Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos
Summary
Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe .
Abstract
Las células son a menudo desafiadas por cambios ambientales repentinos. Los Gránulos de Estrés (SG), complejos de ribonucleoproteínas citoplasmáticas que se forman en células expuestas a condiciones de estrés, están implicados en diversos aspectos del metabolismo celular y la supervivencia. Las SG modulan las vías de señalización celular, la expresión génica post-transcripcional y los programas de respuesta al estrés. La formación de estos gránulos que contienen mRNA está directamente conectada a la traducción celular. SG se desencadena por la iniciación de la traducción inhibida, y el desmontaje SG se promueve por activación de la traducción o por elongación de la traducción inhibida. Esta relación se pone más de relieve por la composición SG. Los componentes de núcleo SG son complejos de preiniciación de traducción estancados, mRNA, y proteínas RNA-binding (RBPs) seleccionadas. El propósito de la asamblea de SG es conservar la energía celular secuestrando los mRNAs de mantenimiento doméstico traducionalmente estancados, permitiendo la traducción mejorada de proteínas que responden al estrés. En additiSobre los constituyentes del núcleo, tales como complejos de preiniciación de traducción estancada, SGs contienen una plétora de otras proteínas y moléculas de señalización. Los defectos en la formación de SG pueden alterar la adaptación celular al estrés y, por lo tanto, pueden favorecer la muerte celular. Las SG y los gránulos similares que contienen ARN se han ligado a una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cáncer, dando lugar al reciente interés en clasificar y definir subtipos de gránulos de ARN. Este protocolo describe ensayos para caracterizar y cuantificar SGs de mamíferos.
Introduction
Las células emplean muchos mecanismos para responder al estrés. Algunas respuestas se producen a nivel post-transcripcional e implican la regulación de la traducción y / o la estabilidad del mRNA 1 , 2 . La detención y degradación de la ARNm de mRNA modulada por estrés se asocian con la formación de focos celulares no membranosos específicos, siendo los más bien caracterizados los Stress Granules (SGs) 3 . Las SGs son focos citoplasmáticos que concentran mRNPs no traducientes en células detenidas en translación que responden al estrés ( por ejemplo, oxidación, choque térmico, inanición de nutrientes e infección viral) 4 . Además de no traducir mRNAs, SGs contienen factores de iniciación de la traducción, RNA-proteínas de unión, y varias proteínas de señalización [ 5] . SGs son biomarcadores de la traducción de proteínas inhibidas y el metabolismo del ARN alterado y se han relacionado con la supervivencia celular y la apoptosis, vía de señalizaciónS, y los procesos nucleares 5 .
SGs son entidades dinámicas, y su formación está estrechamente conectado con el estado de la traducción celular [ 6] . A pesar de su aspecto aparentemente sólido, la mayoría de los componentes de la proteína SG transitan rápidamente dentro y fuera, con un tiempo de residencia de segundos. Mientras SGs persistir durante minutos a horas, la mayoría de sus componentes están en rápido flujo. La inhibición de la iniciación de la traducción y el consiguiente desmontaje de los polisomas de translación promueven la formación de SGs; Por lo tanto, SGs están en equilibrio con la traducción de polisomas. Este equilibrio polysome / SG es clave para distinguir los SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés 6 , 7 .
La detención de la iniciación de la traducción implica la conversión de complejos de preiniciación competentes para la traducción que contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción (eIF) y subunidades ribosómicas 40S O-llamados 48S complejos) en complejos traslacionalmente estancado (lo que se llama 48S * complejos) que pueden coalescer en SGs 4 , 6 . SGs son promovidos por detención traslacional en dos etapas diferentes antes de la formación del complejo 48S: interferencia con las funciones del complejo eIF4F de unión a la capa ( por ejemplo, dirigida a su subunidad eIF4A) o fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación de la traducción eIF2, mediada por una O más de las cuatro quinasas eIF2. La presencia de complejos 48S bloqueados ( es decir subunidades ribosómicas 40S y factores de iniciación de la traducción seleccionados) es un sello distintivo de las SG 8 , 9 .
Las SG se han relacionado con varios estados patológicos, como infecciones virales, neurodegeneración, autoinmunidad y cáncer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Las formas mutadas de varios componentes de SG están asociadas con enfermedades neurodegenerativas ( por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica) en las que las neuronas presentan inclusiones patológicas intracelulares que pueden desempeñar papeles activos en la muerte neuronal 13 . Algunos virus secuestrar componentes SG para inhibir la formación de SG y para mejorar la replicación viral [ 14] . Estudios recientes también vinculan SGs al cáncer 15 ya la supervivencia de las células cancerígenas en tratamientos de quimioterapia y radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Si bien estos hallazgos han estimulado un gran interés en la biología de SG, muchos de los informes publicados carecen de controles importantes para distinguir la formación de SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés.
Las SG se describieron inicialmente como focos citoplasmáticos no membranosos compuestos de proteínas de unión a mRNA seleccionadas (RBP), incluyendo el antígeno ntracelular de células T 1 (TIA-1) y la proteína de unión a PolyA (PABP); Factores de iniciación de la traducción; MARN poliadenilado; Y pequeñas subunidades ribosómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, su composición ha sido determinada por técnicas como la inmunotinción y la expresión ectópica de las proteínas marcadas con fluorescencia 23 , 24 . Debido a su naturaleza altamente dinámica, la inmunolocalización de las proteínas SG y / o ARNm sigue siendo la metodología que define la detección de SGs 23 , 24 . Hasta la fecha, muchas RBP y otras proteínas (más de 120 proteínas distintas) se describen como SG componentes [ 11] . TantasLas proteínas G-localizadas cambian su localización tanto de una manera dependiente del estrés como de una manera independiente y pueden acumularse en otros compartimentos y focos intracelulares, es importante elegir marcadores SG correctos y emplear criterios funcionales para distinguir SG de otros tipos de estrés inducido Focos Bona fide SGs contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción, y pequeñas subunidades ribosómicas y están en equilibrio dinámico con la traducción.
Este simple flujo de trabajo está diseñado para determinar si los focos inducidos por el estrés son SGs de buena fe . Este flujo de trabajo incluye varios enfoques experimentales utilizando células U2OS, células comúnmente utilizadas para estudiar SGs. Estas células son ideales, ya que tienen un citoplasma grande, son relativamente plana, y se adhieren fuertemente a cubreobjetos de vidrio. Otros tipos de células se pueden utilizar para estudiar SGs, pero es importante tener en cuenta que las diferencias en el tiempo, la concentración de fármacos, y la abundancia de SG-nucleating proteínas pueden alterar la cinética y compoSión. Además, algunas células responden a la fijación de paraformaldehído formando vesículas superficiales de las células, dando entonces un aspecto rizado que causa la localización puntiforme de algunos marcadores SG; Sin un análisis cuidadoso, estos pueden ser clasificados erróneamente como SGs. Esto pone de relieve la necesidad de evaluar todos los criterios necesarios para identificar los focos inducidos por el estrés como SG de buena fe . Vinorelbina (VRB), un cáncer terapéutico que promueve SGs 20 , así como Sodium Arsenite (SA), un robusto y bien caracterizado SG inductor, se utilizan como las tensiones para los experimentos en este protocolo.
Canonical SGs contienen múltiples marcadores SG (proteínas y mRNAs) que colocalize en focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto la inmunofluorescencia como la hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar la localización de los marcadores de proteínas y el ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Brevemente, la inmunofluorescencia indirecta utiliza anticuerpos ( i.mi. Anticuerpos primarios) específicos para una proteína dada para detectarla dentro de la célula. Entonces, los anticuerpos secundarios (generalmente específicos de la especie) unidos a los fluorocromos reconocen el anticuerpo primario y revelan la localización de la proteína diana. La microscopía fluorescente se utiliza para detectar la señal localizada dentro de la célula. El uso de anticuerpos producidos en diferentes especies y su detección con anticuerpos secundarios de color diferente permite la detección de la colocalización de múltiples anticuerpos, lo que indica que sus objetivos de proteínas se encuentran en el mismo lugar [ 23] . Es importante seleccionar marcadores que han sido verificados para colocalizar en SGs de buena fe .
FISH utiliza una sonda marcada que pares de bases a un ARN o secuencia de ADN específicos [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza una sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (o pares de bases) a la cola poliA de mRNA ( es decir, poliA FISH). La sonda biotinilada se detecta entonces utilizando estreptavidina conjugada con fluorescencia, ya que la estreptavidina tiene una alta afinidad por la biotina. Al evaluar SGs, es importante acoplar el poliA FISH con la inmunofluorescencia detectando un marcador SG, como en SGs de buena fe , las dos señales deben colocalize.
Usando este protocolo, la colocalización se evalúa de múltiples maneras. En una imagen multicanal ( es decir, RGB: rojo, verde y azul), la colocalización alterará el color de la señal superpuesta ( p. Ej . Color rojo compartido y verde aparecen en color amarillo) 23 . Además, la colocalización se cuantifica gráficamente mediante análisis de barrido lineal, donde la intensidad de cada color se mide a través de una línea dada 8 , 20 . Este protocolo describe dos procedimientos de análisis de exploración de línea utilizando ImageJ 26 . Un procedimiento es manual y pasa por todo el proceso,El otro utiliza una macro, o un programa simple que automatiza los pasos manuales. Es importante pasar por el programa manual para entender el procedimiento macro.
Las SG se forman en las celdas donde se reprime la traducción; Por lo tanto, las células con SGs deben mostrar niveles disminuidos de traducción global en comparación con las células no tratadas. Experimentalmente, se usa ribopuromicilación. Puromicina y emetina se añaden a las células durante un breve período de tiempo antes de la fijación, permitiendo que la puromicina se incorpore en polipéptidos que forman activamente, causando la terminación 27 , 28 . El tratamiento con emetina es necesario para evitar la reiniciación 29 . La puromicina puede entonces detectarse usando anticuerpos anti-puromicina, dando una instantánea de la traducción activa. Este método se utiliza porque es rápido, no requiere pre-hambre con un medio que carece de un aminoácido particular (y potencialmente el pretensado de las células), y revela laLocalización subcelular de la traducción de proteínas. Se han utilizado otros métodos, especialmente el uso de análogos de aminoácidos modificados, tales como el análogo de metionina L-azidohomoalaína (AHA), junto con la química "click-it" 30 , para mostrar que las células que contienen SG presentan una traducción mucho menor que las células vecinas 31 . Sin embargo, esta técnica requiere inanición de metionina seguido de marcaje por pulso durante 15-30 min. El hambre por metionina constituye un estrés adicional, mientras que el largo tiempo de etiquetado ( es decir, 15-30 minutos) da como resultado la medición de la traducción acumulativa en lugar de la continua y también permite que las proteínas recién sintetizadas se muevan desde su sitio de síntesis hasta su destino final dentro del celda. Por el contrario, la ribopuromicilación es mucho más rápida y es compatible con cualquier medio, tal como el medio libre de glucosa utilizado para inducir SG a través de la ingesta de glucosa.
Los SGs canónicos están en equilibrio dinámicoCon traducción activa de polisomas. Esto puede evaluarse experimentalmente mediante el tratamiento de las muestras con los fármacos que estabilizan o desestabilizar polisomas, por lo tanto, el equilibrio entre la inclinación SGs y polisomas [ 23] . La cicloheximida (o emetina, que se comporta de manera similar) bloquea el alargamiento mediante la "congelación" de los ribosomas en el ARNm, disminuyendo así el grupo de mRNP no polisómicos disponibles capaces de formar SGs. Experimentalmente, esto puede ser utilizado de dos maneras: añadiendo cicloheximida (o emetina) antes del estrés para prevenir la formación de SG o añadiendo cicloheximida (o emetina) después de que se hayan formado los SG, incluso sin eliminar el agente tensor, causando el desmontaje SG, Los complejos de preinitiación se introducen lentamente en la fracción de polisoma. Por el contrario, la puromicina provoca la terminación prematura y promueve el desensamblaje del polisoma, aumentando el grupo de ARNm iniciadores capaces de ensamblarse en SGs. Experimentalmente, el tratamiento con puromicina aumenta el número de SG o disminuye el umbralD en la que se forman en respuesta al estrés graduado oa la dosis de fármaco. Cuando se evalúa el efecto de la puromicina, es importante usar un nivel sub-máximo del fármaco de interés, ya que se espera que la puromicina aumente el efecto del fármaco y aumente el porcentaje de células que presentan SGs – esto no puede ocurrir si el fármaco / Estrés provoca SGs en el 100% de las células inicialmente. Esto contrasta con el tratamiento con cicloheximida, que desensambla SGs y funciona mejor cuando ~ 95% de las células inicialmente muestran SGs de modo que se puede observar y cuantificar con precisión la mayor disminución posible.
Este protocolo proporciona un marco para estudiar SGs en células de mamíferos. Los métodos incluyen: (1) tinción inmunofluorescente y análisis ImageJ para evaluar la colocalización de los marcadores clásicos SG asociados eIF4G, eIF3b, y Ras GTPasa-proteína activadora de la proteína de unión 1 (G3BP1) en putativo SGs; (2) hibridación in situ de fluorescencia de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamiento con cicloheximida y puromicina para determinar si los focos inducidos por el estrés están en equilibrio dinámico con polisomas; Y (4) ribopuromicilación para evaluar el estado de traslación de células que contienen SGs putativas. Juntos, estos ensayos pueden determinar si los focos inducidos por el estrés pueden clasificarse como SGs de buena fe .
Protocol
Representative Results
Discussion
Como evidenciado por estudios inmunohistológicos en múltiples enfermedades, el estrés crónico conduce a la formación de diferentes focos intracelulares. Por ejemplo, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por agregados intracelulares de proteínas insolubles. La presencia de SG-proteínas asociadas en tales agregados es a menudo la base para concluir que tales focos son SGs. Una conclusión similar se deduce también cuando se observan focos citoplasmáticos con marcador positivo en cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Ivanov y Anderson por su útil discusión y comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [GM111700 y CA168872 a PA, NS094918 a PI], el Centro Nacional de Ciencias en Polonia [otorgar UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS también reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior en Polonia (Programa Mobility Plus) ya la Comisión Fulbright Polaco-Americana por el apoyo financiero de su investigación en los Estados Unidos.
Materials
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | – commonly written as "U2OS" – culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium | Corning | 10-013-CV | – abbreviated DMEM – contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red – supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin – prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442-500ml | – abbreviated FBS – used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | – used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | – used to supplement media |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues | KIMTECH SCIENCE | 34120 | – commonly called "kimwipes" |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | – autoclaved before used – keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% | Sigma | S7400-100G | – commonly called sodium arsenite and abbreviated SA – dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine | TSZ CHEM | RS055 | – abbreviated VRB – dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | – used to assess translation level (ribopuromycylation) – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | – used in combination with puro to assess general translation level – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide | Sigma | C4859 | – abbreviated CHX – used to assess SG connection with active translation – dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza / VWR | 95042-486 | – abbreviated PBS – wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline | Sigma | P6148-500G | – make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved – aliquots can be stored at – 20 °C for several months – hazardous, use ventilation – discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | – pre-chilled to -20°C before use – discard in special waste |
| Normal Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 31874 | – abbreviated NHS – dilute to 5% in PBS – add sodium azide for storage at 4°C – blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | – dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | – store at 4 °C – use at 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | – eIF3η is also known as eIF3b – store at 4 °C – 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | – store at 4 °C – 1/1000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/2500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C – 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | – incubate with secondary antibodies -stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light – Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | – reconstitute in water as per manufacturer’s instructions, then store at 4°C – 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | – reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20°C – dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use – custom order |
| hybridation box | / | / | – make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom – prewarm the box prior use |
| 20 x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | – dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) – store at room temperature – wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | – block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | – mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS – mix by sonication, followed by stirring overnight at RT – Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT – centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet – aliquot viscous liquid, long-term storage at -20°C, 1 week at 4°C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | – usually referred as "parafilm" |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | – reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | – reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | – preservative agent for blocking solution and vinol – make a 20 % dilution in water |
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