M»01 "на оси X и« Aspect Ratio_M01 »на оси Y для« всей »популяции. Нажмите значок« Создать многоугольник » . Нарисуйте область вокруг ячеек. Назовите эту область« Ячейка ».
ПРИМЕЧАНИЕ. Пользователи могут добавлять дополнительные участки и регионы, чтобы сузить собираемые ячейки. Общий дополнительный график для добавления будет Gradient RMS, чтобы идентифицировать ячейки, которые находятся в фокусе. - Задайте параметры сбора. Укажите имя файла и папку назначения, измените количество событий на «5000» и выберите популяцию коллекции «Ячейка». Нажмите кнопку « Получить» , чтобы получить файл. После сбора файла верните образец, нажав кнопку « Возврат» . Извлеките пробоотборную трубку из прибора.
- Для следующих трех образцов («Голод», «Контроль» и «Контроль + Хлорохин») загрузите образец, введите имя образца, получите образец и верните образец, используя те же настройки, что иДля образца «Голод + Хлорохин», выше.
- После того, как образцы были получены, запустите одноцветные контрольные образцы и получите данные, чтобы можно было создать матрицу компенсации. Выключите SSC-лазер, нажав кнопку SSC . Выключите яркие каналы, нажав кнопку Brightfield и выбрав OFF .
ПРИМЕЧАНИЕ. Если каналы были удалены из галереи изображений для получения экспериментального образца, повторно включите все каналы. Альтернативно, одноцветные элементы управления можно получить, щелкнув вкладку « Компенсация » и выбрав « Создать матрицу» ; Это открывает мастер компенсации, который будет проходить этап сбора файлов и создания матрицы компенсации. - Загрузите одноцветное управление DAPI, нажав кнопку «Загрузить» и загрузите 1,5-миллиметровую трубку в инструмент. Введите имя образца (только DAPI), установите для совокупности совокупность «Все» и измените количество событийС "500".
- Нажмите кнопку « Получить» , чтобы получить одноцветный файл управления.
- Когда коллекция файлов будет завершена, верните образец, нажав кнопку « Возврат» . Извлеките пробоотборную трубку из прибора.
- После образца DAPI нанесите 10% отбеливателя точно так же, как образец, нажав кнопку « Загрузить» и загрузив 100 мкл 10% -ного отбеливателя в пробирку объемом 1,5 мл. Пусть образец пробегает ~ 15 с. Это приведет к удалению остаточного DAPI из трубки.
- Прогон 100 мкл 1x PBS, как сделано в 8.10.3, для удаления остаточного 10% отбеливателя. Теперь прибор готов к работе с одноцветными элементами управления AF488, PE и AF647.
- Повторите шаги 8.10-8.10.2 для каждого из одноцветных элементов управления ( например, AF488, PE и AF647).
ПРИМЕЧАНИЕ. Нет необходимости запускать 10% -ный отбеливатель или PBS между этими образцами, только после одноцветного контроля DAPI.
9. Анализ данных в MIFC.Программное обеспечение alysis
- Запустите программу анализа MIFC (см. Таблицу материалов ).
- Нажмите « Запустить анализ», чтобы запустить мастер открытого файла . Выберите файл данных, который нужно открыть, перейдя к файлу необработанного изображения «Starved + Chloroquine» (.rif). Выберите файл и нажмите кнопку « Открыть» . Нажмите « Далее» .
- Примените компенсацию. Выберите ранее созданную матрицу компенсации и нажмите « Далее» . Кроме того, создайте новую матрицу компенсации, нажав кнопку « Новая матрица» .
ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги 9.2.1.1-9.2.1.2 - это шаги для создания новой матрицы.- Добавьте одноцветные управляющие файлы ( т. Е. Только DAPI, только AF488, только PE и только AF647) в список « Файлы управления», щелкнув « Добавить файлы» , выбрав файлы и нажав кнопку « Открыть» . Нажмите « Далее» .
- В этом эксперименте появится окно « Создать матрицу компенсации» . EnsurЧто Ch02, Ch03, Ch07 и Ch11 выбраны и нажмите « Далее» . Будет создана матрица компенсации. Нажмите « Готово», чтобы сохранить матрицу компенсации. Добавьте файл компенсации в мастер открытого файла и нажмите « Далее» .
- Примените шаблон анализа. На этом этапе шаблон анализа не применяется, поэтому нажмите « Далее» .
ПРИМЕЧАНИЕ. Для других экспериментальных файлов этот файл «Starved + Chloroquine.daf» может использоваться в качестве шаблона. - Назовите файл (имена файлов, соответствующие именам «rif», будут автоматически сгенерированы) и нажмите « Далее» . Задайте свойства отображения изображения, выбрав каналы «02», «03», «07» и «11»; Каналы 01, 06 и 09 предварительно выбираются. Нажмите « Далее» .
- Примените компенсацию. Выберите ранее созданную матрицу компенсации и нажмите « Далее» . Кроме того, создайте новую матрицу компенсации, нажав кнопку « Новая матрица» .
- В конце мастера открытия файла выберите мастер Apoptosis . Нажмите на значок мастера Apoptosis и затем нажмитеКнопку « Выбрать мастера» , чтобы открыть мастер «Апоптоз» .
- Выберите канал ядерного изображения (Ch07) и нажмите « Далее» . Задвиньте ячейки в лучшем фокусе. Нажмите на значок Create Line Region и нарисуйте область на градиенте RMS_M01_Ch01 с 60-90. Назовите этот регион «Фокус», нажмите « ОК» и нажмите « Далее» .
- Ворота одиночных ячеек. Нажмите значок « Создать многоугольник» . Нарисуйте область вокруг отдельных ячеек, назовите область «Одиночный», нажмите « ОК» и нажмите « Далее» . Нажмите « Нет» для «Вы хотите проанализировать подгруппы?».
- Вращают зародышевые клетки. Нажмите значок « Создать линию области» и нарисуйте область, которая включает все ядровые ячейки. Назовите регион «Нуклеат». Нажмите « ОК» и « Далее» .
- Вращайте апоптотические клетки. Нажмите значок « Создать многоугольник» . Нарисуйте область вокруг апоптотических клеток; Это ячейкиС низким ядерным уровнем Area_T50% и высокой яркостью. Нажмите « Готово» . Добавьте второй регион, щелкнув значок « Создать многоугольник» и нарисуя область вокруг неапоптотических ячеек; Позвоните в этот регион «Ячейки».
- Выберите ячейки, которые являются положительными для LAMP1, p62 и LC3. Нажмите на значок « Строительные блоки» , выберите « Флуоресцентные положительные эффекты - один цвет» и выберите популяцию «Ячейки» и Intensity_MC_Ch03 . Обозначьте X-ось «Интенсивность LAMP1». Нарисуйте область, которая включает ячейки с интенсивностью более 10 000, щелкнув значок « Создать линию области» и рисуя область. Назовите эту область «LAMP1 +». Следуйте тем же шагам, что и в 9.4, чтобы выбрать ячейки положительные для p62 и LC3.
- Для p62 + выберите «LAMP1 +» и Intensity_MC_Ch02 . Назовите X-ось «Интенсивность p62» и область p62 + клеток «LAMP1 + / p62 +».; Для LC3 + выберите «LAMP1 + / p62 +» и Intensity_MC_Ch11. Обозначьте X-Axis «Интенсивность LC3» и область LC3 + клеток «LAMP1 + / p62 + / LC3 +». Используйте эту «LAMP1 + / p62 + / LC3 +» для остальной части анализа.
- Создайте функцию подсчета очков для подсчета пятен LC3.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это должно быть создано с использованием образца «Голод + Хлорохин».- Перейдите на вкладку « Анализ » и выберите « Маска» . Нажмите кнопку « Создать», а затем кнопку « Функция» . В разделе « Функция» выберите « Пик» ; Маска , выберите M11 ; И Channel выберите Ch11 . Установите соотношение Spot to Cell Background к 4 . Нажмите « ОК», чтобы закрыть окно « Определить маски» и « ОК», чтобы добавить его в список « Маска» . Нажмите « Закрыть», чтобы выйти из Менеджера маски .
- Перейдите на вкладку « Анализ » и выберите
ПРИМЕЧАНИЕ. Мастер создания Spot также может использоваться для создания функции подсчета очков. Функция подсчета пятен, используемая в этом эксперименте, может не подходить для других экспериментов и / или клеточной линии. Пользователь должен проверить несколько масок / функций подсчета очков при выборе маски / функции для определенного набора данных. Pugsley 2017 содержит дополнительную информацию о подсчете точек с использованием программного обеспечения 26 анализа MIFC. - Нажмите значок « Новая гистограмма» . Выберите «LAMP1 + / p62 + / LC3 +». Выберите функцию подсчета пятна LC3 и нажмите « ОК» .
- Создайте функцию BDC3.
- СЛизать вкладку « Анализ » и выбрать « Особенности» . Нажмите кнопку « Создать» . В разделе « Тип объекта» выберите « Яркая деталь» Colocalization 3 ; Маска , выберите MC ; Изображение 1 , выберите Ch02 (p62); Изображение 2 , выберите Ch03 (LAMP1); И я маг 3 , выберите Ch11 ( LC3 ). Введите «BDC3 p62 / LAMP1 / LC3» для имени и нажмите « ОК» и « Закрыть», чтобы выйти из Менеджер функций .
- Нажмите значок « Новая гистограмма» . Выберите «LAMP1 + / p62 + / LC3 +». Выберите функцию BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 и нажмите OK .
- Нажмите на значок New Scatterplot . Выберите «LAMP1 + / p62 + / LC3 +». Выберите BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 для оси X. Выберите функцию Spot Count LC3 для оси Y. Нажмите « ОК» .
- СохранитьE «Голодный + Хлорохин». Нажмите « Файл» и выберите « Сохранить файл анализа данных» (.daf) . Нажмите « Сохранить» и « Да», чтобы заменить предыдущую версию файла; Этот файл теперь можно использовать в качестве шаблона.
- Откройте файл «Контроль». Нажмите « Файл», а затем « Открыть» . Выберите файл «Control.rif» и нажмите « Открыть» . Выберите матрицу компенсации с шага 9.2.1 и файл «Starved + Chloroquine.daf» в качестве шаблона. Нажмите « ОК» .
- Создайте регионы для накопления автофагосом и накопления автолизосом, используя образец «Контроль», чтобы установить регионы.
- Нажмите на значок « Создать прямоугольник» . Нарисуйте область из X-координат от -0,1 до 3 и Y-координат от 1,5 до -0,3. Назовите этот регион «Низкие точки». Нажать на Создайте значок региона прямоугольника . Нарисуйте область из X-координат от -0,1 до 1 и Y-координатуОт 17,5 до 1,5. Назовите этот регион «High Spot / Low BDC3».
- Нажмите на значок «Создать прямоугольник». Нарисуйте область из X-координат от 1 до 3 и Y-координат от 17,5 до 1,5. Назовите этот регион «High Spots / High BDC3».
- Сохраните файл «Контроль». Нажмите « Файл» и выберите « Сохранить файл анализа данных» (.daf ) . Нажмите « Сохранить» и « Да», чтобы заменить предыдущую версию файла; Этот файл теперь можно использовать в качестве шаблона.
- Откройте файл «Control + Chloroquine», нажав « Файл», а затем « Открыть» . Выберите файл «Control + Chloroquine.rif» и нажмите « Открыть» . Выберите матрицу компенсации с шага 9.2.1 и файл «Control.daf» в качестве шаблона. Нажмите « ОК» . Повторите это для файлов «Голодный» и «Голодный + Хлорохин».
ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетная функция в программном обеспечении анализа также может использоваться для применения компенсацииМатрицы и / или шаблона для других файлов. Окончательная стратегия стробирования показана на рисунке 2 .
Representative Results
Этот метод анализа использует множество функций для осмысления автофагического потока. Чтобы полностью понять окончательный двумерный сюжет, сначала необходимо изучить особенности индивидуального анализа. Подсчет аутофагосом - логичный способ измерения аутофагии; Однако, размер / форма / яркость LC3 puncta могут кардинально меняться между клетками. Изменение может затруднить подсчет автофагосом вручную или использование функции подсчета пятен в программном обеспечении анализа. Поэтому никакая функция подсчета пятен не будет идеальной из-за этой большой изменчивости в аутофагосомах. Однако хорошая функция подсчета пятен будет работать на большинстве ячеек 26 . На рисунке 3 показаны примеры маскирования пятна LCct puncta в клетках Jurkat с использованием различных масок пятен. Функция подсчета пятна, выбранная для этого набора данных, - это Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, что означает, что функция подсчета пятен подсчитывала пятна, которые peAk-маска, идентифицированная в маске канала 11 по умолчанию (M11) на канале 11 (Ch11-LC3-AF647) с соотношением фокус между ячейками 4 (Яркий, 4). На рисунке 4 показаны гистограммы подсчета пятен и репрезентативные изображения для среднего количества пятен для клеток Control, Control + Chloroquine, Starved и Starved + Chloroquine Jurkat, помеченных анти-LC3-AF647. Средние подсчеты контроля и голодания не отличаются друг от друга; С добавлением хлорохина, существует большая разница в среднем контроле + хлорохине по сравнению с голодным + хлорохином.
Следующая функция для исследования - BDC3. BDC3 представляет собой измерение совместной локализации трех маркеров / зондов, в данном случае LC3, p62 и LAMP1. На рисунке 5A- 5D показаны гистограммы BDC3 для клеток Control, Control + Chloroquine, Starved и Starved + Chloroquine Jurkat, помеченных анти-p62-AF488, Анти-LAMP1-PE и анти-LC3-AF647. Существует сдвиг между средним Управлением и средним значением «Стервад», а также «Контрол» + «Хлорохин», означающий среднее значение «Голод» + «Хлорохин». Однако, глядя на изображения ячеек из средних оценок BDC3 на рисунке 5E- 5H , существует большая разница между образцами, чем гистограммы могут привести к мысли. Это связано с тем, что BDC3 не учитывает количество органоидов аутофагии, которые локализуются локально, что приводит к значительной степени изменчивости числа аутофагосом для одного и того же показателя BDC3. В большинстве случаев существует перекрытие между всеми тремя зондами, потому что даже на базальных уровнях p62, LAMP1 и LC3 должны, в определенной степени, локализоваться или находиться в аналогичных областях в клетках. В качестве контраста примером трех зондов, которые не следует локализовать, являются анти-p62-AF488, анти-LC3-AF647 и DAPI ядерный краситель для образца Starved + Chloroquine, показанный на рисунке 6. </ Р>
Когда функция подсчета пятен и функция BDC3 объединены, очевидна наличие различных субпопуляций, которые улучшают способность различать различные образцы / условия. На рисунке 7 показан двумерный график подсчета пятен LC3 по сравнению с BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 для четырех образцов: контроль, контроль + хлорохин, голодный и голодный + хлорохин. Образец контроля использовался для определения стратегии стробирования для трех групп населения: низкие точки, высокие точки / низкий уровень BDC3 и высокие точки / высокий уровень BDC3. Контрольные образцы показали, что более 98% клеток имели 1 или меньше пятен. Граница между High Spots / Low BDC3 и High Spots / High BDC3 была установлена в балл BDC3, равный 1, потому что более 91% контрольной выборки имели показатель BDC3 меньше 1. Краткое изложение результатов для двумерных графиков Показан в таблице 1 .
возраст = "1"> 
Рисунок 1: Настройка инструмента MIFC. Снимок экрана настроек инструмента MIFC, используемых для этого эксперимента, описанных на шаге 8 протокола. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия стратегического анализа программного обеспечения. Снимок экрана схемы построения программного обеспечения анализа, описанной на шаге 9 протокола. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Маскирование пятен LC3. Изображения и маски ячейки Jurkat, используемые для создания функции подсчета очков. Показаны BrightField (BF), LC3-AF647, пик (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), пик (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), пик (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) и Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Маска, которая лучше всего работала для всех отображаемых ячеек, была Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистограммы подсчета пятен LC3. Используя функцию spot-count Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 и гистограммы подсчета пятна LC3-AF647 для управления ( A , светло-синий), Control + ChloroquinE ( B , синий), голодный ( C , розовый) и голодный + хлорохин ( D , красный). Среднее значение пятна для контроля, контроля + хлорохина, голодающего и голодающего + хлорохина составляет 0,07, 1,13, 0,10 и 2,77 соответственно. BF, LC3-AF647 (красный), ядерный краситель DAPI (синий) и композит изображений LC3-AF647 и DAPI репрезентативных клеток для среднего количества пятен показаны для контрольных ( E , 0 пятен), Control + Chloroquine ( F , 1 пятно), голодные ( G , 0 пятен) и голодный + хлорохин ( H , 3 пятна). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистограммы BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. Гистограммы BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 дляR Контроль ( A , голубой), контроль + хлорохин ( B , синий), голодный ( C , розовый) и голодный + хлорохин ( D , красный). Средний балл BDC3 для Control, Control + Chloroquine, Starved и Starved + Chloroquine равен 0,57, 0,82, 0,74 и 0,98 соответственно. BF; P62-AF488 (зеленый); LAMP1-PE (желтый); LC3-AF647 (красный); И композиция изображений p62-AF488, LAMP1-PE и LC3-AF647 репрезентативных клеток для среднего BDC3 показана для Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) и Starved + Chloroquine ( H ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Гистограммы BDC3 p62 / LC3 / DAPI для образца голодающего + хлорохина. ( A ) показана гистограмма BDC3 p62 / LC3 / DAPI для образца Starved + Chloroquine. Средний балл BDC3 равен 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (зеленый); LC3-AF647 (красный); DAPI (синий); И композиция изображений p62-AF488, LC3-AF647 и DAPI репрезентативных клеток для среднего BDC3 показана для образца Starved + Chloroquine. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Двумерные графики LC3 Spot Count против BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Двумерные графики подсчета пятен LC3 по сравнению с BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 для контрольных, контрольных + хлорохиновых, голодных и голодных клеток + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (зеленый); LAMP1-PE (желтый); LC3-AF647 (красный); И композиция изображений p62-AF488, LAMP1-PE и LC3-AF647 из трех областей ( то есть Low Spots, High Spots / Low BDC3 и High Spots / High BDC3) показаны для образца Starved + Chloroquine. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Количество клеток | Яркая деталь Colocalization 3 Средняя | Точечный отсчет LC3 Средний | % Низкое пятно | % High Spot / Low BDC3 | % High Spot / High BDC3 | |
| контроль | 439 | 0,57 | 0,07 | 98,2 | 1,8 | 0.0 |
| Контроль + Хлорохин | 1432 | 0,82 | 1,13 | 68,9 +19,5 | 11,7 | |
| изморенный голод | 1204 | 0,74 | 0,10 | 98,4 | 0.6 | 1,0 |
| Голодный + Хлорохин | +1811 | 0,98 | 2,77 | 32,1 | 36,9 | 31,0 |
Таблица 1: Сводка числа пятен Jurkat LC3 против BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Двухуровневый график
Discussion
При выполнении этого анализа необходимо рассмотреть несколько вещей. Важно иметь соответствующие контрольные образцы. Для этого эксперимента использовались два разных контроля: контроль и контроль + хлорохин. Образец контроля использовался для установки порога для регионов. Он представляет собой базальный уровень аутофагии, не останавливая лизосомальную деградацию, и является контрольным образцом для голодания. Однако контрольный образец не является подходящим контролем для сравнения с результатами образца Starved + Chloroquine, поскольку сам хлорохин влияет на контрольный образец. Поэтому необходимо было иметь контрольный образец + Хлорохин.
Прежде чем выполнять какой-либо анализ для аутофагии, важно только проанализировать / заблокировать отдельные ячейки, которые находятся в фокусе ( т. Е. Градиент RMS больше 60), поскольку результаты могут быть затронуты, если имеется более одной ячейки или изображения Вне фокуса. Крайне важно, чтобы аутофагосомEs и лизосомы находятся в центре внимания для правильного подсчета точек и анализа BDC3. Апоптотические клетки должны быть удалены до анализа аутофагии, поскольку они могут искажать результаты и не должны включаться. Должно быть соответствующее окрашивание для всех трех маркеров ( например , LC3, p62 и LAMP1). Например, все три маркера являются внутриклеточными и должны иметь точечный сигнал; Если сигнал не точечный или если он находится на поверхности клетки, окрашивание не будет подходящим, и эксперимент / окрашивание следует переделать. Кроме того, для того, чтобы BDC3 был точным, важно затворить ячейки, которые ярки для всех трех флуоресцентных маркеров, представляющих интерес. Для предотвращения измерения BDC3 на неспецифических связываниях, визуализационных артефактах и / или шуме необходимо провести стробирование на позитивных событиях. Это имеет решающее значение, поскольку BDC3 может потенциально усиливать артефакты, которые не являются истинными сигналами. Поскольку BDC3 может выполняться только на ярких позитивных событиях, многие клетки не могут быть включены в окончательный анализ; Это especЧто верно для контрольных клеток, которые не имеют накопления LC3, p62 и / или LAMP1. Таким образом, ограничение этого анализа состоит в том, что BDC3 рассматривает только клетки, которые являются положительными для всех трех маркеров, что может быть неприемлемым для всех экспериментов с аутофагами.
Подобно BDS, о котором ранее сообщалось 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , только BDC3 не учитывает количество органоидов аутофагии, которые локализуются, что в значительной степени Вариабельности числа аутофагосом. Поэтому двумерный подход, представленный Rajan et al. работал. Рассматривая двумерные сюжеты, можно спросить,Ячейки должны быть положительными для LC3, p62 и LAMP1; Почему так много клеток, у которых есть 0 пятен? Это связано с тем, что сигнал LC3 может быть достаточно ярким для совместной локализации, но он может не соответствовать порогу, установленному пиковой маской (пик (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)), необходимый для того, чтобы он считался место.
В представленном здесь протоколе используется MIFC для подсчета LC3 puncta и ко-локализация трех маркеров аутофагии для измерения аутофагического потока. В базовых условиях (контрольный образец) количество аутофагосом было низким, и было найдено несколько клеток с «высокими пятнами». С добавлением хлорохина, который ингибирует синтез аутофагосомы / лизосомы, наблюдалось увеличение количества пятен LC3. Так как лизосома неспособна разрушить аутофагосому и p62, которая находится в аутофагосоме, это приводит к увеличению колокализации скопления аутолизосом LC3, p62 и LAMP1. Этот эффект усиливали при питании starvatИон, который индуцирует аутофагию. Однако без добавления хлорохина не было значительного увеличения числа аутофагосом, что, скорее всего, связано с увеличением скорости аутофагиального оборота. Когда клетки подвергались голоданию в присутствии хлорохина, наблюдалось увеличение колокализации и количества аутофагосом, что подтверждает вывод о том, что голодание увеличивает аутофагический поток. Известно, что EBSS является мощным индуктором аутофагии. Поэтому ожидается, что увеличение будет большим. Если для индукции аутофагии используется другой метод, такой как индукция лекарственного средства, разница между контрольным и обработанным образцами может быть более тонкой.
Этот конкретный протокол был разработан для измерения аутофагии в клеточных линиях человека, но анализ можно было бы адаптировать к другим видам путем переключения на антитела для этих конкретных видов. Кроме того, метод анализа может быть использован для любого внутриклеточного применения, которое требует совместной локализацииИз трех зондов / маркеров.
Disclosures
Я работаю MilliporeSigma, создателем бренда Amnis ImageStream, который использовался в этом исследовании.
Acknowledgments
Я хотел бы поблагодарить своих коллег в MilliporeSigma, Philip J. Morrissey и Sherree L. Friend за их поддержку и руководство на протяжении многих лет. Я также хотел бы поблагодарить Видью Венкатачалама и Брайана Р. Дэвидсона за помощь в использовании функции BDC3 в программном обеспечении IDEAS , Ryan P. Jessup, для помощи в редактировании этой рукописи, Raymond Kong за помощь в день съемок, и особое спасибо Визажисту Синтии Xamonthiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
| anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
| anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
| anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
| Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
| Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
| Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| DAPI Stain 5 mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
| Earle's Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14155 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14175 | |
| Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
| MIFC analysis software - IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
| MIFC software - INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
| PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x | HyClone | SV30082.1 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
| Sodium Pyruvate solution (100 mM) | HyClone | SH30239.01 | |
| Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| System Calibration Reagent - SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
| Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |
References
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
- Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
- Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
- Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
- Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
- Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
- Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
- Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
- Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
- Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
- Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
- Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
- Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
- Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
- Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
- Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
- Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
- Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
- Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
- Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
- Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
- Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
- IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).
