Summary
Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.
Abstract
Blutplättchen sind wesentliche Akteure in der Hämostase, die Bildung von Thromben, um vaskuläre Brüche zu versiegeln. Sie sind auch an Thrombose beteiligt, die Bildung von Thromben, die das Gefäßsystem verschlingen und Organe verletzen, mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Dies motiviert die wissenschaftliche Forschung zur Thrombozytenfunktion und die Entwicklung von Methoden zur Verfolgung zellbiologischer Prozesse, wie sie unter Strömungsbedingungen auftreten.
Für die Untersuchung der Thrombozytenadhäsion und -aggregation stehen eine Vielzahl von Strömungsmodellen zur Verfügung, zwei Schlüsselphänomene in der Thrombozytenbiologie. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Vollendung der Plättchendegranulation unter der Strömung während der Aktivierung zu untersuchen. Das Verfahren nutzt eine Strömungskammer, die mit einem Spritzenpumpenaufbau gekoppelt ist, der unter einem Weitfeld-, invertierten LED-basierten Fluoreszenzmikroskop angeordnet ist. Der hier beschriebene Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Erregung von mehreren Fluorophoren, die von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Fluoreszenzen abgegeben werdenEntfärbt. Nach Live-Zell-Imaging-Experimenten können die Deckgläser mit statischer Mikroskopie ( dh konfokale Mikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie) weiterverarbeitet und analysiert werden.
Introduction
Plättchen sind anucleare Zellen, die im Blutstrom zirkulieren. Ihre Hauptfunktion ist es, vaskuläre Brüche an Orten der Verletzung zu versiegeln und Blutverlust zu verhindern. An diesen Verletzungsorten werden subendotheliale Kollagenfasern exponiert und anschließend durch das multimere Protein, von Willebrand-Faktor (VWF) abgedeckt. VWF interagiert mit den Plättchen im Kreislauf in einem Mechanismus, der von dem Ibcoprotein Ibα-IX-V-Komplex auf der Zelloberfläche 1 abhängt, was die Geschwindigkeit der Thrombozyten verlangsamt. Dies ist besonders wichtig bei hohen Scherraten. Die Thrombozyten unterliegen anschließend morphologischen Veränderungen, während sie Aktivierungsimpulse aus Kollagen erhalten. Dies führt zu einer irreversiblen Ausbreitung und schließlich zu einer Blutplättchenaggregation. Beide Prozesse hängen von der Sekretion von Granulatinhalten ab, um das Plättchen-Plättchen-Übersprechen zu erleichtern. Unter anderem enthalten die Plättchen-α-Granulate Fibrinogen und VWF, um die Plättchenadhäsion zu unterstützen und zu überbrückenPlättchen zusammen in einer integrinabhängigen Weise. Die Thrombozyten-dichten Granulate enthalten anorganische Verbindungen 2 , einschließlich Calcium und Adenosindiphosphat (ADP), die zur Verstärkung der Thrombozytenaktivierung beitragen. Weiterhin enthalten die Blutplättchen Mediatoren von (allergischen) Entzündungen 3 , komplementkontrollierenden Proteinen 4 und Angiogenesefaktoren 5 , 6 , wobei die Frage aufgeworfen wird, ob und wie diese Inhalte unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich freigesetzt werden.
Seit den 1980er Jahren ist die Untersuchung der Thrombozytenfunktion in Strömungsmodellen für die Untersuchung von thrombotischen Mechanismen wertvoll 7 . Seitdem wurden viel technischer Fortschritt gemacht, und Strömungsmodelle, die die Fibrinbildung einschließen, werden derzeit entwickelt, um das hämostatische Potential von therapeutischen Thrombozytenkonzentraten ex vivo 8 oder zu untersuchenUntersuchen den Einfluss von Störungen der Scherraten auf die Thrombusmorphologie 9 . Die Unterschiede in den molekularen und zellbiologischen Mechanismen, die eine stabile Adhäsion und physiologische Thrombusbildung (Hämostase) gegenüber der pathologischen Thrombusbildung (Thrombose) antreiben, können sehr subtil sein und die Entwicklung von Strömungsmodellen motivieren, die die Echtzeit-Visualisierung dieser Subzellulären ermöglichen Prozesse.
Ein Beispiel für ein Verfahren, für das ein solches Setup wertvoll wäre, ist die (Re-) Verteilung von intrazellulärem Polyphosphat und die Rekrutierung von Gerinnungsfaktoren, um den zeitabhängigen Einfluss, den dies auf die Fibrin-Ultrastruktur 10 hat, aufzudecken. Studien sind oft auf Endpunktanalysen beschränkt. Das Hauptziel der beschriebenen Methode ist es, die visuelle visuelle Untersuchung von dynamischen subzellulären Prozessen zu ermöglichen, die während der Thrombozytenaktivierung unter Strömung stattfinden.
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Protocol
Das örtliche medizinische Ethikkomitee des Universitätsklinikums Utrecht genehmigte die Zeichnung von Blut für Ex-vivo- Forschungszwecke, einschließlich derjenigen dieser Studie.
1. Lösungsvorbereitung
- Zubereitung eines 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinansulfonsäure- (HEPES) Tyrode-Puffers durch Auflösen von 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 und 5,55 mM D- Glukose in destilliertem Wasser.
- Machen Sie zwei Varianten des Puffers: Stellen Sie den pH-Wert bei 6,5 bzw. 7,4 ein. Machen Sie frischen Puffer für jeden Tag der Experimente. Ergänzung mit 10 ng / mL Prostacyclin wo angegeben.
- Bereiten Sie TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vor, indem Sie 50 mM Tris und 150 mM NaCl in destilliertem Wasser auflösen und den pH-Wert auf 9,0 einstellen.
- Säurecitrat-Dextrose (ACD) durch Auflösen von 85 mM Tri-Natriumcitrat, 71 mM Zitronensäure und 111 mM D-Glucose in disWasser.
- Vorbereitung einer Fixierlösung durch Zugabe von 2% (v / v) Paraformaldehyd (PFA) zu HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4. Hitze auflösen (50 - 70 ° C) und den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Aliquot und bei -20 ° C aufbewahren. Tauen bei 37 ° C vor Gebrauch.
- Stickstoffpuffer durch Auflösen von 1% (m / v) Humanserumalbumin (HSA) in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, vorbereiten
- Eine Polyvinylalkohol-Lösung durch Zugabe von 4,8 g Polyvinylalkohol zu 12 g Glycerin zugeben und gut vermischen. 12 ml destilliertes Wasser zugeben und bei Raumtemperatur über Nacht auf einen Rotator geben.
- Zugabe von 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Bei 30 ° C auf 50 ° C erhitzen. 1,25 g 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) zugeben und gut vermischen. Zentrifuge bei 1.500 xg für 5 min. Aliquot der Überstand (1 ml reicht für 15-20 Folien) und bei -20 ° C lagern. Benutze die Aliquote einmal.
2. Deckglas-Vorbereitung
- Entfetten Sie die AbdeckungGläser (25 x 50 mm 2 ) durch Inkubieren über Nacht in unverdünnter Chromschwefelsäure. Spülen Sie die Deckgläser mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie über Nacht bei 60 ° C in einem Ofen.
- Halten Sie einen Streifen eines Paraffinfilms (10 x 15 cm 2 ) auf eine Laborbank mit einem Tropfen Wasser und entfernen Sie die Luft durch Glätten des Paraffinfilms. Pipettieren Sie 80 μl Tropfen von 10 μg / mL VWF oder 100 μg / ml Fibrinogen auf den Paraffinfilm. Legen Sie die Brille auf die Tropfen; Die Proteinlösung wird sich zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die gesamte Rückseite des Glases zu bedecken. Inkubieren für 1,5 h bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie den Paraffinfilm und blockieren Sie die Deckgläser, indem Sie sie mit der beschichteten Seite nach oben in eine 4-Well-Platte mit Blockierpuffer legen. 1 Stunde bei 37 ° C oder Nacht bei 4 ° C inkubieren. Als Kontrolle blockieren Sie ein Deckglas, das nicht mit VWF oder Fibrinogen beschichtet wurde.
3. Herstellung von plättchenreichem Plasma (PRP)
HINWEIS: Nach der Zentrifugation können drei Schichten beobachtet werden (von oben nach unten): PRP, weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen. Achten Sie darauf, die weißen und roten Zellen nicht einzuschließen. Typischerweise können nach der Zentrifugation eines 9-ml-Blutröhrchens 3 ml PRP gesammelt werden.
HINWEIS: In der Regel können 2 ml nach diesem zweiten Zentrifugationsschritt gesammelt werden.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen des verdünnten PRP hängt von der Thrombozytenzahl des Spenders ab. Die Plättchenzahlen variieren stark zwischen den Spendern, und die PRP-Verdünnung erfordert eine individuelle Einschätzung. Plättchenzählungen gelten als normal, wenn innerhalb von 150.000 und 450.000 Thrombozyten / μL.
4. Vorbereitung von gewaschenen Plättchen
- Bestimmen Sie das mittlere Plättchenvolumen (MPV) im PRP mit einem Zellanalysator.
HINWEIS: Dies ist ein Indikator für die Plättchen-Voraktivierung 11 . Ein normaler MPV für die Rettung von Plättchen ist 7,5-11,5 fL 11 . Der MPV sollte während des Plättchenwaschvorgangs nicht um mehr als 1,5 fl ansteigen. - Füge 1/10 Volumen ACD zu PRP hinzu, um Thrombozytenvoraktivierung zu verhindern und 15 min bei 400 xg und RT ohne Bremse zu zentrifugieren. Den su entfernenPernieren und das Pellet vorsichtig in HEPES Tyrode-Puffer, pH 6,5, auf das ursprüngliche Volumen von PRP aufsetzen.
- Tauen Sie ein Aliquot von Prostacyclin durch Zugabe von TBS zu einer Konzentration von 10 μg / ml; Halten Sie es auf Eis.
- Um die Thrombozytenaktivierung zu verhindern, füge Prostacyclin bei einer Endkonzentration von 10 ng / mL zu den wieder suspendierten Plättchen hinzu und zerkleinere 15 Minuten lang bei 400 xg und RT ohne Bremse. Den Überstand entfernen und das Pellet vorsichtig in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7.4, wieder suspendieren.
- Zählen Sie die Anzahl der Plättchen (Schritt 3.5) und bestimmen Sie die Änderung in MPV (Schritt 4.1) (die MPV sollte nicht mehr als 1,5 fL ändern).
- Die Anzahl der Thrombozyten mit HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf eine Konzentration von 150.000 Thrombozyten / μL einstellen. Lassen Sie die Thrombozyten für 30 Minuten bei RT vor den Experimenten zurück. Verwenden Sie gewaschene Plättchen für Experimente innerhalb von 4 h nach der Isolierung.
5. Durchflusskammermontage
12 . Es können eine Vielzahl von handelsüblichen Strömungskammern verwendet werden, solange sie ein Deckglas halten können, das vorzugsweise für weitere Analysen abnehmbar ist. Die für die beschriebenen Experimente verwendete Strömungskammer besteht aus Poly (methylmethacrylat), um eine Mikroskopeinsatzstufe genau zu platzieren. Es enthält einen Einlass und Auslass ( Abbildung 1A - C ; 1, 2) sowie einen Vakuumanschluss ( Abbildung 1A und C ; 3). Eine kundenspezifische Silikonfolie ( Abbildung 1A und D ; 4) wird oben aufgesetzt. Zwei Ausschnitte bilden Vakuumkanäle ( Fig. 1A und D ; 5), um das Deckglas ( Fig. 1A ; 6) fest an der Kammer anzubringen. Eine zentrale Aussparung bildet den Strömungskanal ( Fig. 1A D ; 7; 2,0 mm Breite und 0,125 mm Höhe). Der Einlass und der Auslass sind mit dem Strömungskanal verbunden und das Vakuum ist mit dem Vakuumkanal verbunden.
- Decken Sie die Oberseite der Durchflusskammer mit destilliertem Wasser ab und legen Sie die kundenspezifische Silikonfolie mit der glatten Seite nach unten auf das Wasser. Schwimmen Sie das Blatt in Position, indem Sie überschüssiges Wasser entfernen, während das Blatt in Position gehalten wird.
HINWEIS: Diese Silikonfolie ist wiederverwendbar (Silikon ist bekannt für seine inerten Eigenschaften); In der Regel wurden Thrombozyten nicht beobachtet, um sie anzubringen. Die Blätter können mit Spülmittel gereinigt und wiederverwendet werden, bis das Material beschädigt wird ( dh das Reißen, insbesondere im Bereich zwischen den Kanälen). Im Allgemeinen kann ein Blatt für 20 Tage mit mehreren Experimenten pro Tag verwendet werden. - Die Strömungskammer für 1 h bei 60 ° C inkubieren, um das restliche Wasser zu verdampfen, um die Silikonfolie fest an der Strömungskammer zu haften.
- Mit einer Plastik Pasteur Pipette, fügen Sie einen Tropfen vonHEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf den Strömungskanal. Legen Sie das Deckglas (siehe Abschnitt 2) mit der beschichteten Seite nach unten auf den Strömungskanal. Befestigen Sie die Vakuumpumpe am Vakuumanschluss ( Abb. 1A und C ; 3). Tragen Sie ~ 10 kPa Druck auf.
6. Vorfärbung der Plättchen und Vorbereitung der Antikörper
- Plättchenfärbung
- Inkubieren der gewaschenen Plättchen mit 10 μg / ml DAPI für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Um das ungebundene DAPI zu waschen und die Thrombozytenaktivierung zu verhindern, füge Prostacyclin bei einer Endkonzentration von 10 ng / mL hinzu und sofort 15 min bei 400 xg und RT ohne Bremse zentrifugieren.
- Das Plättchenpellet in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf eine Plättchenkonzentration von 150.000 Thrombozyten / μL rekonstituieren.
- Vorbereitung von Antikörpern
- Mischen Sie Biotin-markierten Antikörper mit Alexa-markiertem StrepTavidin in einem Molverhältnis von 1: 1. Inkubieren für mindestens 10 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch (Schritt 7.6).
HINWEIS: Die Biotin-Markierungseffizienz kann zwischen verschiedenen Chargen variieren. Sollte es Probleme mit der Visualisierung von Zielmolekülen geben, sollten Kontrollexperimente durchgeführt werden, um die erfolgreiche Biotinylierung zu bestätigen, sowie die Target-Bindungseigenschaften des spezifischen biotinylierten Antikörpers.
- Mischen Sie Biotin-markierten Antikörper mit Alexa-markiertem StrepTavidin in einem Molverhältnis von 1: 1. Inkubieren für mindestens 10 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch (Schritt 7.6).
7. Perfusion
- Starten Sie das Fluoreszenzmikroskop sowie die Mikroskop-Software. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Mikroskopeinstellungen.
HINWEIS: Das Mikroskop und die Aufzeichnungseinstellungen für die Live-Zell-Visualisierung und Aufzeichnung der Thrombozyten und der gewählten fluoreszenzmarkierten Antikörper und / oder Farbstoffe durch Laden eines geeigneten Experiments in die Mikroskop-Software einleiten. Fließversuche bei RT durchführen. - Blockieren Sie den Einlassschlauch, indem Sie eine 10-ml-Spritze an den Schlauch anschließen und 1% HSA-Block austretenKochen Puffer in den Einlass Schlauch. 15 min bei RT inkubieren. Spülen Sie den Einlassschlauch durch Ansaugen von HEPES Tyrode's Puffer, pH 7,4, in den Einlassschlauch.
- Verbinden Sie den blockierten Einlassschlauch und den unbehandelten Auslassschlauch, beide mit einem Durchmesser von 1,02 mm und einer Länge von 20 bis 30 cm zum Einlass und Auslass der Kammer. Verbinden Sie eine 10-ml-Spritze (oder weniger Volumen für mehr Genauigkeit) mit dem Auslassschlauch. Schalten Sie die Spritzenpumpe ein.
HINWEIS: Der Durchmesser der Spritze bestimmt in Kombination mit der an der Pumpe eingestellten Durchflussmenge den volumetrischen Durchfluss. Zusammen mit der Oberfläche des Strömungskanals kann die Schergeschwindigkeit nach der Formel 13 berechnet werden unten. Somit ist es möglich, die Scherrate durch Ändern der Strömungsgeschwindigkeit der Spritzenpumpe zu manipulieren oder die Abmessungen des Strömungskanals zu verändern. Eine Scherrate von 800-1.600 s -1 typischerweise für arterieller Blutfluss, während 25 - 100 s-1 Modelle für venöses Blutfließen. Für diesen Aufbau ergibt eine Durchflussrate von 7,5 μl / min eine Scherrate von 25 s -1 .
Scherrate = 6Q / h 2 W in s -1
Wobei: Q = volumetrische Durchflussrate (mL / s), h = Höhenkanal (cm) (0,015 cm, dies ist die Dicke der Silikonfolie), w = Breite Kanal (cm) (0,2 cm in dieser Kammer). - Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf ein 100faches Objektiv (Gesamtverstärkung von 1.000X) und montieren Sie die Kammer auf dem Mikroskop mit der Glasoberfläche nach unten.
- Setzen Sie den Einlassschlauch in ein Rohr mit HEPES Tyrode's Puffer, pH 7.4. Ziehen Sie den Kolben der Spritze manuell an den Auslaufschlauch und ziehen Sie die Lösung durch die Kammer, um die Luft aus dem System zu entfernen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe ( Abbildung 1B und C ; 8) und führen Sie die Pumpe kurz, um den Kolben zu spannen und sorgen Sie für einen stabilen Durchfluss.
- Füge Antikörper und / oder Farbstoffe der Plättchen-Suspension oder PRP vorsichtig hinzuMit einer Plastikpipette vermischen und die Mischung auf ein 1,5-ml-Röhrchen überführen.
HINWEIS: Für eine typische 30-minütige Perfusion bei einer Schergeschwindigkeit von 25 s-1 (7,5 μl / min) wird ein Minimum von 225 μl Plättchen-Suspension benötigt. Die für die repräsentativen Ergebnisse verwendeten Antikörper sind in Tabelle 2 gezeigt . - Bewegen Sie den Einlaßschlauch, während er aus dem HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, in ein 1,5-ml-Röhrchen, das entweder PRP oder die gewaschenen Plättchen und die Antikörper und / oder Farbstoffe enthält ( Fig. 1B und C ; 9), gedrückt wird.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass beim Überführen des Schlauches der Schlauch gepresst wird (Druckluft), um zu verhindern, dass Luft in den Schlauch eindringt. Es ist möglich, adhärierende Plättchen mit einer Vielzahl von Reagenzien in einem nachfolgenden Schritt zu behandeln, indem man den Einlaßschlauch in ähnlicher Weise zu einem anderen Rohr bewegt. Eine Liste von potentiell nützlichen Reagenzien ist in Tabelle 3 angegeben . - Wähle die "live visualizatio"N "-Option in der Software, fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche des beschichteten Deckglases und starten Sie die Pumpe mit einer Schergeschwindigkeit von 1.600 s-1 (484 μl / min), bis die Plättchen in die Durchflusskammer gelangen. Verringern Sie die Schergeschwindigkeit auf 25 s-1, indem Sie die Einstellungen der Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 7,5 μl / min ändern.
- Überwachen Sie die Oberfläche der beschichteten Seite des Deckglases, warten Sie, bis das erste Plättchen anfängt zu haften, fokussieren Sie das Mikroskop auf dieses Plättchen und starten Sie die Aufnahme, indem Sie das Experiment in der Software initiieren. Siehe Tabelle 1 für die hier verwendeten Aufnahmeeinstellungen.
- Folgen Sie der Liveaufnahme visuell. Nach 30 min die Spritzenpumpe stoppen.
HINWEIS: Sicherstellen, dass die Plättchen im Laufe des Experiments im Fokus bleiben. Typischerweise befestigen 20-30 Thrombozyten im Gesichtsfeld bei einer Vergrößerung von 1.000X; Das sind etwa 2.000-3.000 Plättchen im ganzen Strömungskanal. - Fixierung mitDie Durchflusskammer (optional).
- Wenn die Strömung nach dem Stoppen der Spritzenpumpe gestoppt ist, den Einlassschlauch (luftfrei) in die Fixierlösung überführen. Starten Sie die Pumpe neu und füllen Sie den Fixierungspuffer durch den Kanal für mindestens 10 min mit der gleichen Durchflussrate wie in Schritt 7.8 beschrieben.
- Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop, reinigen Sie das Tauchöl aus dem Glas, trennen Sie das Vakuum und entfernen Sie das Deckglas vorsichtig mit einer 18 G-Nadel aus der Kammer.
HINWEIS: Verhindern, dass das Deckglas brechen und das Silikonblech beschädigt. - Legen Sie den Deckel (mit den Zellen nach oben gerichtet) in eine 4-Well-Platte auf ein Gewebe, vorbestimmt mit destilliertem Wasser.
HINWEIS: Dadurch wird verhindert, dass das Deckglas an der Wannenoberfläche haftet und das Trocknen verhindert. - 750 μl Fixierlösung auf das Deckglas pipettieren und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Falls die Proben nicht direkt analysiert werden können,Lagern sie in 0,5% PFA (verdünnt durch HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4) bei 4 ° C, um eine stabile Fixierung zu gewährleisten. Fahren Sie mit Abschnitt 8 fort, um das Deckglas für die Bildgebung zu verarbeiten.
- Nach dem Gebrauch spülen Sie die Kammer, die Schläuche und die Platte mit destilliertem Wasser und inkubieren über Nacht in einer Waschmittellösung. Vor der Wiederverwendung der Kammer und anderer Komponenten mit destilliertem Wasser abspülen.
- Speichern Sie die Mikroskop-Rohdatendateien, die alle Metadaten enthalten. Wenn nötig, exportiere die Filme in .MOV, h.264 komprimiert oder .AVI unkomprimiert. Speichern Sie einzelne Frames als JPEG- oder TIF-Dateien.
8. Probenvorbereitung für konfokale Fluoreszenzmikroskopie
- Übertragen Sie die Deckgläser auf neue 4-Well-Platten und spülen Sie 5 mal mit 3 ml HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4. 3 ml / Vertiefung des Blockierungspuffers zugeben und 1 h bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie den Blockierpuffer. 3 ml / Vertiefung von 0,15% Glycin (M / V) in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4; Und 15 min bei R inkubierenT.
- Glycinlösung entfernen und 5 mal in 3 ml / Vertiefung des Blockierungspuffers waschen. Gegebenenfalls fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu, die in Blockierungspuffer für zusätzliche Färbung verdünnt sind. Inkubieren für 1 h bei RT im Dunkeln.
- 5 mal mit Blockierungspuffer und 2 mal mit destilliertem Wasser waschen. Trocknen Sie das Glas, indem Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Gewebe (von den Kanten nach innen) entfernen, ohne die Zellen zu berühren.
- 25 μl Polyvinylalkohol-Lösung auf einen Objektträger pipettieren. Legen Sie das Deckglas mit den Zellen nach unten auf den Tropfen und lassen Sie den Polyvinylalkohol zwischen den beiden Flächen verteilen. Inkubieren über Nacht bei RT im Dunkeln.
- Analysieren Sie die Zellen durch konfokale Mikroskopie 14 .
- Speichern Sie die Rohdaten der aufgezeichneten Stapeldaten, die alle Metadaten enthalten. Wenn nötig, verarbeiten Sie die Rohdaten-Dateien in MOV, h.264 komprimiert oder .AVI unkomprimierte Dateien. Speichern Sie separate Stacks als JPEG- oder TIF-Dateien.
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Representative Results
Fig. 1 zeigt Bilder der Strömungskammer und des experimentellen Aufbaus; Die Lage und die Abmessungen des Siliziumblechs; Und Schlauchverbindungen. Abbildung 2 gibt Auskunft über die Abmessungen der Durchflusskammer. Abbildung 3 und Film 1 zeigen eine Zeitreihe von Bildern der Plättchenadhäsion und Ausbreitung auf immobilisiertem VWF. CD63 ist ein Transmembranprotein, das in die Membran von intrazellulären dichten Granulaten von ruhenden Plättchen 15 eingefügt wird. Die zeitabhängige Mobilisierung auf die Plättchenoberfläche ist grün dargestellt. Ähnlich ist P-Selectin (Psel) ein Transmembranprotein, das in die Membran von intrazellulären α-Granulaten von ruhenden Plättchen insertiert ist. Die zeitabhängige Mobilisierung auf die Thrombozytenoberfläche wird in orange dargestellt. Fig. 3B zeigt ein repräsentatives Bild in einem Winkel von 45º, Erworben durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie nach einem Strömungsexperiment. Film 2 zeigt eine Tilt-Serie des gleichen Experiments. Beachten Sie, dass sich CD63 hauptsächlich an der zentralen Granulomere befindet, während P-Selectin über den gesamten Zellkörper verteilt ist und an den Kanten konzentriert erscheint. Abbildung 4A und Film 3 zeigen die zeitabhängige Mobilisierung von CD63 auf die Plättchenoberfläche (grün). In diesen Experimenten wurden Thrombozyten (die keine nukleare DNA haben) mit DAPI (blau) vorinkubiert, das Polyphosphat in dichten Granulaten 16 färbt. Bemerkenswert ist, trotz klarer Anzeichen einer dichten Granulatfreisetzung (Einzelzellanalysen sind in Abbildung 4B und Film 4 gezeigt ) wird Polyphosphat innerhalb oder auf der Außenseite dieser Thrombozyten zurückgehalten. Abbildung 5 und Film 5 zeigen zeitabhängige Mobilisierung (oder Rekrutierung) von VWF, ein thrombogenes MultImer-Protein 17, das in α-Granulaten gelagert ist, auf die Plättchenoberfläche (grün). Ähnlich wie bei Polyphosphat bleibt VWF mit der Oberfläche der aktivierten Blutplättchen assoziiert.
Abbildung 1: Durchflusskammer und Versuchsaufbau. ( A ) Bild der Strömungskammerausführung mit einem Einlass und Auslass (1 und 2), einem Vakuumanschluss (3), auf dem die Silikonfolie (4) angeordnet ist. Zwei äußere Aussparungen (5) im Siliziumblech bilden die Vakuumkanäle zur Befestigung des Deckglases (6). Eine zentrale Aussparung (7) bildet den Strömungskanal ( B ) Bild des Versuchsaufbaus. Einlass und Auslass (1 und 2), Spritzenpumpe (8) und Probenhalter (9). ( C ) Schematische Übersicht des Versuchsaufbaus; Die Zahlen sind identisch mit denen in A und B. ( D ) Schematische Übersicht mit der Dimension Der kundenspezifischen geschnittenen Silikonfolie. ( E ) Allgemeine schematische Übersicht der Poly (methylmethacrylat) Durchflusskammer . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Detaillierter Blaupause der Durchflusskammer. Die Strömungskammer besteht aus einem Poly (methylmethacrylat) -Block (1) , einem geraden Polyoxymethyleneinsatz für den Vakuumeinlass (2) und zwei abgewinkelten Polyoxymethyleneinsätzen für den Probeneinlass und den Auslass (3) . Die abgewinkelten Polyoxymethylen-Einsätze enthalten Metall-Kapillarrohre mit einem Durchmesser von 1,07 mm. Der geradlinige Einsatz enthält ein Kapillarrohr mit einem Durchmesser von 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Plättchenausbreitung und -degranulation auf immobilisiertem von Willebrand-Faktor. ( A ) Zeitabhängige Mobilisierung von CD63 und P-Selectin auf die Oberfläche von Ausbreitungs- und Entkeimungsplättchen. Der weiße Maßstab (oben links) zeigt 10 μm an. ( B ) Repräsentatives konfokales Fluoreszenzmikroskopiebild bei einem Winkel von 45 °. Der weiße Maßstab (unten links) zeigt 2 μm an. Grün, CD63; Orange, P-Selectin Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Abbildung 4: Plättchenausbreitung, Degranulation und Beweglichkeit von Dichtegranulaten auf immobilisiertem Fibrinogen. ( A ) Zeitabhängige Mobilisierung von CD63 und Polyphosphat auf die Plättchenoberfläche. Der weiße Maßstab (oben links) zeigt 10 μm an. ( B ) Zeitreihen eines einzelnen Plättchens (t = 0 stellt die erste Adhäsion an der Oberfläche dar). Der weiße Maßstab (unten rechts) zeigt 2 μm an. Grün, CD63; Blau, DAPI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Oberflächenverknüpfung von von Willebrand-Faktor auf die Plättchenoberfläche von immobilisiertem Fibrinogen. Zeitabhängige Mobilisierung (oder Rekrutierung) von VWF auf die Plättchenoberfläche. TDer weiße Maßstab (oben links) zeigt 5 μm an. Grün, VWF. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Rahmen | Wert |
| Belichtungszeit FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 Intensität FITC (Alexa488) | 50% |
| Belichtungszeit DIC | 30 ms |
| Spannung Halogenlampe | 4,5 Volt |
| Belichtungszeit TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 Intensität FITC (Alexa546) | 50% |
| Belichtungszeit DAPI | 500 ms |
| LED 365 Intensität | 50% |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Objektiv | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Öl |
| Bildrate, Aufnahmezeit | 1 Rahmen / 10 s, 30 min |
| Dateikomprimierungsfilme | MOV (h.264), AVI (unkomprimiert) |
| Dateikomprimierungsbilder | JPEG, TIF |
Tabelle 1: Mikroskopeinstellungen. Einstellungen für die repräsentativen Experimente.
| Ziel | Antikörper / Farbstoff | Konzentration |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-Biotin *)325 ng / ml | |
| P-selectin | Anti-CD62P-Biotin **) | 90 ng / ml |
| DNA | DAPI | 10 & mgr; g / ml |
| VWF | Anti-Mensch-VWF- FITC | 5 & mgr; g / ml |
| *) Anti-CD63-Biotin-Antikörper wird vor der Verwendung mit Streptavidin-Alexa488 in einem Molverhältnis von 1: 1 vermischt | ||
| **) Anti-CD62P-Biotin-Antikörper wird vor der Verwendung mit Streptavidin-Alexa546 in einem Molverhältnis von 1: 1 gemischt | ||
Tabelle 2: Antikörper und Farbstoffe. Empfohlene Antikörper- und Farbstoffkonzentrationen für die dargestellten repräsentativen Experimente.
| Reagenzkategorie | Beispiel compoUnds |
| Plättchen-Agonisten | Thrombin, ADP, PAR-1 oder -4 aktivierende Peptide, U46619, Thromboxan A2, ADP |
| Enzyminhibitoren | Hirudin, PPACK, Heparinoide (indirekt), Mais-Trypsin-Inhibitor, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor |
| Rezeptor-Antagonisten | Anti-Glyprotein 1bα, Anti-Glycoprotein VI; Clopidogrel, (cyclische) RGD-haltige Peptide |
| Aktivierungsinhibitoren | Aspirin Vorbehandlung, Fixierung |
Tabelle 3: Potenziell nützliche Reagenzien.
Ergänzende Filme: Film 1: Zeitreihen von Bildern von Thrombozyten (siehe Abbildung 1 ), Film 2: Tilt-Serie von Abbildung 3B , Film 3: Zeitabhängige Mobilisierung von CD63 auf das Plättchen(Siehe Abbildung 4 ), Film 4: Zeitreihen von Einzelzellanalysen (siehe Abbildung 4B ), Film 5: Zeitabhängige Mobilisierung von VWF (siehe Abbildung 5 ).
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Discussion
Weltweit ist Thrombose eine führende Todesursache und Morbidität, und Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur lebenden Zellenabbildung von Thrombozyten-Degranulation unter Strömung. Es wird allgemein angenommen, dass bei der Aktivierung von Blutplättchen alle körnigen Inhalte direkt in Lösung gelangen. Die begleitenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies nicht unbedingt der Fall ist. Während der Adhäsion und Degranulation behalten die Plättchen eine signifikante Menge an Polyphosphat bei ( Abbildung 4 ). Zusätzlich ist das multimere Protein VWF nach der Degranulation mit der Plättchenoberfläche assoziiert ( Abbildung 5 ). Dies deutet darauf hin, dass die molekularen Mechanismen, die die Plättchengranulat-Degranulation kontrollieren, subtiler sind als allgemein angenommen.
Um die lebende Zellen-Abbildung der Thrombozyten-Degranulation unter der Strömung zu ermöglichen, wurden die experimentellen Bedingungen ausgewählt, um die Plättchenaggregation auf ein Minimum zu halten. PlättchenratTs von 150.000 Thrombozyten / μL wurden verwendet. Dies liegt am unteren Ende des Normalbereichs (150.000-450.000 Thrombozyten / μL). Darüber hinaus wurden Plättchenadhäsion und -ausbreitung auf immobilisiertem VWF oder Fibrinogen untersucht, was zu einer leichten Thrombozytenaktivierung (im Gegensatz zu beispielsweise Kollagen) führte. In Studien mit gewaschenen Plättchen bewegen sich erhöhte Scherraten diese Zellen in die Mitte des Flusses. Dies beeinträchtigt die Adhäsion und die anschließende Ausbreitung und kompliziert die Untersuchung der Degranulation.
Bei der physiologischen Hämostase ist die Thrombozytengrenze wichtig. Dieser Prozess wird von Erythrozyten angetrieben und erklärt, warum eine niedrige Anämie manchmal von einer blutenden Diathese begleitet wird. Eine Einschränkung der dargestellten Technik ist, dass die Visualisierung der Thrombozytentgranulation (mit den präsentierten Materialien und Reagenzien) durch rote Blutkörperchen gestört wird. Die Plättchenfunktion wird durch Scherspannung beeinflusst, die eine Funktion der Viskosität des Fluids (μ) ist, sowieDer Scherrate. Daher empfiehlt es sich, die Plättchenfunktion in Strömungsmodellen in Lösungen mit vergleichbaren Viskositäten zu untersuchen ( dh gewaschene Plättchen, rekonstituiertes Blut, PRP oder Vollblut).
Bei der Durchführung dieser Experimente sind einige praktische Faktoren zu berücksichtigen. Zuerst werden Fluoreszenzsignale stark vom Fokusbereich beeinflusst. Wenn das Mikroskop nicht im Fokus ist, ist das Signal leicht verschwommen oder sogar verloren. Vor dem Eintreffen von Blutplättchen in den Strömungskanal ist es am besten, sich auf den Kanal selbst zu konzentrieren (beginnend am Rand der Silikonfolie / Strömungskanalwand). Wenn Thrombozyten anfangen zu haften, konzentrieren Sie sich auf diese Adhäsion Veranstaltung. Ein zweiter Punkt der Sorge ist das Bleichen bestimmter Fluorophore ( zB FITC). Wiederholte Erregung führt zu einem Signalverlust und stört die Untersuchung. Diese Hindernisse können durch die Verwendung stabilerer Fluorophore überwunden werden, wodurch die Intensität des spannenden LED-Lichts reduziert wirdOsure mal und / oder die Bildrate senken.
Das hier beschriebene Modell ist sehr nützlich für die Durchführung einer detaillierten Untersuchung der Thrombozytenreaktionen auf eine Vielzahl von immobilisierten Proteinen und mit unterschiedlichen Strömungsraten. Potenziell kann diese Methode auch verwendet werden, um ihre Wechselwirkung mit aktivierten Endothelzellen zu untersuchen. Die technischen Fortschritte, die die flexiblen Konstruktionen der speziellen Strömungskammern ermöglichen, eröffnen derzeit die Möglichkeiten der Biokompatibilitätsstudien 19 . Die lebenszellige Abbildung der Thrombozytenreaktivität unter der Strömung zeigt wertvolle Einblicke in die Komplexität der Thrombozytenadhäsionsreaktion. Letztlich sollten diese Erfahrungen zu den entwicklungs-experimentellen Strömungsmodellen führen, die die kombinierte Untersuchung der Thrombozytenfunktion und des Einflusses auf das Koagulationssystem ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
CM erkennt die finanzielle Unterstützung der Internationalen Patientenorganisation für C1-Inhibitor-Defizite (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht und der Landsteiner Stiftung für Bluttransfusionsforschung (LSBR) an.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
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