Summary

Kardial muskelcellebaseret aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2

Published: May 09, 2017
doi:

Summary

I denne undersøgelse udsåes en biologisk aktuator og en selvstabiliserende svømningsbiorobot med funktionaliserede elastomere cantileverarmer med kardiomyocytter, dyrkes og karakteriseres for deres biokemiske og biomekaniske egenskaber over tid.

Abstract

I de seneste år er hybridudstyr, der består af en levende celle eller vævskomponent integreret med en syntetisk mekanisk rygrad blevet udviklet. Disse enheder, kaldet biorobots, drives udelukkende af den kraft, der genereres af den levende komponents kontraktile aktivitet, og kan på grund af deres mange iboende fordele være et alternativ til konventionelle fuldt kunstige robotter. Her beskriver vi metoderne til frø og karakteriserer en biologisk aktuator og en biorobot, der blev designet, fremstillet og funktionaliseret i den første del af denne todelt artikel. Fremstillede biologiske aktuatorer og biorobotindretninger sammensat af en polydimethylsiloxan (PDMS) base og en tyndfilm-cantilever blev funktionaliseret til cellefastgørelse med fibronectin. Efter funktionalisering blev neonatale rotte-kardiomyocytter podet på PDMS-cantileverarmen ved en høj densitet, hvilket resulterede i en sammenflydende celleplade. Indretningerne blev afbildet hver dag og cantiens bevægelseArmene blev analyseret. På den anden dag efter udsåning observerede vi bøjningen af ​​cantilever arme på grund af de kræfter, som cellerne udøver under spontane sammentrækninger. Ved kvantitativ analyse af cantilever-bøjningen blev en gradvis stigning i overfladespændingen udøvet af cellerne, som de blev modnet over tid, observeret. På samme måde observerede vi bevægelsen af ​​biorobot på grund af aktiveringen af ​​PDMS cantilever armen, som fungerede som en fin. Ved kvantificering af udstyrets svømningsprofiler blev der observeret forskellige fremdriftsformer, som var påvirket af finens hvilevinkel. Bevægelsesretningen og slagfrekvensen blev også bestemt af vinkens hvilevinkel, og en maksimal svømningshastighed på 142 μm / s blev observeret. I dette manuskript beskriver vi proceduren for at befolke de fremstillede enheder med cardiomyocytter såvel som til vurderingen af ​​den biologiske aktuator og biorobotaktivitet.

Introduction

Bioroboter er enheder baseret på levende celler, der er indarbejdet i en mekanisk rygrad, der normalt består af bløde, elastiske materialer, såsom PDMS eller hydrogeler 1 . Cellerne gennemgår rytmiske sammentrækninger, enten spontant eller som reaktion på stimuli, og fungerer således som en aktuator. Strømmen, der genereres fra cellekontraktion, driver forskellige bioroboter. Mammalske hjerteceller (kardiomyocytter) og skeletmuskelceller anvendes ofte til biorobotaktivering på grund af deres kontraktile egenskaber. Bortset fra kardiomyocyt- og skeletmuskelceller er andre celletyper, såsom insektmuskelvæv 2 og eksplanterede muskelvæv 3 blevet anvendt. Insekt muskelvæv muliggør drift af biologiske aktuatorer ved stuetemperatur.

Funktionen og ydeevnen af ​​en biorobot bestemmes hovedsageligt af den biologiske aktuators styrke og konsistens ( dvs.. Muskelceller), mens den mekaniske rygradstruktur primært bestemmer bevægelsesmekanismer, stabilitet og kraft. Da disse enheder udelukkende er drevet af kræfter frembragt af celler, er der ingen kemiske forurenende stoffer eller driftslyde. Derfor udgør de et energieffektivt alternativ til andre konventionelle robotter. Forskellige litteraturkilder har diskuteret de forskellige metoder til at integrere levende celler og væv i biorobots 1 , 4 , 5 . Fremskridt inden for mikrofabrikation og vævsteknikker har gjort det muligt at udvikle bioroboter, der kan gå, greb, svømme eller pumpe 5 , 6 . I almindelighed dyrkes celler direkte på den mekaniske (polymere) rygrad som et sammenflydende cellelag, eller de formes til 3-dimensionelle aktiveringsstrukturer inden for stilladser, såsom ringe og strimler. Oftest er bioroboterFremstillet ved anvendelse af kardiomyocytarkene 6 , 7 , da disse celler har en medfødt evne til at udvise spontan sammentrækning uden eksterne stimuli. På den anden side er rapporter om skeletmuskelcelleplader begrænset grund af deres behov for stimuli til at initiere sammentrækninger in vitro for at initiere membran depolarisering 8 .

Denne protokol beskriver først hvordan man frøer kardiomyocytter på en funktionaliseret biologisk aktuator lavet af en tynd PDMS cantilever. Derefter beskrives detaljeret såning og analyse af svømningsprofilerne. Cantileveren er funktionaliseret med et celleklæbende protein, såsom fibronectin, og er podet sammen med kardiomyocytter. Efterhånden som cellerne er podet på enheden kontrakten, forårsager de cantilever at bøje og således fungere som en aktuator. Efterhånden som cellerne modnes, sporer vi ændringerne i overfladebelastningen på enheden ved at analysere videoer afCantilever bøjning. Den her udviklede biologiske aktuator kan anvendes til at bestemme kontraktile egenskaber af en hvilken som helst celletype, såsom fibroblasterne eller inducerede pluripotente stamceller, idet de undergår differentiering.

Meget af den tidligere forskning om biorobots har været fokuseret på at udvikle biologiske aktuatorer, mens optimering af biorobotarkitekturen og funktionelle kapaciteter stort set blev overset. For nylig har et par studier demonstreret implementeringen af ​​svømmemetoder i bioroboter, der er inspireret af naturen. For eksempel er svømning bioroboter med flagella-baseret bevægelse 6 , vandmandsfremdrift 9 og bio-hybrid stråler 4 blevet konstrueret. I modsætning til andre værker i litteratur fokuserer vi her på at variere egenskaberne af den mekaniske rygrad for at skabe en selvstabiliserende struktur. Den biorobot, der er udviklet i dette studie, er i stand til at opretholde en konstant tonehøjde, rulle og imMersion dybde, da det svømmer. Disse parametre kan modificeres ved at variere tykkelsen af ​​hver basiskomposit. Fabrikationstrinene involveret i udviklingen af ​​PDMS-aktuatoren, den nedsænkelige biorobot og funktionaliteten af ​​anordningen er beskrevet detaljeret i del 1 i denne todelt artikel, såvel som i vores seneste arbejde 7. Den teknik, der udvikles her, kan bane Vejen for udviklingen af ​​nye, højeffektive bioroboter til forskellige anvendelser, såsom fragtlevering.

Isoleringsprocessen, der følges i denne undersøgelse, ligner den proces, der er beskrevet i et tidligere arbejde 10 , såvel som i for nylig udgivet arbejde 7 . Mikrofabrikationsmetoderne til fremstilling af PDMS-aktuatorer og biorobotindretninger er beskrevet detaljeret i del 1 i dette todelt manuskript. Protokolafsnittet i dette manuskript beskriver trinene involveret i såning af kardiomyocytter på den fremstillede PDMS aCtuator og biorobot efter deres funktionalisering med celleklæbende proteiner.

Protocol

Alle procedurer beskrevet her er blevet udført ved hjælp af en godkendt protokol og i overensstemmelse med forskrifterne fra Institut for Dyrpleje og Brug af Universitetet i Notre Dame. 1. Cellsædning og kultur Før du starter, skal du forberede de nødvendige elementer: en lille trakt, pipetter og varm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% Penicillin antibiotikum (DMEM komplet). Tag T-25 flasker sammen med den fu…

Representative Results

Den biologiske aktuator fremstillet af en tynd PDMS cantilever (25 μm i tykkelse) og kardiomyocytter udgør kernen af ​​svømningsbiorobot som vist i skematisk og skærmbillede af indretningerne i figur 1 . Cellerne begynder at udvise sammentrækninger efter 24 timer i kulturen, og bøjning af cantilever armerne blev observeret ved dag 2. Indretningens sideprofil blev registreret hver dag, og overfladespændingen blev kvantificeret fra bøjning af cantileverarmene v…

Discussion

Fremgangsmåden beskrevet her beskriver en vellykket såningsmetode til PDMS-baserede aktuatorer og bioroboter, hvilket letter fastgørelsen af ​​kardiomyocytter. Desuden er processen med billedopsamling og den efterfølgende analyse, som karakteriserer opførelsen af ​​cellerne og udførelsen af ​​indretningerne, beskrevet.

Vi observerede spontan sammentrækning af celler på cantilever arme efter 24 timer; Intensiteten af ​​sammentrækninger fortsatte med at stige støt ove…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MT Holley støttes af Graduate Fellows-programmet fra Louisiana Board of Regents, og C. Danielson støttes af Howard Hughes Medical Institute Professors Program. Denne undersøgelse støttes af NSF Grant No: 1530884.

Materials

Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells) Charles River NA Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) Hyclone Laboratories 16750-074 with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum Hyclone industries, GE 16777-240 Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) Sigma-Aldrich D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141 Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) Molecular Probes L3224
Calcium Fluo-4, AM Molecular Probes F14217 calcium indicator dye
Tyrodes salt solution Sigma-Aldrich T2397 buffer solution
Pluronic F-127 Molecular Probes P3000MP nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde Electron microscopy 15710 Caution: Irritant and combustible
Triton x-100 Sigma-Aldrich X-100 100 mL cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent Molecular Probes P10144 Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin Molecular Probes A12381 Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Molecular Probes A-11012
pha Molecular Probes A-11001
Anti-connexin 43 antibody Abcam ab11370 Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody Abcam ab10231 Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution Electron microscopy 100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS) Elsevier Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera Thor Labs DCC1545M
LED light strip NA NA Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope Nikkon C2 NA Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens Infinity Model# 252120
Software
Matlab Mathworks NA Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J National Institute of Health NA Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis.
Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam Thor Labs NA Camera operating software

References

  1. Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
  2. Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
  3. Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
  4. Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
  5. Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
  6. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
  7. Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
  8. Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
  9. Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
  11. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
  12. Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
  13. Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
  14. Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney’s equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
  15. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
  16. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
  17. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  18. Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).

Play Video

Cite This Article
Nagarajan, N., Holley, M. T., Danielson, C., Park, K., Zorlutuna, P. Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot – Part 2. J. Vis. Exp. (123), e55643, doi:10.3791/55643 (2017).

View Video