القلب القائم على خلايا العضلات المحرك و بيوبوبوت الاستقرار الذاتي - الجزء 2
Summary
في هذه الدراسة، يتم تصنيف المصنف البيولوجي و بيوبوبوت السباحة ذات الاستقرار الذاتي، والسباحة مع الأسلحة ناتستاليزد إلاستوميريك ناتئ مع كارديوميوسيتس، مثقف، وتتميز للخصائص البيوكيميائية والميكانيكا الحيوية مع مرور الوقت.
Abstract
في السنوات الأخيرة، تم تطوير الأجهزة الهجينة التي تتكون من خلية حية أو مكون الأنسجة متكاملة مع العمود الفقري الميكانيكية الاصطناعية. هذه الأجهزة، وتسمى بيوروبوتس، مدعوم فقط من القوة الناتجة عن النشاط مقلص المكون الحي، وبسبب العديد من المزايا الكامنة، يمكن أن يكون بديلا للروبوتات الاصطناعية التقليدية تماما. هنا، نحن تصف أساليب البذور وتوصيف المحرك البيولوجي و بيوروبوت التي تم تصميمها، ملفقة، و فونكتيوناليزد في الجزء الأول من هذه المادة من جزأين. تم تشغيل فونكتيوناليزد المحرك البيولوجي ملفقة وأجهزة بيوروبوت تتكون من قاعدة بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) وكابيل رقيقة لمرفق الخلية مع فبرونيكتين. بعد فونكتيوناليزاشيون، تم تصنيف بذور العضلية الفئران حديثي الولادة على الذراع ناتئ بدمس في كثافة عالية، مما أدى إلى ورقة الخلية متموجة. تم تصوير الأجهزة كل يوم وحركة كانتيتم تحليل ذراع ذراع. في اليوم الثاني بعد البذر، لاحظنا الانحناء من الأسلحة ناتئ بسبب القوى التي تمارسها الخلايا خلال تقلصات عفوية. عند التحليل الكمي للثني ناتئ، لوحظت زيادة تدريجية في الإجهاد السطحي التي تمارسها الخلايا كما نضجت مع مرور الوقت. وبالمثل، لاحظنا حركة بيوروبوت بسبب يشتغل ذراع ناتئ بدمس، الذي تصرف بمثابة زعنفة. عند القياس الكمي لمحات السباحة من الأجهزة، لوحظت وسائط الدفع المختلفة، والتي تأثرت زاوية الراحة من الزعنفة. كما تم تحديد اتجاه الحركة وتكرار الضرب من زاوية استراح الزعنفة، وقد لوحظت أقصى سرعة للسباحة تبلغ 142 ميكرون / ثانية. في هذه المخطوطة، ونحن تصف الإجراء لملء الأجهزة ملفقة مع العضلية، وكذلك لتقييم المحرك البيولوجي والنشاط بيوروبوت.
Introduction
بيوروبوتس هي الأجهزة القائمة على الخلايا الحية التي يتم تضمينها ضمن العمود الفقري الميكانيكية التي تتكون عادة من مواد لينة ومرنة، مثل بدمس أو الهلاميات المائية 1 . وتخضع الخلايا للتقلصات الإيقاعية، إما بشكل تلقائي أو استجابة للمؤثرات، وبالتالي تعمل كمحرك. الطاقة المولدة من تقلص الخلية محركات بيوروبوتس مختلفة. وغالبا ما تستخدم خلايا الثدييات الثدييات (خلايا عضلية) وخلايا العضلات والهيكل العظمي ل يشتغل بيوروبوت بسبب خصائصها مقلص. وبصرف النظر عن كارديوميوسيت وخلايا العضلات والهيكل العظمي، وقد استخدمت أنواع الخلايا الأخرى، مثل أنسجة العضلات الحشرات 2 و أنسجة العضلات 3 إكسلانتيد. الأنسجة العضلية الحشرات تمكن من تشغيل المحركات البيولوجية في درجة حرارة الغرفة.
يتم تحديد وظيفة وأداء بيوروبوت أساسا من قوة واتساق المحرك البيولوجي ( أي. خلايا العضلات)، في حين أن هيكل العمود الفقري الميكانيكية يحدد في المقام الأول آليات الحركة والاستقرار، والسلطة. وبما أن هذه الأجهزة هي وحدها التي تحركها القوى الناتجة عن الخلايا، فلا توجد ملوثات كيميائية أو ضوضاء تشغيلية. ولذلك، فإنها تشكل بديلا موفرا للطاقة للروبوتات التقليدية الأخرى. وقد ناقشت مصادر الأدب المختلفة الطرق المختلفة لدمج الخلايا الحية والأنسجة في بيوروبوتس 1 ، 4 ، 5 . وقد مكنت التطورات في تقنيات التصنيع المجهرية وهندسة الأنسجة من تطوير بيوروبوتس التي يمكن المشي، قبضة، السباحة، أو مضخة 5 ، 6 . بشكل عام، يتم استزراع الخلايا مباشرة على العمود الفقري الميكانيكي (البوليمري) كخلايا خلية متموجة أو يتم صياغتها في هياكل تشغيل ثلاثية الأبعاد داخل السقالات مثل الحلقات والشرائط. في معظم الأحيان، بيوروبوتس هيملفقة باستخدام ورقة كارديوميوسيت 6 ، 7 ، وهذه الخلايا لديها القدرة الفطرية لإظهار انكماش عفوية دون المحفزات الخارجية. من ناحية أخرى، تقارير عن خلايا خلايا العضلات والهيكل العظمي محدودة بسبب حاجتهم إلى المحفزات لبدء تقلصات في المختبر من أجل الشروع في الاستقطاب الغشاء 8 .
يصف هذا البروتوكول أولا كيفية كارديوميوسيتس البذور على المحرك البيولوجي فونكتيوناليزد مصنوعة من ناتئ بدمس رقيقة. ثم يصف بالتفصيل البذر وتحليل ملامح السباحة. و ناتشوراليزد ناتئ فونكتيوناليزد مع بروتين لاصق الخلية مثل فبرونيكتين و يصنف كونفلنتلي مع كارديوميوسيتس. كما الخلايا المصنفة على عقد الجهاز، فإنها تتسبب في ناتئ لثني، وبالتالي لتكون بمثابة المحرك. مع مرور الوقت، كما تنضج الخلايا، ونحن تتبع التغيرات في الإجهاد السطحي على الجهاز من خلال تحليل أشرطة الفيديو منالانحناء ناتئ. المحرك البيولوجي المتقدمة هنا يمكن استخدامها لتحديد خصائص مقلص من أي نوع من الخلايا، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة، لأنها تخضع للتمايز.
وقد ركز الكثير من البحوث السابقة على بيوروبوتس على تطوير المحركات البيولوجية، في حين تم إهمال إلى أقصى حد من العمارة بيوروبوت والقدرات الوظيفية إلى حد كبير. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت دراسات قليلة تنفيذ أساليب السباحة في بيوروبوتس التي هي مستوحاة من الطبيعة. على سبيل المثال، تم تصميم بيوروبوتات السباحة مع الحركة القائمة على سيلا 6 ، دفع قنديل البحر 9 ، والأشعة الهجينة الحيوية 4 . خلافا لغيرها من الأعمال في الأدب، ونحن هنا نركز على اختلاف خصائص العمود الفقري الميكانيكية لخلق هيكل الاستقرار الذاتي. بيوروبوت وضعت في هذه الدراسة قادرة على الحفاظ على الملعب المستمر، لفة، و إمعمق التعمير كما أنها تسبح. هذه المعلمات يمكن تعديلها من خلال تغيير سمك كل قاعدة المركب. يتم وصف الخطوات تصنيع تشارك في تطوير المحرك بدمس، بيوروبوت الجوفية، و فونكتيوناليزاشيون من الجهاز بالتفصيل في الجزء 1 من هذه المادة من جزأين، وكذلك في عملنا مؤخرا 7. يمكن للتقنية المتقدمة هنا تمهيد طريقة لتطوير رواية، بيوروبوتس عالية الكفاءة لمختلف التطبيقات، مثل تسليم البضائع.
عملية العزل المتبعة في هذه الدراسة مشابهة للعملية الموصوفة في عمل سابق 10 ، وكذلك في العمل المنشور مؤخرا 7 . يتم وصف أساليب التصنيع ميكروفابريكاتيون المستخدمة لتصنيع المحركات بدمس وأجهزة بيوروبوت بالتفصيل في الجزء 1 من هذه المخطوطة من جزئين. القسم بروتوكول من هذه المخطوطة يصف الخطوات التي ينطوي عليها زرع الخلايا العضلية على بدمس ملفقة أكتواتور و بيوروبوت بعد فونكتيوناليزاشيون مع البروتينات لاصقة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء الموضح هنا يصف طريقة البذر الناجحة للمشغلات القائمة على بدمس والبيوروبوتات، مما يسهل مرفق الخلايا العضلية. وعلاوة على ذلك، وصفت عملية الحصول على الصور والتحليل اللاحق الذي يميز سلوك الخلايا وأداء الأجهزة.
لاحظنا انكماش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم مت هولي من قبل برنامج الزملاء الدراسات العليا من مجلس ولاية لويزيانا من الحكام، و C. دانيلسون بدعم من برنامج هوارد هيوز الطبية أساتذة المعهد. ويدعم هذه الدراسة من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة رقم: 1530884.
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney’s equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
