Summary
Detta arbete beskriver en fluorescensmikroskopibaserad metod för studier av trombocytadhesion, spridning och utsöndring under flöde. Denna mångsidiga plattform möjliggör undersökning av trombocytfunktion för mekanisk forskning om trombos och hemostas.
Abstract
Blodplättar är viktiga aktörer i hemostas, bildandet av trombi för att försegla vaskulära brott. De är också involverade i trombos, bildandet av trombi som ockluderar kärlsystemet och skadade organ, med livshotande konsekvenser. Detta motiverar vetenskaplig forskning om trombocytfunktion och utveckling av metoder för att spåra cellbiologiska processer som de uppträder under flödesförhållanden.
En mängd olika flödesmodeller finns tillgängliga för studier av trombocytadhesion och aggregering, två nyckelfenomen i blodplättsbiologi. I det här arbetet beskrivs en metod för att studera realtid i blodplättens degranulering under flöde under aktivering. Metoden använder sig av en flödeskammare kopplad till en sprutpumpuppsättning som placeras under ett brettfält, inverterat, LED-baserat fluorescensmikroskop. Inställningen som beskrivs här möjliggör samtidig excitering av flera fluoroforer som levereras av fluorescensmärkta antikroppar eller fluorescensEntfärger. Efter experiment med levande celler kan täckglasen bearbetas vidare och analyseras med statisk mikroskopi ( dvs. konfokal mikroskopi eller scanningelektronmikroskopi).
Introduction
Blodplättar är anukleatceller som cirkulerar i blodflödet. Deras huvudsakliga funktion är att försegla vaskulära brott mot skadedjur och förhindra blodförlust. Vid dessa skadeställor blir subendoteliala kollagenfibrer exponerade och täcks därefter av det multimera proteinet, von Willebrand-faktorn (VWF). VWF interagerar med blodplättarna i omlopp i en mekanism som beror på glykoprotein Iba-IX-V-komplexet på cellytan 1 , vilket sänker hastigheten hos blodplättarna. Detta är särskilt viktigt vid höga skjuvhastigheter. Plättarna genomgår därefter morfologiska förändringar under mottagning av aktiveringsimpulser från kollagen. Detta leder till irreversibel spridning och så småningom till trombocytaggregation. Båda förfarandena beror på utsöndringen av granulainnehåll för att underlätta trombocyt-trombocytkroppsstörning. Bland annat innehåller blodplätts-a-granuler fibrinogen och VWF för att hjälpa trombocytadhesion och att överbryggaBlodplättar tillsammans på ett integrationsberoende sätt. De trombocyt-täta granulerna innehåller oorganiska föreningar 2 , innefattande kalcium och adenosindifosfat (ADP), vilket bidrar till att förstärka trombocytaktivering. Vidare innehåller trombocyter mediatorer av (allergisk) inflammation 3 , komplementskontrollande proteiner 4 och angiogenesfaktorer 5 , 6 , som lyfter frågan om huruvida och hur dessa innehåll är differentiellt frisläppta under varierande förhållanden.
Sedan 1980-talet har studien av trombocytfunktion i flödesmodeller varit värdefull för undersökningen av trombotiska mekanismer 7 . Sedan dess har mycket tekniska framsteg gjorts och flödesmodeller som innefattar fibrinbildning utvecklas för närvarande för att analysera den hemostatiska potentialen av terapeutiska blodplättskoncentrat ex vivo 8 eller tillUndersöka påverkan av störningar i skjuvhastigheter på trombusmorfologi 9 . Skillnaderna i molekylära och cellbiologiska mekanismer som driver stabil vidhäftning och fysiologisk trombbildning (hemostas) mot patologisk trombbildning (trombos) kan vara mycket subtila och motivera utvecklingen av flödesmodeller som möjliggör realtidsvisualisering av dessa subcellulära processer.
Ett exempel på ett förfarande för vilket en sådan inställning skulle vara värdefull är (åter) fördelningen av intracellulärt polyfosfat och rekryteringen av koagulationsfaktorer för att avslöja den tidsberoende påverkan som detta har på fibrin-ultrastruktur 10 . Studier är ofta begränsade till slutpunktsanalyser. Huvudsyftet med den beskrivna metoden är att möjliggöra realtidsvisuell undersökning av dynamiska subcellulära processer som äger rum under blodplättsaktivering under flöde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den lokala medicinska etiska kommittén vid Universitetssjukhuset Utrecht godkände teckning av blod för ex vivo forskningsändamål, inklusive studierna.
1. Lösningsberedning
- Förbered en 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) Tyrodes buffert genom att lösa 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2 HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 och 5,55 mM D- Glukos i destillerat vatten.
- Gör två varianter av bufferten: sätt pH-nivåerna vid 6,5 respektive 7,4. Gör ny buffert för varje experimentdag. Supplement med 10 ng / ml prostacyklin, där det anges.
- Beredda TRIS-buffrad saltlösning (TBS) genom att lösa 50 mM Tris och 150 mM NaCl i destillerat vatten och justera pH till 9,0.
- Förbered syracitrat dextros (ACD) genom att lösa 85 mM tri-natriumcitrat, 71 mM citronsyra och 111 mM D-glukos i disBetongvatten.
- Förbered en fixativ lösning genom att tillsätta 2% (v / v) paraformaldehyd (PFA) till HEPES Tyrode buffert, pH 7,4. Värm att lösa upp (50 - 70 ° C) och sätt pH till 7,4. Aliquot och lagra vid -20 ° C. Tina vid 37 ° C före användning.
- Förbered blockeringsbuffert genom att lösa 1% (m / v) humant serumalbumin (HSA) i HEPES Tyrode buffert, pH 7,4
- Gör en polyvinylalkohollösning genom att tillsätta 4,8 g polyvinylalkohol till 12 g glycerol och blanda väl. Tillsätt 12 ml destillerat vatten och låt det stå på en rotator vid rumstemperatur över natten.
- Tillsätt 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Värm till 50 ° C under blandning i 30 minuter. Tillsätt 1,25 g 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) och blanda väl. Centrifugera vid 1500 xg i 5 min. Aliquot supernatanten (1 ml är tillräcklig för 15-20 glidbanor) och förvaras vid -20 ° C. Använd alikvoterna en gång.
2. Cover Glass Preparation
- AvfallsskyddGlasögon (25 x 50 mm 2 ) genom att inkubera över natten i outspädd kromosvavelsyra. Skölj skyddsglasögonen med destillerat vatten och torka dem över natten vid 60 ° C i en ugn.
- Håll en remsa av en paraffinfilm (10 x 15 cm 2 ) ovanpå en laboratoriebänk med en droppe vatten och avlägsna luften genom att utjämna paraffinsfilmen. Pipettera 80 μl droppar 10 μg / ml VWF eller 100 μg / ml fibrinogen på paraffinfilmen. Placera glasögonen på dropparna; Proteinlösningen kommer att spridas mellan de två ytorna för att täcka hela baksidan av glaset. Inkubera i 1,5 h vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort parafinfilmen och blockera skyddsglasögonen genom att placera dem, med den belagda sidan uppåt i en 4-brunnsplatta med blockeringsbuffert. Inkubera i 1 h vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C. Som en kontroll, blockera ett täckglas som inte har belagts med VWF eller fibrinogen.
3. Framställning av blodplättrik plasma (PRP)
OBS: Efter centrifugering kan tre skikt observeras (från topp till botten): PRP, vita blodkroppar och röda blodkroppar. Se till att inte inkludera de vita och röda cellerna. Typiskt kan 3 ml PRP uppsamlas efter centrifugering av ett 9 ml blodrör.
OBS: Typiskt kan 2 ml uppsamlas efter detta andra centrifugeringssteg.
OBS: Den totala volymen av utspädd PRP beror på donatorns blodplättantal. Antalet blodplättar varierar mycket mellan givare och PRP-utspädning kräver bedömning individuellt. Trombocyträkningar anses vara normala när de är inom 150 000 och 450 000 trombocyter / μl.
4. Framställning av tvättade blodplättar
- Bestäm den genomsnittliga blodplättvolymen (MPV) i PRP med hjälp av en cellanalysator.
OBS! Det här är en indikator på blodplättsför aktivering 11 . En normal MPV för vilande blodplättar är 7,5-11,5 fL 11 . MPV bör inte öka med mer än 1,5 fL under trombocytvätskeproceduren. - Lägg till en 1/10 volym ACD till PRP för att förhindra trombocytför aktivering och centrifugering i 15 minuter vid 400 xg och RT utan broms. Ta bort suPernatant och åter suspendera pelleten försiktigt i HEPES Tyrode buffert, pH 6,5, till den ursprungliga volymen PRP.
- Tina en alikvot av prostacyklin genom att tillsätta TBS till en koncentration av 10 | ig / ml; Håll det på is.
- För att förhindra trombocytaktivering, tillsätt prostacyklin vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml till de återupptagna blodplättarna och centrifugera omedelbart i 15 minuter vid 400 xg och RT utan broms. Ta bort supernatanten och suspendera pelleten noggrant i HEPES Tyrode buffert, pH 7,4.
- Räkna antalet blodplättar (steg 3.5) och bestäm förändringen i MPV (steg 4.1) (MPV bör inte ändra mer än 1,5 fL).
- Justera antalet blodplättar med HEPES Tyrode buffert, pH 7,4, till en koncentration av 150 000 blodplättar / μl. Låt trombocyterna återhämta sig i 30 minuter vid RT före experimenten. Använd tvättade blodplättar för experiment inom 4 timmar efter isolering.
5. Flödeskammarmontering
12 . En mängd kommersiellt producerade flödeskammare kan användas så länge de kan hålla ett täckglas, vilket företrädesvis är avlägsningsbart för ytterligare analyser. Flödeskammaren som användes för de beskrivna försöken är gjord av poly (metylmetakrylat) för att exakt passa ett mikroskopinsättningssteg. Den innehåller ett inlopp och utlopp ( Figur 1A - C ; 1, 2), liksom en vakuumanslutning ( Figur 1A och C ; 3). Ett anpassat silikonplåt ( Figur 1A och D ; 4) placeras på toppen. Två utskurningar bildar vakuumkanaler ( Figur 1A och D ; 5) för att fästa täckglaset ( Figur 1A ; 6) tätt mot kammaren. En central utskjutning bildar strömningskanalen ( Figur 1A D ; 7; 2,0 mm bredd och 0,125 mm höjd). Inloppet och utloppet är anslutna till strömningskanalen och vakuumet är anslutet till vakuumkanalen.
- Täck överflödeskammarens topp med destillerat vatten och placera det anpassade silikonplåten med den släta sidan ner på vattnet. Flyta arket till plats genom att ta bort överskott av vatten medan du håller arket på plats.
OBS: Denna silikonplåt är återanvändbar (silikon är känd för sina inerta egenskaper); I allmänhet har blodplättar inte observerats att fästa vid den. Plåtarna kan rengöras med tvättmedel och återanvändas tills materialet blir skadat ( dvs riva, särskilt i området mellan kanalerna). I allmänhet kan ett ark användas i 20 dagar med flera experiment per dag. - Inkubera flödeskammaren i 1 h vid 60 ° C för att indunsta det kvarvarande vattnet för att fasta silikonplåten fast vid flödeskammaren.
- Lägg till en droppe med en plastpasteurpipettHEPES Tyrode buffert, pH 7,4, på flödeskanalen. Placera lockglaset (se avsnitt 2) med den belagda sidan neråt, på strömningskanalen. Fäst vakuumpumpen i vakuumanslutningen ( Figur 1A och C ; 3). Applicera ~ 10 kPa tryck.
6. Förfärgning av blodplättar och beredning av antikropparna
- Blodplättfärgning
- Inkubera de tvättade blodplättarna med 10 μg / ml DAPI i 30 minuter vid 37 ° C i mörkret. För att tvätta bort obundet DAPI och förhindra blodplättsaktivering, tillsätt prostacyklin vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml och omedelbart centrifugera i 15 min vid 400 xg och RT utan broms.
- Rekonstruera blodplättpelleten i HEPES Tyrode buffert, pH 7,4, till en blodplättskoncentration av 150 000 blodplättar / μl.
- Framställning av antikroppar
- Blanda biotin-märkt antikropp med Alexa-märkt strepTavidin vid ett molförhållande av 1: 1. Inkubera i minst 10 minuter vid rumstemperatur före användning (steg 7.6).
OBS! Biotin märkningseffektivitet kan variera mellan olika satser. Om det skulle finnas problem med visualisering av målmolekyler, bör kontrollförsök utföras för att bekräfta framgångsrik biotinylering, såväl målbindningsegenskaperna hos den specifika biotinylerade antikroppen.
- Blanda biotin-märkt antikropp med Alexa-märkt strepTavidin vid ett molförhållande av 1: 1. Inkubera i minst 10 minuter vid rumstemperatur före användning (steg 7.6).
7. Perfusion
- Starta fluorescensmikroskopet, såväl som mikroskopprogrammet. Använd de mikroskopinställningar som anges i tabell 1 .
OBS! Starta mikroskop och inspelningsinställningar för live-cell visualisering och inspelning av blodplättar och de valda fluorescensmärkta antikropparna och / eller färgämnena genom att ladda ett lämpligt experiment i mikroskopprogrammet. Utför flödesexperiment vid RT. - Blockera inloppsröret genom att ansluta en 10 ml spruta till röret och aspirera 1% HSA-bloCkingbuffert i inloppsröret. Inkubera i 15 min vid RT. Skölj inloppsröret genom att aspirera HEPES Tyrode buffert, pH 7,4, i inloppsröret.
- Anslut det blockerade inloppsröret och det obehandlade utloppsslangen, både med en diameter av 1,02 mm och en längd på ~ 20-30 cm till kammarens inlopp och utlopp. Anslut en 10 ml spruta (eller lägre volym för mer noggrannhet) till utloppsslangen. Sätt på sprutpumpen.
OBS: Sprutens diameter, i kombination med den flödeshastighet som är inställd på pumpen, bestämmer volymen flödeshastigheten. Tillsammans med flödeskanalens ytarea kan skjuvhastigheten beräknas enligt formeln 13 Nedan. Därför är det möjligt att manipulera skjuvhastigheten genom att ändra flödeshastigheten hos sprutpumpen eller ändra flödeskanalens dimensioner. En skjuvhastighet av 800-1 600 s -1 typiskt modeller för arteriellt blodflöde medan 25-100 s-1 modeller för venöst blodflöde. För denna inställning resulterar en flödeshastighet av 7,5 μl / min i en skjuvhastighet av 25 s -1 .
Skjuvhastighet = 6Q / h 2 w i s -1
Där: Q = volymflödeshastighet (ml / s), h = höjdhöjd (cm) (0,0125 cm, detta är silikonplastets tjocklek), w = breddskanal (cm) (0,2 cm i denna kammare). - Placera en droppe nedsänkningsolja på ett 100X-objektiv (totalförstärkning på 1000x) och montera kammaren på mikroskopet med glasytan nere.
- Placera inloppsröret i ett rör som innehåller HEPES Tyrode buffert, pH 7,4. Dra manuellt kolven på sprutan ansluten till utloppsslangen och dra lösningen genom kammaren för att ta bort luften från systemet. Placera sprutan i sprutpumpen ( Figur 1B och C ; 8) och kör pumpen kort för att dra åt kolven och se till att det är stabilt flöde.
- Lägg till antikroppar och / eller färgämnen till blodplättsuspensionen eller PRP, försiktigtBlanda med en plastpipett och överför blandningen till ett 1,5 ml rör.
ANMÄRKNING: För en typisk 30 min-perfusion vid skjuvhastighet 25 s-1 (7,5 pi / min) krävs minst 225 pi blodplättsuspension. De antikroppar som används för de representativa resultaten visas i tabell 2 . - Flytta inloppsröret, medan du klämmer, från HEPES Tyrode buffert, pH 7,4, till ett 1,5 ml rör innehållande antingen PRP eller de tvättade blodplättarna och antikropparna och / eller färgämnena ( Figur 1B och C ; 9).
OBSERVERA: Det är viktigt att tuben pressas genom att trycka ut luften när du överför röret för att förhindra att luft kommer in i röret. Det är möjligt att behandla vidhäftande blodplättar med en mängd olika reagens i ett efterföljande steg genom att flytta inloppsröret till ett annat rör på ett liknande sätt. En lista över potentiellt användbara reagens finns i tabell 3 . - Välj "live visualizatioN "-alternativet i mjukvaran, fokusera mikroskopet på ytan av det belagda lockglaset och starta pumpen med en skjuvhastighet av 1600 s-1 (484 μL / min) tills blodplättarna når strömningskammaren. För närvarande, Minska skjuvhastigheten till 25 s-1 genom att ändra inställningarna för sprutpumpen till en flödeshastighet på 7,5 μL / min.
- Övervaka ytan på täckglasets täckta sida, vänta tills den första trombocyten börjar fästa, fokusera mikroskopet på denna blodplätt och börja spela in genom att initiera experimentet i programvaran. Se tabell 1 för inspelningsinställningarna som används här.
- Följ liveinspelningen visuellt. Stäng sprutpumpen efter 30 minuter.
OBS! Se till att blodplättarna håller fokus under experimentets gång. Vanligtvis fäster 20-30 blodplättar i synfältet vid en förstoring av 1000X; Det här är ca 2000-3000 blodplättar i hela flödeskanalen. - Fixering medStrömningskammaren (tillval).
- När flödet har slutat efter att sprutpumpen har stoppats, överför inloppsröret (luftfritt) till fixeringslösningen. Starta om pumpen och flöda fixeringsbufferten genom kanalen i minst 10 minuter med samma flödeshastighet som nämns i steg 7.8.
- Ta bort kammaren från mikroskopet, rengör nedsänkningsoljan från glaset, koppla loss vakuumet och försiktigt avlägsna lockglaset från kammaren med en 18 G-nål.
OBS! Förhindra att täckglaset bryts och skadar kiselplåten. - Placera skyddsglaset (med cellerna riktat uppåt) i en 4-brunnsplatta ovanpå en vävnad, förfuktad med destillerat vatten.
OBS: Detta förhindrar att täckglaset sitter fast vid brunnsytan och förhindrar torkning. - Pipettera 750 μL fixativ lösning ovanpå täckglaset och inkubera i 1 h vid rumstemperatur. Om proven inte kan analyseras direkt,Förvara dem i 0,5% PFA (utspädd av HEPES Tyrode buffert, pH 7,4) vid 4 ° C för att säkerställa stabil fixering. Fortsätt till avsnitt 8 för att bearbeta lockglaset för bildbehandling.
- Skölj kammaren, röret och arket med destillerat vatten och inkubera det över natten i en tvättmedelslösning. Innan återanvändning av kammaren och andra komponenter sköljs med destillerat vatten.
- Spara mikroskopets rådatafiler som innehåller alla metadata. Vid behov exporterar du filmen till .MOV, h.264 komprimerad eller .AVI okomprimerad. Spara separata ramar som JPEG- eller TIF-filer.
8. Provberedning för konfokal fluorescensmikroskopi
- Överför skyddsglasögonen till nya 4-brunnsplattor och skölj 5 gånger med 3 ml HEPES Tyrode buffert, pH 7,4. Tillsätt 3 ml / brunn blockerande buffert och inkubera i 1 h vid RT.
- Ta bort blockeringsbufferten; Tillsätt 3 ml / brunn av 0,15% glycin (M / V) i HEPES Tyrode buffert, pH 7,4; Och inkubera i 15 minuter vid RT.
- Ta bort glycinlösningen och tvätta 5 gånger i 3 ml / brunn blockerande buffert. Eventuellt tillsätt fluorofore-konjugerade antikroppar utspädda i blockeringsbuffert för ytterligare färgning. Inkubera i 1 h vid RT i mörkret.
- Tvätta 5 gånger med blockeringsbuffert och 2 gånger med destillerat vatten. Torka glaset genom att avlägsna överskottsvätska med en vävnad (från kanterna inåt) utan att röra cellerna.
- Pipettera 60 μl polyvinylalkohollösning på en mikroskopglas. Placera lockglaset, med cellerna ner, ovanpå droppen och låt polyvinylalkoholen sprida sig mellan de två ytorna. Inkubera över natten vid RT i mörkret.
- Analysera cellerna med konfokal mikroskopi 14 .
- Spara de råa datafilerna i den inspelade stapeldata som innehåller alla metadata. Vid behov bearbetar de rada datafilerna till MOV, h.264 komprimerade eller .AVI okomprimerade filer. Spara separata staplar som JPEG- eller TIF-filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar bilder av flödeskammaren och experimentell inställning; Positionen och dimensionerna för kiselplåten; Och slanganslutningar. Figur 2 ger detaljer om flödeskammarens dimensioner. Figur 3 och Film 1 visar en tidsserie av bilder av trombocytadhesion och spridning på immobiliserad VWF. CD63 är ett transmembranprotein som införs i membranet av intracellulära täta granuler av vilande blodplättar 15 . Dess tidsberoende mobilisering på trombocytytan visas i grönt. På liknande sätt är P-selektin (Psel) ett transmembranprotein infört i membranet av intracellulära a-granuler av vilande blodplättar. Dess tidsberoende mobilisering på trombocytytan visas i orange. Figur 3B visar en representativ bild vid en 45 ° vinkel, Förvärvad av konfokal fluorescensmikroskopi efter ett flödesexperiment. Film 2 visar en tilt-serie av samma experiment. Observera att CD63 huvudsakligen ligger vid den centrala granulomeren, medan P-selektin fördelas över hela cellkroppen och verkar koncentrerad vid kanterna. Figur 4A och Film 3 visar den tidsberoende mobiliseringen av CD63 på trombocytytan (grön). I dessa experiment inkuberades trombocyter (som inte har kärn-DNA) pre-inkuberat med DAPI (blå), vilket fläckar polyfosfat i täta granuler 16 . Anmärkningsvärt, trots tydliga tecken på tät granulutsläpp (enkeldataanalyser visas i Figur 4B och Film 4 ), bibehålls polyfosfat inom eller på utsidan av dessa blodplättar. Figur 5 och Film 5 visar tidsberoende mobilisering (eller rekrytering) av VWF, en trombogen multImeriskt protein 17 lagrat i a-granuler, till trombocytytan (grön). Liksom polyfosfat är VWF förknippad med ytan av de aktiverade blodplättarna.
Figur 1: Flödeskammare och experimentell inställning. ( A ) Bild av flödeskammardesign med inlopp och utlopp (1 och 2), en vakuumanslutning (3) på vilken silikonplattan (4) är placerad. Två yttre utklipp (5) i kiselplåten bildar vakuumkanalerna för att fästa lockglaset (6). En central cutout (7) bildar flödeskanalen ( B ) Bild av den experimentella inställningen. Inlopp och utlopp (1 och 2), sprutpump (8) och provhållare (9). ( C ) Schematisk översikt över experimentuppsättningen; Siffrorna är identiska med de i A och B. ( D ) Schematisk översikt med dimensionen Av det skräddarsydda kiselplåten. ( E ) Allmän schematisk översikt över flödeskammaren av poly (metylmetakrylat) . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Detaljerad ritning av flödeskammare. Flödeskammaren består av ett poly (metylmetakrylat) block (1) , en rak polyoximetyleninsats för vakuuminloppet (2) och två vinklade polyoximetyleninsatser för provinloppet och utloppet (3) . De vinklade polyoximetyleninsatserna innehåller metallkapillärrör med diametrar av 1,07 mm. Den raka insatsen innehåller ett kapillärrör med en diameter av 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Spridning och gradering av blodplättar på immobiliserad von Willebrand-faktor. ( A ) Tidsberoende mobilisering av CD63 och P-selektin på ytan av spridning och degranulering av blodplättar. Den vita skalan (övre vänster) indikerar 10 μm. ( B ) Representativ konfokal fluorescensmikroskopi bild vid en 45 ° vinkel. Den vita skalen (nedre vänster) indikerar 2 μm. Grön, CD63; Orange, P-selektin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Figur 4: Blodplättspridning, degranulering och rörlighet av täta granuler på immobiliserad fibrinogen. ( A ) Tidsberoende mobilisering av CD63 och polyfosfat på trombocytytan. Den vita skalan (övre vänster) indikerar 10 μm. ( B ) Tidsserier av en enda trombocyt (t = 0 representerar den första vidhäftningen till ytan). Den vita skalen (nedre högra) indikerar 2 μm. Grön, CD63; Blå, DAPI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ytansamling av von Willebrand-faktor på plattformsytan av immobiliserad fibrinogen. Tidsberoende mobilisering (eller rekrytering) av VWF till trombocytytan. THan vitstångsbar (övre vänster) indikerar 5 μm. Grön, VWF. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Miljö | Värde |
| Exponeringstid FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensitet FITC (Alexa488) | 50% |
| Exponeringstid DIC | 30 ms |
| Spänning halogenlampa | 4,5 volt |
| Exponeringstid TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 intensitet FITC (Alexa546) | 50% |
| Exponeringstid DAPI | 500 ms |
| LED 365 intensitet | 50% |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Mål | Alpha Plan-Fluar 100x / 1,45 Olja |
| Bildhastighet, inspelningstid | 1 ram / 10 s, 30 min |
| Filkomprimeringsfilmer | MOV (h.264), AVI (okomprimerad) |
| Filkomprimeringsbilder | JPEG, TIF |
Tabell 1: Mikroskopinställningar. Inställningar som används för de representativa experimenten.
| Mål | Antikropp / färgämne | Koncentration |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotin *)325 ng / ml | |
| P-selektin | Anti-CD62P-biotin **) | 90 ng / ml |
| DNA | DAPI | 10 | ig / ml |
| VWF | Anti-human VWF-FITC | 5 | ig / ml |
| *) Anti-CD63-biotin antikropp blandas med streptavidin-Alexa488 i ett molförhållande av 1: 1 före användning | ||
| **) anti-CD62P-biotin antikropp blandas med streptavidin-Alexa546 i ett molförhållande av 1: 1 före användning | ||
Tabell 2: Antikroppar och färgämnen. Rekommenderade antikropps- och färgkoncentrationer för de visade representativa experimenten.
| Reagens kategori | Exempel kompoFONDERNA |
| Blodplättsagonister | Trombin, ADP, PAR-1 eller -4 aktiverande peptider, U46619, Thromboxan A2, ADP |
| Enzymhämmare | Hirudin, PPACK, heparinoider (indirekt), majs trypsininhibitor, sojaböns trypsininhibitor |
| Receptorantagonister | Anti-glyprotein 1ba, anti-glykoprotein VI; Klopidogrel, (cykliska) RGD-innehållande peptider |
| Aktiveringsinhibitorer | Aspirinbehandling, fixering |
Tabell 3: Potentiellt användbara reagens.
Tilläggsfilmer: Film 1: Tidsserier av bilder av blodplättar (se Figur 1 ), Film 2: Tiltserier i Figur 3B , Film 3: Tidberoende mobilisering av CD63 på blodplättenYta (se Figur 4 ), Film 4: Tidsserier av encellsanalyser (se Figur 4B ), Film 5: Tidsberoende mobilisering av VWF (se Figur 5 ).
Vänligen klicka här för att ladda ner film 1.
Vänligen klicka här för att ladda ner Movie 2.
Vänligen klicka här för att ladda ner Movie 3.
Vänligen klicka här för att ladda ner Movie 4.
Vänligen klicka här för att ladda ner Movie 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Globalt är trombos en ledande orsak till dödsfall och sjuklighet, och blodplättar spelar en central roll i utvecklingen. I det här arbetet beskrivs en metod för levande celler avbildning av blodplätt degranulering under flöde. Det antas generellt att när alla blodplättar aktiveras frigörs alla granulära innehåll direkt i lösning. De medföljande resultaten tyder på att detta inte nödvändigtvis är fallet. Under vidhäftning och degranulering behåller blodplättar en signifikant mängd polyfosfat ( Figur 4 ). Dessutom är det multimera proteinet VWF associerat med trombocytytan efter degranulering ( Figur 5 ). Detta indikerar att de molekylära mekanismerna som kontrollerar trombocytgranulat-degranulering är subtilare än vad som normalt antas.
För att möjliggöra avbildning av levande celler av blodplättdigranulering under flöde, valdes försöksbetingelserna för att hålla blodplättsaggregeringen till ett minimum. TrombocyterTs av 150 000 blodplättar / μl användes. Detta ligger i nedre delen av det normala intervallet (150 000-450 000 blodplättar / μl). Vidare studerades trombocytadhesion och spridning på immobiliserad VWF eller fibrinogen, vilket ledde till mild blodplättsaktivering (i motsats till till exempel kollagen). I studier med tvättade blodplättar flyttar ökade skjuvhastigheter dessa celler till mitten av flödet. Detta stör vidhäftning och efterföljande spridning och komplicerar undersökningen av degranulering.
I fysiologisk hemostas är marginalering av blodplättar viktigt. Denna process drivs av erytrocyter och förklarar varför låg anemi ibland åtföljs av en blödande diatese. En begränsning av den presenterade tekniken är att visualiseringen av trombocyt degranulering (med de presenterade materialen och reagenserna) störs av röda blodkroppar. Plättfunktionen påverkas av skjuvspänning, vilken är en funktion av viskositeten hos vätskan (μ), liksomAv skjuvhastigheten. Därför rekommenderas att studera trombocytfunktion i flödesmodeller i lösningar med jämförbara viskositeter ( dvs tvättade blodplättar, rekonstituerat blod, PRP eller helblod).
Det finns flera praktiska faktorer att ta hänsyn till vid genomförandet av dessa experiment. För det första påverkas fluorescenssignaler starkt av fokusområdet. Om mikroskopet inte är i fokus, är signalen lätt suddig eller till och med förlorad. Före ankomsten av blodplättar till flödeskanalen är det bäst att fokusera på själva kanalen (börja vid kanten av kiselplattan / flödesväggen). När blodplättar börjar klibba, fokusera på denna vidhäftningshändelse. En andra oro är blegningen av vissa fluoroforer ( t.ex. FITC). Upprepad excitation kommer att leda till en signalförlust som störa utredningen. Dessa hinder kan övervinnas genom att använda mer stabila fluoroforer, vilket reducerar intensiteten hos det spännande LED-ljuset, förkortar exponentenOsure gånger och / eller sänka bildhastigheten.
Modellen som beskrivs här är mycket användbar för utförande av en detaljerad studie av blodplättssvar mot en mängd olika immobiliserade proteiner och vid olika flödeshastigheter. Potentiellt kan denna metod också användas för att studera deras interaktion med aktiverade endotelceller 18 . De tekniska framsteg som möjliggör de flexibla mönstren hos specialflödesrummen öppnar för närvarande vägar för biokompatibilitetsstudier 19 . Live-cellbildningen av blodplättsreaktivitet under flöde kommer att avslöja värdefulla insikter på komplexiteten hos trombocytadhesionsresponsen. I slutändan bör dessa erfarenheter leda till utvecklingsexperimentella flödesmodeller som möjliggör den kombinerade undersökningen av trombocytfunktion och påverkan på koagulationssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
CM erkänner ekonomiskt stöd från International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht och Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
