Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55637
Automatic Translation
1
1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

Summary

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Abstract

Otofaji, büyüme ve farklılaşma esnasında biriken normal veya işlevsel olmayan hücresel bileşenlerin lizozom ile parçalanması ve geri dönüşüme tabi tutulduğu katabolik bir yoludur. Otofaji sırasında, sitoplazmik LC3 proteini lipidize edilir ve otofagosomatik membranlara işe alır. Otofagozom daha sonra autosfosome vezikülün parçalanması ve içeriğinin bulunduğu otolizozomu oluşturmak için lizozom ile birleşir. LC3'e bağlanan ubiquitin ile ilişkili protein p62, otofajik akıyı izlemek için de kullanılır. Otofajyondan geçen hücreler, p62, LC3 ve lizozomal belirteçlerin birlikte lokalizasyonunu göstermelidir. İmmünofloresan mikroskobu, LC3 punktasını, p62'yi ve / veya lizozomları hücre başına bazında görsel olarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, objektif ve istatistiksel olarak titiz bir değerlendirme yapmak zor olabilir. Bu problemlerin üstesinden gelmek için multispektral görüntüleme akım sitometrisi ve parlak de-Üç otofaji belirteçlerinden (LC3, p62 ve lizozomal LAMP1) kuyruk görüntüleri üretir ve otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için LC3 nokta sayımı ile kombinasyon halinde birlikte lokalizasyonunu nicelendirir.

Introduction

Bundan sonra otofajinin olarak anılacaktır Macroautophagy, zarar görmüş ya da işlevsel parçalar, uzun ömürlü proteinler ve organeller lizozom ile parçalanan ve 1 geri dönüştürülür edildiği bir katabolik geçiş yoludur. Otofaji, bir otofagosom oluşumunu içeren dinamik, çok aşamalı bir süreçtir; Otoflikozomun lizozom ile kaynaşması, otolizozomun oluşturulması; Ve otolizozomun içeriğinin bozunması 2 . Membran sistemlerinde otofajiyi tanımlamak için kullanılan kritik biyolojik belirteç otofajozomal membranı oluşturan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) 'dur. Otofaji sırasında sitosolik LC3-1, LC3-II oluşturmak üzere fosfatidiletanolamine konjüge edilir; Daha sonra LC3-II, otofajozomal zar 3 içine dahil edilir. Otofajik akı için yaygın olarak kullanılan bir diğer marker, otofaj reseptör sekestozomu 1 (SQSTM1, p62) olup, bunlar fiziksel olarak liAutophagic membran 4 , 5'e otofajik yük getirir.

Geleneksel olarak otofajiyi ölçmek için kullanılan yöntemler Western lekeleri ve floresan mikroskobu 7'dir . Ancak bu yöntemlerin hiçbirinin "altın standart" olarak kabul edilir 2, bu tekniklerin her ikisi ile ilişkili zorluklar vardır 6 olarak. Western lekeleri ortalama verir çünkü homojen bir örnek kullandıklarından, gözlemciler tek tek hücrelerde neler olduğunu göremezler. Öte yandan, flüorür mikroskobu, tek hücre seviyesinde bir gözlemci bilgi verir, ancak, objektif ve istatistiksel olarak titiz değerlendirmelerin elde edilmesini zorlaştıran üretim kapasitesinden yoksundur. Son yıllarda, multispektral görüntüleme akış sitometrisi (MIFC, Malzeme Tablosuna bakınız) ile LC3 ve p62 ölçümü popülasyon kazanmaktadırNiceliksel gücü, yüksek işleme kapasitesi, çoklama potansiyeli ve her hücrenin imajını oluşturma yeteneği nedeniyle çok sayıda. Otofaji kendi kendine analiz yazılımıyla (bkz . Malzemelerin Tablosu ) birlikte kullanarak otofajiyi ölçmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biri, LC3 punktasının veya otofagozomların 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14'ün nokta sayımı yoluyla yapılır , 15 , 16 , 17 . Bununla birlikte, otofagozomlarda bir artış, mutlaka, otofajide bir artış olduğu anlamına gelmez çünkü süreçte bir blokaj da gösterebilir 2 . LC3-II cirosu, varlıklardaki hücreleri analiz ederek otofajik akıyı ölçmek için yararlı bir parametredir veKlorosin gibi bir lizozomal bozunma önleyicisinin bulunmaması. Klorokuin, böylece 18 oluşabilir lizozomal bozulması önce otofajik akı durdurulması ile otofajinin derecesinin bir ölçüsü olarak, otofagozom oluşumunun miktarının belirlenmesine izin veren lizozoma otofagozom füzyonunu inhibe eder. Buna ek olarak, p62 öncelikle otofaji ile bozundur ve otofagozomun ve içeriğinin lizozomal parçalanması engellendiğinde, p62'nin birikimi 17 , 19 olması beklenir.

Otofaji çok aşamalı bir süreçtir ve LC3 veya p62'nin tek başına ölçümü, hücrelerde olup bitenenin tam bir resmini vermez. Yakın tarihli yayınlar, otolizozomun eşzamanlı oluşumunu inceleme ihtiyacını vurgulamıştır 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - lizozom 15 otofagozom ko-lokalizasyonunu görüntüleme ile autolysosome oluşumunu ölçmek için benzersiz mümkün. Buna ek olarak, P62 ve MIFC kullanılarak LC3 eş yerleşimi de otofajik akı 5 ölçmek için incelenmiştir. Referans analiz yazılımında, birlikte yerelleştirmeyi ölçen "özellik", "Parlak Detay Benzerliği R3" (BDS) olarak adlandırılır ve iki görüntünün küçük, parlak görüntü ayrıntılarını karşılaştırmak için özel olarak tasarlanmıştır. BDS, 3 piksel veya daha düşük bir yarıçapa sahip lokalize parlak noktaların log dönüşümlü Pearson korelasyon katsayısıdır; Başka bir deyişle, BDS hesaplar o derecesiİki farklı flüoresan kanalından pikseller verlapping. Parlak noktalar ya birbiriyle ilişkilendirilir (diğer bir deyişle, aynı uzaysal konum) veya ilişkisizdir ( yani, farklı uzaysal yerler). Bu nedenle korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı aralığı sıfırdan sonsuza 26 , 27'ye çıkarmak için log dönüşümlüdür. BDS tek başına yeterli olmayabilir; Rajan ve ark. Sadece BDS'nin kullanılması yanlış-pozitif veya yanlış-negatif sonuçlara neden olabileceğini bulmuştur 21 . BDS, otofajinin iki belirteçinin birlikte lokalizasyonunu değerlendirir, ancak otofagozom sayısını dikkate almaz. Otofagozom sayısını açıklamak için Rajan ve ark. LC3 puncta 21'in nokta sayımını içermektedir. Rajan ve ark. BDS'ye karşı LC3 nokta sayımının bir iki değişkenli dağılım grafiğini kullanarak önerdi. Bu iki değişkenli arsa kullanılarak iki popülasyonİlk tanımlanan: biri yüksek seviyede LC3 lekelerine sahip hücreler ve diğeri düşük seviyeli LC3 lekelerine sahip hücreler. Yüksek eş-lokalizasyonu (yani otolizozomlara birikmesi), düşük (diğer bir deyişle, otofagozomların birikmesi) eş-lokalizasyonu ve hücreler ile hücrelerin: Yüksek LC3 nokta popülasyonu ayrıca iki popülasyona sınıflandırılmıştır. Bu iki değişkenli arsa, az sayıda otofagozomlu hücreler ile otofagozom birikimi ve / veya otolizozomlar 21 olan hücreleri ayırt etmeyi sağlar.

Şimdiye kadar, LC3, p62 ve LAMP1'in (lizozomal markör) eş zamanlı birlikte lokalizasyonu, MIFC tamamlayıcı analiz yazılımında tek bir "Özellik Türü" kullanarak mümkün değildi (Malzeme Tablosuna bakın). Bununla birlikte, kısa süre önce 6.1 sürümünde tanıtılan yeni bir özellik, Parlak Ayrıntı Ayrıntılı Yerleştirme 3 (BDC3) olarak adlandırılır. BDC3, üç görüntünün her birinden parlak ayrıntı resimlerini karşılaştırır (bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1) ve üç sondanın birlikte lokalizasyonunu niceleştirir ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). BDC3 özelliği, Pearson korelasyon katsayısını üç görüntüye kadar genişletmek için hesaplar. Üç görüntünün parlak noktaları ya korelasyonlu ya da korelasyonsuz olduğundan, korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı, 0 ile sonsuz arasındaki dinamik aralığı arttırmak için günlüğe dönüştürülür. BDS özelliğini BDC3 özelliğiyle değiştirerek, Rajan ve ark. Tarafından sunulan analiz yöntemi, Autophagy'yi aynı anda bir sistemde ölçmek için en çok kullanılan üç markörü bir araya getirebilir. Otofajinin bu üç belirteçinin tek bir deneyde birlikte lokalize edilmesi, otofajinin indüksiyonunda ve düzenlenmesinde yeni anlayışlara yol açabilir. Aşağıdaki protokol, Jurkat hücrelerinde otofaji indirecek adımları özetlemektedir; Hücreleri LC3, p62 ve LAMP1 antikorları ile etiketleyin; Multisp hakkında veri edininEktral görüntüleme akış sitometresi; Ve otofajik akıyı değerlendirmek için verileri analiz eder.

Protocol

1. Kültür ortamı ve Lizozomal Degradasyon İnhibitörünün Hazırlanması

  1. 1.1. ~ 500 mL 1x RPMI kültür ortamı yapın. 5 mL'lik MEM gerekli olmayan amino asitler (100x), 5 mL sodyum piruvat (100 mM), 5 mL penisilin-streptomisin-glutamin (100x) ve 25 mL fetal sığır serumu (FBS) 500 mL Şişe RPMI - 1640 1x orta. Ortam, biyogüvenlik kabininde hazırlanmalıdır. RPMI kültür ortamını 2-8 ° C'de saklayın. Jurkat hücrelerine eklemeden önce RPMI kültür ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
  2. 100 mM klorokin, lizozomal degradasyon inhibitörü yapın. 0.05 g klorokin difosfat tuzunu tartın ve 15 mL'lik santrifüj tüpünde 1 mL hücre kültürü dereceli suya ilave edin. Klorokin çözülene kadar girdap.

2. Hücrelerin Kültürlenmesi

  1. Jurkat hücrelerinin kültür 80 ml 37 ° C'de RPMI kültür ortamında E6-1 klonlanması ve% 5 CO2.
    NOT: Hücreleri kültürlerkenVeya sabitlemeden önce Jurkat hücreleriyle çalışmak için tüm çalışmalar biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
  2. Otofaji indüklemeden önce, bir hemositometre veya başka bir hücre sayım cihazı kullanarak Jurkat hücrelerini sayarak hücreleri / mL'yi belirleyin.

3. Hücrelerde Otofaji İndükleme

  1. Jurkat hücrelerini üstel büyüme evresinde alın ve her biri 50 mL'lik santrifüj tüplerinde 20 mL'lik dört numuneye bölün. Tüpleri "Kontrol", "Kontrol + Klorokin", "Starved" ve "Starved + Chloroquine" olarak etiketleyin.
    Not: Jurkat hücreleri 2.5-5 x 10 5 hücre / mL'lik bir konsantrasyona sahip olmalıdır.
  2. Her bir numuneye Ca 2+ veya Mg 2+ (HBSS) içermeyen 30 mL Hank Dengeli Tuz Çözeltisi ilave ederek hücreleri yıkayın. 10 dakika 250 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çöp bidonuna boşaltın.
  3. Kontrol numunelerini RPMI kültür ortamının 20 mL'sinde, 25 mL'lik bir sıvıyı kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar süspanse edinTerile tek kullanımlık pipet ile hafif vorteks oluşturma izledi. Benzer şekilde, aç kalmış örnekleri, Ca 2+ veya Mg 2+ (EBSS) olmaksızın 20 mL Earle Dengeli Tuz Çözeltisinde tekrar süspanse edin.
  4. 25 mL'lik steril tek kullanımlık bir pipet kullanarak, kontrol ve aç bırakılmış örnekleri "Kontrol", "Kontrol + Kloroquin", "Starved" ve "Starved + Chloroquine" olarak etiketlenmiş T75 şişelerine aktarın.
  5. "Control + Chloroquine" ve "Starved + Chloroquine" şişelerindeki 20 ml'lik hücre kültürü ortamına 20 μL 100 mM klorokin ekleyin. Şişeyi yavaşça döndürerek klorokuinle karıştırın. 2 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatöründe tüm şişeler yerleştirin.

4. LC3, LAMP1 ve p62'nin Tespiti ve Etiketlenmesi için Tamponların Hazırlanması

  1. PBS 10 mL% 4 formalin fiksasyon çözeltisi hazırlayın. 1 mL 10x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlanmış 4 mL'lik% 10'luk formalin stokunu ekleyin15 mL'lik bir santrifüj tüpünde Ca 2+ veya Mg 2+ (PBS) içermeyen tuzlu su çözeltisi ve 5 mL ultra saf su.
    NOT: DİKKAT. Formül / formaldehit, solunması veya yutulması durumunda toksiktir; Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş edicidir; Ve solunduğunda veya cilt ile temasında alerji yapabilir. Gözler için ciddi hasar riski vardır. Potansiyel bir kanserojen.
  2. PBS 10 mL% 1 formalin son tekrar süspansiyon çözeltisi hazırlayın. 15 mL santrifüj tüpünde 9 mL 1x PBS'e 1 mL% 10 formalin stok ekleyin.
  3. 1x PBS 500 mL'lik bir şişeye 10 mL FBS ekleyerek 500 mL yıkama tamponu hazırlayın.
  4. Adım 4.3'te hazırlanan 49.5 mL yıkama tamponuna% 0.5 triton X-100 0.5 mL ekleyerek 50 mL santrifüj tüpüne 50 mL permeabilizasyon tamponu hazırlayın.
  5. S-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) antikoru / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonunu, 5 μL anti-SQSTM1 / p62-AF488 ilâve edilerek 495 μL permeabilizasyon tamponuna ilave ederek hazırlayınTepe 4.4. Nihai antikor konsantrasyonunun 5 μg / mL olduğundan emin olun.
    NOT: Antikor permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonunu numuneye eklemeden hemen önce yapın. Çözümü ışığa karşı koruyun.
  6. Adım 4.4'te hazırlanan permeabilizasyon tamponunun 495 μL'sine 5 μL fare anti-LC3 ekleyerek fare anti-LC3 / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonu hazırlayın. Nihai antikor konsantrasyonunun 20 μg / mL olduğundan emin olun.
    NOT: Numuneye eklenmeden önce antikor permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonları yapın. Çözümü ışığa karşı koruyun.
  7. Adım 4.4'te hazırlanan permeabilizasyon tamponunun 495 μL'sine AF647 etiketli eşek anti-fare - IgG'nin 5 μL'sini ekleyerek eşek anti-fare-Alexa 647 (AF647) / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonu hazırlayın. Nihai antikor konsantrasyonunun 20 μg / mL olduğundan emin olun.
    NOT: Antikor permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonunu hemen numuneye eklemeden önce yapın. KoruIşıktan çözüm.
  8. Adım 4.4'te hazırlanan permeabilizasyon tamponunun 475 μL'sine 25 μL anti-CD107a (LAMP1) -PE ilave ederek anti-insan CD107a (LAMP1) -PE antikoru / permeabilizasyon tamponu çalışma çözeltisi hazırlayın. Nihai antikor konsantrasyonunun 21 ug / mL olduğundan emin olun.
    NOT: Antikor permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonunu hemen numuneye eklemeden önce yapın. Çözümü ışığa karşı koruyun.
  9. 1x PBS 896 μL 5 mg / mL DAPI ve 100 μL% 10 triton X-100 4 uL ekleyerek 10x DAPI nükleer leke hazırlayın.

5. Jurkat Hücrelerinin LC3, LAMP1 ve p62 ile etiketlenmesi

  1. Örnek başına 2 x 10 6 hücre çıkarın (adım 2.2'deki hücreleri sayın). Her numuneyi, uygun numune adı ile etiketlenmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ( örn. Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved veya Starved + Chloroquine).
    1. Orada yıkama tamponu ekleyin, böylece iHer 15 mL santrifüj tüpünde toplam 15 mL hacim. Örnekleri 250 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire.
  2. Hücre pelletlerinin her birine 100 μL% 4 formalin fiksasyon solüsyonu ekleyin. Bir P200 pipetle aşağı yukarı pipetle tekrar süspansiyon haline getirin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sabitleme adımı sırasında numuneleri etiketli, silikonlu polipropilen mikro santrifüj tüplerine aktarın.
    NOT: Hücreleri aşırı ısınmamaya özen gösterin; Bu zayıf etiketleme sonuçlarına neden olabilir.
  3. 10 dakika fiksasyon adımından sonra, her bir numuneye 1 mL yıkama tamponu ekleyin. Numuneyi karıştırmak için P1000 pipetle aşağı ve yukarı pipetleyin. 5 dakika boyunca 250 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire.
  4. Her numuneye 100 μL anti-SQSTM1 / p62-AF488 antikoru / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonu ekleyin. Bir P200 pipetle aşağı yukarı pipetle tekrar süspansiyon haline getirin. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri 1 mLPermeabilizasyon tamponu her numuneye uygulanır. Numuneyi karıştırmak için P1000 pipetle aşağı ve yukarı pipetleyin. 5 dakika boyunca 250 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire.
  6. Antikor çalışma çözümlerinin her biri için 5.4-5.5 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Antikor çalışma solüsyonları fare anti-LC3 / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonu, eşek anti-fare-AF647 / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonu ve anti-insan CD107a (LAMP1) -PE antikoru / permeabilizasyon tamponu çalışma solüsyonudur. Her bir antikor ayrı ayrı ve listelenen sırayla yapılmalıdır. Sipariş, antikorlar arasındaki istenmeyen çapraz reaktiviteyi en aza indirgemek üzere seçildi.
  7. 100 uL% 1 formalin solüsyonu ilave edin. Bir P200 pipetle aşağı yukarı pipetle tekrar süspansiyon haline getirin. Her bir numuneye 10 uL 10x DAPI nükleer lekesi ilave edin. Karıştırmak için her numuneyi hafifçe vorteksleyin. Cihaz üzerindeki örneklerden herhangi birisini çalıştırmadan önce oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta inkübe edin.
    NOT: Bu noktada örnek, ya bMIFC üzerinde çalışır veya 2-8 ° C'de ışığa karşı korunarak bir haftaya kadar depolanır.

6. Tek Renkli Kontrollerin Etiketlenmesi

  1. Her tek renkli kontrol ( örn. AF488, PE, AF647 ve DAPI) için, örnek popülasyonlardan herhangi birinden elde edilen 1 x 10 6 Jurkat hücresi alın. AF488, PE, AF647 veya DAPI olarak etiketlenmiş 15 mL santrifüj tüplerine 1 x 10 6 hücre koyun.
  2. Her bir 15 mL'lik santrifüj tüpünde toplam 15 mL'lik bir hacim olacak şekilde yıkama tamponu ekleyin. Örnekleri 250 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire.
  3. AF488, PE ve AF647 tüplerine 100 μL yıkama tamponu ekleyin.
    Not: DAPI tüpü için adım 6.8'e gidin.
    1. Bir P200 pipetle aşağı yukarı pipetle tekrar süspansiyon haline getirin. 1.5 mL tüplere aktarın.
  4. Sırasıyla AF488, PE veya AF647 tüplerine 5 μL anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE veya anti-CD45-AF647 ekleyin. Karıştırıp karıştırarak lightly.
  5. AF488, PE ve AF647 tüplerini oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Anti-CD45 antikorları yerine LC3, p62 ve LAMP-1 antikorları gibi diğer işaretleyiciler kullanılabilir. Bununla birlikte, CD45, tek renkli kontroller için güvenilir bir işarettir.
  6. Her numuneye 1 mL yıkama tamponu ilave ederek AF488, PE ve AF647 hücrelerini yıkayın.
    1. Numuneyi karıştırmak için P1000 pipetle aşağı ve yukarı pipetleyin. 5 dakika boyunca 250 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire.
  7. 100 uL% 1 formalin solüsyonu ilave edin. Bir P200 pipetle aşağı yukarı pipetle tekrar süspansiyon haline getirin.
    NOT: Bu noktada numune, MIFC üzerinde çalıştırılabilir veya 2-8 ° C'de ışığa karşı korunarak bir haftaya kadar saklanabilir.
  8. DAPI tüpüne 100 uL% 1 formalin fiksasyon solüsyonu ekleyin.
    1. Bir P200 pipetle aşağı yukarı pipetle tekrar süspansiyon haline getirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    2. 10 ekle1; L, 10x DAPI nükleer lekesi DAPI örneğine. Karıştırmak için hafif girdap. Cihaz üzerinde çalıştırmadan önce oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
      NOT: Bu noktada numune, MIFC üzerinde çalıştırılabilir veya 2-8 ° C'de ışığa karşı korunarak bir haftaya kadar saklanabilir.

7. MIFC'yi Başlatma ve Kalibre Etme

  1. Kılıfın, sistem kalibrasyon reaktifinin ( Malzeme Tablosuna bakınız), kabarcık giderici, temizleyici ve sterilizatör kaplarının dolduğundan ve atık deposunun boş olduğundan emin olun. Değilse, kutuları doldurun ve atık depolarını boşaltın.
  2. Sistemi çalıştırın ve uygulamayı başlatmak için yazılımı açın ( Malzeme Masasına bakın) simgesine çift tıklayın; Bu MIFC yazılımını başlatacaktır.
  3. Başlangıç düğmesini tıklayın ve tüm kalibrasyon ve testleri başlat'ın seçili olduğundan emin olun. Bu, sistemi, yük kılıfını, sistem kalibrasyon reaktifini,Ve sistemi kalibre edin.

8. MIFC'de Örnekleri ve Tek Renkli Kontrolleri Çalıştırma

  1. Dosya sekmesine gidip Varsayılan Şablon Yükle'yi seçerek varsayılan şablonu yükleyin .
    NOT: Varsayılan şablon ham maksimum piksel nokta arsalarını içerir.
  2. İlgili düğmelerine tıklayarak 488 nm, 405 nm, 642 nm ve SSC lazerleri açın. Her lazer düğmesinin yanındaki istenen gücü girerek lazer gücünü ayarlayın. Bkz. Şekil 1 .
    NOT: Bu deney için, sırasıyla 488 nm, 405 nm, 642 nm ve SSC için lazer güçleri sırasıyla 200 mW, 20 mW, 150 mW ve 5 mW'dır (Ch06). MIFC varsayılan şablon büyütme değeri 40X olarak ayarlandı, varsayılan hassasiyet Hi ve tüm kanallar etkinleştirildi.
  3. Büyütme kaydırıcısının 40X olarak ayarlandığını, yüksek hassaslık modunun seçildiğini ve tüm kanalların resim galerisinde gösterildiğini onaylayın; Şekil 1
  4. Yük düğmesini tıklayıp enstrümanın üzerine 1,5 mL tüp yerleştirerek "Starved + Chloroquine" örneğini yükleyin .
    NOT: Bu deneysel örnek, AF488, PE ve AF647 için tüm örneklerin en yüksek sinyaline sahip olmalıdır (DAPI sinyalinin "Starved + Chloroquine" örneği dahil olmak üzere tüm deneysel örnekler için yaklaşık aynı sinyal gücü olmalıdır).
  5. 488 nm, 405 nm, 642 nm ve SSC lazerler için uygun lazer güçlerinin ayarlandığını onaylamak için "Starved + Chloroquine" örneğini kullanın. Sinyallerin güçlü olmasına, ancak CCD kamera üzerinde doyurulacak olan 4,096 ham maksimum piksel değerine ulaşmamak için lazer güçlerini ayarlamak için varsayılan şablonun ham maksimum piksel nokta plotlarını kullanın. Tüm deney numuneleri için bu lazer ayarını kullanın.
  6. Yeni bir nokta çizimi oluşturmak için Nokta Paftalari Oluştur simgesini tıklayın. "Alan_M'yi seçin01 "ve" tüm "popülasyon için Y ekseni üzerindeki" Aspect Ratio_M01 "'e tıklayın Poligon Bölgesi Oluştur simgesine tıklayın Hücrelerin etrafına bir bölge çizin Bu bölgeye" Hücre "adını verin.
    NOT: Kullanıcılar toplanan hücreleri daraltmak için ek çizikler ve bölgeler ekleyebilirler. Odaklanmış olan hücreleri tanımlamak için eklenecek ek bir komplo Gradient RMS olacaktır.
  7. Edinim parametrelerini ayarlayın. Dosya adını ve hedef klasörü belirtin, olay sayısını "5,000" olarak değiştirin ve "Hücre" toplama popülasyonunu seçin. Dosyayı edinmek için Edin düğmesini tıklayın. Dosyayı topladıktan sonra, Geri Dön düğmesini tıklayarak numuneyi iade edin. Örnek tüpünü aletten çıkarın.
  8. Sonraki üç örnek için ("Starved", "Control" ve "Control + Chloroquine"), numune yükleyin, numune adını girin, numuneyi alın ve numuneyiYukarıdaki "Starved + Chloroquine" örneği için.
  9. Numuneler edinildikten sonra, tek renk kontrol örneklerini çalıştırın ve bir tazminat matrisi yapılabilmesi için veri edinin. SSC düğmesini tıklayarak SSC lazerini kapatın. Parlaklık düğmesini tıklayarak ve KAPALI'yı seçerek parlak alan kanallarını kapatın .
    NOT: Deneysel örnek edinmek için resim galerisinde kanallar çıkarıldıysa, tüm kanalları yeniden etkinleştirin. Alternatif olarak, tek renkli kontroller, Tazminat sekmesini tıklayıp Matris Oluştur'u seçerek elde edilebilir ; Bu dosyalar toplama ve bir kompanzasyon matrisi hazırlama aşamasında ilerleyecek olan tazminat sihirbazını açar.
  10. DAPI tek renk denetimini Load (Yükle) düğmesine tıklayıp enstrüme 1,5 mL tüp yerleştirerek yükleyin. Örnek adını girin (yalnızca DAPI), toplama popülasyonunu "Tümü" olarak ayarlayın ve etkinlik sayısını değiştirinS'den "500" e kadar
    1. Tek renkli kontrol dosyasını edinmek için Edin düğmesini tıklayın.
    2. Dosya toplama işlemi tamamlandığında, Geri Dönüş düğmesini tıklatarak örnek döndürür . Örnek tüpünü aletten çıkarın.
    3. DAPI örneğinden sonra, Yük düğmesini tıklatarak ve 1.5 mL'lik bir tüpte 100 μL% 10'luk ağartıcı yükleyerek bir örnek gibi% 10 çamaşır suyu yükleyin . Örnek 15 s kadar çalıştırılsın. Bu, borudaki kalan DAPI'yı kaldıracaktır.
    4. Artık% 10 beyazlatıcıyı çıkarmak için 8.10.3'de olduğu gibi 100 uL 1x PBS'yi çalıştırın. Cihaz şimdi AF488, PE ve AF647 tek renkli kontrolleri çalıştırmaya hazırdır.
    5. Tek renkli kontrollerin her biri için ( örn. AF488, PE ve AF647) 8.10-8.10.2 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Bu örnekler arasında% 10 beyazlatma veya PBS çalıştırmaya gerek yoktur, yalnızca DAPI tek renk kontrolü sonrasında.

9. MIFC'de Veri AnaliziAlysis Yazılım

  1. MIFC analiz yazılımını başlatın (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Dosya Aç Sihirbazını başlatmak için Analiz Başlat'a tıklayın. Açılacak veri dosyasını "Starved + Chloroquine" ham resim dosyasına (.rif) göz atarak seçin. Dosyayı seçin ve Aç düğmesini tıklayın. İleri 'yi tıklayın.
    1. Tazminat uygulayın. Önceden oluşturulmuş bir tazminat matris seçin ve İleri'ye tıklayın. Alternatif olarak, Yeni Matris düğmesini tıklayarak yeni bir kompanzasyon matrisi oluşturun.
      NOT: Adımlar 9.2.1.1-9.2.1.2, yeni bir matris oluşturmak için gereken adımlardır.
      1. Tek renkli kontrol dosyaları ekleyin (yani DAPI sadece AF488 sadece PE sadece ve AF647 için), Add Files tıklayarak dosyaları seçerek ve Aç düğmesini tıklayarak Kontrol Dosyalar listesine. İleri 'yi tıklayın.
      2. Bu denemede Create Compensation Matrix penceresi görünür. ensurCH02, Ch03, CH07 ve Ch11 seçilir ve İleri'ye tıklayın e. Tazminat matrisi oluşturulacaktır. Tazminat matrisini kaydetmek için Son'u tıklayın. Dosya Aç Sihirbazı tazminat dosyası ekleyin ve İleri'yi tıklayın.
    2. Analiz şablonunu uygulayın. Bu aşamada, uygulamak, İleri seçeneğini tıklatarak hiçbir analiz şablonu vardır.
      NOT: Diğer deneysel dosyalar için bu "Starved + Chloroquine.daf" dosyası şablon olarak kullanılabilir.
    3. Dosya ( "rif" adları ile gelen dosya adları otomatik olarak oluşturulur) Ad ve İleri'ye tıklayın. "02", "03", "07" ve "11" kanallarını seçerek görüntü görüntüleme özelliklerini ayarlayın; Kanal 01, 06 ve 09 önceden seçilir. İleri 'yi tıklayın.
  3. Dosya Açma Sihirbazı'nın sonunda Apoptosis Sihirbazı'nı seçin. Apoptosis Sihirbazı simgesini tıklayın ve sonra üzerine tıklayın.Apoptosis Sihirbazını açmak için Sihirbazı Seç düğmesi.
    1. Nükleer görüntü kanalını (CH07) seçin ve İleri'ye tıklayın. Hücreleri en iyi odaklanarak kapıdan çekin. Çizgi Bölgesini Oluştur simgesini tıklayın ve Gradient RMS_M01_Ch01'de 60-90 arasında bir bölge çizin. Bu bölgeyi Ad "Focus," Tamam tıklatın ve İleri'yi tıklayın.
    2. Tek hücreleri kapatın. Çokgen Bölgesini Oluştur simgesini tıklayın. Bölgeyi isim, tek hücrelerin etrafındaki bir bölge çiz "Tek" Tamam tıklatın ve İleri'yi tıklayın. Için tıklayın "Eğer alt popülasyonları analiz etmek istiyor musunuz?"
    3. Çekirdek hücreleri kapayın. Çizgi Bölgesini Oluştur simgesini tıklayın ve tüm çekirdeklenmiş hücreleri içeren bir bölge çizin. Bölgeyi "Çekirdek" olarak adlandırın. Tamam ve İleri'yi tıklayın.
    4. Apoptotik hücreleri kapayın. Çokgen Bölgesini Oluştur simgesini tıklayın. Apoptotik hücrelerin etrafına bir bölge çizin; Bunlar hücrelerDüşük nükleer Alan% _T50 ve yüksek parlaklık kontrastı ile. Son'u tıklayın. Poligon Bölgesi Oluştur ikonuna tıklayarak ve apoptotik olmayan hücrelerin çevresini çizerek ikinci bir bölge ekleyin; Bu bölgeyi "Hücreler" olarak adlandır.
  4. LAMP1, p62 ve LC3 için pozitif olan hücreleri seçin. Yapılandırma Blokları simgesini tıklayın, Floresans Pozitif - Bir Renk seçin ve "Hücreler" popülasyonunu ve Yoğunluk_MC_Ch03'ü seçin . X-Eksenini "Yoğunluk LAMP1" olarak etiketleyin. 10. Hat Bölgesi Oluştur simgesini tıklayarak ve bölgeyi çizerek yoğunlukları 10.000'den yüksek hücreleri içeren bir bölge çizin. Bu bölgeyi "LAMP1 +" olarak etiketleyin. P62 ve LC3 için pozitif hücreleri seçmek için 9.4'deki adımları izleyin.
    1. P62 + için "LAMP1 +" popülasyonunu ve Intensity_MC_Ch02'yi seçin . X-Ekseni "Yoğunluk p62" ve p62 + hücrelerinin bölgesi "LAMP1 + / p62 +" olarak etiketleyin.; LC3 + için, "LAMP1 + / p62 +" popülasyonunu ve Intensity_MC_Ch11'i seçin. X-Ekseni "Yoğunluk LC3" ve LC3 + hücrelerinin bölgesi "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" olarak etiketleyin. Analizin geri kalanı için bu "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" popülasyonunu kullanın.
  5. LC3 noktalarını saymak için bir nokta sayısı özelliği oluşturun.
    NOT: Bu, "Starved + Chloroquine" örneği kullanılarak oluşturulmalıdır.
    1. Analiz sekmesini tıklayın ve Maske'yi seçin. Yeni'yi ve ardından İşlev düğmesini tıklayın. İşlev altında, Tepe'yi seçin; Maskeleme , M11'i seçin; Ve Kanal , Ch11'i seçin. Spot Hücre Arka Plan Oranı'nı 4 olarak ayarlayın . Maske listesine eklemek için Maske Fonksiyonu tanımla penceresi ve Tamam kapatmak için Tamam'a tıklayın. Maske Yöneticisi'nden çıkmak için Kapat'ı tıklayın.
    2. Analiz sekmesini tıklayın ve Yeni düğmesini tıklayın. Özellik Türü altında, Nokta Sayısı ve Maske altında seçeneğini Tepe (M11, Chll, Parlak, 4). Ad için "Nokta Sayısı LC3" yazın ve Özellik Yöneticisi'nden çıkmak için Tamam'ı ve Kapat'ı tıklayın.
      NOT: Nokta sihirbazı bir nokta sayımı özelliği oluşturmak için de kullanılabilir. Bu deneyde kullanılan nokta sayımı özelliği, diğer deneyler ve / veya hücre dizisi için uygun olmayabilir. Kullanıcı, belirli bir veri kümesi için bir maske / özellik belirlerken birkaç nokta sayımı maskesini / özelliklerini test etmelidir. Pugsley 2017, MIFC analiz yazılımı 26 kullanarak nokta sayma hakkında daha ayrıntılı bilgiye sahiptir.
    3. Yeni Histogram simgesini tıklayın. "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" popülasyonunu seçin. Nokta Sayısı LC3 özelliğini seçin ve OK tıklayın.
  6. BDC3 özelliğini oluşturun.
    1. CAnaliz sekmesini yalayın ve Özellikleri seçin. Yeni düğmesini tıklayın. Özellik Türü altında, Parlak Ayrıntı Colocalization 3'ü seçin ; Maskeleyin , MC'yi seçin ; Resim 1 , Ch02'yi seçin (p62); Resim 2 , Ch03'ü seçin (LAMP1); Ve ben mage 3 , Ch11 (LC3) seçin. Ad için "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" yazıp Tamam'ı ve kapatmak için Tamam'ı tıklayın. Özellik Yöneticisi .
    2. Yeni Histogram simgesini tıklayın. "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" popülasyonunu seçin. BDC3 P62 / LAMP1 / LC3 özelliğini seçin ve OK tıklayın.
  7. Yeni Scatterplot simgesini tıklayın. "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" popülasyonunu seçin. X ekseni için BDC3 p62 / LAMP1 / LC3'ü seçin. Y ekseni için Nokta Sayısı LC3 özelliğini seçin. Tamam'a tıklayın.
  8. Inci kaydedinE "Starved + Chloroquine" dosyası. Dosya ' yı tıklayın ve Veri Analizi Dosyasını Kaydet'i (.daf) seçin . Dosyanın önceki sürümünü değiştirmek için Kaydet ve Evet'i tıklayın; Bu dosya artık bir şablon olarak kullanılabilir.
  9. "Kontrol" dosyasını açın. Dosya ve ardından Aç tıklayın. "Control.rif" dosyasını seçin ve Aç'ı tıklayın. Adım 9.2.1'den kompanzasyon matrisini ve şablon olarak "Starved + Chloroquine.daf" dosyasını seçin. Tamam'a tıklayın.
  10. Bölgeleri ayarlamak için "Kontrol" örneğini kullanarak otofagosom birikimi ve otolizozom birikimi için bölgeler oluşturun.
    1. Dikdörtgen Bölge Oluştur simgesini tıklayın. X-koordinatlarından -0.1 ila 3 ve Y-koordinatları 1.5 ila -0.3 arası bir bölge çizin. Bu bölgeyi "Düşük Noktalar" olarak adlandırın. Tıkla Dikdörtgen Bölge simgesi oluşturun . X-koordinatlarından -0.1 ila 1 ve Y-koordinatlarından bir bölge çizin17.5 ila 1.5 aralığı. Bu bölgeyi "Yüksek Spot / Düşük BDC3" olarak adlandırın.
    2. Dikdörtgen Bölge Oluştur simgesini tıklayın. 1 - 3 arası X-koordinatlarından, 17.5 - 1.5 arası Y-koordinatlarından bir bölge çizin. Bu bölgeyi "Yüksek Noktalar / Yüksek BDC3" olarak adlandırın.
  11. "Kontrol" dosyasını kaydedin. Dosya ' yı tıklayın ve Veri Analizi Dosyasını Kaydet'i (.daf ) seçin . Dosyanın önceki sürümünü değiştirmek için Kaydet ve Evet'i tıklayın; Bu dosya artık bir şablon olarak kullanılabilir.
  12. "Control + Chloroquine" dosyasını File (Dosya) ve ardından Open (Aç) seçeneğini tıklayarak açın . "Control + Chloroquine.rif" dosyasını seçin ve Aç'ı tıklayın. Adım 9.2.1'den kompanzasyon matrisini ve şablon olarak "Control.daf" dosyasını seçin. Tamam'a tıklayın. "Starved" ve "Starved + Chloroquine" dosyaları için bunu tekrarlayın.
    NOT: Analiz yazılımındaki toplu iş işlevi, kompansanın uygulanması için de kullanılabilirMatrisini ve / veya şablonunu diğer dosyalara kopyalayın. Son geçiş stratejisi Şekil 2'de gösterilmektedir.

Representative Results

Bu analiz metodu, otofajik akışını değerlendirmek için birden fazla özellik kullanmaktadır. Nihai iki yönlü çizimi tam olarak anlamak için, önce bireysel analiz özellikleri araştırılmalıdır. Otofagozomların sayımı, otofajiyi ölçmek için mantıklı bir yöntemdir; Bununla birlikte, LC3 noktalannın boyutu / şekli / parlaklığı, hücreler arasında büyük ölçüde değişebilir. Varyasyon, otofagozomları manuel olarak veya analiz yazılımında bir nokta sayımı özelliği kullanarak saymayı zorlaştırabilir. Bu nedenle, otofagosomlardaki bu büyük değişkenlik nedeniyle nokta sayma özelliği mükemmel olmayacaktır. Bununla birlikte, çoğu nokta hücresinde iyi bir nokta sayımı özelliği çalışacaktır 26 . Şekil 3 , farklı spot maskeleri kullanan Jurkat hücrelerinde LC3 punktasının spot maskeleme örneğini göstermektedir. Bu veri seti için seçilen nokta sayımı özelliği, Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4'tür; bu, nokta sayımı özelliğinin nokta(Parlak, 4) nokta-hücre arka plan oranıyla 11 kanalında (Ch11-LC3-AF647) varsayılan kanal 11 maskesinde (M11) tanımlanan ak maskesi. Şekil 4 , anti-LC3-AF647 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved + Kloroquin Jurkat hücreleri için ortalama nokta sayısı için nokta sayım histogramlarını ve temsili görüntüleri göstermektedir. Kontrol ve Açlık ortalaması spot sayıları önemli ölçüde farklı değildir; Klorokuin ilavesi ile, Starved + Chloroquine'e kıyasla Control + Chloroquine ortalamasında büyük bir fark vardır.

Araştırılacak bir sonraki özellik BDC3'tür. BDC3, bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1 olmak üzere üç belirteç / probun ortak lokalizasyonunun bir ölçümüdür. Şekil 5A - 5D , anti-p62-AF488 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için BDC3 histogramlarını göstermektedir, Anti-LAMP1-PE ve anti-LC3-AF647. Kontrol ortalama ile Açlığa ortalam arasında bir kayma vardır, bunun yanında Kontrol + Klorokin ortalama + Klorokin ortalaması anlamına gelir. Bununla birlikte, Şekil 5E ortalama BDC3 puanlardan hücre görüntüleri bakarak - 5H, inanmak için bir neden olabilir histogramlar daha örnekler arasında büyük bir fark vardır. Bunun nedeni, BDC3'ün aynı lokalize olduğu otofaji organellerin sayısını göz önünde bulundurmaması ve aynı BDC3 skoru için otofagosom sayısının büyük ölçüde değişmesine neden olmasıdır. Çoğu durumda, üç prob arasında da çakışma vardır, çünkü bazal seviyelerde bile, p62, LAMP1 ve LC3, belirli bir seviyede, hücrelerdeki benzer bölgelerde birlikte lokalize olmalı veya kalmalıdır. Aksine, birlikte lokalize edilmemesi gereken üç probun bir örneği, Şekil 6'da gösterilen Starved + Chloroquine örneği için anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 ve DAPI nükleer boyadır. </ P>

Nokta sayımı özelliği ve BDC3 özelliği birleştirildiğinde, çeşitli örnek / koşulları ayırt etme becerisini geliştiren farklı alt popülasyonların varlığı belirgindir. Şekil 7 , dört örnek için BDC3 p62 / LAMP1 / LC3'e karşı LC3 spot sayımının iki değişkenli grafiğini göstermektedir: Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine. Kontrol örneği üç popülasyon için geçiş stratejisini belirlemek için kullanıldı: Düşük Noktalar, Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3. Kontrol örnekleri, hücrelerin% 98'den fazlasının 1 veya daha az noktaya sahip olduğunu göstermiştir. Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3 arasındaki sınır, BDC3 skoru 1 olarak ayarlandı, çünkü Kontrol örneğinin% 91'den fazlası bir BDC3 puanı 1'den daha düşüktü. İki değişkenli parseller için sonuçların özeti Tablo 1'de gösterilmektedir.

yaş = "1"> Şekil 1
Şekil 1: MIFC Enstrüman Ayarı. Protokolün 8. adımında özetlenen, bu deney için kullanılan MIFC cihaz ayarlarının bir ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Analiz Yazılımı Geçitleme Stratejisi. Protokolün 9. adımında ana hatlarıyla verilen analiz yazılımları geçiş planının bir ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Fig3.jpg "/>
Şekil 3: LC3 Nokta Maskelemesi. Jurkat hücre görüntüleri ve maskeleri, nokta sayımı özelliğini oluşturmak için kullanılıyordu. Gösterilen BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 2), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647 , Parlak, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 5,3,1) ve Nokta (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 6,2,1). Gösterilen tüm hücreler için en iyi sonucu veren maske Peak'ti (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: LC3 Spot-sayımlı Histogramlar. Nokta sayımı özelliği Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4 ve LC3-AF647 Kontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin için spot-sayım histogramları kullanılarakE ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama nokta sayısı sırasıyla 0.07, 1.13, 0.10 ve 2.77'dir. BF, LC3-AF647 (kırmızı), DAPI nükleer boya (mavi) ve ortalama nokta sayımı için temsili hücrelerin LC3-AF647 ve DAPI görüntüsünün bir bileşimi Kontrol ( E , 0 noktalar), Kontrol + Klorokin F , 1 nokta), Starved ( G , 0 lekeler) ve Starved + Chloroquine ( H , 3 lekeler). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5: p62 / LAMP1 / LC3'ün BDC3 Histogramları. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogramlarıKontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama BDC3 skoru sırasıyla 0.57, 0.82, 0.74 ve 0.98'dir. BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi, Kontrol ( E ), Kontrol + Kloroquin ( F ), Starved ( G ) ve Starved + Chloroquine H ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 6
Şekil 6: p62 / L'nin BDC3 HistogramlarıStarved + Chloroquine Örneği için C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine örneği için BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogramı gösterilmektedir. BDC3 ortalama puanı 0.07'dir. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LC3-AF647 (kırmızı); DAPI (mavi); Ve Starved + Chloroquine örneği için ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LC3-AF647 ve DAPI görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7
Şekil 7: LC3 Nokta Sayısı ile BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 arasındaki İki Değişkenli Grafikler. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için LC3 spot sayısına karşılık BDC3 p62 / LAMP1 / LC3'ün iki değişkenli parselleri. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve Starved + Chloroquine örneği için üç bölgeden ( yani, Düşük Noktalar, Yüksek Noktalar / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3) p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Hücre Sayısı Parlak Ayrıntılı Kolokalizasyon 3 Ortalama Nokta Sayısı LC3 Ortalama Düşük Nokta Yüksek Spot / Düşük BDC3 Yüksek Spot / Yüksek BDC3
Kontrol 439 0.57 0.07 98.2 1.8 0.0
Kontrol + Klorokin 1432 0,82 1.13 68.9 19.5 11.7
hasret 1204 0.74 0.10 98.4 0.6 1.0
Starved + Chloroquine 1811 0.98 2.77 32.1 36.9 31.0

Tablo 1: Jurkat LC3 Noktası Özeti BDC3 P62 / LAMP1 / LC3 değişkenli grafiği Sayısı

Discussion

Bu analiz yapılırken göz önüne alınması gereken birkaç nokta var. Uygun kontrol örneklerine sahip olmak önemlidir. Bu deney için iki farklı kontrol kullanıldı: Kontrol ve Kontrol + Klorokin. Bölgeler için eşik değeri belirlemek için Kontrol örneği kullanıldı. Otofajinin temel seviyesini lizozomal bozunmayı durdurmadan gösterir ve Starved örneğinin kontrolüdür. Bununla birlikte, Kontrol örneği, Starved + Chloroquine örneğindeki sonuçlar ile karşılaştırmak için uygun bir kontrol değildir; çünkü klorokin kontrol numunesini etkiler. Dolayısıyla, bir Control + Chloroquine örneği almak gerekiyordu.

Otofaj için herhangi bir analiz yapmadan önce, yalnızca odaklanan tek hücre ( yani, RMS, 60'dan büyük gradyan) üzerinde analiz etmek / kapamak önemlidir, çünkü birden fazla hücre varsa veya görüntüler etkilenebilir odak dışı. OtofagosomunEs ve lizozomlar uygun nokta sayımı ve BDC3 analizi için odaklanmaktadır. Otofaji analizinden önce apoptotik hücreler çıkartılmalıdır, çünkü sonuç çarpıtabilir ve eklenmemelidir. Her üç belirteç için de uygun boyama yapılmalıdır ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). Örneğin, üç belirteçin tümü hücrelerarasıdır ve noktalamalı bir işaret içermelidir; Sinyal işaretli değilse veya hücrenin yüzeyinde bulunuyorsa boyama uygun olmayacak ve deney / boyanma yeniden yapılmalıdır. Buna ek olarak, BDC3'ün doğru olması için, ilgilenilen üç flüoresan markeri için parlak olan hücreleri kaplamak gereklidir. Olumlu olaylar üzerinde geçiş, BDC3'ün spesifik olmayan bağlanma, görüntüleme eserleri ve / veya gürültü üzerindeki ölçümünü önlemek için gereklidir. BDC3, gerçek sinyaller olmayan eserleri potansiyel olarak artırabildiği için bu çok önemlidir. BDC3 yalnızca parlak olumlu olaylar üzerinde gerçekleştirilebildiğinden, birçok hücre son analizde yer almayabilir; Bu especLC3, p62 ve / veya LAMP1 birikimine sahip olmayan kontrol hücreleri için geçerlidir. Bu nedenle, bu tahlilde bir sınırlama, BDC3'ün yalnızca üç markör için de pozitif olan hücreleri inceler, bu da tüm otofajy deneyleri için uygun olmayabilir.

Daha önce 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 olarak bildirilen BDS gibi, BDC3 tek başına, birlikte lokalize olan otofaji organellerin sayısını hesaba katmaz, bu da büyük bir dereceye neden olur Otofagozom sayısındaki değişkenlik. Bu nedenle, Rajan ve ark. Tarafından sunulan iki değişkenli yaklaşım ; kullanılmıştır. İki değişkenli parsele baktığımızda,Hücreler LC3, p62 ve LAMP1 için pozitif olmalıdır; Neden 0 noktalı çok fazla hücre var? Bunun nedeni, LC3 sinyalinin birlikte lokalizasyon için yeterince parlak olabilmesidir, ancak bunun dikkate alınması için gerekli olan tepe maskesinin (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4)) belirlediği eşiğe gelmeyebilir yer.

Burada sunulan protokol, otofajik akıyı ölçmek için LC3 noktalamasını saymak için MIFC'yi ve üç otofaji belirteçinin birlikte lokalizasyonunu kullandı. Bazal şartlar altında (kontrol örneği), otofagozom sayısı düşük ve "Yüksek Noktalar" ile çok az hücre bulundu. Otofagozom / lizozom füzyonunu inhibe eden klorokin ilavesi ile LC3 lekelerinin sayısında bir artış olmuştur. Lizozom otofagozomu ve otofagozomda bulunan p62'yi parçalayamadığından, LC3, p62 ve LAMP1 otolizozom birikiminin birlikte lokalizasyonunda artışa neden olur. Bu etki, besleyici starvatIyon, otofajiye neden olur. Bununla birlikte, klorokin ilavesi olmaksızın, büyük olasılıkla otofajik döngü oranındaki artıştan ötürü otofogozom sayısındaki belirgin bir artış görülmemiştir. Hücreler klorokin varlığında aç bırakıldığında, açlığın otofajik akıyı arttırdığı sonucunu destekleyen otofagozomların birlikte lokalizasyonunda ve sayısında bir artış oldu. EBSS, otofajinin güçlü bir uyarıcısı olarak bilinir. Dolayısıyla, artışın büyük olması bekleniyor. Otofajiyi indüklemek için uyuşturucu indüksiyonu gibi başka bir yöntem kullanılırsa, kontrol ve muamele edilmiş numuneler arasındaki fark daha ince olabilir.

Bu özel protokol, insan hücre dizilerindeki otofajiyi ölçmek üzere tasarlanmıştı, ancak tahlil, bu türler için antikora geçiş yaparak diğer türlere adapte edilebilir. Buna ek olarak, analiz yöntemi, birlikte lokalizasyonu gerektiren herhangi bir hücre içi uygulama için kullanılabilirÜç prob / belirteçten oluşur.

Disclosures

Bu çalışmada kullanılan Amnis markası ImageStream'in yapımcısı MilliporeSigma tarafından istihdam edildim.

Acknowledgments

MilliporeSigma, Philip J. Morrissey ve Sherree L. Friend'deki meslektaşlarımıza yıllar boyunca destek ve rehberlik yaptıkları için teşekkür etmek istiyorum. Vidya Venkatachalam'a ve Bryan R. Davidson'a, IDEAS yazılımındaki BDC3 özelliği ile ilgili yardımlarından ötürü teşekkür ediyorum , bu el yazması için Raymond Kong'a yardımcı olmak için Ryan P. Jessup çekim gününde yardım ve özel teşekkürler Makyaj sanatçısı Cynthia Xamonthiene'e.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
50 mL centrifuge tube Falcon 352070
AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG  Invitrogen A-31571 Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
anti-human CD107a-PE (LAMP1) BioLegend 328607 Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
anti-human CD45- AF488 BioLegend 304017 Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
anti-human CD45- PE  BioLegend 304008 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-human CD45-AF647  BioLegend 304018 Clone HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 MBL International Corporation M152-3 Clone 4E+12.  Concentration 2 mg/mL.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) abcam ab185015 Clone EPR4844.  Concentration 0.5 mg/mL.  http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Chloroquine diphosphate Salt Sigma-Aldrich C6628-25G
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mL MilliporeSigma 508741 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% Isopropanol MilliporeSigma 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x MilliporeSigma BSS-2010-B  Ca++Mg++ Free 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x MilliporeSigma BSS-1006-B PBS Ca++Mg++ Free 
Earle's Balanced Salt Solution 1x Gibco 14155
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Balanced Salt Solution 1x Gibco 14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Non-Essential Amino Acids 100x HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II MilliporeSigma 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS 6.2 MilliporeSigma 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).  IDEAS version 6.2
MIFC software - INSPIRE MilliporeSigma 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 BioLegend 328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100x HyClone SV30082.1
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RPMI-1640 Medium 1x HyClone SH30027.01
Sheath - PBS MilliporeSigma BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes Fisherbrand 02-681-320 Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Sodium Pyruvate solution (100 mM) HyClone SH30239.01
Sterilizer - 0.4 - 0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead MilliporeSigma 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T75 flask Falcon 353136
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered MilliporeSigma 648463-50ML http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Water, Cell Culture Grade  HyClone SH30529.03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  2. Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
  3. Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
  4. Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
  5. Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
  6. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
  7. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
  8. Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
  9. Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
  10. Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
  11. Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
  12. Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
  13. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  14. Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
  15. Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).
  16. Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
  17. Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
  18. Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
  19. Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
  20. Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
  21. Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
  22. Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
  23. Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
  24. Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
  25. Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
  26. Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
  27. IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 125 Otofaji multispektral görüntüleme akış sitometresi (MIFC) ImageStream otofagozom otolizozom LC3 p62 LAMP1
Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic… More

Pugsley, H. R. Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55637, doi:10.3791/55637 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter