Summary
Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.
Abstract
Las plaquetas de la sangre son actores esenciales en la hemostasia, la formación de trombos para sellar las brechas vasculares. También están implicados en la trombosis, la formación de trombos que ocluyen la vasculatura y lesionan los órganos, con consecuencias potencialmente mortales. Esto motiva la investigación científica sobre la función de las plaquetas y el desarrollo de métodos para rastrear los procesos celulares y biológicos a medida que se producen en condiciones de flujo.
Una variedad de modelos de flujo están disponibles para el estudio de la adhesión de las plaquetas y la agregación, dos fenómenos clave en la biología de plaquetas. Este trabajo describe un método para estudiar la desgranulación de plaquetas en tiempo real bajo flujo durante la activación. El método hace uso de una cámara de flujo acoplada a una instalación de bomba de jeringa que se coloca bajo un microscopio de fluorescencia de LED de gran campo, invertido. La configuración descrita aquí permite la excitación simultánea de múltiples fluoróforos que son suministrados por anticuerpos marcados fluorescentemente o fluorescentesColorantes. Después de experimentos de formación de imágenes de células vivas, los vidrios de cubierta se pueden procesar y analizar posteriormente usando microscopía estática ( es decir, microscopía confocal o microscopía electrónica de barrido).
Introduction
Las plaquetas son células anucleadas que circulan en el torrente sanguíneo. Su función principal es sellar las brechas vasculares en los sitios de lesión y prevenir la pérdida de sangre. En estos sitios de lesión, las fibras de colágeno subendoteliales quedan expuestas y son posteriormente cubiertas por la proteína multimérica, el factor de von Willebrand (VWF). VWF interactúa con las plaquetas en circulación en un mecanismo que depende de la glicoproteína Ibα-IX-V complejo en la superficie celular 1 , ralentizar la velocidad de las plaquetas. Esto es particularmente importante a altas velocidades de cizallamiento. Las plaquetas sufren posteriormente cambios morfológicos mientras reciben impulsos de activación del colágeno. Esto conduce a la propagación irreversible y, finalmente, a la agregación plaquetaria. Ambos procesos dependen de la secreción del contenido de gránulos para facilitar la diafonía plaquetaria-plaquetas. Entre otros, los gránulos alpha de plaquetas contienen fibrinógeno y VWF para ayudar a la adhesión de las plaquetas y para puentearPlaquetas juntas de una manera dependiente de la integrina. Los gránulos densos de plaquetas contienen compuestos inorgánicos 2 , incluyendo calcio y difosfato de adenosina (ADP), que ayudan a reforzar la activación plaquetaria. Además, las plaquetas contienen mediadores de la inflamación (alérgica) 3 , proteínas 4 de control del complemento, y factores de angiogénesis 5 , 6 , planteando la cuestión de si y cómo estos contenidos se liberan diferencialmente en condiciones variables.
Desde la década de 1980, el estudio de la función plaquetaria en los modelos de flujo ha sido valiosa para la investigación de los mecanismos trombóticos [ 7] . Desde entonces, se ha hecho mucho progreso técnico y modelos de flujo que incluyen formación de fibrina se desarrollan actualmente para ensayar el potencial hemostático de los concentrados plaquetarios terapéuticos ex vivo 8 oInvestigar la influencia de las alteraciones en las tasas de cizallamiento en la morfología del trombo [ 9] . Las diferencias en los mecanismos moleculares y biológicos celulares que impulsan la adhesión estable y la formación de trombos fisiológicos (hemostasia) frente a la formación de trombos patológicos (trombosis) pueden ser muy sutiles y motivar el desarrollo de modelos de flujo que permitan la visualización en tiempo real de estos subcelulares Procesos.
Un ejemplo de un proceso para el cual tal disposición sería valiosa es la (re) distribución de polifosfato intracelular y el reclutamiento de factores de coagulación para descubrir el impacto dependiente del tiempo que esto tiene sobre la ultraestructura de fibrina 10 . Los estudios se limitan a menudo a análisis de los puntos finales. El objetivo principal del método descrito es permitir la investigación visual en tiempo real de procesos subcelulares dinámicos que tienen lugar durante la activación plaquetaria bajo flujo.
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Protocol
El comité médico ético local del centro médico de la universidad Utrecht aprobó el drenaje de la sangre para los propósitos ex vivo de la investigación, incluyendo los de este estudio.
1. Preparación de la solución
- Preparar un tampón de Tyrode del ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) disolviendo HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO $ ₄ $ 1 mM y D5- Glucosa en agua destilada.
- Hacer dos variantes de la memoria intermedia: establecer los niveles de pH en 6,5 y en 7,4, respectivamente. Hacer buffer fresco para cada día de experimentos. Suplemento con 10 ng / mL de prostaciclina cuando se indique.
- Preparar solución salina tamponada con TRIS (TBS) disolviendo Tris 50 mM y NaCl 150 mM en agua destilada y ajustar el pH a 9,0.
- Preparar ácido citrato dextrosa (ACD) disolviendo 85 mM Tri-sodio citrato, 71 mM de ácido cítrico, y 111 mM D-glucosa en disAgua labrada
- Preparar una solución fijadora mediante la adición de paraformaldehído (PFA) al 2% (v / v) al tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4. Calentar para disolver (50 - 70 ° C) y ajustar el pH a 7,4. Alícuotas y almacenar a -20 ° C. Descongele a 37 ° C antes de usar.
- Preparar tampón de bloqueo disolviendo albúmina de suero humano (HSA) al 1% (m / v) en tampón HEPES Tyrode, pH 7,4
- Hacer una solución de alcohol polivinílico añadiendo 4,8 g de alcohol polivinílico a 12 g de glicerol y mezclar bien. Añadir 12 ml de agua destilada y dejarla en un rotador a temperatura ambiente durante la noche.
- Añadir 24 ml de Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5. Calentar a 50 ° C mientras se mezcla durante 30 min. Añadir 1,25 g de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) y mezclar bien. Centrifugar a 1.500 xg durante 5 min. Alícuota del sobrenadante (1 ml es suficiente para 15-20 diapositivas) y almacenar a -20 ° C. Utilice las alícuotas una vez.
2. Preparación del cristal de la cubierta
- Desgrasar la cubierta(25 x 50 mm ^ { 2} ) incubando durante la noche en ácido cromosulfúrico no diluido. Enjuagar los cristales de la cubierta con agua destilada y secarlos durante la noche a 60 ° C en un horno.
- Adherir una tira de una película de parafina (10 x 15 cm 2 ) en la parte superior de un banco de laboratorio con una gota de agua y eliminar el aire alisando la película de parafina. Pipetee 80 μL de gotas de 10 μg / mL VWF o 100 μg / mL de fibrinógeno sobre la película de parafina. Coloque los vasos sobre las gotas; La solución de proteína se extenderá entre las dos superficies para cubrir toda la parte posterior del vidrio. Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente (RT).
- Retire la película de parafina y bloquear los vidrios de cubierta colocándolos, con el lado recubierto hacia arriba en una placa de 4 pocillos con tampón de bloqueo. Incubar durante 1 ha 37 ° C o durante la noche a 4 ° C. Como control, bloquee un vidrio de cubierta que no haya sido recubierto con VWF o fibrinógeno.
3. Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
NOTA: Después de la centrifugación, se pueden observar tres capas (de arriba hacia abajo): PRP, glóbulos blancos y glóbulos rojos. Asegúrese de no incluir las células blancas y rojas. Típicamente, se pueden recoger 3 ml de PRP después de la centrifugación de un tubo de sangre de 9 ml.
NOTA: Típicamente, se pueden recoger 2 ml después de esta segunda etapa de centrifugación.
NOTA: El volumen total de PRP diluido depende del recuento de plaquetas del donante. Los recuentos de plaquetas varían ampliamente entre los donantes, y la dilución de PRP requiere una evaluación individual. Los recuentos de plaquetas se consideran normales cuando están dentro de 150.000 y 450.000 plaquetas / μl.
4. Preparación de plaquetas lavadas
- Determine el volumen medio de plaquetas (MPV) en el PRP usando un analizador de células.
NOTA: Este es un indicador de la pre-activación plaquetaria 11 . Un MPV normal para las plaquetas en reposo es 7,5-11,5 fL 11 . El MPV no debe aumentar en más de 1,5 fL durante el procedimiento de lavado de plaquetas. - Añadir un volumen 1/10 de ACD a PRP para prevenir la pre-activación de las plaquetas y centrifugar durante 15 min a 400 xg y RT sin freno. Quitar el suY volver a suspender el gránulo cuidadosamente en tampón HEPES Tyrode, pH 6,5, al volumen original de PRP.
- Descongele una alícuota de prostaciclina añadiendo TBS a una concentración de 10 μg / mL; Mantenerlo en hielo.
- Para prevenir la activación plaquetaria, añada prostaciclina a una concentración final de 10 ng / ml a las plaquetas re-suspendidas e inmediatamente centrifugue durante 15 min a 400 xg y RT sin freno. Se retira el sobrenadante y se vuelve a suspender el gránulo cuidadosamente en tampón HEPES Tyrode, pH 7,4.
- Contar el número de plaquetas (paso 3.5) y determinar el cambio en MPV (paso 4.1) (el MPV no debe cambiar más de 1,5 fL).
- Ajustar el número de plaquetas con el tampón HEPES Tyrode, pH 7,4, hasta una concentración de 150.000 plaquetas / μl. Dejar las plaquetas para recuperar durante 30 minutos a RT antes de los experimentos. Utilizar plaquetas lavadas para experimentos dentro de las 4 h después del aislamiento.
5. Montaje de la Cámara de Flujo
12 . Se puede usar una variedad de cámaras de flujo producidas comercialmente, siempre y cuando puedan contener un vidrio de cubierta, que preferentemente es removible para análisis adicionales. La cámara de flujo usada para los experimentos descritos está hecha de poli (metacrilato de metilo) para adaptarse con precisión a una etapa de inserción de microscopio. Contiene una entrada y salida ( Figura 1A - C , 1, 2), así como una conexión de vacío ( Figura 1A y C , 3). Una hoja de silicona personalizada ( Figura 1A y D , 4) se coloca en la parte superior. Dos recortes forman canales de vacío ( Figura 1A y D , 5) para fijar firmemente el vidrio de cubierta ( Figura 1A , 6) a la cámara. Un corte central forma el canal de flujo ( Figura 1A D ; 7; 2,0 mm de ancho y 0,125 mm de altura). La entrada y la salida están conectadas al canal de flujo, y el vacío está conectado al canal de vacío.
- Cubra la parte superior de la cámara de flujo con agua destilada y coloque la hoja de silicona a medida con el lado suave hacia abajo sobre el agua. Flote la hoja en su posición eliminando el exceso de agua mientras mantiene la hoja en su posición.
NOTA: Esta hoja de silicona es reutilizable (la silicona es conocida por sus propiedades inertes); Generalmente, no se ha observado que las plaquetas se unan a ella. Las hojas pueden limpiarse con detergente y reutilizarse hasta que el material se dañe ( es decir, desgarro, especialmente en el área entre canales). Generalmente, una hoja puede usarse durante 20 días con múltiples experimentos por día. - Incubar la cámara de flujo durante 1 h a 60 ° C para evaporar el agua residual para adherir firmemente la hoja de silicona a la cámara de flujo.
- Con una pipeta Pasteur de plástico, agregue una gota deHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, en el canal de flujo. Coloque el cristal de cubierta (ver sección 2) con el lado recubierto hacia abajo, en el canal de flujo. Conecte la bomba de vacío a la conexión de vacío ( Figuras 1A y C ; 3). Aplicar ~ 10 kPa de presión.
6. Pre-tinción de las plaquetas y preparación de los anticuerpos
- Tinción de plaquetas
- Incubar las plaquetas lavadas con DAPI 10 μ g / mL durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Para lavar el DAPI no unido y para prevenir la activación plaquetaria, añadir prostaciclina a una concentración final de 10 ng / mL e inmediatamente centrifugar durante 15 min a 400 xg y RT sin freno.
- Reconstituir el sedimento de plaquetas en el tampón HEPES Tyrode, pH 7,4, a una concentración plaquetaria de 150.000 plaquetas / μl.
- Preparación de anticuerpos
- Mezclar anticuerpo marcado con biotina con estreptococos marcados con AlexaTavidina en una relación molar de 1: 1. Incubar durante un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente antes de usar (paso 7.6).
NOTA: La eficiencia del etiquetado de biotina puede variar entre diferentes lotes. En caso de que haya problemas con la visualización de las moléculas diana, deben realizarse experimentos de control para confirmar la biotinilación exitosa, así como las propiedades de unión a diana del anticuerpo biotinilado específico.
- Mezclar anticuerpo marcado con biotina con estreptococos marcados con AlexaTavidina en una relación molar de 1: 1. Incubar durante un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente antes de usar (paso 7.6).
7. Perfusión
- Iniciar el microscopio de fluorescencia, así como el software del microscopio. Utilice los ajustes del microscopio que se muestran en la Tabla 1 .
NOTA: Inicie el microscopio y los ajustes de grabación para la visualización de células vivas y el registro de las plaquetas y los anticuerpos y / o tintes marcados fluorescentemente elegidos cargando un experimento apropiado en el software del microscopio. Realizar experimentos de flujo a RT. - Bloquee el tubo de entrada conectando una jeringa de 10 ml a la tubería y aspirando 1% de HSA bloCking en el tubo de entrada. Incubar durante 15 min a RT. Enjuague el tubo de entrada aspirando el tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4, en el tubo de entrada.
- Conecte el tubo de entrada bloqueado y el tubo de salida no tratado, ambos con un diámetro de 1,02 mm y una longitud de ~ 20-30 cm a la entrada y salida de la cámara. Conecte una jeringa de 10 ml (o un volumen más bajo para mayor precisión) a la tubería de salida. Encienda la bomba de la jeringa.
NOTA: El diámetro de la jeringa, en combinación con el caudal establecido en la bomba, determina el caudal volumétrico. Junto con el área superficial del canal de flujo, la velocidad de cizallamiento se puede calcular de acuerdo con la fórmula 13 abajo. Por lo tanto, es posible manipular la velocidad de cizalladura cambiando el caudal de la bomba de jeringa o alterando las dimensiones del canal de flujo. Una velocidad de corte de 800-1.600 s -1 típicamente modelos para el flujo sanguíneo arterial, mientras que 25 - 100 s-1 modelos de sangre venosafluir. Para esta configuración, un caudal de 7,5 μL / min da como resultado una velocidad de cizallamiento de 25 s -1 .
Frecuencia de corte = 6Q / h 2 w en s -1
Donde: Q = caudal volumétrico (ml / s), h = altura del canal (cm) (0,0125 cm, es el espesor de la lámina de silicona), w = anchura del canal (cm) (0,2 cm en esta cámara). - Coloque una gota de aceite de inmersión en un objetivo 100X (amplificación total de 1.000 X) y monte la cámara en el microscopio con la superficie de vidrio hacia abajo.
- Coloque el tubo de entrada en un tubo que contenga el tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4. Tire manualmente del émbolo de la jeringa conectado a la tubería de salida y tire de la solución a través de la cámara para eliminar el aire del sistema. Coloque la jeringa en la bomba de la jeringa ( Figura 1B y C ; 8) y haga funcionar la bomba brevemente para apretar el émbolo y asegurar un flujo estable.
- Añadir anticuerpos y / o colorantes a la suspensión de plaquetas o PRP,Mezclar con una pipeta de plástico, y transferir la mezcla a un tubo de 1,5 ml.
NOTA: Para una perfusión típica de 30 minutos a una velocidad de corte de 25 s-1 (7,5 μl / min), se necesita un mínimo de 225 μl de suspensión de plaquetas. Los anticuerpos utilizados para los resultados representativos se muestran en la Tabla 2 . - Mueva el tubo de entrada, mientras se aprieta, desde el tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4, a un tubo de 1,5 ml que contiene PRP o las plaquetas lavadas y los anticuerpos y / o colorantes ( Figura 1B y C ; 9).
NOTA: Es importante que, al transferir el tubo, el tubo se comprima (presionando el aire) para evitar que el aire entre en el tubo. Es posible tratar las plaquetas adherentes con una variedad de reactivos en una etapa subsiguiente moviendo el tubo de entrada a otro tubo de una manera similar. En la Tabla 3 se proporciona una lista de reactivos potencialmente útiles. - Seleccione la opción "visualización en vivo"N "en el software, enfocar el microscopio en la superficie del vidrio cubierto y comenzar la bomba a una velocidad de corte de 1.600 s-1 (484 μl / min) hasta que las plaquetas lleguen a la cámara de flujo En este momento, Reducir la velocidad de cizalladura a 25 s-1 cambiando los ajustes de la bomba de la jeringa a un caudal de 7,5 μl / min.
- Supervise la superficie del lado recubierto del vidrio de la cubierta, espere hasta que la primera plaquita empiece a adherirse, enfoque el microscopio sobre esta plaquita e inicie la grabación iniciando el experimento en el software. Consulte la Tabla 1 para ver los ajustes de grabación utilizados aquí.
- Siga la grabación en vivo visualmente. Después de 30 minutos, detenga la bomba de la jeringa.
NOTA: Asegúrese de que las plaquetas permanezcan enfocadas durante el transcurso del experimento. Típicamente, 20-30 plaquetas se fijan en el campo de visión con una ampliación de 1.000 X; Esto es alrededor de 2.000 a 3.000 plaquetas en todo el canal de flujo. - Fijación medianteLa cámara de flujo (opcional).
- Cuando el flujo se detiene después de detener la bomba de la jeringa, transfiera el tubo de entrada (libre de aire) a la solución fijadora. Reinicie la bomba y fluya el tampón de fijación a través del canal durante un mínimo de 10 min a la misma velocidad de flujo que se menciona en el paso 7.8.
- Retire la cámara del microscopio, limpie el aceite de inmersión del vidrio, desconecte el vacío y retire cuidadosamente el vidrio de la cubierta de la cámara con una aguja de 18 G.
NOTA: Evite que el cristal de cubierta rompa y dañe la hoja de silicio. - Coloque la diapositiva de la cubierta (con las celdas dirigidas hacia arriba) en una placa de 4 pocillos sobre un tejido, previamente humedecida con agua destilada.
NOTA: Esto evita que el vidrio de cubierta se adhiera a la superficie del pozo y evite el secado. - Pipetee 750 μl de solución fijadora en la parte superior del cristal de cubierta e incube durante 1 h a temperatura ambiente. En el caso de que las muestras no puedan ser analizadas directamente,Almacenarlos en PFA al 0,5% (diluido con tampón HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C para asegurar una fijación estable. Proceda a la sección 8 para procesar el cristal de la tapa para obtener imágenes.
- Después del uso, enjuague la cámara, el tubo y la lámina con agua destilada e incube durante la noche en una solución detergente. Antes de reutilizar la cámara y otros componentes, aclarar con agua destilada.
- Guardar los archivos de datos crudos del microscopio que contienen todos los metadatos. Cuando sea necesario, exporte las películas a .MOV, h.264 comprimido o .AVI sin comprimir. Guarde marcos separados como archivos JPEG o TIF.
8. Preparación de Muestras para Microscopía de Fluorescencia Confocal
- Transferir los vidrios de tapa a las nuevas placas de 4 pocillos y enjuagar 5 veces con 3 mL de tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4. Añadir 3 ml / pocillo de tampón de bloqueo e incubar durante 1 h a RT.
- Quitar el tampón de bloqueo; Añadir 3 ml / pocillo de glicina al 0,15% (M / V) en tampón HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubar durante 15 min en RT.
- Eliminar la solución de glicina y lavar 5 veces en 3 ml / pocillo de tampón de bloqueo. Opcionalmente, añadir anticuerpos conjugados con fluoróforo diluidos en tampón de bloqueo para tinción adicional. Incubar durante 1 h a RT en la oscuridad.
- Lavar 5 veces con tampón de bloqueo y 2 veces con agua destilada. Seque el vidrio quitando el exceso de líquido con un tejido (de los bordes hacia adentro), sin tocar las células.
- Pipetee 60 μL de solución de alcohol polivinílico sobre una lámina de microscopio. Coloque el vidrio de cubierta, con las células hacia abajo, en la parte superior de la gota y dejar que el alcohol de polivinilo se extiende entre las dos superficies. Incubar durante la noche a RT en la oscuridad.
- Analizar las células por microscopía confocal [ 14] .
- Guarde los archivos de datos sin formato de los datos de la pila grabada que contengan todos los metadatos. Cuando sea necesario, procese los archivos de datos sin formato en archivos MOV, h.264 comprimidos o .AVI sin comprimir. Guarda pilas separadas como archivos JPEG o TIF.
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Representative Results
La figura 1 muestra imágenes de la cámara de flujo y disposición experimental; La posición y dimensiones de la lámina de silicio; Y conexiones de tubería. La figura 2 proporciona detalles sobre las dimensiones de la cámara de flujo. La Figura 3 y la Pelıcula 1 muestran una serie cronológica de imágenes de adhesión y esparcimiento de plaquetas sobre VWF inmovilizado. CD63 es una proteína transmembrana que se inserta en la membrana de gránulos densos intracelulares de plaquetas en reposo [ 15] . Su movilización dependiente del tiempo sobre la superficie de las plaquetas se muestra en verde. De forma similar, la P-selectina (Psel) es una proteína transmembrana insertada en la membrana de los α-gránulos intracelulares de las plaquetas en reposo. Su movilización dependiente del tiempo sobre la superficie de las plaquetas se muestra en naranja. La figura 3B muestra una imagen representativa con un ángulo de 45º, Adquirido por microscopía de fluorescencia confocal después de un experimento de flujo. La película 2 muestra una serie de inclinación del mismo experimento. Tenga en cuenta que CD63 se encuentra principalmente en el granulomere central, mientras que la P-selectina se distribuye en todo el cuerpo celular y parece concentrado en los bordes. Las Figuras 4A y 3 muestran la movilización dependiente del tiempo de CD63 sobre la superficie de las plaquetas (verde). En estos experimentos, las plaquetas (que no tienen ADN nuclear) fueron pre-incubadas con DAPI (azul), que manchas de polifosfato en gránulos densos [ 16] . Notablemente, a pesar de los claros signos de liberación gruesa de gránulos (análisis de células individuales se muestran en la Figura 4B y Película 4 ), polifosfato se retiene dentro o en el exterior de estas plaquetas. La figura 5 y la película 5 muestran la movilización dependiente del tiempo (o el reclutamiento) de VWF, una trombogénica multImérica 17 almacenada en α-gránulos, a la superficie de las plaquetas (verde). Al igual que el polifosfato, el VWF permanece asociado con la superficie de las plaquetas activadas.
Figura 1: Cámara de flujo y configuración experimental. ( A ) Imagen del diseño de cámara de flujo con una entrada y una salida (1 y 2), una conexión de vacío (3) sobre la cual se coloca la hoja de silicona (4). Dos recortes externos (5) en la hoja de silicio forman los canales de vacío para fijar el vidrio de cubierta (6). Un recorte central (7) forma el canal de flujo ( B ) Imagen del montaje experimental. Entrada y salida (1 y 2), bomba de jeringa (8) y porta muestras (9). ( C ) Esquema de la configuración experimental; Los números son idénticos a los de A y B. ( D ) Esquema general con la dimensión De la hoja de silicona cortada a medida. ( E ) Vista general esquemática general de la cámara de flujo de poli (metacrilato de metilo) . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Plano detallado de la cámara de flujo. La cámara de flujo consiste en un bloque de poli (metacrilato de metilo) (1) , un inserto recto de polioximetileno para la entrada de vacío (2) y dos insertos de polioximetileno angulados para la entrada y salida de la muestra (3) . Los insertos angulares de polioximetileno contienen tubos capilares metálicos, con diámetros de 1,07 mm. La inserción recta contiene un tubo capilar con un diámetro de 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esparcimiento y desgranulación de plaquetas en el factor inmovilizado von Willebrand. ( A ) Movilización dependiente del tiempo de CD63 y de la selectina P sobre la superficie de las plaquetas que se diseminan y desgranulan. La barra de escala blanca (superior izquierda) indica 10 μm. ( B ) Imagen de microscopía confocal fluorescente representativa en un ángulo de 45 °. La barra de escala blanca (inferior izquierda) indica 2 μm. Verde, CD63; Naranja, P-selectina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4: Separación de plaquetas, desgranulación y movilidad de gránulos densos sobre fibrinógeno inmovilizado. ( A ) Movilización dependiente del tiempo de CD63 y polifosfato sobre la superficie de las plaquetas. La barra de escala blanca (superior izquierda) indica 10 μm. ( B ) Serie temporal de una sola plaquita (t = 0 representa la primera adherencia a la superficie). La barra de escala blanca (inferior derecha) indica 2 μm. Verde, CD63; Azul, DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Asociación Superficial del Factor de von Willebrand sobre la Superficie Plaquetaria del Fibrinógeno Inmovilizado. Movilización temporal (o reclutamiento) de VWF a la superficie de las plaquetas. TLa barra de escala blanca (superior izquierda) indica 5 μm. Verde, VWF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ajuste | Valor |
| Tiempo de exposición FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| Intensidad del LED 488 FITC (Alexa488) | 50% |
| Tiempo de exposición DIC | 30 ms |
| Lámpara halógena de voltaje | 4,5 voltios |
| Tiempo de exposición TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| Intensidad del LED 555 FITC (Alexa546) | 50% |
| Tiempo de exposición DAPI | 500 ms |
| Intensidad LED 365 | 50% |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Objetivo | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Aceite |
| Frecuencia de fotogramas, tiempo de grabación | 1 marco / 10 s, 30 min |
| Películas de compresión de archivos | MOV (h.264), AVI (sin comprimir) |
| Imágenes de compresión de archivo | JPEG, TIF |
Tabla 1: Configuración del microscopio. Configuración utilizada para los experimentos representativos.
| Objetivo | Anticuerpo / tinte | Concentración |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotina *)325 ng / ml | |
| P-selectina | Anti - CD62P - biotina **) | 90 ng / ml |
| ADN | DAPI | 10 μg / mL |
| VWF | VWF-FITC anti-humano | 5 mu g / ml |
| *) Anticuerpo anti-CD63-biotina se mezcla con estreptavidina-Alexa488 en una relación molar de 1: 1 antes del uso | ||
| **) anticuerpo anti-CD62P-biotina se mezcla con estreptavidina-Alexa546 en una relación molar de 1: 1 antes del uso | ||
Tabla 2: Anticuerpos y Colorantes. Concentraciones de anticuerpos y colorantes recomendadas para los experimentos representativos mostrados.
| Categoría del reactivo | Ejemplo compoUnds |
| Agonistas plaquetarios | Trombina, ADP, péptidos activadores de PAR-1 o -4, U46619, Tromboxano A2, ADP |
| Inhibidores enzimáticos | Hirudina, PPACK, heparinoides (indirectos), inhibidor de tripsina de maíz, inhibidor de tripsina de soja |
| Antagonistas del receptor | Anti-Glyprotein 1bα, anti-glicoproteína VI; Clopidogrel, péptidos (cíclicos) que contienen RGD |
| Inhibidores de la activación | Pretratamiento de la aspirina, fijación |
Tabla 3: Reactivos potencialmente útiles.
Películas suplementarias: Película 1: Serie cronológica de imágenes de plaquetas (ver Figura 1 ), Película 2: serie de inclinación de la Figura 3B , Película 3: Movilización dependiente del tiempo de CD63 sobre la plaquetas(Ver Figura 4 ), Película 4: Serie temporal de análisis de una sola célula (ver Figura 4B ), Película 5: Movilización dependiente del tiempo de VWF (ver Figura 5 ).
Haga clic aquí para descargar la Película 1.
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Haga clic aquí para descargar la Película 3.
Por favor, haga clic aquí para descargar Película 4.
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Discussion
En todo el mundo, la trombosis es una causa principal de muerte y morbilidad, y las plaquetas juegan un papel central en su desarrollo. Este trabajo describe un método para la obtención de imágenes de células vivas de la desgranulación plaquetaria bajo flujo. Generalmente se supone que, cuando las plaquetas se activan, todos los contenidos granulares se liberan directamente en la solución. Los resultados que acompañan sugieren que esto no es necesariamente el caso. Durante la adhesión y la desgranulación, las plaquetas retienen una cantidad significativa de polifosfato ( Figura 4 ). Adicionalmente, la proteína multimérica VWF se asocia con la superficie plaquetaria después de la desgranulación ( Figura 5 ). Esto indica que los mecanismos moleculares que controlan la desgranulación de gránulos plaquetarios son más sutiles de lo que generalmente se supone.
Para permitir la formación de imágenes en células vivas de la desgranulación plaquetaria bajo flujo, se seleccionaron las condiciones experimentales para mantener la agregación plaquetaria al mínimo. PlaquetasSt de 150.000 plaquetas / μl. Esto está en el extremo inferior del rango normal (150.000-450.000 plaquetas / μL). Además, la adhesión de las plaquetas y la propagación se estudiaron en VWF inmovilizado o fibrinógeno, lo que llevó a la activación leve de plaquetas (en contraste con, por ejemplo, el colágeno). En estudios con plaquetas lavadas, las mayores tasas de cizallamiento desplazan estas células al centro del flujo. Esto interfiere con la adhesión y posterior propagación y complica la investigación de la desgranulación.
En la hemostasia fisiológica, la marginación plaquetaria es importante. Este proceso es impulsado por eritrocitos, lo que explica por qué la anemia baja a veces va acompañada de una diátesis hemorrágica. Una limitación de la técnica presentada es que la visualización de la desgranulación plaquetaria (con los materiales y reactivos presentados) es perturbada por glóbulos rojos. La función plaquetaria está influenciada por el esfuerzo cortante, que es una función de la viscosidad del fluido (μ), así comoDe la velocidad de cizallamiento. Por lo tanto, se recomienda estudiar la función plaquetaria en modelos de flujo en soluciones con viscosidades comparables (p. Ej., Plaquetas lavadas, sangre reconstituida, PRP o sangre entera).
Hay varios factores prácticos a tener en cuenta al realizar estos experimentos. En primer lugar, las señales de fluorescencia están fuertemente influenciadas por el área de enfoque. Si el microscopio no está enfocado, la señal se borra fácilmente o incluso se pierde. Antes de la llegada de las plaquetas al canal de flujo, es mejor centrarse en el propio canal (comienzan en el borde de la pared de silicio / canal de flujo). Cuando las plaquetas comienzan a adherirse, se centran en este evento de adhesión. Un segundo punto de preocupación es el blanqueo de ciertos fluoróforos ( por ejemplo, FITC). La excitación repetida conducirá a una pérdida de señal, perturbando la investigación. Estos obstáculos pueden ser superados usando fluoróforos más estables, reduciendo la intensidad de la emocionante luz LED, acortando la expOsure veces, y / o bajar la velocidad de fotogramas.
El modelo descrito aquí es muy útil para realizar un estudio detallado de las respuestas plaquetarias a una amplia variedad de proteínas inmovilizadas ya diferentes velocidades de flujo. Potencialmente, este método también puede ser utilizado para estudiar su interacción con las células endoteliales activadas [ 18] . Los avances técnicos que permiten los diseños flexibles de las cámaras especiales de flujo están abriendo actualmente vías para estudios de biocompatibilidad 19 . La imagen de células vivas de la reactividad de las plaquetas bajo flujo revelará información valiosa sobre la complejidad de la respuesta de adhesión plaquetaria. En última instancia, estas experiencias deben conducir al desarrollo de modelos de flujo experimental que permitan la investigación combinada de la función plaquetaria y la influencia en el sistema de coagulación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
CM reconoce el apoyo financiero de la Organización Internacional del Paciente para las deficiencias del inhibidor C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht y la Fundación Landsteiner para la Investigación de la Transfusión Sanguínea (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
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