Herzmuskelzell-basierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - Teil 2

Summary

In dieser Studie werden ein biologischer Aktuator und ein selbststabilisierender, schwimmender Biorobot mit funktionalisierten elastomeren Cantileverarmen mit Kardiomyozyten ausgesät, kultiviert und charakterisiert für ihre biochemischen und biomechanischen Eigenschaften über die Zeit.

Abstract

In den letzten Jahren wurden Hybrid-Geräte entwickelt, die aus einer lebenden Zelle oder Gewebekomponente bestehen, die mit einem synthetischen mechanischen Rückgrat integriert ist. Diese Vorrichtungen, die sogenannten Biorobots, werden allein durch die Kraft, die aus der kontraktilen Aktivität der lebenden Komponente hervorgerufen wird, angetrieben und können aufgrund ihrer vielen inhärenten Vorteile eine Alternative zu herkömmlichen, vollständig künstlichen Robotern sein. Hier beschreiben wir die Methoden, um einen biologischen Aktuator und einen Biorobot zu seedieren und zu charakterisieren, der im ersten Teil dieses zweiteiligen Artikels entworfen, gefertigt und funktionalisiert wurde. Gefertigte biologische Aktuatoren und Biorobot-Vorrichtungen, die aus einer Polydimethylsiloxan-Basis (PDMS) und einem Dünnfilm-Cantilever zusammengesetzt waren, wurden für die Zelladhäsion mit Fibronektin funktionalisiert. Nach der Funktionalisierung wurden neonatale Ratten-Kardiomyozyten auf den PDMS-Cantilever-Arm mit hoher Dichte ausgesät, was zu einer konfluenten Zellfolie führte. Die Geräte wurden jeden Tag abgebildet und die Bewegung der CantiHebelarme wurde analysiert. Am zweiten Tag nach dem Seeding beobachteten wir die Biegung der Cantilever-Arme aufgrund der Kräfte, die von den Zellen während der spontanen Kontraktionen ausgeübt wurden. Bei der quantitativen Analyse der Cantilever-Biegung wurde eine allmähliche Zunahme der Oberflächenspannung, die von den Zellen ausgeübt wurde, während sie im Laufe der Zeit reiften, beobachtet. Ebenso beobachteten wir die Bewegung des Biorobots aufgrund der Betätigung des PDMS-Cantileverarms, der als Flosse fungierte. Bei der Quantifizierung der Schwimmprofile der Geräte wurden verschiedene Antriebsmodi beobachtet, die durch den Ruhewinkel der Rippe beeinflusst wurden. Die Bewegungsrichtung und die Schlagfrequenz wurden auch durch den Ruhewinkel der Rippe bestimmt und es wurde eine maximale Schwimmgeschwindigkeit von 142 μm / s beobachtet. In diesem Manuskript beschreiben wir die Vorgehensweise für die Bevölkeung der gefertigten Geräte mit Kardiomyozyten sowie für die Beurteilung der biologischen Aktor- und Biorobot-Aktivität.

Introduction

Biorobots sind Geräte, die auf lebenden Zellen basieren, die in einem mechanischen Rückgrat eingebaut sind, das üblicherweise aus weichen, elastischen Materialien wie PDMS oder Hydrogelen besteht. Die Zellen unterliegen rhythmischen Kontraktionen, entweder spontan oder in Reaktion auf Reize und fungieren somit als Aktuator. Die aus der Zellkontraktion erzeugte Kraft treibt verschiedene Biorobots an. Säugetierherzzellen (Kardiomyozyten) und Skelettmuskelzellen werden häufig aufgrund ihrer kontraktilen Eigenschaften für die Biorobot-Betätigung verwendet. Abgesehen von Kardiomyozyten- und Skelettmuskelzellen wurden auch andere Zelltypen wie Insektenmuskelgewebe ² und explantierte Muskelgewebe ³ verwendet. Insektenmuskelgewebe ermöglichen den Betrieb von biologischen Aktoren bei Raumtemperatur.

Die Funktion und die Leistungsfähigkeit eines Biorobots werden hauptsächlich durch die Festigkeit und Konsistenz des biologischen Aktors bestimmt ( dh. Muskelzellen), während die mechanische Grundgerüststruktur in erster Linie die Mechanismen der Fortbewegung, der Stabilität und der Kraft bestimmt. Da diese Geräte ausschließlich durch von Zellen erzeugte Kräfte angetrieben werden, gibt es keine chemischen Schadstoffe oder Betriebsgeräusche. Deshalb bilden sie eine energieeffiziente Alternative zu anderen konventionellen Robotern. Verschiedene Literaturquellen haben die verschiedenen Methoden zur Integration lebender Zellen und Gewebe in Bioroboter ^{1 , 4 , 5} diskutiert. Fortschritte in der Mikrofabrikation und Tissue Engineering Techniken haben die Entwicklung von Bioroboten, die zu Fuß, Griff, Schwimmen oder Pumpen ^{5 , 6} ermöglicht. Im Allgemeinen werden Zellen direkt auf das mechanische (polymere) Rückgrat als konfluierende Zellfolie kultiviert oder sie werden in dreidimensionale Betätigungsstrukturen in Gerüsten wie Ringen und Streifen geformt. Am häufigsten sind BiorobotsHergestellt unter Verwendung von Kardiomyozytenblättern ^{6 , 7} , da diese Zellen eine angeborene Fähigkeit haben, eine spontane Kontraktion ohne äußere Reize zu zeigen. Auf der anderen Seite sind Berichte über Skelettmuskelzellfolien aufgrund ihres Bedarfs an Stimuli begrenzt, um Kontraktionen in vitro einzuleiten , um die Membrandepolarisation zu initiieren ⁸ .

Dieses Protokoll beschreibt zunächst, wie man Kardiomyozyten auf einem funktionalisierten biologischen Aktuator aus einem dünnen PDMS-Cantilever aussieht. Es beschreibt dann im Detail die Aussaat und Analyse der Schwimmprofile. Der Cantilever ist mit einem Zellklebstoffprotein wie Fibronectin funktionalisiert und wird konsequent mit Kardiomyozyten ausgesät. Als die Zellen auf dem Gerät vertreten, veranlassen sie den Cantilever zu biegen und damit als Aktuator zu handeln. Im Laufe der Zeit, wie die Zellen reifen, verfolgen wir die Veränderungen der Oberflächenspannung auf dem Gerät durch die Analyse von Videos derFreitragende Biegung. Der hier entwickelte biologische Aktuator kann zur Bestimmung der kontraktilen Eigenschaften eines beliebigen Zelltyps, wie der Fibroblasten oder induzierten pluripotenten Stammzellen, verwendet werden, da sie einer Differenzierung unterliegen.

Ein Großteil der früheren Forschung auf Biorobots konzentrierte sich auf die Entwicklung biologischer Aktoren, während die Optimierung der Biorobot-Architektur und der funktionalen Fähigkeiten weitgehend vernachlässigt wurde. Vor kurzem haben einige Studien die Umsetzung von Schwimmmodi in Bioroboten gezeigt, die von der Natur inspiriert sind. Zum Beispiel wurden schwimmende Biorobots mit Flagella-basierter Bewegung ⁶ , Quallenantrieb ⁹ und Bio-Hybridstrahlen ⁴ entwickelt. Im Gegensatz zu anderen Werken in der Literatur konzentrieren wir uns hier auf die Veränderung der Eigenschaften des mechanischen Rückgrats, um eine selbststabilisierende Struktur zu schaffen. Der in dieser Studie entwickelte Biorobot ist in der Lage, eine konstante Tonhöhe, Rolle und Im aufrechtzuerhaltenMersionstiefe, wie sie schwimmt Diese Parameter können durch Variieren der Dicke jedes Basiskomposits modifiziert werden. Die Fertigungsschritte, die bei der Entwicklung des PDMS-Aktuators, des untertauchbaren Biorobots und der Funktionalisierung des Gerätes beteiligt sind, sind in Teil 1 dieses zweiteiligen Artikels sowie in unserer neueren Arbeit ⁷ ausführlich beschrieben. Die hier entwickelte Technik kann die Weg für die Entwicklung von neuartigen, hocheffizienten Bioroboten für verschiedene Anwendungen wie Frachtlieferung.

Der in dieser Studie verfolgte Isolierungsprozess ähnelt dem in einem früheren Werk ¹⁰ beschriebenen Verfahren sowie in der kürzlich veröffentlichten Arbeit ⁷ . Die für die Herstellung der PDMS-Aktoren und Biorobot-Geräte verwendeten Mikrofabrikationsverfahren sind in Teil 1 dieses zweiteiligen Manuskripts ausführlich beschrieben. Der Protokollabschnitt dieses Manuskripts beschreibt die Schritte, die bei der Aussaat von Kardiomyozyten auf das hergestellte PDMS a auftretenCtuator und der biorobot nach ihrer Funktionalisierung mit Zelladhäsivproteinen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden mit einem genehmigten Protokoll und gemäß den Bestimmungen des Institutional Animal Care and Use Committee der Universität von Notre Dame durchgeführt. 1. Zellseeding und Kultur Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die benötigten Gegenstände vor: einen kleinen Trichter, Pipetten und warmes Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS) und 1% Penicillin Antibiotikum (DMEM komplett). Nehmen…

Representative Results

Der biologische Aktuator aus einem dünnen PDMS-Cantilever (25 μm Dicke) und Kardiomyozyten bildet den Kern des schwimmenden Biorobots, wie im schematischen und Screenshot der Geräte in Abbildung 1 gezeigt . Die Zellen beginnen nach 24 h in der Kultur Kontraktionen zu zeigen, und das Biegen der freitragenden Arme wurde am Tag 2 beobachtet. Das Seitenprofil der Vorrichtung wurde jeden Tag aufgezeichnet, und die Oberflächenspannung wurde aus der Biegung der Auslegerarme…

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren beschreibt eine erfolgreiche Seeding-Methode für PDMS-basierte Aktoren und Biorobots, die die Anbindung von Kardiomyozyten erleichtert. Weiterhin wurde der Prozess der Bilderfassung und die anschließende Analyse, die das Verhalten der Zellen charakterisiert, und die Leistungsfähigkeit der Geräte beschrieben.

Wir beobachteten spontane Kontraktion der Zellen an den freitragenden Armen nach 24 h; Die Intensität der Kontraktionen setzte sich im Laufe der Zeit…

Materials

Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells)	Charles River	NA	Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum	Hyclone industries, GE	16777-240	Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator dye
Tyrodes salt solution	Sigma-Aldrich	T2397	buffer solution
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde	Electron microscopy	15710	Caution: Irritant and combustible
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent	Molecular Probes	P10144	Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antibody	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody	Abcam	ab10231	Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution	Electron microscopy	100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED light strip	NA	NA	Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope	Nikkon C2	NA	Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera operating software