Summary
Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.
Abstract
As plaquetas são jogadores essenciais na hemostasia, a formação de trombos para selar as violações vasculares. Eles também estão envolvidos em trombose, a formação de trombos que obstruem a vasculatura e ferem órgãos, com conseqüências que ameaçam a vida. Isso motiva a pesquisa científica sobre a função plaquetária e o desenvolvimento de métodos para rastrear processos biológicos celulares, pois ocorrem em condições de fluxo.
Uma variedade de modelos de fluxo estão disponíveis para o estudo da adesão e agregação de plaquetas, dois fenômenos-chave na biologia das plaquetas. Este trabalho descreve um método para estudar a degranulação de plaquetas em tempo real sob fluxo durante a ativação. O método faz uso de uma câmara de fluxo acoplada a uma configuração de bomba de seringa que é colocada sob um microscópio de fluorescência à base de LED de campo largo e invertido. A configuração descrita aqui permite a excitação simultânea de múltiplos fluoróforos que são administrados por anticorpos marcados com fluorescência ou fluorescentesCorantes. Após experiências de imagem de células vivas, os óculos de cobertura podem ser processados e analisados usando microscopia estática (por exemplo , microscopia confocal ou microscopia eletrônica de varredura).
Introduction
As plaquetas são células anucleadas que circulam na corrente sanguínea. Sua principal função é selar as rupturas vasculares em locais de lesão e prevenir a perda de sangue. Nesses locais de lesão, as fibras subendoteliais de colágeno tornam-se expostas e são posteriormente cobertas pela proteína multimérica, o fator von Willebrand (VWF). O VWF interage com as plaquetas em circulação em um mecanismo que depende do complexo de glicoproteína Ibα-IX-V na superfície celular 1 , diminuindo a velocidade das plaquetas. Isto é particularmente importante a altas taxas de cisalhamento. As plaquetas subseqüentemente sofrem alterações morfológicas enquanto recebem impulsos ativadores do colágeno. Isso leva a disseminação irreversível e, eventualmente, a agregação de plaquetas. Ambos os processos dependem da secreção de conteúdos de grânulos para facilitar a interferência plaquetária-plaquetas. Entre outros, os grânulos α plaquetários contêm fibrinogênio e VWF para auxiliar a adesão plaquetária e a ponteAs plaquetas juntas de uma maneira dependente da integrina. Os grânulos densos de plaquetas contêm compostos inorgânicos 2 , incluindo o difosfato de adenosina e cálcio (ADP), que ajudam a reforçar a ativação plaquetar. Além disso, as plaquetas contêm mediadores da inflamação (alérgica) 3 , proteínas de controle do complemento 4 e fatores de angiogênese 5 , 6 , aumentando as questões de se e como esses conteúdos são diferencialmente liberados em condições variáveis.
Desde a década de 1980, o estudo da função plaquetária em modelos de fluxo tem sido valioso para a investigação de mecanismos trombóticos 7 . Desde então, muitos progressos técnicos foram feitos e os modelos de fluxo que incluem a formação de fibrina são atualmente desenvolvidos para testar o potencial hemostático de concentrados de plaquetas terapêuticas ex vivo 8 ou paraInvestigar a influência de distúrbios nas taxas de cisalhamento na morfologia do trombo 9 . As diferenças nos mecanismos moleculares e biológicos celulares que conduzem a adesão estável e formação de trombo fisiológico (hemostasia) versus formação de trombo patológico (trombose) podem ser muito sutis e motivar o desenvolvimento de modelos de fluxo que permitam a visualização em tempo real desses sub-celulares Processos.
Um exemplo de um processo para o qual essa configuração seria valiosa é a (re) distribuição de polifosfato intracelular e o recrutamento de fatores de coagulação para descobrir o impacto dependente do tempo que isso tem na ultraestrutura da fibrina 10 . Os estudos geralmente são limitados a análises de ponto final. O objetivo principal do método descrito é habilitar a pesquisa visual em tempo real de processos subcelulares dinâmicos que ocorrem durante a ativação plaquetária sob fluxo.
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Protocol
O Comitê de Ética Médica local do Centro Médico Universitário de Utrecht aprovou o desenho de sangue para fins de pesquisa ex vivo , incluindo aqueles deste estudo.
1. Preparação da solução
- Prepare um tampão de Tyrode do ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) por dissolução de HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM e D- Glicose em água destilada.
- Faça duas variantes do buffer: ajuste os níveis de pH em 6,5 e em 7,4, respectivamente. Faça um novo buffer para cada dia de experimentos. Suplementar com prostaciclina a 10 ng / mL quando indicado.
- Prepare solução salina tamisada com TRIS (TBS) dissolvendo Tris 50 mM e NaCl 150 mM em água destilada e ajuste o pH para 9,0.
- Prepare o citrato de ácido dextrose (ACD) dissolvendo citrato de tri-sódio 85 mM, ácido cítrico 71 mM e D-glucose 111 mM nissoÁgua cultivada.
- Prepare uma solução fixadora adicionando 2% (v / v) de paraformaldeído (PFA) ao tampão HEPES Tyrode, pH 7,4. Aquecer para dissolver (50 - 70 ° C) e ajustar o pH para 7,4. Alíquota e armazene a -20 ° C. Descongelar a 37 ° C antes de usar.
- Prepare o tampão de bloqueio dissolvendo albumina de soro humano (HSA) a 1% (m / v) no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4
- Faça uma solução de álcool polivinílico adicionando 4,8 g de álcool polivinílico a 12 g de glicerol e misture bem. Adicione 12 ml de água destilada e deixe-o em um rotador à temperatura ambiente durante a noite.
- Adicionar 24 mL de Tris-HCL 0,2 M, pH 8,5. Aquecer até 50 ° C enquanto se mistura durante 30 min. Adicione 1,25 g de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) e misture bem. Centrifugar a 1.500 xg por 5 min. Alíquota do sobrenadante (1 mL é suficiente para lâminas 15-20) e armazene a -20 ° C. Use as alíquotas uma vez.
2. Preparação do vidro da tampa
- Descarte a tampaÓculos (25 x 50 mm 2 ) por incubação durante a noite em ácido cromossulfúrico não diluído. Enxaguar os óculos de cobertura com água destilada e secá-los durante a noite a 60 ° C no forno.
- Aderir a uma tira de uma película de parafina (10 x 15 cm 2 ) em cima de um banco de laboratório com uma gota de água e remover o ar alisando a película de parafina. Pipetar 80 μL de gotas de 10 μg / mL de VWF ou 100 μg / mL de fibrinogênio na película de parafina. Coloque os óculos nas gotas; A solução de proteína se espalhará entre as duas superfícies para cobrir toda a parte traseira do vidro. Incubar durante 1,5 h à temperatura ambiente (RT).
- Remova o filme de parafina e bloqueie os óculos de cobertura colocando-os, com o lado revestido para cima em uma placa de 4 poços com tampão de bloqueio. Incubar durante 1 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C. Como controle, bloqueie um copo de cobertura que não tenha sido revestido com VWF ou fibrinogênio.
3. Preparação de Plasma rico em plaquetas (PRP)
NOTA: Após a centrifugação, três camadas podem ser observadas (de cima para baixo): PRP, glóbulos brancos e glóbulos vermelhos. Certifique-se de não incluir as células brancas e vermelhas. Tipicamente, 3 mL de PRP podem ser coletados após centrifugação de um tubo de sangue de 9 ml.
NOTA: Tipicamente, podem ser coletados 2 mL após este segundo passo de centrifugação.
NOTA: O volume total de PRP diluído depende da contagem de plaquetas do doador. As contagens de plaquetas variam amplamente entre os doadores e a diluição do PRP exige uma avaliação individual. As contagens de plaquetas são consideradas normais quando dentro de 150.000 e 450.000 plaquetas / μL.
4. Preparação de plaquetas lavadas
- Determine o volume médio de plaquetas (MPV) no PRP usando um analisador de células.
NOTA: Este é um indicador de pré-ativação plaquetária 11 . Um MPV normal para plaquetas em repouso é 7.5-11.5 fL 11 . O MPV não deve aumentar em mais de 1,5 fL durante o procedimento de lavagem de plaquetas. - Adicione um volume 1/10 de ACD ao PRP para evitar a pré-ativação das plaquetas e centrifugue por 15 min a 400 xg e RT sem freio. Remova o suPernatant e re-suspende o grânulo cuidadosamente no tampão de HEPES Tyrode, pH 6,5, ao volume original de PRP.
- Destilar uma alíquota de prostaciclina por adição de TBS a uma concentração de 10 μg / mL; Mantenha-o no gelo.
- Para evitar a ativação plaquetária, adicione prostaciclina em uma concentração final de 10 ng / mL às plaquetas re-suspensas e centrifugue imediatamente por 15 min a 400 xg e RT sem freio. Remova o sobrenadante e volte a suspender o grânulo com cuidado no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4.
- Contar o número de plaquetas (passo 3.5) e determinar a alteração no MPV (passo 4.1) (o MPV não deve mudar mais de 1,5 fL).
- Ajuste o número de plaquetas com o tampão HEPES Tyrode, pH 7,4, para uma concentração de 150 000 plaquetas / μL. Deixe as plaquetas se recuperar durante 30 minutos à RT antes dos experimentos. Use plaquetas lavadas para experiências dentro de 4 h após o isolamento.
5. Conjunto da câmara de fluxo
12 . Pode ser utilizada uma variedade de câmaras de fluxo produzidas comercialmente, desde que possam conter uma tampa de vidro, que preferencialmente é removível para análises adicionais. A câmara de fluxo utilizada para as experiências descritas é feita a partir de poli (metacrilato de metilo) para ajustar precisamente uma fase de inserção do microscópio. Contém uma entrada e saída ( Figura 1A - C ; 1, 2), bem como uma conexão a vácuo ( Figura 1A e C ; 3). Uma folha de silicone personalizada ( Figura 1A e D ; 4) é colocada no topo. Dois recortes formam canais de vácuo ( Figura 1A e D ; 5) para fixar firmemente a tampa do vidro ( Figura 1A ; 6). Um corte central forma o canal de fluxo ( Figura 1A D ; 7; 2,0 mm de largura e 0,125 mm de altura). A entrada e a saída estão conectadas ao canal de fluxo, e o vácuo está conectado ao canal de vácuo.
- Cubra a parte superior da câmara de fluxo com água destilada e coloque a folha de silicone personalizada com o lado liso na água. Flutue a folha na posição removendo o excesso de água enquanto mantém a folha na posição.
NOTA: Esta folha de silicone é reutilizável (o silicone é conhecido por suas propriedades inertes); Geralmente, as plaquetas não foram observadas para anexar a ela. As folhas podem ser limpas com detergente e reutilizadas até que o material fique danificado ( isto é, rasgando, especialmente na área entre os canais). Geralmente, uma folha pode ser usada por 20 dias com múltiplas experiências por dia. - Incubar a câmara de fluxo durante 1 h a 60 ° C para evaporar a água residual para aderir firmemente a folha de silicone à câmara de fluxo.
- Com uma pipeta Pasteur de plástico, adicione uma gota deHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, no canal de fluxo. Coloque o vidro da tampa (consulte a seção 2) com o lado revestido para baixo, no canal de fluxo. Conecte a bomba de vácuo à conexão de vácuo ( Figuras 1A e C ; 3). Aplique uma pressão de ~ 10 kPa.
6. Pré-coloração das plaquetas e preparação dos anticorpos
- Coloração de plaquetas
- Incubar as plaquetas lavadas com 10 μg / mL de DAPI durante 30 min a 37 ° C no escuro. Para lavar a DAPI não ligada e prevenir a ativação plaquetária, adicione prostaciclina a uma concentração final de 10 ng / mL e centrifugue imediatamente por 15 min a 400 xg e RT sem freio.
- Reconstitua o sedimento de plaquetas no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4, a uma concentração de plaquetas de 150 000 plaquetas / μL.
- Preparação de anticorpos
- Misture o anticorpo marcado com biotina com estreptoma marcada com AlexaTavidina numa proporção molar de 1: 1. Incubar durante um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente antes da utilização (passo 7.6).
NOTA: A eficiência da rotulagem da biotina pode variar entre diferentes lotes. Caso haja problemas com a visualização de moléculas alvo, as experiências de controle devem ser realizadas para confirmar a biotinilação bem sucedida, bem como as propriedades de ligação ao alvo do anticorpo biotinilado específico.
- Misture o anticorpo marcado com biotina com estreptoma marcada com AlexaTavidina numa proporção molar de 1: 1. Incubar durante um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente antes da utilização (passo 7.6).
7. Perfusão
- Comece o microscópio de fluorescência, bem como o software do microscópio. Use as configurações do microscópio listadas na Tabela 1 .
NOTA: Inicie o microscópio e as configurações de gravação para a visualização e registro das plaquetas e os anticorpos e / ou corantes marcados fluorescentemente escolhidos, carregando um experimento apropriado no software do microscópio. Execute experiências de fluxo na RT. - Bloqueie a tubulação de entrada conectando uma seringa de 10 mL à tubulação e aspirando 1% de HSA bloNo buffer de entrada. Incube durante 15 minutos à TA. Enxaguar o tubo de entrada aspirando o tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4, no tubo de entrada.
- Conecte o tubo de entrada bloqueado e o tubo de saída não tratado, ambos com um diâmetro de 1,02 mm e um comprimento de ~ 20-30 cm para a entrada e saída da câmara. Conecte uma seringa de 10 mL (ou menor volume para mais precisão) ao tubo de saída. Alimentar a bomba da seringa.
NOTA: O diâmetro da seringa, em combinação com o caudal ajustado na bomba, determina o caudal volumétrico. Juntamente com a área de superfície do canal de fluxo, a taxa de cisalhamento pode ser calculada de acordo com a fórmula 13 abaixo. Por isso, é possível manipular a taxa de cisalhamento alterando o caudal da bomba da seringa ou alterando as dimensões do canal de fluxo. Uma taxa de cisalhamento de 800-1,600 s -1 tipicamente modelos para o fluxo sanguíneo arterial, enquanto 25 - 100 modelos s-1 para sangue venosofluxo. Para esta configuração, uma taxa de fluxo de 7,5 μL / min resulta em uma taxa de cisalhamento de 25 s -1 .
Taxa de cisalhamento = 6Q / h 2 w em s -1
Em que: Q = taxa de fluxo volumétrico (mL / s), h = canal de altura (cm) (0,0125 cm, esta é a espessura da folha de silicone), w = largura do canal (cm) (0,2 cm nesta câmara). - Coloque uma gota de óleo de imersão em um objetivo de 100X (amplificação total de 1.000X) e monte a câmara no microscópio com a superfície de vidro para baixo.
- Coloque a tubulação de entrada em um tubo contendo tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. Puxe manualmente o êmbolo da seringa conectado ao tubo de saída e puxe a solução através da câmara para remover o ar do sistema. Coloque a seringa na bomba de seringa ( Figura 1B e C ; 8) e execute a bomba brevemente para apertar o êmbolo e garantir um fluxo estável.
- Adicionar anticorpos e / ou corantes à suspensão de plaquetas ou PRP, cuidadosamenteMisture com uma pipeta de plástico e transfira a mistura para um tubo de 1,5 mL.
NOTA: Para uma perfusão típica de 30 min a taxa de cisalhamento 25 s-1 (7,5 μL / min), é necessário um mínimo de 225 μL de suspensão de plaquetas. Os anticorpos utilizados para os resultados representativos são mostrados na Tabela 2 . - Mova o tubo de entrada, enquanto aperta, do tampão HEPES Tyrode, pH 7,4, para um tubo de 1,5 mL contendo PRP ou as plaquetas lavadas e os anticorpos e / ou corantes ( Figura 1B e C ; 9).
NOTA: É importante que, ao transferir a tubulação, a tubulação seja espremida (pressionando o ar) para evitar que o ar entre na tubulação. É possível tratar plaquetas aderentes com uma variedade de reagentes em um passo subsequente, movendo o tubo de entrada para outro tubo de maneira semelhante. Uma lista de reagentes potencialmente úteis é fornecida na Tabela 3 . - Selecione a "visualização ao vivoN "no software, focalize o microscópio na superfície do vidro revestido revestido e inicie a bomba a uma taxa de cisalhamento de 1.600 s-1 (484 μL / min) até que as plaquetas atinjam a câmara de fluxo. Neste momento, Reduzir a taxa de cisalhamento de volta para 25 s-1 alterando as configurações da bomba da seringa para um caudal de 7,5 μL / min.
- Monitore a superfície do lado revestido do vidro da tampa, espere até que a primeira plaquetas comece a aderir, aponte o microscópio para esta plaquetas e comece a gravar iniciando a experiência no software. Consulte a Tabela 1 para as configurações de gravação usadas aqui.
- Siga a gravação ao vivo visualmente. Após 30 min, pare a bomba da seringa.
NOTA: Certifique-se de que as plaquetas permanecem em foco durante o curso da experiência. Normalmente, 20-30 plaquetas se ligam no campo de visão com uma ampliação de 1.000X; Isto é cerca de 2.000-3.000 plaquetas em todo o canal de fluxo. - Fixação usandoA câmara de fluxo (opcional).
- Quando o fluxo parou depois que a bomba da seringa é parada, transfira a tubulação de entrada (sem ar) para a solução fixadora. Reinicie a bomba e circule o tampão de fixação através do canal por um mínimo de 10 minutos com o mesmo caudal mencionado no passo 7.8.
- Remova a câmara do microscópio, limpe o óleo de imersão do vidro, desconecte o vácuo e remova cuidadosamente o vidro da tampa com uma agulha de 18 G.
NOTA: Evite que o vidro da tampa quebre e danifique a folha de silicone. - Coloque o slide da tampa (com as células direcionadas para cima) em uma placa de 4 poços em cima de um tecido, pré-molhado com água destilada.
NOTA: Isso evita que o vidro da tampa adira à superfície do poço e evita a secagem. - Pipetar 750 μL de solução fixadora no topo do vidro da tampa e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Caso as amostras não possam ser analisadas diretamente,Guarde-os em 0,5% de PFA (diluído pelo tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C para garantir uma fixação estável. Proceda à seção 8 para processar o vidro da tampa para imagens.
- Após o uso, enxágue a câmara, a tubulação e a folha com água destilada e incube durante a noite em uma solução detergente. Antes da reutilização da câmara e de outros componentes, enxaguar com água destilada.
- Salve os arquivos de dados brutos do microscópio contendo todos os metadados. Quando necessário, exporte os filmes para .MOV, h.264 comprimido ou .AVI descompactado. Guarde quadros separados como arquivos JPEG ou TIF.
8. Preparação de Amostras para Microscopia de Fluorescência Confocal
- Transfira os óculos de cobertura para placas novas de 4 poços e enxágue 5 vezes com 3 mL de tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. Adicione 3 mL / poço de tampão de bloqueio e incube durante 1 h à TA.
- Remova o buffer de bloqueio; Adicionar 3 mL / poço de 0,15% de glicina (M / V) no tampão HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubar durante 15 minutos em RT.
- Retire a solução de glicina e lave 5 vezes em 3 mL / poço de tampão de bloqueio. Opcionalmente, adicione anticorpos conjugados com fluoróforos diluídos em tampão de bloqueio para coloração adicional. Incube durante 1 h à RT no escuro.
- Lavar 5 vezes com tampão de bloqueio e 2 vezes com água destilada. Secar o vidro removendo o excesso de líquido com um tecido (das bordas para dentro), sem tocar nas células.
- Pipetar 60 μL de solução de álcool polivinílico em uma lâmina de microscópio. Coloque a tampa de vidro, com as células para baixo, em cima da gota e deixe o álcool polivinílico se espalhar entre as duas superfícies. Incube durante a noite na RT no escuro.
- Analisar as células por microscopia confocal 14 .
- Salve os arquivos de dados brutos dos dados da pilha gravada contendo todos os metadados. Quando necessário, processe os arquivos de dados brutos nos arquivos MOV, h.264 comprimidos ou .AVI descompactados. Guarde pilhas separadas como arquivos JPEG ou TIF.
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Representative Results
A Figura 1 mostra imagens da câmara de fluxo e configuração experimental; A posição e as dimensões da folha de silício; E conexões de tubulação. A Figura 2 fornece detalhes sobre as dimensões da câmara de fluxo. A Figura 3 eo Filme 1 mostram uma série de imagens de adesão plaquetária e propagação em VWF imobilizado. CD63 é uma proteína transmembranar que é inserida na membrana de grânulos densos intracelulares de plaquetas em repouso 15 . Sua mobilização dependente do tempo na superfície das plaquetas é mostrada em verde. Da mesma forma, a P-selectina (Psel) é uma proteína transmembrana inserida na membrana de grânulos α intracelulares de plaquetas em repouso. Sua mobilização dependente do tempo na superfície das plaquetas é mostrada em laranja. A Figura 3B mostra uma imagem representativa com um ângulo de 45 °, Adquirida por microscopia de fluorescência confocal após uma experiência de fluxo. O filme 2 mostra uma série de inclinação da mesma experiência. Note-se que o CD63 está localizado principalmente no granulometro central, enquanto a P-selectina é distribuída em todo o corpo da célula e parece concentrada nas bordas. A Figura 4A e o filme 3 mostram a mobilização dependente do tempo de CD63 na superfície da plaquetas (verde). Nestas experiências, as plaquetas (que não possuem DNA nuclear) foram pré-incubadas com DAPI (azul), que mancha o polifosfato em grânulos densos 16 . Notavelmente, apesar de sinais claros de liberação de grânulos densos (as análises de célula única são mostradas na Figura 4B e no Filme 4 ), o polifosfato é retido dentro ou por fora dessas plaquetas. A Figura 5 e o filme 5 mostram a mobilização (ou recrutamento) dependente do tempo de VWF, uma combinação trombogênicaProteína imérica 17 armazenada em grânulos a, na superfície da plaquetas (verde). Semelhante ao polifosfato, o VWF permanece associado à superfície das plaquetas ativadas.
Figura 1: Câmara de fluxo e configuração experimental. ( A ) Imagem do design da câmara de fluxo com uma entrada e saída (1 e 2), uma conexão de vácuo (3) na qual a folha de silicone (4) é colocada. Dois cortes externos (5) na folha de silicone formam os canais de vácuo para fixar o vidro da tampa (6). Um recorte central (7) forma o canal de fluxo ( B ) Imagem da configuração experimental. Entrada e saída (1 e 2), bomba de seringa (8) e suporte da amostra (9). ( C ) Visão geral esquemática da configuração experimental; Os números são idênticos aos de A e B. ( D ) Visão geral esquemática com a dimensão Da folha de silicone cortada personalizada. ( E ) Visão geral esquemática geral da câmara de fluxo de poli (metacrilato de metilo) . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Modelo detalhado da câmara de fluxo. A câmara de fluxo consiste em um bloco de poli (metacrilato de metilo) (1) , um inserto de polioximetileno reto para a entrada de vácuo (2) e duas inserções de polioximetileno em ângulo para a entrada e saída de amostra (3) . As inserções angulares de polioximetileno contêm tubos capilares metálicos, com diâmetros de 1,07 mm. A inserção recta contém um tubo capilar com um diâmetro de 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição plaquetária e degradação do fator de von Willebrand imobilizado. ( A ) Mobilização dependente do tempo de CD63 e P-selectina na superfície de espalhamento e degranulação de plaquetas. A barra de escala branca (superior esquerda) indica 10 μm. ( B ) Imagem de microscopia de fluorescência confocal representativa com um ângulo de 45 °. A barra de escala branca (inferior esquerda) indica 2 μm. Verde, CD63; Laranja, P-selectina. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Figura 4: Espalhamento plaquetário, desgranulação e mobilidade de grânulos densos em fibrinogênio imobilizado. ( A ) Mobilização dependente do tempo de CD63 e polifosfato na superfície das plaquetas. A barra de escala branca (superior esquerda) indica 10 μm. ( B ) Série temporal de uma única plaquetas (t = 0 representa a primeira adesão à superfície). A barra de escala branca (inferior direita) indica 2 μm. Verde, CD63; Azul, DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 5: Associação de superfície do fator von Willebrand na superfície plaquetária do Fibrinogênio imobilizado. Mobilização dependente do tempo (ou recrutamento) de VWF para a superfície das plaquetas. TA barra de escala branca (superior esquerda) indica 5 μm. Verde, VWF. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
| Configuração | Valor |
| Tempo de exposição FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensidade FITC (Alexa488) | 50% |
| Tempo de exposição DIC | 30 ms |
| Lâmpada de halogéneo de voltagem | 4,5 Volt |
| Tempo de exposição TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| Intensidade LED 555 FITC (Alexa546) | 50% |
| Tempo de exposição DAPI | 500 ms |
| Intensidade do LED 365 | 50% |
| FITC Filterset | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Objetivo | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Óleo |
| Taxa de quadros, tempo de gravação | 1 quadro / 10 s, 30 min |
| Filmes de compressão de arquivos | MOV (h.264), AVI (descompactado) |
| Imagens de compressão de arquivos | JPEG, TIF |
Tabela 1: configurações do microscópio. Configurações usadas para experiências representativas.
| Alvo | Anticorpo / Tintura | Concentração |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotin *)325 ng / mL | |
| P-selectina | Anti-CD62P-biotina **) | 90 ng / mL |
| DNA | DAPI | 10 μg / mL |
| VWF | VWF-FITC anti-humano | 5 μg / mL |
| *) Anticorpo anti-CD63-biotina é misturado com estreptavidina-Alexa488 numa proporção molar de 1: 1 antes do uso | ||
| **) o anticorpo anti-CD62P-biotina é misturado com estreptavidina-Alexa546 numa proporção molar de 1: 1 antes do uso | ||
Tabela 2: Anticorpos e corantes. Concentrações recomendadas de anticorpos e corantes para as experiências representativas mostradas.
| Categoria Reagente | Exemplo de compoUnds |
| Agonistas de plaquetas | Peptídeos ativadores de trombina, ADP, PAR-1 ou -4, U46619, Thromboxane A2, ADP |
| Inibidores de enzimas | Hirudina, PPACK, heparinoides (indireta), inibidor de tripsina de milho, inibidor de tripsina de soja |
| Antagonistas dos receptores | Anti-Glyprotein 1bα, anti-Glycoprotein VI; Clopidogrel, péptidos (cíclicos) contendo RGD |
| Inibidores de ativação | Pretratamento de aspirina, fixação |
Tabela 3: Reagentes potencialmente úteis.
Filmes suplementares: filme 1: séries temporais de imagens de plaquetas (veja a figura 1 ), filme 2: série inclinada da figura 3B , filme 3: mobilização dependente do tempo de CD63 na plaquetasSuperfície (veja a Figura 4 ), filme 4: séries temporais de análises de célula única (veja a Figura 4B ), filme 5: mobilização dependente do tempo de VWF (veja a Figura 5 ).
Clique aqui para baixar o filme 1.
Clique aqui para baixar o filme 2.
Clique aqui para baixar o filme 3.
Clique aqui para baixar o filme 4.
Clique aqui para baixar o filme 5.
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Discussion
Em todo o mundo, a trombose é uma das principais causas de morte e morbidade, e as plaquetas desempenham um papel central no seu desenvolvimento. Este trabalho descreve um método para a imagem de células vivas de degranulação de plaquetas sob fluxo. Em geral, assume-se que, quando as plaquetas se ativam, todos os conteúdos granulares são liberados diretamente na solução. Os resultados que acompanham sugerem que este não é necessariamente o caso. Durante a adesão e degranulação, as plaquetas retêm uma quantidade significativa de polifosfato ( Figura 4 ). Além disso, a proteína multimérica VWF está associada à superfície das plaquetas após a degranulação ( Figura 5 ). Isso indica que os mecanismos moleculares que controlam a degranulação dos grânulos de plaquetas são mais sutis do que os geralmente assumidos.
Para permitir a formação de células vivas de degranulação plaquetária sob fluxo, as condições experimentais foram selecionadas para manter a agregação plaquetária no mínimo. País de plaquetasSão utilizados 150 mil plaquetas / μL. Esta é a extremidade inferior do intervalo normal (150,000-450,000 plaquetas / μL). Além disso, a adesão e espalhamento de plaquetas foram estudadas sobre VWF ou fibrinogênio imobilizado, o que levou à ativação leve de plaquetas (em contraste, por exemplo, colágeno). Em estudos com plaquetas lavadas, as taxas de cisalhamento aumentadas movem essas células para o centro do fluxo. Isso interfere na adesão e subseqüente propagação e complica a investigação da degranulação.
Na hemostasia fisiológica, a marcação das plaquetas é importante. Este processo é conduzido por eritrócitos, explicando por que a baixa anemia às vezes é acompanhada por uma diátese hemorrágica. Uma limitação da técnica apresentada é que a visualização da degranulação das plaquetas (com os materiais e reagentes apresentados) é perturbada pelos glóbulos vermelhos. A função plaquetária é influenciada pelo esforço de cisalhamento, que é função da viscosidade do fluido (μ), bem comoDa taxa de cisalhamento. Por isso, recomenda-se estudar a função plaquetária em modelos de fluxo em soluções com viscosidades comparáveis (p. Ex., Plaquetas lavadas, sangue reconstituído, PRP ou sangue total).
Existem vários fatores práticos a serem considerados ao realizar essas experiências. Primeiro, os sinais de fluorescência são fortemente influenciados pela área de foco. Se o microscópio não estiver em foco, o sinal é facilmente borrado ou mesmo perdido. Antes da chegada das plaquetas ao canal de fluxo, é melhor focar o canal em si (começar na borda da parede do canal de silício / canal de fluxo). Quando as plaquetas começam a aderir, concentre-se neste evento de adesão. Um segundo ponto de preocupação é o branqueamento de certos fluoróforos ( por exemplo, FITC). A excitação repetida levará a uma perda de sinal, perturbando a investigação. Esses obstáculos podem ser superados usando fluoróforos mais estáveis, reduzindo a intensidade da excitante luz LED, reduzindo a expTempos de gravação e / ou diminuir a taxa de quadros.
O modelo aqui descrito é muito útil para realizar um estudo detalhado das respostas das plaquetas a uma grande variedade de proteínas imobilizadas e a diferentes taxas de fluxo. Potencialmente, esse método também pode ser usado para estudar sua interação com células endoteliais ativadas 18 . Os avanços técnicos que permitem os projetos flexíveis das câmaras de fluxo especiais estão abrindo avenidas para estudos de biocompatibilidade 19 . A imagem em células vivas da reatividade plaquetária sob fluxo revelará informações valiosas sobre a complexidade da resposta de adesão plaquetária. Em última análise, essas experiências devem levar ao desenvolvimento de modelos experimentais de fluxo que permitem a investigação combinada de função plaquetária e influência no sistema de coagulação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O CM reconhece o apoio financeiro da Organização Internacional de Pacientes para Deficiências de Inibidores de C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e a Fundação Landsteiner para Pesquisa de Transfusão de Sangue (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
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