心筋細胞ベースのアクチュエータと自己安定化ビオロボ - 第2部
Summary
この研究では、機能化されたエラストマーカンチレバーアームを有する生物学的アクチュエータおよび自己安定性水泳用ビオロボットに、心筋細胞を播種し、培養し、それらの生化学的および生体力学的特性を経時的に特徴付けた。
Abstract
近年、合成機械骨格と一体化された生細胞または組織成分からなるハイブリッドデバイスが開発されている。バイオロボットと呼ばれるこれらの装置は、生体構成要素の収縮活動から発生する力のみによって駆動され、多くの固有の利点のために、従来の完全人工ロボットの代替物となり得る。ここでは、この2部構成の記事の最初の部分で設計、製作、機能化された生物学的アクチュエータとバイオロボットをシードして特性付けする方法について説明します。ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースおよび薄膜カンチレバーからなる製作された生物学的アクチュエータおよびバイオロボットデバイスを、フィブロネクチンとの細胞接着のために官能化した。機能化後、新生児ラット心筋細胞をPDMSカンチレバーアーム上に高密度で播種し、コンフルエントな細胞シートを得た。デバイスは毎日撮影され、キャッチャーの動きレバーアームを分析した。播種後2日目に、自発収縮時に細胞が及ぼす力によるカンチレバーアームの屈曲を観察した。カンチレバー曲げの定量分析の際に、細胞が時間とともに成熟する際に表面の応力が徐々に増加することが観察された。同様に、我々は、フィンとして機能するPDMSカンチレバーアームの作動によるビオロボットの動きを観察した。装置の泳動プロファイルを定量化すると、フィンの静止角度の影響を受ける様々な推進モードが観察された。運動方向と鼓動周波数もまた、フィンの静止角度によって決定され、142μm/ sの最大泳速が観察された。この原稿では、作製されたデバイスに心筋細胞を移植するための手順、ならびに生物学的アクチュエータおよびビオロボの活性の評価について説明する。
Introduction
ビオロボットは、PDMSまたはヒドロゲル1のような軟質の弾性材料で通常構成される機械的骨格内に組み込まれた生きた細胞に基づくデバイスである。細胞は、自発的にまたは刺激に応答して、律動収縮を受け、したがって、アクチュエータとして機能する。細胞収縮から生成された電力は、様々なビオロボを駆動する。哺乳動物の心臓細胞（心筋細胞）および骨格筋細胞は、収縮特性のために、ビオロボの作動にしばしば用いられる。心筋細胞および骨格筋細胞のほかに、昆虫筋肉組織2および外植された筋肉組織3などの他の細胞型も使用されている。昆虫の筋組織は、室温で生物学的アクチュエータの操作を可能にする。
ビオロボットの機能および性能は、主に生物学的アクチュエータの強度および一貫性によって決定される（ すなわち、。筋肉細胞）、機械的骨格構造は主として、運動、安定性、および力のメカニズムを決定する。これらのデバイスは細胞によって生成される力によって単独で駆動されるので、化学的汚染物質または作動音は存在しない。したがって、他の従来のロボットに代わるエネルギー効率の高い代替手段を構成します。様々な文献情報が生存細胞と組織をビオロボットに組み込む様々な方法について議論してきた1,4,5。微細加工技術と組織工学技術の進歩により、歩く、握る、泳ぐ、またはポンプすることができるバイオロボットの開発が可能になった5,6。一般に、細胞は、コンフルエントな細胞シートとして機械的（ポリマー）バックボーン上に直接培養されるか、またはリングやストリップなどの足場内の三次元作動構造に成形される。ほとんどの場合、ビオロボットは心筋細胞シート6,7を使用して作製される。なぜなら、これらの細胞は、外部刺激なしで自然収縮を示す本来の能力を有するからである。一方、骨格筋細胞シートに関する報告は、膜脱分極を開始するためにインビトロで収縮を開始する刺激の必要性のために制限されている8 。
このプロトコールは、最初に、薄いPDMSカンチレバーで作られた機能化された生物学的アクチュエータ上に心筋細胞を播種する方法を記載する。次に、水泳プロフィールの種蒔きと分析について詳しく説明します。カンチレバーは、フィブロネクチンなどの細胞接着タンパク質で機能化され、心筋細胞とコンフルエントに播種される。デバイスが収縮した細胞は、カンチレバーを曲げてアクチュエータとして動作させます。細胞が成熟するにつれて、時間の経過と共に、我々は、細胞の表面のストレスの変化を追跡する。カンチレバー曲げ。ここで開発された生物学的アクチュエータは、線維芽細胞または誘導された多能性幹細胞などの任意の細胞型の収縮特性を、それらが分化する際に決定するために使用することができる。
バイオロボットに関する以前の研究の多くは、生物学的アクチュエータの開発に焦点を当てていたが、バイオロボットアーキテクチャと機能能力の最適化はほとんど無視されていた。最近、いくつかの研究が、自然に触発されたバイオロボットの水泳モードの実施を実証している。例えば、鞭毛に基づく動き6 、クラゲの推進力9 、およびバイオハイブリッド線4を有する水泳ビオロボットが設計されている。文学の他の研究とは異なり、ここでは、機械的なバックボーンの特性を変化させて自己安定化構造を作り出すことに焦点を当てる。この研究で開発されたバイオロボットは、一定のピッチ、ロール、およびイムを維持することができる泳ぐにつれて水深が広がります。これらのパラメータは、各ベースコンポジットの厚さを変えることによって変更できます。 PDMSアクチュエータ、水中バイノロボット、およびデバイスの機能化の開発に関わる製造工程は、この2部構成の記事のパート1と最近の作業7で詳細に説明されています。ここで開発された技術は、貨物配送などのさまざまな用途に適した、非常に効率的な新規のビオロボットの開発を目指しています。
この研究に従った分離プロセスは、以前の研究10および最近公開された研究7に記載されたプロセスと同様である。 PDMSアクチュエータおよびバイオロボットデバイスを製造するために使用される微細加工方法は、この2部構成の原稿の第1部に詳細に記載されている。この原稿のプロトコールセクションは、作製されたPDMSに心筋細胞を播種するステップctuatorおよびbiorobotを細胞接着タンパク質で機能化した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで概説した手順は、心筋細胞の付着を促進するPDMSベースのアクチュエータおよびビオロボットのための成功した播種方法を記載する。さらに、細胞の挙動および装置の性能を特徴付ける画像取得およびその後の分析のプロセスが記載された。
我々は、24時間後にカンチレバーアーム上の細胞の自発収縮を観察した;収縮の強度は経時的に着実に増加し続け、6日目に最…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MT Holleyはルイジアナ理事会のGraduate Fellowsプログラムによって支持されており、C. DanielsonはHoward Hughes Medical Institute教授プログラムの支援を受けています。この研究は、NSFグラント番号：1530884によって支持されている。
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
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