哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法
Summary
ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフローを記述しています。
Abstract
細胞はしばしば突然の環境変化によって挑戦される。ストレス条件に曝露された細胞内で形成される細胞質リボ核タンパク質複合体であるストレス顆粒（SG）は、細胞代謝および生存の様々な局面に関与している。 SGは、細胞シグナル伝達経路、転写後遺伝子発現およびストレス応答プログラムを調節する。これらのmRNA含有顆粒の形成は細胞翻訳に直接関連する。 SGアセンブリは阻害された翻訳開始によって誘発され、SG分解は翻訳活性化または阻害された翻訳伸長によって促進される。この関係は、SGの構成によってさらに強調される。コアSG成分は、失われた翻訳開始前複合体、mRNA、および選択されたRNA結合タンパク質（RBP）である。 SGアセンブリーの目的は、ストレス応答タンパク質の翻訳の促進を可能にし、翻訳停止したハウスキーピングmRNAを隔離することによって細胞エネルギーを保存することである。アドイティ失われた翻訳予備開始複合体のような核構成要素には、SGは他のタンパク質およびシグナル伝達分子の過剰を含む。 SG形成における欠陥は、ストレスに対する細胞の適応を損ない、細胞死を促進する可能性がある。 SGおよび類似のRNA含有顆粒は、神経変性障害および癌を含む多くのヒト疾患に関連しており、最近RNA顆粒亜型の分類および定義に関心が高まっている。このプロトコールは、哺乳動物SGを特徴づけ、定量するためのアッセイを記載する。
Introduction
細胞はストレスに応答するために多くのメカニズムを使用します。いくつかの応答は、転写後レベルで起こり、mRNA翻訳および/または安定性を調節することを含む1,2 。ストレス調節されたmRNAの翻訳停止および分解は、特異的な非膜性細胞巣の形成に関連しており、最もよく特徴づけられているのはストレス顆粒（SGs） 3である。 SGは、ストレス（ 例えば、酸化、熱ショック、栄養飢餓、ウイルス感染）に応答して、翻訳拘束細胞に非翻訳mRNPを集中させる細胞質病巣である4 。非翻訳mRNAに加えて、SGは翻訳開始因子、RNA結合タンパク質、および様々なシグナル伝達タンパク質を含む5 。 SGは阻害されたタンパク質翻訳および改変されたRNA代謝のバイオマーカーであり、細胞生存およびアポトーシス、シグナル伝達経路に関連しているs、核プロセス5 。
SGは動的エンティティであり、それらの形成は細胞翻訳6の状態に密接に関連している。一見しっかりした外見にもかかわらず、ほとんどのSGタンパク質成分は、滞留時間が秒で急速に出入りする。 SGは数分から数時間持続しますが、その構成要素のほとんどは急速に変化しています。翻訳開始の阻害およびそれに伴う翻訳ポリソームの解体は、SGの形成を促進する。したがって、SGは翻訳ポリソームと平衡状態にある。このポリソーム/ SG平衡は、 真の SGを他のストレス誘導病巣から区別するための鍵である6,7。
停止開始停止は、mRNA、翻訳開始因子（eIF）、および40Sリボソームサブユニットを含む翻訳コンピテントな開始前複合体の変換を伴う （いわゆる48S *複合体）に翻訳し、SGs 4,6に融合することができる。 SGSは、48S複合体形成の上流の2つの異なる段階で翻訳停止が促進される：キャップ結合eIF4F複合体（ 例えば、そのeIF4Aサブユニットを標的とする）の機能への干渉または翻訳開始因子eIF2のαサブユニットのリン酸化4つのeIF2キナーゼのうちの1つ以上を阻害する。停止した48S複合体（ すなわち、 40Sリボソームサブユニットおよび選択された翻訳開始因子）の存在は、SGs8,9の特徴である。
SGは、ウイルス感染、神経変性、自己免疫、および癌3,10,11,12などの様々な病的状態に関連している。ss = "xref"> 12,13。いくつかのSG成分の変異型は、ニューロンがニューロン死に積極的な役割を果たす細胞内病理学的封入体を示す神経変性疾患（ 例えば、筋萎縮性側索硬化症）と関連している13 。いくつかのウイルスはSG成分をハイジャックしてSGの形成を阻害し、ウイルス複製を増強する14 。最近の研究はまた、化学療法および放射線療法の治療10,16,17,18,19,20の下で、SGを癌15および癌細胞の生存と関連付ける。このような発見はSG生物学に大きな関心を刺激したが、公開された報告の多くは、 真の SGの形成を他のストレス誘発病巣と区別するための重要なコントロールがない。
SGは、T細胞細胞内抗原1（TIA-1）およびポリA結合タンパク質（PABP）を含む、選択されたmRNA結合タンパク質（RBP）からなる非膜性細胞質病巣として最初に記載された。翻訳開始因子;ポリアデニル化mRNA;小型リボソームサブユニット4,6,21,22。伝統的に、それらの組成は、免疫染色および蛍光標識されたタンパク質の異所性発現のような技術によって決定されている23,24。それらの非常に動的な性質のため、SGタンパク質および/またはmRNAの免疫局在化は、SG23,24を検出するための決定的な方法論のままである。今日まで、多くのRBPおよび他のタンパク質（120以上の異なるタンパク質）がSG構成要素11として記載されている。多くのSG-局在タンパク質は、ストレス依存性および独立性の両方でそれらの局在を変化させ、他の細胞内区画および病巣に蓄積することができるので、SGマーカーを選択し、SGを他のタイプのストレス誘発フォーカス。 真正の SGは、mRNA、翻訳開始因子、および小リボソームサブユニットを含み、翻訳と動的平衡にある。
この単純なワークフローは、ストレス誘発病巣が真正 SGであるかどうかを判断するために設計されています。このワークフローには、SGsを研究するために一般的に使用される細胞であるU2OS細胞を使用したいくつかの実験的アプローチが含まれています。これらの細胞は、大きな細胞質を有し、比較的平坦でガラスカバースリップに強く付着するので、理想的である。 SGを研究するために他の細胞タイプを使用することができますが、SG核生成タンパク質のタイミング、薬物濃度、および存在量の違いが動態および成分を変化させることがあることに注意することが重要ですsition。さらに、いくつかの細胞は、細胞表面のブレブを形成することによってパラホルムアルデヒド固定に応答し、次いで、いくつかのSGマーカーの点状局在を引き起こすぎざぎざのような外観を与える。注意深く分析することなく、これらはSGとして誤って分類される可能性があります。これは、ストレス誘発病巣を真正 SGとして同定するために必要なすべての基準を評価する必要性を強調する。 SG22を促進する癌治療薬であるVinorelbine（VRB）と、強固で特徴の良いSG誘導物質であるSodium Arsenite（SA）は、このプロトコルの実験のストレスとして使用されます。
標準的なSGは、細胞質フォーカスにおいて共局在する複数のSGマーカー（タンパク質およびmRNAの両方）を含む。このプロトコルは、タンパク質マーカーおよびポリアデニル化mRNA 22のそれぞれの局在を検出するために、免疫蛍光および蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の両方を使用する。簡単に説明すると、間接免疫蛍光法は、抗体（すなわち、e。一次抗体）を細胞内で検出することができる。次いで、蛍光色素に結合した二次抗体（通常は種特異的）が一次抗体を認識し、標的タンパク質の局在を明らかにする。蛍光顕微鏡法を用いて、細胞内の局在化シグナルを検出する。異なる種で産生された抗体を使用し、異なった色の二次抗体を用いてそれらを検出することにより、複数の抗体の共局在の検出が可能になり、それらのタンパク質標的が同じ場所にあることが示される。 真正 SGで共局在することが確認されているマーカーを選択することが重要です。
FISHは、特定のRNAまたはDNA配列に塩基対合する標識プローブを使用します25 。 mRNAを検出するために、このプロトコールは、mRNAのポリA尾部にハイブリダイズする（または塩基対を形成する）ビオチン化オリゴ（dT） 40プローブ（ すなわち、ポリA FISH）。次いで、ストレプトアビジンはビオチンに対して高い親和性を有するので、ビオチン化プローブは蛍光共役ストレプトアビジンを用いて検出される。 SGを評価する場合、真正SGと同様に、ポリAアフィニティを免疫蛍光法と結合させることが重要であり、両シグナルは共局在すべきである。
このプロトコルを用いて、共局在化は複数の方法で評価される。マルチチャンネル（RGB：赤、緑、青）の画像では、共局在化によって重なった信号の色が変わります（ 例えば、共局在化された赤色と緑色は黄色に見えます）。さらに、各色の強度が所定のライン8,20にわたって測定されるラインスキャン分析を用いて、共局在化を図式的に定量化する。このプロトコルは、ImageJ26を使用する2つのラインスキャン分析手順を記述する。 1つの手順は手動であり、プロセス全体を処理します他のマクロは、マクロを使用するか、手動ステップを自動化する単純なプログラムを使用します。マクロプロシージャを理解するには、手動プログラムを実行することが重要です。
翻訳が抑制されている細胞ではSGが形成される。したがって、SGを有する細胞は、未処理細胞と比較して、全体的翻訳のレベルが低下しているはずである。実験的に、リボプロファイリングが用いられる。ピューロマイシンおよびエメチンは、固定前に短時間細胞に添加され、ピューロマイシンが積極的にポリペプチドを形成するように組み込み、終結を引き起こす27,28。再開始を防ぐには、エメチンによる治療が必要です29 。ピューロマイシンは、抗ピューロマイシン抗体を用いて検出することができ、能動的翻訳のスナップショットを与える。この方法は速く、特定のアミノ酸が欠けている培地でプレ飢餓させる必要がなく（潜在的に細胞にプレストレスをかける）ために使用され、タンパク質翻訳の細胞内局在化。特に、メチオニン類似体L-アジドホモマレイン（AHA）のような修飾アミノ酸類似体を「クリック – イット（click-it）」化学反応30と組み合わせて使用する他の方法を用いて、SGを含有する細胞が隣接細胞31よりもはるかに低い翻訳を示すことが示されている31 。しかし、この技術では、メチオニンの飢餓とそれに続く15〜30分間のパルス標識が必要です。メチオニン飢餓はさらなるストレスを構成する一方、長い標識時間（ すなわち 15〜30分）は進行中ではなく累積翻訳の測定をもたらし、また新しく合成されたタンパク質が合成部位から合成部位を最終部位に移動させる細胞。対照的に、リボプロマイシン酸化は非常に速く、グルコース飢餓によってSGを誘導するために使用されるグルコース不含培地などの任意の培地と適合する。
正規のSGは動的平衡状態にある積極的にポリソームを翻訳しています。これは、ポリソームを安定化または不安定化する薬剤でサンプルを処理することにより、SGとポリソーム23との間のバランスを変えることによって、実験的に評価することができる23 。シクロヘキシミド（または同様に作用するエメチン）は、リボソームをmRNA上に「凍結」することによって伸長をブロックし、SGを形成することができる利用可能な非ポリソームのmRNPのプールを減少させる。実験的には、これは2つの方法で使用することができます：ストレスの前にシクロヘキシミド（またはエメチン）を添加してSGの形成を防止するか、またはSGが形成された後にシクロヘキシミド（またはエメチン）予備初期化複合体はポリソーム画分にゆっくり取り込まれる。対照的に、ピューロマイシンは早期終了を引き起こし、ポリソーム分解を促進し、SGに組み立てることができる開始mRNAのプールを増加させる。実験的に、ピューロマイシン治療はSGの数を増加させるか、または閾値を低下させるこれらは、段階的なストレスまたは薬物投与量に応じて形成される。ピューロマイシンの効果を評価する際には、ピューロマイシンが薬剤の効果を増大させ、SGを提示する細胞の割合を増加させることが予想されるので、最大のレベル以下の薬剤を使用することが重要である。 /ストレスは、最初に細胞の100％においてSGを引き起こす。これは、シクロヘキシミド処置と対照的であり、SGを分解し、〜95％の細胞が最初にSGを表示して最大の可能な減少が観察され、正確に定量化されるときに最も効果的である。
このプロトコルは、哺乳動物細胞のSGを研究するための枠組みを提供する。方法は、（1）推定上のSGにおいて古典的なSG関連マーカーeIF4G、eIF3b、およびRas GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）の共局在化を評価するための免疫蛍光染色およびImageJ分析; （2）ポリアデニル化mRNAを検出するためのオリゴ（dT）蛍光in situハイブリダイゼーション（polyA FISH）; （3）ストレス誘発病巣がポリソームと動的平衡状態にあるかどうかを決定するためのシクロヘキシミドおよびピューロマイシン処置; （4）推定上のSGを含有する細胞の翻訳状態を評価するためのリボプロマイシン酸化。一緒に、これらのアッセイは、ストレス誘発病巣が真正 SGとして分類され得るか否かを決定することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
複数の疾患における免疫組織学的研究によって証明されるように、慢性ストレスは、異なる細胞内病巣の形成をもたらす。例えば、ほとんどの神経変性疾患は、不溶性タンパク質の細胞内凝集物を特徴とする。このような凝集体中のSG結合タンパク質の存在は、しばしば、そのような病巣がSGであると結論付けるための基礎である。新しいストレス刺激で処理した細胞でSGマーカー陽性細胞質?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私はイワノフとアンダーソンのラボのメンバーに、この原稿に関する有益な議論とフィードバックを感謝します。この研究は、ポーランド国立科学センター（UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054からWSへの付与）の国立衛生研究所[PA、NS094918からPIへのGM111700およびCA168872]によって支持された。 WSはまた、ポーランドの科学と高等教育省（モビリティプラスプログラム）とポーランド・アメリカのフルブライト委員会が米国での彼の研究の財政的支援を認めていることも認めています。
Materials
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | – commonly written as "U2OS" – culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | – abbreviated DMEM – contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red – supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin – prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442-500ml | – abbreviated FBS – used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | – used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | – used to supplement media |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues | KIMTECH SCIENCE | 34120 | – commonly called "kimwipes" |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | – autoclaved before used – keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% | Sigma | S7400-100G | – commonly called sodium arsenite and abbreviated SA – dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine | TSZ CHEM | RS055 | – abbreviated VRB – dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | – used to assess translation level (ribopuromycylation) – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | – used in combination with puro to assess general translation level – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide | Sigma | C4859 | – abbreviated CHX – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza / VWR | 95042-486 | – abbreviated PBS – wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline | Sigma | P6148-500G | – make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved – aliquots can be stored at – 20 °C for several months – hazardous, use ventilation – discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | – pre-chilled to -20°C before use – discard in special waste |
| Normal Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 31874 | – abbreviated NHS – dilute to 5% in PBS – add sodium azide for storage at 4°C – blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | – dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | – store at 4 °C – use at 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | – eIF3η is also known as eIF3b – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | – store at 4 °C – 1/1000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/2500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | – incubate with secondary antibodies -stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light – Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions, then store at 4°C – 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | – reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20°C – dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use – custom order |
| hybridation box | / | / | – make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom – prewarm the box prior use |
| 20 x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | – dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) – store at room temperature – wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | – block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | – mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS – mix by sonication, followed by stirring overnight at RT – Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT – centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet – aliquot viscous liquid, long-term storage at -20°C, 1 week at 4°C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | – usually referred as "parafilm" |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | – reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | – reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | – preservative agent for blocking solution and vinol – make a 20 % dilution in water |
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