Kardial muskelcellebaseret aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2
Summary
I denne undersøgelse udsåes en biologisk aktuator og en selvstabiliserende svømningsbiorobot med funktionaliserede elastomere cantileverarmer med kardiomyocytter, dyrkes og karakteriseres for deres biokemiske og biomekaniske egenskaber over tid.
Abstract
I de seneste år er hybridudstyr, der består af en levende celle eller vævskomponent integreret med en syntetisk mekanisk rygrad blevet udviklet. Disse enheder, kaldet biorobots, drives udelukkende af den kraft, der genereres af den levende komponents kontraktile aktivitet, og kan på grund af deres mange iboende fordele være et alternativ til konventionelle fuldt kunstige robotter. Her beskriver vi metoderne til frø og karakteriserer en biologisk aktuator og en biorobot, der blev designet, fremstillet og funktionaliseret i den første del af denne todelt artikel. Fremstillede biologiske aktuatorer og biorobotindretninger sammensat af en polydimethylsiloxan (PDMS) base og en tyndfilm-cantilever blev funktionaliseret til cellefastgørelse med fibronectin. Efter funktionalisering blev neonatale rotte-kardiomyocytter podet på PDMS-cantileverarmen ved en høj densitet, hvilket resulterede i en sammenflydende celleplade. Indretningerne blev afbildet hver dag og cantiens bevægelseArmene blev analyseret. På den anden dag efter udsåning observerede vi bøjningen af cantilever arme på grund af de kræfter, som cellerne udøver under spontane sammentrækninger. Ved kvantitativ analyse af cantilever-bøjningen blev en gradvis stigning i overfladespændingen udøvet af cellerne, som de blev modnet over tid, observeret. På samme måde observerede vi bevægelsen af biorobot på grund af aktiveringen af PDMS cantilever armen, som fungerede som en fin. Ved kvantificering af udstyrets svømningsprofiler blev der observeret forskellige fremdriftsformer, som var påvirket af finens hvilevinkel. Bevægelsesretningen og slagfrekvensen blev også bestemt af vinkens hvilevinkel, og en maksimal svømningshastighed på 142 μm / s blev observeret. I dette manuskript beskriver vi proceduren for at befolke de fremstillede enheder med cardiomyocytter såvel som til vurderingen af den biologiske aktuator og biorobotaktivitet.
Introduction
Bioroboter er enheder baseret på levende celler, der er indarbejdet i en mekanisk rygrad, der normalt består af bløde, elastiske materialer, såsom PDMS eller hydrogeler 1 . Cellerne gennemgår rytmiske sammentrækninger, enten spontant eller som reaktion på stimuli, og fungerer således som en aktuator. Strømmen, der genereres fra cellekontraktion, driver forskellige bioroboter. Mammalske hjerteceller (kardiomyocytter) og skeletmuskelceller anvendes ofte til biorobotaktivering på grund af deres kontraktile egenskaber. Bortset fra kardiomyocyt- og skeletmuskelceller er andre celletyper, såsom insektmuskelvæv 2 og eksplanterede muskelvæv 3 blevet anvendt. Insekt muskelvæv muliggør drift af biologiske aktuatorer ved stuetemperatur.
Funktionen og ydeevnen af en biorobot bestemmes hovedsageligt af den biologiske aktuators styrke og konsistens ( dvs.. Muskelceller), mens den mekaniske rygradstruktur primært bestemmer bevægelsesmekanismer, stabilitet og kraft. Da disse enheder udelukkende er drevet af kræfter frembragt af celler, er der ingen kemiske forurenende stoffer eller driftslyde. Derfor udgør de et energieffektivt alternativ til andre konventionelle robotter. Forskellige litteraturkilder har diskuteret de forskellige metoder til at integrere levende celler og væv i biorobots 1 , 4 , 5 . Fremskridt inden for mikrofabrikation og vævsteknikker har gjort det muligt at udvikle bioroboter, der kan gå, greb, svømme eller pumpe 5 , 6 . I almindelighed dyrkes celler direkte på den mekaniske (polymere) rygrad som et sammenflydende cellelag, eller de formes til 3-dimensionelle aktiveringsstrukturer inden for stilladser, såsom ringe og strimler. Oftest er bioroboterFremstillet ved anvendelse af kardiomyocytarkene 6 , 7 , da disse celler har en medfødt evne til at udvise spontan sammentrækning uden eksterne stimuli. På den anden side er rapporter om skeletmuskelcelleplader begrænset på grund af deres behov for stimuli til at initiere sammentrækninger in vitro for at initiere membran depolarisering 8 .
Denne protokol beskriver først hvordan man frøer kardiomyocytter på en funktionaliseret biologisk aktuator lavet af en tynd PDMS cantilever. Derefter beskrives detaljeret såning og analyse af svømningsprofilerne. Cantileveren er funktionaliseret med et celleklæbende protein, såsom fibronectin, og er podet sammen med kardiomyocytter. Efterhånden som cellerne er podet på enheden kontrakten, forårsager de cantilever at bøje og således fungere som en aktuator. Efterhånden som cellerne modnes, sporer vi ændringerne i overfladebelastningen på enheden ved at analysere videoer afCantilever bøjning. Den her udviklede biologiske aktuator kan anvendes til at bestemme kontraktile egenskaber af en hvilken som helst celletype, såsom fibroblasterne eller inducerede pluripotente stamceller, idet de undergår differentiering.
Meget af den tidligere forskning om biorobots har været fokuseret på at udvikle biologiske aktuatorer, mens optimering af biorobotarkitekturen og funktionelle kapaciteter stort set blev overset. For nylig har et par studier demonstreret implementeringen af svømmemetoder i bioroboter, der er inspireret af naturen. For eksempel er svømning bioroboter med flagella-baseret bevægelse 6 , vandmandsfremdrift 9 og bio-hybrid stråler 4 blevet konstrueret. I modsætning til andre værker i litteratur fokuserer vi her på at variere egenskaberne af den mekaniske rygrad for at skabe en selvstabiliserende struktur. Den biorobot, der er udviklet i dette studie, er i stand til at opretholde en konstant tonehøjde, rulle og imMersion dybde, da det svømmer. Disse parametre kan modificeres ved at variere tykkelsen af hver basiskomposit. Fabrikationstrinene involveret i udviklingen af PDMS-aktuatoren, den nedsænkelige biorobot og funktionaliteten af anordningen er beskrevet detaljeret i del 1 i denne todelt artikel, såvel som i vores seneste arbejde 7. Den teknik, der udvikles her, kan bane Vejen for udviklingen af nye, højeffektive bioroboter til forskellige anvendelser, såsom fragtlevering.
Isoleringsprocessen, der følges i denne undersøgelse, ligner den proces, der er beskrevet i et tidligere arbejde 10 , såvel som i for nylig udgivet arbejde 7 . Mikrofabrikationsmetoderne til fremstilling af PDMS-aktuatorer og biorobotindretninger er beskrevet detaljeret i del 1 i dette todelt manuskript. Protokolafsnittet i dette manuskript beskriver trinene involveret i såning af kardiomyocytter på den fremstillede PDMS aCtuator og biorobot efter deres funktionalisering med celleklæbende proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåden beskrevet her beskriver en vellykket såningsmetode til PDMS-baserede aktuatorer og bioroboter, hvilket letter fastgørelsen af kardiomyocytter. Desuden er processen med billedopsamling og den efterfølgende analyse, som karakteriserer opførelsen af cellerne og udførelsen af indretningerne, beskrevet.
Vi observerede spontan sammentrækning af celler på cantilever arme efter 24 timer; Intensiteten af sammentrækninger fortsatte med at stige støt ove…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MT Holley støttes af Graduate Fellows-programmet fra Louisiana Board of Regents, og C. Danielson støttes af Howard Hughes Medical Institute Professors Program. Denne undersøgelse støttes af NSF Grant No: 1530884.
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney’s equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
