Summary
עבודה זו מתארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.
Abstract
טסיות דם הם שחקנים חיוניים בהמוסטזיס, היווצרות של טרומבי לחותם הפרעות בכלי הדם. הם מעורבים גם פקקת, היווצרות של תרומבי כי לכסות את כלי הדם ואת הפגיעה באיברים, עם תוצאות מסכנות חיים. זה מניע מחקר מדעי על תפקוד טסיות ופיתוח שיטות כדי לעקוב אחר תהליכים ביולוגיים התא כפי שהם מתרחשים בתנאי זרימה.
מגוון של מודלים לזרימה זמינים לחקר הדבקה וטסיות טסיות, שתי תופעות מרכזיות בביולוגיה טסיות. עבודה זו מתארת שיטה ללימוד degranulation טסיות בזמן אמת תחת זרימה במהלך ההפעלה. השיטה עושה שימוש בתא הזרימה מצמידים ההתקנה משאבה מזרק ממוקם תחת שדה רחב, הפוך, מבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED. ההתקנה המתוארת כאן מאפשר גירוי סימולטני של fluorophores מרובים אשר מועברים על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently או fluorescצבעים. לאחר ניסויים הדמיה חיה תא, כוסות לכסות ניתן לעבד עוד יותר ונותחו באמצעות מיקרוסקופ סטטי ( כלומר מיקרוסקופיה confocal או מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה).
Introduction
טסיות הדם הן תאים אנוקליאטיות המסתובבות בזרם הדם. הפונקציה העיקרית שלהם היא לחתום הפרות כלי הדם באתרים של פגיעה כדי למנוע אובדן דם. באתרים אלה של פגיעה, סיבי קולגן subendothelial נחשפים והם מכוסים לאחר מכן על ידי חלבון multimeric, פון Willebrand גורם (VWF). VWF אינטראקציה עם טסיות במחזור במנגנון זה תלוי glycoprotein IBA-IX-V מורכבים על פני התא 1 , להאט את מהירות הטסיות. זה חשוב במיוחד בשיעורי גזירה גבוהה. טסיות לאחר מכן לעבור שינויים מורפולוגיים בעת קבלת הפעלת דחפים קולגן. זה מוביל להתפשטות בלתי הפיך ובסופו של דבר צבירה טסיות. שני התהליכים תלויים בהפרשת תכולת גרגירים כדי להקל על קרוסטלקט טסיות טסיות. בין היתר, טסיות α- גרגרים מכילים פיברינוגן ו VWF לסייע הידבקות טסיות לגשרטסיות יחד בצורה תלויי אינטגרין. גרגירי הצפיפות הטסיות מכילים תרכובות אנאורגניות 2 , כולל סידן ואדנוזין diphosphate (ADP), אשר מסייעות לחזק את פעולת הטסיות. יתר על כן, טסיות להכיל מתווכים של דלקת (אלרגית) 3 , משלימים שליטה חלבונים 4 , ו אנגיוגנזה גורמים 5 , 6 , מעלה את השאלה האם וכיצד תוכן אלה משתחררים באופן דיפרנציאלי בתנאים משתנים.
מאז 1980, המחקר של תפקוד טסיות במודלים הזרימה היה בעל ערך לחקירת מנגנוני טרומבוטיים. מאז, התקדמות טכנית רבה נעשתה, מודלים הזרימה הכוללים היווצרות fibrin מפותחים כיום כדי assay הפוטנציאל המוסטטי של ריכוז טסיות טיפולית לשעבר vivo 8 אולחקור את השפעת ההפרעות בשיעורי גזירה על מורפולוגיה 9 . ההבדלים במנגנונים המולקולריים והתאים הביולוגיים שמניעים הידבקות יציבה ויצירת פקקת פיזיולוגית (הימוסטאזיס) לעומת היווצרות פקק פתולוגי (פקקת) עשויים להיות מתוחכמים מאוד ומניעים את התפתחות מודלים הזרימה המאפשרים הדמיה בזמן אמת של תת-תאים אלה תהליכים.
דוגמה לתהליך שעבורו התקנה כזו תהיה בעלת ערך היא ההפצה (re) של polyphosphate תוך תאיים וגיוס גורמים קרישניים כדי לחשוף את ההשפעה תלוי הזמן על זה על תשתית פיברין 10 . מחקרים מוגבלים לעיתים קרובות לניתוח נקודות קצה. המטרה העיקרית של השיטה המתוארת היא לאפשר את החקירה החזותית בזמן אמת של תהליכים תת-דינמיים דינמיים המתרחשים במהלך הפעלת טסיות מתחת לזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה הרפואית הרפואית המקומית של המרכז הרפואי האוניברסיטאי אוטרכט אישרה את רישום הדם למטרות מחקר של vivo לשעבר , כולל אלו של מחקר זה.
1. הכנת פתרון
- הכנת חומצה 4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) של חיץ Tyrode על ידי המסת 10 מ"מ HEPES, 0.5 מ"מ Na 2 HPO 4 , 145 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgSO 4 , ו 5.55 מ"מ D- גלוקוז במים מזוקקים.
- בצע שתי גרסאות של המאגר: להגדיר את רמות ה- pH ב 6.5 ו 7.4, בהתאמה. הפוך למאגר טרי עבור כל יום של ניסויים. להשלים עם 10 ng / mL prostacyclin שבו צוין.
- הכן טריס שנאגרו מלוחים (TBS) על ידי המסת 50 מ"מ טריס ו 150 מ"מ NaCl במים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 9.0.
- הכן חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) על ידי המסת 85 מ"מ טרי ציטראט ציטראט, 71 מ"מ חומצת לימון, 111 מ"מ גלוקוז D ב דיסמים טריים.
- הכן פתרון מקבע על ידי הוספת 2% (V / V) paraformaldehyde (PFA) למאגר HEPES Tyrode, pH 7.4. מחממים לפזר (50 - 70 מעלות צלזיוס) ולהגדיר את ה- pH 7.4. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. ההפשרה ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- הכן חיץ חסימת על ידי המסת 1% (מ / V) אלבומין בסרום האדם (HSA) במאגר HEPES Tyrode, pH 7.4
- הפוך פתרון polyvinyl אלכוהול על ידי הוספת 4.8 גרם של אלכוהול polyvinyl ל 12 גרם של גליצרול ומערבבים היטב. הוסף 12 מ"ל של מים מזוקקים ולהשאיר אותו על rotator בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- הוסף 24 מ"ל של 0.2 M Tris-HCL, pH 8.5. מחממים ל 50 מעלות צלזיוס תוך ערבוב במשך 30 דקות. הוסף 1.25 גרם של 1,4-diazabicyclo [2.2.2] אוקטן (DABCO) ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 5 דקות. Aliquot supernatant (1 מ"ל מספיק עבור שקופיות 15-20) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. השתמש aliquots פעם אחת.
2. הכנת הכנת זכוכית
- כיסוי degreaseמשקפיים (25 x 50 מ"מ 2 ) על ידי דוגרים בן לילה בחומצה chromosulfuric. שוטפים את הכוסות המכוסות במים מזוקקים ומייבשים אותן במשך הלילה ב 60 מעלות צלזיוס בתנור.
- דבק רצועה של סרט פרפין (10 x 15 ס"מ 2 ) על גבי ספסל מעבדה עם טיפה של מים ולהסיר את האוויר על ידי החלקה של הסרט פרפין. פיפטה 80 טיפות μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל VWF או פיברינוגן 100 מיקרוגרם / מ"ל על הסרט פרפין. מניחים את המשקפיים על הטיפות; הפתרון חלבון יתפשט בין שני משטחים כדי לכסות את הצד האחורי כולו של הזכוכית. לדגור על 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר את הסרט פרפין לחסום את הכוסות על ידי הצבת אותם, עם הצד המצופה למעלה בצלחת 4-היטב עם חיץ חסימה. לדגור על 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. כבקרה, לחסום כוס לכסות כי לא היה מצופה VWF או פיברינוגן.
3. הכנת פלזמה עשירה פלזמה (PRP)
הערה: לאחר צנטריפוגה, שלוש שכבות ניתן לראות (מלמעלה למטה): PRP, תאי דם לבנים, ותאי דם אדומים. הקפד לא לכלול את התאים הלבנים והאדומים. בדרך כלל, 3 מ"ל של PRP ניתן לאסוף לאחר צנטריפוגה של צינור דם 9 מ"ל.
הערה: בדרך כלל, 2 מ"ל ניתן לאסוף לאחר צעד צנטריפוגה השני.
הערה: הנפח הכולל של PRP המדולל תלוי בספירת הטסיות של התורם. ספירת הטסיות משתנה מאוד בין התורמים, ודילול PRP דורש הערכה על בסיס אישי. ספירת טסיות נחשבת נורמלית כאשר בתוך 150,000 ו 450,000 טסיות / μL.
הכנת טסיות שטף
- קביעת נפח טסיות ממוצע (MPV) ב PRP באמצעות מנתח התא.
הערה: זהו אינדיקטור לטרום הפעלה טסיות 11 . MPV רגיל עבור restlets טסיות הוא 7.5-11.5 fL 11 . MPV לא צריך להגדיל יותר מ 1.5 fL במהלך ההליך שטיפה טסיות. - הוסף 1/10 נפח של ACD כדי PRP כדי למנוע טסיות מראש הפעלה צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 400 xg ו RT ללא בלם. הסר את הסו Pernatant מחדש להשעות את גלולה בזהירות במאגר HEPES Tyrode, pH 6.5, לנפח המקורי של PRP.
- להפשיר aliquot של prostacyclin ידי הוספת TBS לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל; לשמור על הקרח.
- כדי למנוע הפעלה טסיות, להוסיף prostacyclin בריכוז סופי של 10 ng / mL לטסיות מחדש מושעה צנטריפוגה מיד במשך 15 דקות ב 400 xg ו RT ללא בלימה. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה בזהירות במאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4.
- ספירת מספר טסיות (שלב 3.5) ולקבוע את השינוי MPV (שלב 4.1) (MPV לא צריך לשנות יותר מ -1.5 fL).
- התאם את מספר הטסיות עם המאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4, לריכוז של 150,000 טסיות / μL. השאירו את טסיות להתאושש במשך 30 דקות ב RT לפני הניסויים. השתמש טסיות שטף עבור ניסויים בתוך 4 שעות לאחר בידוד.
5. תזרים לשכת האסיפה
Ss = "jove_content"> הערה: ניסויים אלו עושים שימוש בתא הזרימה שפותח בתוך הבית. מגוון של תזרים המיוצר מסחרית ניתן להשתמש, כל עוד הם יכולים להחזיק זכוכית לכסות, אשר מועדף נשלף לניתוחים נוספים. תא הזרימה המשמש את הניסויים המתוארים עשוי פולי (methacrylate מתיל) כדי להתאים בדיוק לשלב להכניס מיקרוסקופ. הוא מכיל מפרצון מוצא ( איור 1A - C , 1, 2), כמו גם חיבור ואקום ( איור 1 א ו C ; 3). גיליון סיליקון מותאם אישית ( איור 1 א ו D , 4) ממוקם על גבי. שני לחתוך- outs טופס ואקום ערוצים ( איור 1 א ו D ; 5) כדי לצרף את כיסוי זכוכית ( איור 1 א ; 6) בחוזקה לחדר. חתך מרכזי יוצר את ערוץ הזרימה ( איור 1 א D ; 7; 2.0 מ"מ רוחב 0.125 מ"מ גובה). השקע והשקע מחוברים לערוץ הזרימה, והוואקום מחובר לערוץ הוואקום.
- מכסים את החלק העליון של החדר לזרום עם מים מזוקקים במקום גיליון סיליקון אישית עם הצד החלק למטה על המים. הצף את הסדין למקומו על ידי הסרת מים עודפים, תוך שמירה על הסדין במקומו.
הערה: גיליון זה סיליקון מחדש שמיש (סיליקון ידוע המאפיינים אינרטי שלה); בדרך כלל לא נצפו טסיות דם. ניתן לנקות את הסדינים באמצעות חומר ניקוי ולהשתמש בהם מחדש עד שייפגע החומר (קריעה, במיוחד באזור שבין הערוצים). בדרך כלל, גיליון יכול לשמש במשך 20 ימים עם ניסויים מרובים ליום. - דגירה תא לזרום עבור 1 שעה ב 60 ° C להתאדות המים שיורית כדי לדבוק בחוזקה את הסיליקון גיליון לתא הזרימה.
- עם פיפטה פלסטיק פסטר, להוסיף טיפה שלהמאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4, על ערוץ הזרימה. הניחו את מכסה הזכוכית (ראו סעיף) 2 עם הצד המצופה כלפי מטה, אל תעלת הזרימה. חבר את משאבת ואקום לחיבור ואקום ( תרשימים 1A ו- C 3). החל ~ 10 kPa הלחץ.
6. מכתים מראש של טסיות והכנת הנוגדנים
- כתמי טסיות
- דגירה טסיות שטף עם 10 מיקרוגרם / מ"ל DAPI במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחושך. כדי לשטוף DAPI מאוגד וכדי למנוע טסיות ההפעלה, להוסיף prostacyclin בריכוז סופי של 10 ng / מ"ל ו צנטריפוגה מיד 15 דקות ב 400 xg ו RT ללא בלם.
- לשחזר את גלולה טסיות במאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4, לריכוז טסיות של 150,000 טסיות / μL.
- הכנת נוגדנים
- מערבבים ביוטין נוגדן שכותרתו עם סטרקה שכותרתו AlexaTavidin על יחס טוחנת של 1: 1. דגירה במשך מינימום של 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש (שלב 7.6).
הערה: יעילות תיוג של ביוטין יכולה להשתנות בין קבוצות שונות. אם יש בעיות עם ויזואליזציה של מולקולות היעד, ניסויים בקרה צריכה להתבצע כדי לאשר biotinylation מוצלח, כמו גם את המאפיינים היעד מחייב של נוגדן biotinylated ספציפיים.
- מערבבים ביוטין נוגדן שכותרתו עם סטרקה שכותרתו AlexaTavidin על יחס טוחנת של 1: 1. דגירה במשך מינימום של 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש (שלב 7.6).
7. זלוף
- הפעל את מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם את התוכנה מיקרוסקופ. השתמש בהגדרות המיקרוסקופ המפורטות בטבלה 1 .
הערה: ייזום המיקרוסקופ והגדרות ההקלטה עבור הדמיה תא חי הקלטה של טסיות ואת הנוגדנים שכותרתו fluorescently שכותרתו ו / או צבעים על ידי טעינת הניסוי המתאים בתוכנת מיקרוסקופ. בצע ניסויים זרימה ב RT. - חסום את צינורות כניסת על ידי חיבור מזרק 10 מ"ל לצינור ו aspirating 1% HSA bloחיץ cking לתוך צינורות כניסת. דגירה במשך 15 דקות ב RT. שוטפים את צינורות מפרצון על ידי aspirating HEPES Tyrode של חיץ, pH 7.4, לתוך צינורות מפרצון.
- חבר את צינורות הכניסה חסומות צינורות שפופרת לא מטופלים, הן עם קוטר של 1.02 מ"מ ו ~ ~ 20-30 ס"מ אורך לשקע ואת מוצא של החדר. חבר מזרק 10 מ"ל (או נפח נמוך יותר עבור דיוק) צינורות מוצא. הפעל את משאבת המזרק.
הערה: הקוטר של המזרק, בשילוב עם קצב הזרימה שנקבע על המשאבה, לקבוע את קצב הזרימה volumetric. יחד עם פני השטח של ערוץ הזרימה, שיעור גזירה ניתן לחשב על פי הנוסחה 13 לְהַלָן. לפיכך, ניתן לתפעל את שיעור הגזירה על ידי שינוי קצב הזרימה של משאבת מזרק או לשנות את הממדים של ערוץ הזרימה. שיעור גזירה של 800-1,600 s -1 בדרך כלל מודלים של זרימת הדם העורקי, בעוד 25 - 100 מודלים 1 עבור דם ורידיזְרִימָה. עבור התקנה זו, קצב הזרימה של 7.5 μL / דקות תוצאות בשיעור גזירה של 25 s -1 .
שיעור גזירה = 6Q / h 2 s ב -1 s
כאשר: Q = קצב זרימה volumetric (mL / s), גובה = גובה ערוץ (ס"מ) (0.0125 ס"מ, זה עובי של הסיליקון גיליון), w = רוחב ערוץ (ס"מ) (0.2 ס"מ בחדר זה). - מניחים טיפה של שמן טבילה על המטרה 100X (הגברה סך של 1000X) ואת הר החדר על המיקרוסקופ עם משטח הזכוכית למטה.
- מניחים את צינורות כניסת לתוך צינור המכיל HEPES Tyrode של חיץ, pH 7.4. באופן ידני למשוך את הבוכנה של המזרק מחובר צינורות מוצא ולמשוך את הפתרון דרך החדר כדי להסיר את האוויר מן המערכת. מניחים את המזרק לתוך משאבת מזרק ( איור 1 ב ו C ; 8) ולהפעיל את המשאבה לזמן קצר להדק את הבוכנה להבטיח זרימה יציבה.
- הוסף נוגדנים ו / או צבעים על ההשעיה טסיות או PRP, בזהירותלערבב עם פיפטה פלסטיק, ולהעביר את התערובת לצינור 1.5 מ"ל.
הערה: עבור זלוף אופייני 30 דקות בקצב הגזירה 25 s-1 (7.5 μL / min), מינימום של 225 μL של ההשעיה טסיות יש צורך. הנוגדנים המשמשים את התוצאות המייצגות מוצגים בטבלה 2 . - מעבירים את צינורות הכניסה, תוך לחיצה, מן המאגר HEPES Tyrode, pH 7.4, צינור 1.5 מ"ל המכיל או PRP או טסיות שטף את הנוגדנים ו / או צבעים ( איור 1 ב ו C ; 9).
הערה: חשוב כי בעת העברת צינורות, צינורות הוא סחוט (לחיצה החוצה את האוויר) כדי למנוע את כניסת האוויר לצינור. ניתן לטפל טסיות חסיד עם מגוון של ריאגנטים בשלב הבא על ידי הזזת צינורות מפרצון צינור אחר בצורה דומה. בטבלה 3 ניתן למצוא רשימה של ריאגנטים מועילים. - בחר את "Live visualizatioN "בתוכנה, למקד את המיקרוסקופ על משטח הזכוכית המכסה המצופה, ולהפעיל את המשאבה בקצב גזירה של 1,600 s-1 (484 μL / min) עד שהטסיות יגיעו לתא הזרימה, להקטין את שיעור הגזירה בחזרה 25 s-1 על ידי שינוי ההגדרות של משאבת מזרק בקצב זרימה של 7.5 μL / min.
- צג השטח של הצד המצופה של זכוכית לכסות, לחכות עד הטסיות הראשון מתחיל לדבוק, למקד את המיקרוסקופ על הטסיות האלה, ולהתחיל להקליט על ידי ייזום הניסוי בתוכנה. ראה טבלה 1 עבור הגדרות ההקלטה שבשימוש כאן.
- בצע את ההקלטה חיה חזותית. לאחר 30 דקות, לעצור את המשאבה מזרק.
הערה: ודא כי טסיות להישאר להתמקד במהלך הניסוי. בדרך כלל, 20-30 טסיות לצרף בשדה הראייה בהגדלה של 1,000X; זה בערך 2,000-3,000 טסיות בכל ערוץ הזרימה. - קיבעון באמצעותתא הזרימה (אופציונלי).
- כאשר הזרימה נעצרה לאחר משאבת מזרק הוא עצר, להעביר את צינורות כניסת (אוויר חינם) לפתרון מקבע. הפעל מחדש את המשאבה ואת זרימת חיץ קיבעון דרך הערוץ במשך מינימום של 10 דקות באותו קצב הזרימה כאמור בשלב 7.8.
- הסר את החדר מן המיקרוסקופ, לנקות את שמן טבילה מן הזכוכית, לנתק את ואקום, בזהירות להסיר את כיסוי זכוכית מן החדר עם מחט 18 G.
הערה: מנע מכוס הכיסוי לשבור ולפגוע בסיליקון. - מניחים את השקופית לכסות (עם התאים מופנים כלפי מעלה) בצלחת 4 באר על גבי רקמה, מראש הרטובות עם מים מזוקקים.
הערה: פעולה זו מונעת את כיסוי הזכוכית מלדבוק במשטח הבאר ומונעת ייבוש. - פיפטה 750 μL של פתרון מקבע על גבי זכוכית לכסות דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. במקרה דגימות לא ניתן לנתח ישירות,לאחסן אותם PFA 0.5% (מדולל על ידי חיץ HEPES Tyrode, pH 7.4) ב 4 ° C כדי להבטיח קיבעון יציב. המשך לסעיף 8 כדי לעבד את כיסוי הזכוכית לצורך הדמיה.
- לאחר השימוש, לשטוף את החדר, צינורות, גיליון עם מים מזוקקים דגירה לילה פתרון דטרגנט. לפני השימוש חוזר של החדר ומרכיבים אחרים, לשטוף עם מים מזוקקים.
- שמור את הנתונים מיקרוסקופ נתוני גלם המכילים את כל המטא נתונים. בעת הצורך, ייצא את הסרטים ל- .MOV, h.264 דחוס, או .AVI לא דחוס. שמור מסגרות נפרדות כמו קבצי JPEG או TIF.
8. הכנה לדוגמא עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטי confocal
- מעבירים את המשקפיים לכסות חדש 4 גם צלחות ולשטוף 5 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ HEPES Tyrode, pH 7.4. הוסף 3 מ"ל / טוב של חסימת חיץ דגירה במשך שעה 1 ב RT.
- הסר את המאגר החוסם; מוסיפים 3 מ"ל / טוב של גליצין 0.15% (M / V) במאגר HEPES Tyrode, pH 7.4; ו דגירה במשך 15 דקות ב RT.
- הסר פתרון גליצין לשטוף 5 פעמים ב 3 מ"ל / טוב של חסימת חיץ. לחלופין, להוסיף נוגדנים fluorophore מצומדות בדילול חסימת חיץ עבור מכתים נוספים. דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
- לשטוף 5 פעמים עם חיץ חסימת ו 2 פעמים עם מים מזוקקים. יבש את הכוס על ידי הסרת נוזל עודף עם רקמה (מן הקצוות פנימה), מבלי לגעת בתאים.
- פיפטה 60 μL של פתרון אלכוהול פוליוויניל על שקופית מיקרוסקופ. מניחים את מכסה זכוכית, עם התאים למטה, על גבי ירידה ולתת אלכוהול polyvinyl להתפשט בין שני משטחים. דגירה לילה ב RT בחושך.
- לנתח את התאים על ידי מיקרוסקופיה confocal 14 .
- שמור את קובצי הנתונים הגולמיים של נתוני הערימה שנרשמו המכילים את כל המטא נתונים. בעת הצורך, לעבד את הנתונים הגולמיים קבצים לתוך MOV, H.264 דחוסים, או. קבצים לא דחוסים. שמור ערימות נפרדות כמו קבצי JPEG או TIF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תמונות של החדר לזרום ההתקנה ניסיוני; את המיקום ואת הממדים של הסיליקון גיליון; ואת חיבורי צינורות. איור 2 מספק פרטים על הממדים של החדר הזרימה. איור 3 ו סרט 1 להראות סדרה של זמן של תמונות של הידבקות טסיות והתפשטות על VWF משותק. CD63 הוא חלבון transmembrane כי הוא מוכנס לתוך קרום של גרגרי צפופה תאיים של טסיות מנוחה 15 . גייסו תלוי הזמן על גבי משטח הטסיות מוצג בירוק. באופן דומה, P-selectin (Psel) הוא חלבון transmembrane מוכנס בקרום של גרגרי α- תאיים של טסיות מנוחה. גייסו תלוי הזמן על גבי משטח הטסיות מוצג בכתום. איור 3 ב מציג תמונה נציג בזווית של 45 °, רכשה מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לאחר ניסוי זרימה. סרט 2 מציג סדרת הטיה של אותו ניסוי. שים לב כי CD63 ממוקם בעיקר גרנולומר המרכזי, בעוד P-selectin מופץ על פני כל גוף התא ומופיע מרוכז בקצוות. איור 4 א ו סרט 3 להראות את הזמן תלוי גיוס של CD63 על משטח טסיות (ירוק). בניסויים אלה, טסיות (אשר אין להם DNA גרעיני) היו מראש מודגרות עם DAPI (כחול), אשר כתמים polyphosphate בגרגרים צפופים 16 . למרבה הפלא, למרות סימנים ברורים של שחרור גרגיר צפוף (בודד תא ניתוחים מוצגים בתרשים 4B ו סרט 4 ), polyphosphate נשמר בתוך או מחוץ טסיות אלה. איור 5 וסרט 5 מראים גיוס תלוי זמן (או גיוס) של VWF, רב טרומבוגניחלבון imeric 17 מאוחסן גרגרי α, על משטח טסיות (ירוק). בדומה polyphosphate, VWF נשאר קשור עם פני השטח של טסיות מופעלות.
איור 1: חדר זרימה והגדרת הניסוי. ( א ) תמונה של עיצוב קאמרית זרימה עם מפרצון לשקע (1 ו -2), חיבור ואקום (3) שבו גיליון סיליקון (4) ממוקם. שני cutouts החיצוני (5) בגיליון הסיליקון טופס ערוצי ואקום כדי לצרף את כיסוי זכוכית (6). חיתוך מרכזי (7) יוצר את ערוץ הזרימה ( ב ) תמונה של ההתקנה הניסויית. פתח ושקע (1 ו -2), משאבת מזרק (8), ובעל מדגם (9). ( ג ) סקירה סקטית של הגדרת הניסוי; המספרים זהים לאלה של A ו- B ( D ) סקירה סקמטית עם המאפיין של גיליון סיליקון לחתוך אישית. ( ה ) סקירה כללית סכימטי של פול (מתיל methacrylate) זרימה קאמרית . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תכנית אב מפורטת של תזרים לשכת. תא הזרימה מורכב של בלוק (מתיל methacrylate) בלוק (1) , אחד חד polyoxymethylene להוסיף את כניסת ואקום (2) , ושני זוויות polyoxymethylene זווית עבור פתח פתח מוצא (3) . הזוויות polyoxymethylene זווית להכיל צינורות נימי מתכת, עם קוטר של 1.07 מ"מ. תוסף ישר מכיל צינור נימי עם קוטר של 1.3 מ"מ. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: התפשטות טסיות ו degranulation על פון Wilbrand פקטור משותק. ( A ) זמן תלוי גיוס של CD63 ו- P-selectin על פני השטח של התפשטות טסיות degranulating. סרגל הסולם הלבן (השמאלי העליון) מציין 10 מיקרומטר. ( ב ) נציג confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי תמונה בזווית של 45 מעלות. סרגל הסולם הלבן (משמאל למטה) מציין 2 מיקרומטר. ירוק, CD63; כתום, P-selectin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
איור 4: התפשטות טסיות, degranulation, וניידות של גרגרים צפופים על פיברינוגן משותקת. ( A ) זמן תלוי גיוס של CD63 ו polyphosphate על משטח הטסיות. סרגל הסולם הלבן (השמאלי העליון) מציין 10 מיקרומטר. ( ב ) סדרת זמן של טסיות אחת (t = 0 מייצג את ההדבקה הראשונה על פני השטח). סרגל קנה המידה הלבן (מימין למטה) מציין 2 מיקרומטר. ירוק, CD63; כחול, DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: אגודת השטח של פון Willebrand פקטור על משטח טסיות של פיברינוגן משותקת. זמן תלוי גיוס (או גיוס) של VWF על משטח טסיות. Tהוא בר בקנה מידה לבן (השמאלי העליון) מציין 5 מיקרומטר. ירוק, VWF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| הגדרה | ערך |
| זמן חשיפה FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 עוצמת FITC (Alexa488) | 50% |
| זמן חשיפה DIC | 30 ms |
| מנורת הלוגן מתח | 4.5 וולט |
| זמן חשיפה TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 עוצמת FITC (Alexa546) | 50% |
| זמן חשיפה DAPI | 500 מילישניות |
| LED 365 אינטנסיביות | 50% |
| מסנן FITC | מסנן 10 |
| מסנן TRITC | מסננים 20 |
| מסנן DAPI | מסננים 01 |
| מַטָרָה | אלפא Plan-Fluar 100x / 1.45 שמן |
| קצב פריימים, זמן הקלטה | 1 מסגרת / 10 שניות, 30 דקות |
| סרטים דחיסת קבצים | MOV (h.264), AVI (לא דחוס) |
| קובץ דחיסת תמונות | JPEG, TIF |
טבלה 1: הגדרות מיקרוסקופ. הגדרות המשמשות עבור הניסויים הייצוגיים.
| יַעַד | נוגדן / דיי | ריכוז |
| CD63 | <Td> אנטי CD63-biotin *)325 ng / mL | |
| P-selectin | Anti-CD62P-biotin **) | 90 ng / mL |
| דנ"א | DAPI | 10 מיקרוגרם / מ"ל |
| VWF | אנטי אנושי VWF- FITC | 5 מיקרוגרם / מ"ל |
| *) נוגדנים נוגדי CD63-biotin מעורבב עם streptavidin-Alexa488 ב יחס טוחנת של 1: 1 לפני השימוש | ||
| **) נוגדנים נגד CD62P-biotin מעורבב עם streptavidin-Alexa546 ביחס טוחנת של 1: 1 לפני השימוש | ||
טבלה 2: נוגדנים וצבעים. מומלץ נוגדן ריכוזי צבע עבור הניסויים נציג מוצג.
| קטגוריה מגיב | דוגמה compoאוספים |
| אגוניסטים טסיות | טרומבין, ADP, PAR-1 או -4 מפעילים פפטידים, U46619, Thromboxane A2, ADP |
| מעכבי אנזים | Hirudin, PPACK, heparinoids (עקיף), מעכב טריפסין תירס, מעכב טריפסין שעועית סויה |
| אנטגוניסטים של קולטן | אנטי Glyprotein 1bα, אנטי גליקופרוטין השישי; Clopidogrel, (מחזורית) RGD המכילים פפטידים |
| מעכבי הפעלה | טיפול באספירין, קיבוע |
טבלה 3: ריאגנטים מועילים פוטנציאליים.
סרטים משלימים: סרט 1: זמן סדרה של תמונות של טסיות (ראה איור 1 ), סרט 2: להטות סדרה של איור 3B , סרט 3: זמן תלוי גיוס של CD63 על טסיות(ראה איור 4 ), סרט 4: סדרת זמן של ניתוח תא בודד (ראה איור 4 ב ), סרט 5: זמן תלוי גיוס של VWF (ראה איור 5 ).
אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט 1.
לחץ כאן להורדת הסרט 2.
לחץ כאן כדי להוריד סרט 3.
לחץ כאן להורדת הסרט 4.
לחץ כאן להורדת הסרט 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ברחבי העולם, פקקת היא גורם מוביל למוות ולתחלואה, וטסיות משחקות תפקיד מרכזי בהתפתחותה. עבודה זו מתארת שיטה עבור הדמיה תא חי של degranulation טסיות מתחת לזרימה. בדרך כלל מניחים כי כאשר טסיות הדם הופעלות, כל התכנים הגרעיניים משוחררים ישירות לפתרון. התוצאות הנלוות מלמדות כי אין זה בהכרח כך. במהלך הדבקה ו degranulation, טסיות לשמור על כמות משמעותית של polyphosphate ( איור 4 ). בנוסף, VWF חלבון multimeric קשורה משטח טסיות לאחר degranulation ( איור 5 ). זה מצביע על כך המנגנונים המולקולריים השולטים degranulation גרגר טסיות הם עדין יותר מאשר להניח בדרך כלל.
כדי לאפשר הדמיה של תאים חיים של degranulation טסיות מתחת לזרימה, תנאי הניסוי נבחרו כדי לשמור על הצבירה טסיות למינימום. פלאטלטטס של 150,000 טסיות / μL שימשו. זה בקצה התחתון של טווח נורמלי (150,000-450,000 טסיות / μL). יתר על כן, הדבקה טסיות התפשטות נחקרו על VWF Vob או פיברוזיגן, אשר הובילה הפעלת טסיות קלה (בניגוד, למשל, קולגן). במחקרים עם טסיות שטף, שיעורי גזירה מוגברת להעביר תאים אלה למרכז הזרימה. זה מפריע הידבקות ולאחר מכן התפשטות ומסבך את החקירה של degranulation.
ב hemostasis פיזיולוגי, שולי טסיות חשוב. תהליך זה מונע על ידי אריתרוציטים, ומסביר מדוע אנמיה נמוכה מלווה לפעמים diathesis דימום. מגבלה של הטכניקה המוצגת היא כי ויזואליזציה של degletulation טסיות (עם החומרים המוצגים ריאגנטים) מופרע על ידי כדוריות דם אדומות. הפונקציה טסיות מושפע הלחץ גזירה, שהוא פונקציה של צמיגות של נוזל (μ), כמו גםשל שיעור הגזירה. לכן, מומלץ ללמוד את טסיות הדם במודלים זרימה בפתרונות עם צמיגות דומות ( כלומר, טסיות שטופות דם, דם משוחזר, PRP או דם שלם).
ישנם מספר גורמים מעשיים לקחת בחשבון בעת ביצוע ניסויים אלה. ראשית, אותות הקרינה מושפעים מאוד על ידי אזור המיקוד. אם המיקרוסקופ אינו ממוקד, האות מטושטש בקלות או אפילו אבוד. לפני הגעתו של טסיות לתוך ערוץ הזרימה, עדיף להתמקד בערוץ עצמו (להתחיל בקצה של הסיליקון גיליון / ערוץ ערוץ זרימה). כאשר טסיות להתחיל לדבוק, להתמקד באירוע הדבקה זה. נקודה שנייה של דאגה היא הלבנה של fluorophores מסוימים ( למשל, FITC). עירור חוזר יוביל לאובדן אות, מטריד את החקירה. מכשולים אלה ניתן להתגבר באמצעות fluorophores יציב יותר, הפחתת עוצמת האור מרגש LED, לקצר את expOsure פעמים, ו / או להקטין את קצב המסגרת.
המודל המתואר כאן הוא מאוד שימושי לביצוע מחקר מפורט של תגובות טסיות למגוון רחב של חלבונים משותקים בקצב זרימה שונים. פוטנציאל, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את האינטראקציה שלהם עם תאים אנדותל מופעל 18 . ההתקדמות הטכנית המאפשרת עיצובים גמישים של תאי זרימה מיוחדת כרגע פותחים אפיקים עבור מחקרים biocompatibility 19 . הדמיה חיה של תגובתיות טסיות מתחת לזרימה יגלה תובנות חשובות על המורכבות של התגובה הדבקה טסיות. בסופו של דבר, חוויות אלה צריכות להוביל את מודלים זרימת הניסוי פיתוח המאפשרים חקירה משולבת של תפקוד טסיות והשפעה על מערכת קרישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
CM מודה על תמיכה כספית של הארגון הבינלאומי לחולים לליקויים של C1-Inhibitor (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht וקרן לנדסטיינר לחקר עירוי דם (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
