Summary
Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi.
Abstract
Le piastrine di sangue sono giocatori essenziali in emostasi, la formazione di trombi per sigillare violazioni vascolari. Sono anche coinvolti nella trombosi, nella formazione di trombi che occludono la vascolarizzazione e danno gli organi, con conseguenze pericolose per la vita. Questo motiva la ricerca scientifica sulla funzionalità piastrinica e lo sviluppo di metodi per tenere traccia dei processi biologici in fase di flusso.
Sono disponibili diversi modelli di flusso per lo studio dell'adesione e dell'aggregazione delle piastrine, due fenomeni chiave della biologia piastrinica. Questo lavoro descrive un metodo per studiare la degranulazione piastrinica in tempo reale in fase di attivazione. Il metodo utilizza una camera di flusso accoppiata ad una messa a punto della pompa a siringa posta sotto un microscopio a fluorescenza a LED basato su ampio campo, invertito. L'impostazione qui descritta consente l'eccitazione simultanea di fluorofori multipli che vengono fornite da anticorpi a fluorescenza o fluorescentiColoranti ent. Dopo gli esperimenti di immagini a cellule vive, i vetri di copertura possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando microscopia statica ( cioè microscopia confocale o microscopia a scansione elettronica).
Introduction
Le piastrine sono cellule anucleate che circolano nel flusso sanguigno. La loro funzione principale è quella di sigillare le ferite vascolari nei siti di lesioni e di prevenire la perdita di sangue. In questi siti di lesioni, le fibre di collagene subendoteliale diventano esposte e successivamente sono coperte dalla proteina multimerica, il fattore von Willebrand (VWF). VWF interagisce con le piastrine in circolazione in un meccanismo che dipende dal complesso glicoprotein Ibα-IX-V sulla superficie cellulare 1 , rallentando la velocità delle piastrine. Ciò è particolarmente importante a velocità elevate. Le piastrine successivamente subiscono cambiamenti morfologici mentre ricevono impulsi di attivazione dal collagene. Ciò porta ad una diffusione irreversibile e alla fine alla aggregazione piastrinica. Entrambi i processi dipendono dalla secrezione del contenuto di granuli per facilitare la crosstalk piastrinica. Tra gli altri, le piastrine α-granuli contengono fibrinogeno e VWF per assistere l'adesione piastrinica e per ponteLe piastrine insieme in un modo integrin-dipendente. I granuli piastriniti contengono composti inorganici 2 , inclusi il calcio e l'adenosina difosfato (ADP), che contribuiscono a rafforzare l'attivazione delle piastrine. Inoltre, le piastrine contengono mediatori di infiammazione (allergica) 3 , proteine di controllo del complemento 4 e fattori di angiogenesi 5 , 6 , sollevando le questioni di se e come tali contenuti vengono diffusi differenzialmente in condizioni diverse.
Dagli anni Ottanta, lo studio della funzionalità piastrinica nei modelli di flusso è stato prezioso per la ricerca di meccanismi trombotici 7 . Da allora, sono stati fatti molti progressi tecnici e sono stati sviluppati modelli di flusso che includono la formazione di fibrina per analizzare il potenziale emostatico dei concentrati terapeutici piastrinici ex vivo 8 oIndagare l'influenza dei disturbi in velocità di taglio sulla morfologia del trombo 9 . Le differenze nei meccanismi molecolari e cellulari che conducono adesione stabile e formazione di trombi fisiologici (emostasi) rispetto alla formazione di trombi patologici (trombosi) possono essere molto sottili e motivare lo sviluppo di modelli di flusso che consentono la visualizzazione in tempo reale di queste subcellulari processi.
Un esempio di un processo per cui una tale configurazione sarebbe preziosa è la (ri) distribuzione del polifosfato intracellulare e l'assunzione di fattori di coagulazione per scoprire l'impatto dipendente dal tempo che questo ha sull'ultrastruttura della fibrina 10 . Gli studi sono spesso limitati alle analisi dei punti finali. Lo scopo principale del metodo descritto è quello di consentire l'esame visivo in tempo reale dei processi subcellulari dinamici che si verificano durante l'attivazione piastrinica sotto flusso.
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Protocol
Il Comitato Etico Medico Comunale del Centro Medico Universitario di Utrecht ha approvato il disegno del sangue per scopi di ricerca ex vivo , inclusi quelli di questo studio.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare un buffer di Tyrode di 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico sciogliendo 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 e 5,55 mM D- Glucosio in acqua distillata.
- Fare due varianti del buffer: impostare i livelli di pH a 6,5 e rispettivamente a 7,4. Fai buca fresca per ogni giorno di esperimenti. Supplemento con 10 ng / ml prostacyclin dove indicato.
- Preparare la soluzione salina tricolata TRIS (TBS) dissolvendo 50 mM Tris e 150 mM NaCl in acqua distillata e regolare il pH a 9.0.
- Preparare il destrosio acido citrato (ACD) sciogliendo 85 mM tri-sodio citrato, 71 mM acido citrico e 111 mM D-glucosio in disAcqua stagionata.
- Preparare una soluzione fissativa aggiungendo la paraformaldeide (PFA) del 2% (v / v) al tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4. Scaldare per dissolvere (50 - 70 ° C) e impostare il pH a 7,4. Aliquota e conservare a -20 ° C. Scongelare a 37 ° C prima dell'uso.
- Preparare il tampone di bloccaggio sciogliendo l'albumina umana (HSA) dell'1% (m / v) nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4
- Creare una soluzione di alcool polivinilico aggiungendo 4,8 g di alcool polivinilico a 12 g di glicerolo e mescolare bene. Aggiungere 12 ml di acqua distillata e lasciarlo su rotatore a temperatura ambiente durante la notte.
- Aggiungere 24 ml di 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Riscaldare a 50 ° C mentre si mescola per 30 min. Aggiungere 1,25 g di 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano (DABCO) e mescolare bene. Centrifugare a 1.500 xg per 5 min. Aliquota il surnatante (1 mL è sufficiente per 15-20 diapositive) e conservare a -20 ° C. Usate le aliquote una volta.
2. Preparazione del vetro di copertura
- Sgrassare la coperturaBicchieri (25 x 50 mm 2 ) incubando durante la notte in acido cromosumpurico non diluito. Sciacquare gli occhiali con acqua distillata e asciugarli per una notte a 60 ° C in un forno.
- Aderire una striscia di una pellicola paraffina (10 x 15 cm 2 ) in cima a una panca da laboratorio con una goccia d'acqua e rimuovere l'aria lisciando la pellicola paraffina. Pipettare 80 μL gocce di 10 μg / mL VWF o 100 μg / mL fibrinogeno sulla pellicola paraffina. Posizionare gli occhiali sulle gocce; La soluzione proteica si diffonde tra le due superfici per coprire l'intera parte posteriore del vetro. Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere la pellicola paraffina e bloccare i vetri di copertura posizionandoli, con il lato rivestito in su in una piastra a 4 pozzetti con blocco di blocco. Incubare per 1 ora a 37 ° C o per una notte a 4 ° C. Come controllo, bloccare un vetro di copertura non rivestito con VWF o fibrinogeno.
3. Preparazione del plasma ricco di piastrine (PRP)
NOTA: Dopo la centrifugazione si possono osservare tre strati (dall'alto verso il basso): PRP, globuli bianchi e globuli rossi. Assicurarsi di non includere le celle bianche e rosse. Tipicamente, 3 ml di PRP possono essere raccolti dopo la centrifugazione di un tubo di sangue da 9 ml.
NOTA: In genere, 2 mL possono essere raccolti dopo questa seconda fase di centrifugazione.
NOTA: Il volume totale di PRP diluito dipende dal numero di piastrine del donatore. I conteggi delle piastrine variano notevolmente tra i donatori e la diluizione di PRP richiede una valutazione su base individuale. Le conta piastrine sono considerate normali quando si trovano entro 150.000 e 450.000 piastrine / μL.
4. Preparazione di piastrine lavate
- Determinare il volume medio delle piastrine (MPV) nel PRP utilizzando un analizzatore di celle.
NOTA: Questo è un indicatore della pre-attivazione delle piastrine 11 . Un MPV normale per le piastrine di riposo è di 7,5-11,5 fL 11 . Il MPV non dovrebbe aumentare di più di 1,5 fL durante la procedura di lavaggio delle piastrine. - Aggiungere un volume 1/10 di ACD a PRP per prevenire la pre-attivazione delle piastrine e centrifugare per 15 minuti a 400 xg e RT senza freno. Rimuovere la suPernatante e ri-sospendere attentamente il pellet nel tampone di HEPES Tyrode, pH 6,5, al volume originale di PRP.
- Sciogliere una aliquota di prostacyclin aggiungendo TBS ad una concentrazione di 10 μg / mL; Tenerlo su ghiaccio.
- Per prevenire l'attivazione delle piastrine, aggiungere prostaciclina a una concentrazione finale di 10 ng / mL alle piastrine ri-sospese e centrifugare immediatamente per 15 minuti a 400 xg e RT senza freni. Rimuovere il surnatante e ri-sospendere attentamente il pellet nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4.
- Conta il numero delle piastrine (passo 3.5) e determinare la variazione nella MPV (passo 4.1) (il MPV non deve cambiare più di 1,5 fL).
- Regolare il numero di piastrine con il tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, ad una concentrazione di 150.000 piastrine / μL. Lasciare le piastrine per recuperare per 30 minuti a RT prima degli esperimenti. Usare le piastrine lavate per esperimenti entro 4 ore dall'isolamento.
5. Assemblea della camera di flusso
12 . Possono essere utilizzate varie camere di flusso commercialmente prodotte, purché possano contenere un vetro di copertura, preferibilmente rimovibile per ulteriori analisi. La camera di flusso utilizzata per le esperienze descritte è costituita da poli (metilacrilato) per adattarsi in modo preciso allo stadio di inserimento del microscopio. Contiene un ingresso e uscita ( Figura 1A - C ; 1, 2), nonché una connessione a vuoto ( Figura 1A e C ; 3). Una lastra di silicone personalizzata ( Figura 1A e D ; 4) è posta sulla parte superiore. Due estremità formano i canali di vuoto ( Figura 1A e D ; 5) per fissare strettamente la camera di copertura ( Figura 1A ; 6) alla camera. Un taglio centrale forma il canale di flusso ( Figura 1A D ; 7; 2,0 mm di larghezza e 0,125 mm di altezza). L'ingresso e la presa sono collegati al canale di flusso e il vuoto è collegato al canale di vuoto.
- Coprire la parte superiore della camera di flusso con acqua distillata e posizionare il foglio in silicone personalizzato con il lato liscio in basso sull'acqua. Spostare il foglio in posizione rimuovendo l'acqua in eccesso pur mantenendo il foglio in posizione.
NOTA: questo foglio di silicone è riutilizzabile (il silicone è noto per le sue proprietà inerte); In genere, le piastrine non sono state osservate per aderire a essa. Le lenzuola possono essere pulite con detersivo e riutilizzate fino a quando il materiale non viene danneggiato ( cioè strappo, soprattutto nella zona tra i canali). In genere, un foglio può essere utilizzato per 20 giorni con più esperimenti al giorno. - Incubare la camera di flusso per 1 h a 60 ° C per evaporare l'acqua residua per fissare saldamente il foglio di silicone alla camera di flusso.
- Con una pipetta di Pasteur plastica, aggiungere una goccia diTampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, sul canale di flusso. Posizionare il vetro di copertura (vedi sezione 2) con il lato rivestito rivolto verso il basso, sul canale di flusso. Collegare la pompa a vuoto alla connessione a vuoto ( figure 1A e C ; 3). Applicare pressione ~ 10 kPa.
6. Pre-colorazione delle piastrine e preparazione degli anticorpi
- Colorazione delle piastrine
- Incubare le piastrine lavate con 10 μg / mL DAPI per 30 minuti a 37 ° C al buio. Per lavare via DAPI non legato e per prevenire l'attivazione delle piastrine, aggiungere prostacyclin ad una concentrazione finale di 10 ng / mL e immediatamente centrifugare per 15 minuti a 400 xg e RT senza freno.
- Ricostituire il pellet piastrinico nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, ad una concentrazione di piastrine di 150.000 piastrine / μL.
- Preparazione degli anticorpi
- Mescolare l'anticorpo biotino-etichettato con strep etichettato con AlexaTavidin a un rapporto molare di 1: 1. Incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso (passo 7.6).
NOTA: L'efficienza di etichettatura della biotina può variare tra i diversi lotti. In caso di problemi con la visualizzazione delle molecole bersaglio occorre eseguire esperimenti di controllo per confermare la biotinilazione riuscita, nonché le proprietà vincolanti dell'obiettivo specifico dell'anticorpo biotinilato.
- Mescolare l'anticorpo biotino-etichettato con strep etichettato con AlexaTavidin a un rapporto molare di 1: 1. Incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso (passo 7.6).
7. Perfusione
- Avviare il microscopio a fluorescenza, oltre al microscopio. Utilizzare le impostazioni del microscopio elencate nella tabella 1 .
NOTA: Inizia la microscopia e le impostazioni di registrazione per la visualizzazione e la registrazione delle cellule vive delle piastrine e degli anticorpi e / o coloranti contrassegnati fluorescenti caricando un esperimento appropriato nel software del microscopio. Eseguire esperimenti di flusso a RT. - Bloccare il tubo di entrata collegando una siringa da 10 ml alla tubazione e aspirando 1% HSA bloTamponare il tampone nel tubo di entrata. Incubare per 15 minuti a RT. Sciacquare il tubo di ingresso aspirando il tampone di HEPES Tyrode, pH 7.4, nel tubo di ingresso.
- Collegare il tubo di ingresso bloccato e il tubo di scarico non trattato, entrambi con un diametro di 1,02 mm e una lunghezza di circa 20-30 cm, all'entrata e all'uscita della camera. Collegare una siringa da 10 ml (o un volume più basso per maggiore precisione) al tubo di uscita. Accendere la pompa della siringa.
NOTA: Il diametro della siringa, in combinazione con la portata impostata sulla pompa, determina la portata volumetrica. Insieme alla superficie del canale di flusso, la velocità di taglio può essere calcolata in base alla formula 13 sotto. Di conseguenza, è possibile manipolare la velocità di taglio cambiando la portata della pompa della siringa o alterando le dimensioni del canale di flusso. Una velocità di taglio di 800-1.600 s -1 tipicamente modelli per il flusso sanguigno arterioso, mentre 25-100 s-1 modelli per il sangue venosoflusso. Per questa impostazione, una portata di 7,5 μL / min determina una velocità di taglio di 25 s -1 .
Velocità di taglio = 6Q / h 2 w in s -1
Dove: Q = portata volumetrica (mL / s), h = canale di altezza (cm) (0.0125 cm; spessore del foglio di silicone); w = canale di larghezza (cm) (0,2 cm in questa camera). - Posizionare una goccia di olio di immersione su un obiettivo 100X (amplificazione totale di 1.000x) e montare la camera sul microscopio con la superficie in vetro verso il basso.
- Posizionare il tubo di ingresso in un tubo contenente il tampone HEPES Tyrode, pH 7.4. Tirare manualmente lo stantuffo della siringa collegato al tubo di uscita e tirare la soluzione attraverso la camera per rimuovere l'aria dal sistema. Posizionare la siringa nella pompa della siringa ( Figura 1B e C ; 8) ed eseguire brevemente la pompa per stringere lo stantuffo e assicurare un flusso stabile.
- Aggiungere gli anticorpi e / oi coloranti alla sospensione piastrinica o alla PRP, con attenzioneMescolare con una pipetta di plastica e trasferire la miscela in un tubo da 1,5 ml.
NOTA: Per una perfusione tipica di 30 min alla velocità di taglio 25 s-1 (7,5 μL / min), è necessario un minimo di 225 μL di sospensione piastrinica. Gli anticorpi utilizzati per i risultati rappresentativi sono mostrati nella Tabella 2 . - Spostare il tubo di entrata, pur spremendolo, dal tampone di TRODE di Hepes, pH 7,4, in un tubo da 1,5 mL contenente PRP o le piastrine lavate e gli anticorpi e / o coloranti ( Figura 1B e C ; 9).
NOTA: È importante che durante il trasferimento del tubo la tubazione sia compressa (premendo l'aria) per impedire l'ingresso dell'aria nel tubo. È possibile trattare le piastrine aderenti con una varietà di reagenti in un passaggio successivo spostando il tubo di entrata in un altro tubo in modo simile. Un elenco di reagenti potenzialmente utili è fornito nella tabella 3 . - Selezionare la "visualizzazione in diretta"N "nel software, mettere a fuoco il microscopio sulla superficie del vetro rivestito rivestito e avviare la pompa a una velocità di taglio di 1.600 s-1 (484 μL / min) fino a quando le piastrine raggiungono la camera di flusso.In questo momento, Ridurre la velocità di taglio a 25 s-1 modificando le impostazioni della pompa della siringa ad una portata di 7,5 μL / min.
- Monitorare la superficie del lato rivestito del vetro di copertura, attendere che la prima piastrina inizia ad aderire, mettere a fuoco il microscopio su questa piastrina e avviare la registrazione avviando l'esperimento nel software. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni di registrazione utilizzate qui.
- Seguire visivamente la registrazione dal vivo. Dopo 30 minuti, arrestare la pompa della siringa.
NOTA: Assicurarsi che le piastrine rimangano a fuoco durante il corso dell'esperimento. In genere, 20-30 piastrine si collegano nel campo visivo ad un ingrandimento di 1.000X; Si tratta di circa 2.000-3.000 piastrine in tutto il canale di flusso. - Fissazione usandoLa camera di flusso (opzionale).
- Quando il flusso si è arrestato dopo che la pompa della siringa è ferma, trasferire il tubo di entrata (senza aria) alla soluzione fissativa. Riavviare la pompa e passare il buffer di fissaggio attraverso il canale per un minimo di 10 minuti alla stessa portata di cui al punto 7.8.
- Rimuovere la camera dal microscopio, pulire l'olio da immersione dal vetro, scollegare il vuoto e rimuovere con cura l'involucro dalla camera con un ago da 18 G.
NOTA: impedire che il vetro di copertura rompe e che danneggia il foglio di silicio. - Posizionare lo scivolo del coperchio (con le celle dirette verso l'alto) in una piastra a 4 pozzetti in cima a un tessuto pre-imbevuto di acqua distillata.
NOTA: questo impedisce che il vetro di copertura si adesca alla superficie del pozzetto e impedisca l'essiccazione. - Pipettare 750 μL di soluzione fissativa sulla parte superiore del vetro di copertura e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel caso in cui i campioni non possano essere analizzati direttamente,Conservarli in 0,5% PFA (diluito con il tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C per garantire una fissazione stabile. Procedere alla sezione 8 per elaborare il vetro di copertura per la fotografia.
- Dopo l'uso, sciacquare la camera, il tubo e il foglio con acqua distillata e incubare per una notte in una soluzione detergente. Prima del riutilizzo della camera e di altri componenti, risciacquare con acqua distillata.
- Salvare i file di dati raw del microscopio contenenti tutti i metadati. Se necessario, esportare i filmati su .MOV, h.264 compressi o. AVI non compressi. Salvare i fotogrammi separati come file JPEG o TIF.
8. Preparazione del campione per la microscopia a fluorescenza confocale
- Trasferire i vetri di copertura a nuovi piatti a 4 pozzetti e sciacquare 5 volte con 3 ml di tampone HEPES Tyrode, pH 7,4. Aggiungere 3 mL / pozzetto di tampone di blocco e incubare per 1 ora a RT.
- Rimuovere il buffer di blocco; Aggiungere 3 ml / pozzetto di glicina 0,15% (M / V) nel tampone di HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubare per 15 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione di glicina e lavare 5 volte in 3 mL / pozzetto di tampone di blocco. Facoltativamente, aggiungere anticorpi coniugati con fluoroforo diluiti nel buffer di blocco per ulteriori colorazioni. Incubare per 1 h a RT al buio.
- Lavare 5 volte con tampone di blocco e 2 volte con acqua distillata. Asciugare il vetro rimuovendo il liquido in eccesso con un tessuto (dai bordi verso l'interno), senza toccare le celle.
- Pipettare 60 μL di soluzione di alcool polivinilico su uno scivolo a microscopio. Posizionare il vetro di copertura, con le cellule in basso, in cima alla goccia e lasciare che l'alcool polivinilico si diffonda tra le due superfici. Incubare durante la notte in RT all'oscurità.
- Analizzare le cellule mediante la microscopia confocale 14 .
- Salvare i file di dati raw dei dati registrati dello stack contenenti tutti i metadati. Quando necessario, elaborare i file di dati grezzi nei file compressi MOV, h.264 compressi o .AVI. Salvare gli stack separati come file JPEG o TIF.
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Representative Results
La figura 1 mostra le immagini della camera di flusso e della configurazione sperimentale; La posizione e le dimensioni del foglio di silicio; E connessioni tubi. La Figura 2 fornisce i dettagli sulle dimensioni della camera di flusso. La figura 3 e il filmato 1 mostrano una serie di immagini di adesione e diffusione piastrinica su VWF immobilizzato. CD63 è una proteina transmembrana che viene inserita nella membrana di granuli denso intracellulari di piastrine di riposo 15 . La sua mobilitazione a tempo dipendente sulla superficie delle piastrine è mostrata in verde. Analogamente, P-selectina (Psel) è una proteina transmembrana inserita nella membrana di granuli α-intracellulari di piastrine riposanti. La sua mobilitazione a tempo dipendente sulla superficie piastrinica è mostrata in arancione. La figura 3B mostra un'immagine rappresentativa ad angolo di 45 °, Acquisita mediante microscopia confocale a fluorescenza dopo un esperimento di flusso. Il filmato 2 mostra una serie di inclinazione dello stesso esperimento. Si noti che CD63 si trova principalmente al granulomere centrale, mentre la P-selectina è distribuita su tutto il corpo cellulare e appare concentrata ai bordi. La figura 4A e il filmato 3 mostrano la mobilitazione temporale del CD63 sulla superficie delle piastrine (verde). In questi esperimenti, le piastrine (che non hanno DNA nucleare) sono state pre-incubate con DAPI (blu), che macchia polifosfato in granuli duri16 . Notevole, nonostante i chiari segni di rilascio di granuli densi (analisi delle singole cellule sono riportate in Figura 4B e Movie 4 ), il polifosfato è conservato all'interno o all'esterno di queste piastrine. La figura 5 e il film 5 mostrano mobilitazione (o reclutamento) di tempo dipendente di VWF, un mult trombogenicoProteina immersa 17 immagazzinata in granuli α, alla superficie piastrinica (verde). Simile al polifosfato, il VWF rimane associato alla superficie delle piastrine attivate.
Figura 1: Camera di flusso e configurazione sperimentale. ( A ) Immagine della struttura della camera di flusso con un ingresso e uscita (1 e 2), un collegamento a vuoto (3) sul quale è posizionato il foglio di silicone (4). Due fogli esterni (5) nella lastra di silicio formano i canali di vuoto per fissare il vetro di copertura (6). Un ritaglio centrale (7) forma il canale di flusso ( B ) Immagine della configurazione sperimentale. Ingresso e uscita (1 e 2), pompa siringa (8) e porta campione (9). ( C ) Schema generale della configurazione sperimentale; I numeri sono identici a quelli in A e B. ( D ) Panoramica schematica con la dimensione Del foglio di silicone tagliato personalizzato. ( E ) Schema generale schematico della camera di flusso di poli (metacrilato) . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cianografia dettagliata della camera di flusso. La camera di flusso è costituita da un blocco di poli (metilmetacrilato) (1) , un inserto poliossimetilenico diretto per l'ingresso di vuoto (2) e due inserti in poliossimetilene angolati per l'ingresso e l'uscita del campione (3) . Gli inserti in poliossimetilene angolati contengono tubi capillari metallici, con diametri di 1,07 mm. L'inserto diritto contiene un tubo capillare con diametro di 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diffusione e Degranulazione del Platelet sul fattore von Willebrand Immobilizzato. ( A ) Mobilizzazione a tempo dipendente di CD63 e P-selectin sulla superficie delle piastrine di diffusione e degranulazione. La barra di scala bianca (in alto a sinistra) indica 10 μm. ( B ) Rappresentante confocale a microscopia a fluorescenza a 45 °. La barra di scala bianca (in basso a sinistra) indica 2 μm. Verde, CD63; Arancio, P-selectin. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Figura 4: La diffusione piastrinica, la degranulazione e la mobilità dei granuli densi sul fibrinogeno immobilizzato. ( A ) Mobilizzazione a tempo dipendente di CD63 e polifosfato sulla superficie delle piastrine. La barra di scala bianca (in alto a sinistra) indica 10 μm. ( B ) Serie temporale di una singola piastrina (t = 0 rappresenta la prima adesione alla superficie). La barra di scala bianca (in basso a destra) indica 2 μm. Verde, CD63; Blu, DAPI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Associazione di superficie del fattore di von Willebrand sulla superficie del platelet di fibrinogeno immobilizzato. Mobilizzazione (o reclutamento) di VWF a tempo dipendente dalla superficie piastrinica. TLa barra di scala bianca (in alto a sinistra) indica 5 μm. Verde, VWF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ambientazione | Valore |
| Tempo di esposizione FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensità FITC (Alexa488) | 50% |
| Tempo di esposizione DIC | 30 ms |
| Lampada alogena di tensione | 4,5 Volt |
| Tempo di esposizione TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| Intensità LED 555 FITC (Alexa546) | 50% |
| Tempo di esposizione DAPI | 500 ms |
| Intensità del LED 365 | 50% |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filtri TRITC | Filterset 20 |
| Filtri DAPI | Filterset 01 |
| Obbiettivo | Alpha Plan-Fluar 100x / 1,45 Olio |
| Frequenza frame, tempo di registrazione | 1 fotogramma / 10 s, 30 min |
| Filmati di compressione di file | MOV (h.264), AVI (non compresso) |
| Immagini di compressione di file | JPEG, TIF |
Tabella 1: Impostazioni del microscopio. Impostazioni utilizzate per gli esperimenti rappresentativi.
| Bersaglio | Anticorpo / Dye | Concentrazione |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotina *)325 ng / ml | |
| P-selectina | Anti-CD62P-biotina **) | 90 ng / ml |
| DNA | DAPI | 10 μg / ml |
| VWF | VWF-FITC anti-umano | 5 μg / mL |
| *) L'anticorpo anti-CD63-biotina viene miscelato con streptavidin-Alexa488 in un rapporto molare di 1: 1 prima dell'uso | ||
| **) l'anticorpo anti-CD62P-biotina viene mescolato con streptavidin-Alexa546 in un rapporto molare di 1: 1 prima dell'uso | ||
Tabella 2: Anticorpi e coloranti. Raccomandata concentrazione di anticorpi e tinture per gli esperimenti rappresentativi rappresentati.
| Categoria di reagenti | Esempio di compounds |
| Agonisti della piastrinica | Trombina, ADP, PAR-1 o -4 peptidi di attivazione, U46619, Trombossano A2, ADP |
| Inibitori enzimatici | Hirudin, PPACK, heparinoidi (indiretto), inibitore della tripsina di mais, inibitore della tripsina di soia |
| Antagonisti del ricettore | Anti-Glyproteina 1bα, anti-Glicoproteina VI; Clopidogrel, (peptidi ciclici) contenenti RGD |
| Inibitori di attivazione | Pretrattamento di aspirin, fissazione |
Tabella 3: Reagenti potenzialmente utili.
Film supplementari: Film 1: serie temporale di immagini di piastrine (vedi figura 1 ), film 2: serie di inclinazione della figura 3B , film 3: mobilitazione temporale di CD63 sulla piastrina(Vedi Figura 4 ), Film 4: Serie temporale di analisi a singola cella (vedi Figura 4B ), Film 5: Mobilizzazione a tempo dipendente di VWF (vedi Figura 5 ).
Clicca qui per scaricare il filmato 1.
Clicca qui per scaricare Movie 2.
Clicca qui per scaricare il filmato 3.
Clicca qui per scaricare il filmato 4.
Clicca qui per scaricare il filmato 5.
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Discussion
In tutto il mondo, la trombosi è una causa principale di morte e morbilità e le piastrine hanno un ruolo centrale nel suo sviluppo. Questo lavoro descrive un metodo per l'imaging a cellule vive della degranulazione piastrinica sotto il flusso. Generalmente si presume che, quando le piastrine si attivano, tutti i contenuti granulari vengono direttamente rilasciati in soluzione. I risultati di accompagnamento suggeriscono che questo non è necessariamente il caso. Durante l'aderenza e la degranulazione, le piastrine conservano una significativa quantità di polifosfato ( Figura 4 ). Inoltre, la proteina multimerica VWF è associata alla superficie piastrinica dopo la degranulazione ( Figura 5 ). Ciò indica che i meccanismi molecolari che controllano la degranulazione del granulo piastrinico sono più sottili di quanto generalmente presupposto.
Per consentire l'imaging delle cellule vive della degranulazione piastrinica sotto il flusso, le condizioni sperimentali sono state selezionate per mantenere l'aggregazione piastrinica al minimo. Platelet counTs di 150.000 piastrine / μL sono state utilizzate. Ciò è all'estremità inferiore della gamma normale (150.000-450.000 piastrine / μL). Inoltre, l'adesione e la diffusione delle piastrine sono state studiate su VWF immobilizzato o fibrinogeno, che hanno causato una lieve attivazione piastrinica (a differenza di, ad esempio, collagene). Negli studi con le piastrine lavate, aumentate le velocità di taglio spostano queste cellule al centro del flusso. Questo interferisce con l'adesione e successiva diffusione e complicano l'indagine della degranulazione.
In emostasi fisiologica, la marginalità delle piastrine è importante. Questo processo è guidato da eritrociti, spiegando perché l'anemia bassa è talvolta accompagnata da una diatesemia sanguinante. Una limitazione della tecnica presentata è che la visualizzazione della degranulazione piastrinica (con i materiali e reagenti presentati) è disturbata dai globuli rossi. La funzione piastrinica è influenzata dalla tensione di taglio, che è funzione della viscosità del fluido (μ), così comeDella velocità di taglio. Quindi, è consigliabile studiare la funzionalità piastrinica nei modelli di flusso in soluzioni con viscosità comparabili ( cioè le piastrine lavate, il sangue ricostituito, il PRP o il sangue intero).
Esistono diversi fattori pratici da tenere in considerazione durante l'esecuzione di questi esperimenti. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono fortemente influenzati dall'area di messa a fuoco. Se il microscopio non è a fuoco, il segnale è facilmente sfuocato o persino perso. Prima dell'arrivo delle piastrine nel canale di flusso, è meglio concentrarsi sul canale stesso (iniziano a bordo del muro di canale del flusso di silicio / flusso). Quando le piastrine cominciano ad aderire, concentrarsi su questo evento di adesione. Un secondo punto di preoccupazione è il sbiancamento di alcuni fluorofori ( es. FITC). L'eccitazione ripetuta porterà ad una perdita di segnale, disturbando l'indagine. Questi ostacoli possono essere superati utilizzando fluorofori più stabili, riducendo l'intensità della luce LED emozionante, riducendo l'expTempi di oscuramento e / o abbassamento della frequenza fotogrammi.
Il modello qui descritto è molto utile per eseguire uno studio dettagliato sulle risposte piastriniche ad una grande varietà di proteine immobilizzate ea diverse portate. Potenzialmente, questo metodo può anche essere utilizzato per studiare la loro interazione con le cellule endoteliali attivate 18 . Gli avanzamenti tecnici che consentono i disegni flessibili delle camere di flusso speciali sono attualmente aperture per studi di biocompatibilità 19 . L'imaging a cellule vive della reattività piastrinica sotto il flusso rivelerà preziosi approfondimenti sulla complessità della risposta adesione piastrinica. In ultima analisi, queste esperienze dovrebbero portare a sviluppare modelli di flusso sperimentale che permettano l'analisi combinata della funzione piastrinica e l'influenza sul sistema di coagulazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
CM riconosce il sostegno finanziario dell'Organizzazione Internazionale del Paziente per le Deficienze C1-Inibitore (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e la Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
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