Summary
Dette arbeidet beskriver en fluorescensmikroskopibasert metode for studier av trombocytadhesjon, spredning og sekresjon under strømning. Denne allsidige plattformen muliggjør undersøkelse av blodplatefunksjon for mekanistisk forskning på trombose og hemostase.
Abstract
Blodplater er viktige spillere i hemostase, dannelsen av trombier for å forsegle vaskulære brudd. De er også involvert i trombose, dannelsen av trombi som okkluderer vaskulaturen og skadet organer, med livstruende konsekvenser. Dette motiverer vitenskapelig forskning på blodplatefunksjon og utvikling av metoder for å spore cellebiologiske prosesser som de oppstår under flytforhold.
En rekke strømningsmodeller er tilgjengelige for studier av trombocytadhesjon og aggregering, to sentrale fenomener i blodplatebiologi. Dette arbeidet beskriver en metode for å studere sanntids blodplante degranulasjon under flyt under aktivering. Metoden gjør bruk av et strømningskammer koblet til en sprøytepumpeoppsett som er plassert under et brede, invertert, LED-basert fluorescensmikroskop. Oppsettet beskrevet her muliggjør samtidig eksitering av flere fluoroforer som leveres av fluorescensmerkede antistoffer eller fluorescensEnt farger. Etter eksponering av levende celler, kan dekslet briller behandles videre og analyseres ved hjelp av statisk mikroskopi ( dvs. konfokal mikroskopi eller skanning elektronmikroskopi).
Introduction
Blodplater er anukleatceller som sirkulerer i blodstrømmen. Deres hovedfunksjon er å forsegle vaskulære brudd på steder av skade og for å forhindre blodtap. På disse steder av skade blir subendoteliale kollagenfibre eksponert og dekkes deretter av det multimere proteinet, von Willebrand-faktor (VWF). VWF interagerer med blodplater i omløp i en mekanisme som avhenger av glykoprotein Ibα-IX-V-komplekset på celleoverflaten 1 , og senker hastigheten på blodplater. Dette er spesielt viktig ved høy skjærhastighet. Plättene gjennomgår etterfølgende morfologiske endringer mens de mottar aktiveringsimpulser fra kollagen. Dette fører til irreversibel spredning og til slutt til blodplateaggregering. Begge prosessene er avhengige av sekretjonen av granulinnhold for å lette blodplate-blodplate-kronestikk. Blant annet inneholder blodplate-a-granuler fibrinogen og VWF for å hjelpe trombocytadhesjon og å broBlodplater sammen på en integrin-avhengig måte. De blodplate-tette granulatene inneholder uorganiske forbindelser 2 , inkludert kalsium og adenosindifosfat (ADP), som bidrar til å forsterke blodplateaktivering. Videre inneholder blodplater mediatorer av (allergisk) betennelse 3 , komplementkontrollerende proteiner 4 og angiogenesefaktorer 5 , 6 , som løfter spørsmål om hvorvidt og hvordan disse innholdene blir differensielt frigjort under varierende betingelser.
Siden 1980-tallet har studien av blodplatefunksjon i flytmodeller vært verdifull for undersøkelsen av trombotiske mekanismer 7 . Siden da har det blitt gjort mye teknisk fremgang, og strømningsmodeller som inkluderer fibrindannelse, er for tiden utviklet for å analysere det hemostatiske potensialet av terapeutiske blodplatekoncentrater ex vivo 8 eller tilUndersøke påvirkning av forstyrrelser i skjærhastigheter på trombusmorfologi 9 . Forskjellene i molekylære og cellebiologiske mekanismer som driver stabil vedheft og fysiologisk trombusdannelse (hemostase) versus patologisk trombusdannelse (trombose) kan være svært subtile og motivere utviklingen av strømningsmodeller som gjør det mulig for real-time visualisering av disse subcellulære prosesser.
Et eksempel på en prosess som et slikt oppsett ville være verdifullt er (re) fordeling av intracellulært polyfosfat og rekruttering av koagulasjonsfaktorer for å avdekke den tidsavhengige påvirkning som dette har på fibrin-ultrastruktur 10 . Studier er ofte begrenset til endepunktsanalyser. Hovedformålet med den beskrevne metoden er å muliggjøre sanntidsvisuell undersøkelse av dynamiske subcellulære prosesser som finner sted under blodplateaktivering under strømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den lokale medisinske etiske komiteen ved Universitetshospitalsenteret Utrecht godkjente tegning av blod for eks vivo forskningsformål, inkludert de i denne studien.
1. Løsningsberedning
- Forbered en 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) Tyrodes buffer ved å oppløse 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgS04 og 5,55 mM D- Glukose i destillert vann.
- Lag to varianter av bufferen: sett pH-nivåene ved 6,5 og henholdsvis 7,4. Lag fersk buffer for hver dag med eksperimenter. Supplement med 10 ng / ml prostacyklin hvor det er angitt.
- Tilbered TRIS-buffret saltvann (TBS) ved å oppløse 50 mM Tris og 150 mM NaCl i destillert vann og juster pH til 9,0.
- Forbered syrecitratdextrose (ACD) ved å oppløse 85 mM Tri-natriumcitrat, 71 mM sitronsyre og 111 mM D-glukose i disBetongvann.
- Forbered en fikseringsløsning ved å tilsette 2% (v / v) paraformaldehyd (PFA) til HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Varm oppløsningen (50 - 70 ° C) og sett pH til 7,4. Aliquot og lagre ved -20 ° C. Tine ved 37 ° C før bruk.
- Forbered blokkeringsbufferen ved å oppløse 1% (m / v) humant serumalbumin (HSA) i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4
- Lag en polyvinylalkoholoppløsning ved å tilsette 4,8 g polyvinylalkohol til 12 g glycerol og bland godt. Tilsett 12 ml destillert vann og la det stå på en rotator ved romtemperatur over natten.
- Tilsett 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Varm til 50 ° C mens du blander i 30 minutter. Tilsett 1,25 g 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) og bland godt. Sentrifuger ved 1500 xg i 5 min. Aliquot supernatanten (1 ml er tilstrekkelig for 15-20 lysbilder) og oppbevares ved -20 ° C. Bruk alikvotene en gang.
2. Cover Glass Preparation
- Avfett dekseletBriller (25 x 50 mm 2 ) ved inkubering over natten i ufortynnet kromosvovelsyre. Skyll dekselbrillene med destillert vann og tørk dem over natten ved 60 ° C i en ovn.
- Fest en stripe av en paraffinfilm (10 x 15 cm 2 ) på toppen av en laboratoriebenk med en dråpe vann og fjern luften ved å glatte ut paraffinfilmen. Pipette 80 μl dråper 10 μg / ml VWF eller 100 μg / ml fibrinogen på paraffinfilmen. Plasser brillene på dråpene; Proteinløsningen sprer seg mellom de to flatene for å dekke hele baksiden av glasset. Inkuber i 1,5 timer ved romtemperatur (RT).
- Fjern parafinfilmen og blokkér dekselbrillene ved å plassere dem, med den belagte siden opp i en 4-brønn plate med blokkeringsbuffer. Inkuber i 1 time ved 37 ° C eller over natten ved 4 ° C. Som en kontroll må du blokkere et dekselglass som ikke er belagt med VWF eller fibrinogen.
3. Fremstilling av blodplate rik plasma (PRP)
MERK: Etter sentrifugering kan tre lag observeres (fra topp til bunn): PRP, hvite blodlegemer og røde blodlegemer. Pass på at du ikke inkluderer de hvite og røde blodkroppene. Vanligvis kan 3 ml PRP oppsamles etter sentrifugering av et 9 ml blodrør.
MERK: Vanligvis kan 2 ml oppsamles etter dette andre sentrifugeringstrinnet.
MERK: Det totale volumet av fortynnet PRP avhenger av blodplateantallet til giveren. Blodplate-tall varierer mye mellom givere, og PRP-fortynning krever vurdering på individuell basis. Blodplate-teller regnes som normale når det er innenfor 150.000 og 450.000 blodplater / μl.
4. Fremstilling av vaskede blodplater
- Bestem gjennomsnittlig blodplatevolum (MPV) i PRP ved hjelp av en celleanalysator.
MERK: Dette er en indikator for blodplatefor aktivering 11 . En normal MPV for hvile blodplater er 7,5-11,5 fL 11 . MPV bør ikke øke med mer enn 1,5 fL i løpet av blodplatevaskingsprosedyren. - Tilsett et 1/10 volum ACD til PRP for å forhindre blodplatefor-aktivering og sentrifugering i 15 minutter ved 400 xg og RT uten brems. Fjern suPernatant og res suspender pelleten forsiktig i HEPES Tyrode's buffer, pH 6,5, til det opprinnelige volumet PRP.
- Tine en alikvot av prostacyklin ved å tilsette TBS til en konsentrasjon på 10 μg / mL; Hold det på is.
- For å forhindre blodplateaktivering, legg til prostacyklin ved en sluttkonsentrasjon på 10 ng / mL til de gjenoppløste blodplater og umiddelbart sentrifuger i 15 minutter ved 400 xg og RT uten brems. Fjern supernatanten og suspender pelleten forsiktig i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4.
- Telle antall blodplater (trinn 3.5) og fastslå endringen i MPV (trinn 4.1) (MPV bør ikke endres over 1,5 fL).
- Juster antall blodplater med HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, til en konsentrasjon på 150.000 blodplater / μl. La blodplater gjenopprette i 30 minutter ved RT før eksperimenter. Bruk vaskede blodplater til forsøk innen 4 timer etter isolasjon.
5. Sammensetning av flytkammer
12 . En rekke kommersielt produserte strømningskamre kan anvendes, så lenge de kan holde et dekselglass, som fortrinnsvis kan fjernes for videre analyser. Strømningskammeret som brukes for de beskrevne eksperimenter, er laget av poly (metylmetakrylat) for å passe akkurat inn i et mikroskopinnleggsstadium. Den inneholder et innløp og utløp ( Figur 1A - C ; 1, 2), samt en vakuumforbindelse ( Figur 1A og C ; 3). Et tilpasset silikonplate ( Figur 1A og D ; 4) er plassert på toppen. To utskjæringer danner vakuumkanaler ( figur 1A og D ; 5) for å feste dekselglasset ( figur 1A ; 6) tett til kammeret. En sentral utskjæring danner strømningskanalen ( figur 1A D ; 7; 2,0 mm bredde og 0,125 mm høyde). Innløpet og utløpet er koblet til strømningskanalen, og vakuumet er koblet til vakuumkanalen.
- Dekk toppen av strømningskammeret med destillert vann og legg det tilpassede silikonplaten med glatt side ned på vannet. Flytt arket på plass ved å fjerne overflødig vann mens du holder arket på plass.
MERK: Denne silikonplaten er gjenbrukbar (silikon er kjent for sine inerte egenskaper); Generelt har ikke blodplater blitt observert å knytte seg til det. Arkene kan rengjøres med vaskemiddel og gjenbrukes til materialet blir skadet ( dvs. rive, spesielt i området mellom kanaler). Vanligvis kan et ark brukes i 20 dager med flere eksperimenter per dag. - Inkubér strømningskammeret i 1 time ved 60 ° C for å fordampe restvannet for å feste silikonplaten fast til strømningskammeret.
- Med en plast Pasteur pipette, legg til en dråpeHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, på strømningskanalen. Plasser dekselet glass (se kapittel 2) med den belagte siden ned, på strømningskanalen. Fest vakuumpumpen til vakuumforbindelsen ( figur 1A og C ; 3). Påfør ~ 10 kPa trykk.
6. Forfarging av blodplater og preparering av antistoffene
- Blodplatefarging
- Inkuber de vasket blodplater med 10 μg / ml DAPI i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. For å vaske bort ubundet DAPI og for å forhindre blodplateaktivering, legg til prostacyklin i en sluttkonsentrasjon på 10 ng / mL og umiddelbart sentrifuger i 15 minutter ved 400 xg og RT uten brems.
- Rekonstituer blodplatepellet i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, til en blodplatekonsentrasjon på 150.000 blodplater / μl.
- Fremstilling av antistoffer
- Bland biotin-merket antistoff med Alexa-merket strepTavidin ved et molforhold på 1: 1. Inkuber i minst 10 minutter ved romtemperatur før bruk (trinn 7.6).
MERK: Biotin-merkingseffektiviteten kan variere mellom forskjellige batcher. Skulle det være problemer med visualisering av målmolekyler, bør kontrollforsøk utføres for å bekrefte vellykket biotinylering, samt målbindingsegenskapene til det spesifikke biotinylerte antistoff.
- Bland biotin-merket antistoff med Alexa-merket strepTavidin ved et molforhold på 1: 1. Inkuber i minst 10 minutter ved romtemperatur før bruk (trinn 7.6).
7. Perfusjon
- Start fluorescensmikroskopet, så vel som mikroskopprogrammet. Bruk mikroskopinnstillingene som er oppført i tabell 1 .
MERK: Start mikroskop- og innspillingsinnstillingene for levendecellens visualisering og innspilling av blodplater og de valgte fluorescensmerkede antistoffene og / eller fargestoffene ved å legge et passende eksperiment i mikroskopprogrammet. Utfør flytforsøk ved RT. - Blokker innløpsrøret ved å koble en 10 ml sprøyte til slangen og aspirere 1% HSA blomstCking buffer i innløpsrøret. Inkuber i 15 minutter ved RT. Skyll innløpsrøret ved å suge HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, inn i innløpsrøret.
- Koble den blokkerte innløpsrøret og det ubehandlede utløpsrøret, begge med en diameter på 1,02 mm og en ~ 20-30 cm lengde til innløpet og utløpet av kammeret. Koble en 10 ml sprøyte (eller lavere volum for mer nøyaktighet) til utløpsrøret. Slå på sprøytepumpen.
MERK: Sprøytens diameter, i kombinasjon med strømningshastigheten satt på pumpen, bestemmer volumetrisk strømningshastighet. Sammen med overflaten av strømningskanalen kan skjærhastigheten beregnes i henhold til formelen 13 under. Det er derfor mulig å manipulere skjærhastigheten ved å endre strømningshastigheten til sprøytepumpen eller endre dimensjonene til strømningskanalen. En skjærhastighet på 800-1,600 s -1 typisk modeller for arteriell blodstrøm, mens 25-100 s-1 modeller for venøst blodstrømme. For dette oppsettet resulterer en strømningshastighet på 7,5 μl / min i en skjærhastighet på 25 s -1 .
Skjærhastighet = 6Q / h 2 w i s -1
Hvor: Q = volumetrisk strømningshastighet (mL / s), h = høyde kanal (cm) (0,0125 cm, dette er tykkelsen på silikonplaten), w = bredde kanal (cm) (0,2 cm i dette kammeret). - Plasser en dråpe neddypningsolje på et 100X objektiv (total forsterkning på 1000X) og monter kammeret på mikroskopet med glassflaten nedover.
- Plasser innløpsrøret i et rør som inneholder HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Trekk støpstemperaturen på sprøyten manuelt koblet til utløpsrøret og trekk løsningen gjennom kammeret for å fjerne luften fra systemet. Plasser sprøyten i sprøytepumpen ( Figur 1B og C ; 8) og kjør pumpen kort for å stramme stemplet og sikre stabil strømning.
- Legg til antistoffer og / eller fargestoffer til blodplate-suspensjonen eller PRP, forsiktigBland med en plastpipett, og overfør blandingen til et 1,5 ml rør.
MERK: For en typisk perfeksjon på 30 minutter ved skjærhastighet 25 s-1 (7,5 μl / min) er det nødvendig med minst 225 μl blodplateoppheng. Antistoffene som brukes for de representative resultatene er vist i tabell 2 . - Flytt innløpsrøret mens du klemmer, fra HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, til et 1,5 ml rør som inneholder enten PRP eller de vasket blodplater og antistoffene og / eller fargestoffene ( Figur 1B og C ; 9).
MERK: Det er viktig at når du overfører slangen, presses slangen (trykk ut luften) for å forhindre luft i å komme inn i slangen. Det er mulig å behandle vedheftende blodplater med en rekke reagenser i et etterfølgende trinn ved å flytte innløpsrøret til et annet rør på lignende måte. En liste over potensielt nyttige reagenser er gitt i tabell 3 . - Velg "live visualizatioN "-alternativet i programvaren, fokuser mikroskopet på overflaten av det belagte dekselglasset og start pumpen ved en skjærhastighet på 1600 s-1 (484 μL / min) til blodplater når strømningskammeret. For øyeblikket, Reduser skjærhastigheten tilbake til 25 s-1 ved å endre innstillingene til sprøytepumpen til en strømningshastighet på 7,5 μL / min.
- Overvåk overflaten på den belagte siden av dekselglasset, vent til den første blodplaten begynner å feste, fokus mikroskopet på denne blodplaten, og start opptaket ved å starte eksperimentet i programvaren. Se tabell 1 for innspillingsinnstillingene som brukes her.
- Følg liveopptaket visuelt. Etter 30 minutter skal du stoppe sprøytepumpen.
MERK: Sørg for at blodplättene holder seg i fokus i løpet av forsøket. Vanligvis føyer 20-30 blodplater i synsfeltet ved en forstørrelse på 1000X; Dette er om lag 2000-3000 blodplater i hele flytkanalen. - Fiksering medStrømningskammeret (valgfritt).
- Når strømmen har stoppet etter at sprøytepumpen er stoppet, overfør innløpsrøret (luftfritt) til fikseringsløsningen. Start pumpen på nytt og flyt fikseringsbufferen gjennom kanalen i minst 10 minutter med samme strømningshastighet som nevnt i trinn 7.8.
- Fjern kammeret fra mikroskopet, rengjør nedsenkingsoljen fra glasset, koble fra vakuumet og fjern forsiktig glasset fra kammeret med en 18 G nål.
MERK: Forhindre at dekselglasset bryter og ødelegger silisiumplaten. - Plasser dekselet (med cellene rettet oppover) i en 4-brønn plate på toppen av et vev, for-fuktet med destillert vann.
MERK: Dette forhindrer at dekselglasset holder seg fast på brønnoverflaten og forhindrer tørking. - Pipetter 750 μL fikseringsløsning på toppen av dekselet og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Dersom prøvene ikke kan analyseres direkte,Oppbevar dem i 0,5% PFA (fortynnet av HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4) ved 4 ° C for å sikre stabil fiksering. Fortsett til seksjon 8 for å behandle dekselet til bildebehandling.
- Etter bruk, skyll kammeret, slangen og arket med destillert vann og inkuber natten over i en vaskemiddelløsning. Før gjenbruk av kammeret og andre komponenter, skyll med destillert vann.
- Lagre mikroskopets rå datafiler som inneholder alle metadataene. Når det trengs, eksporterer du filmene til .MOV, h.264 komprimert eller .AVI ukomprimert. Lagre egne rammer som JPEG- eller TIF-filer.
8. Prøveforberedelse for konfokal fluorescensmikroskopi
- Overfør dekselbrillene til nye 4-brønnsplater og skyll 5 ganger med 3 mL HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Tilsett 3 ml / brønn blokkeringsbuffer og inkuber i 1 time ved RT.
- Fjern blokkeringsbufferen; Tilsett 3 ml / brønn med 0,15% glycin (M / V) i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4; Og inkuber i 15 minutter ved RT.
- Fjern glycinoppløsning og vask 5 ganger i 3 ml / brønn av blokkeringsbuffer. Eventuelt tilsettes fluorofore-konjugerte antistoffer fortynnet i blokkeringsbuffer for ytterligere farging. Inkubér i 1 time ved RT i mørket.
- Vask 5 ganger med blokkeringsbuffer og 2 ganger med destillert vann. Tørk glasset ved å fjerne overflødig væske med et vev (fra kantene innover) uten å berøre cellene.
- Pipetter 60 μL polyvinylalkoholoppløsning på en mikroskopdiode. Plasser dekselet glass, med cellene ned, på toppen av dråpen og la polyvinylalkohol spredes mellom de to flatene. Inkuber natten over ved RT i mørket.
- Analyser cellene med konfokal mikroskopi 14 .
- Lagre de raske datafilene i de opptatte stakkdataene som inneholder alle metadataene. Når det trengs, behandler de rade datafilene i MOV, h.264 komprimerte eller .AVI ukomprimerte filer. Lagre separate stabler som JPEG- eller TIF-filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser bilder av strømningskammeret og eksperimentelt oppsett; Plasseringen og dimensjonene av silisiumplaten; Og rørforbindelser. Figur 2 gir detaljer om dimensjonene til strømningskammeret. Figur 3 og Film 1 viser en tidsserie av bilder av vedheft av blodplater og spredning på immobilisert VWF. CD63 er et transmembranprotein som settes inn i membranen av intracellulære tette granuler av hvilende blodplater 15 . Den tidsavhengige mobiliseringen på blodplateoverflaten er vist i grønt. På lignende måte er P-selektin (Psel) et transmembranprotein satt inn i membranen til intracellulære a-granuler av hvilende blodplater. Dens tidsavhengige mobilisering på blodplateoverflaten er vist i oransje. Figur 3B viser et representativt bilde ved en 45 ° vinkel, Oppnådd av konfokal fluorescensmikroskopi etter et strømningsforsøk. Film 2 viser en tilt-serie med samme eksperiment. Merk at CD63 hovedsakelig er lokalisert ved sentralgranulomeren, mens P-selektin er fordelt over hele cellekroppen og ser ut til å være konsentrert ved kantene. Figur 4A og Film 3 viser tidsavhengig mobilisering av CD63 på blodplateoverflaten (grønn). I disse forsøkene ble blodplater (som ikke har nukleært DNA) preinkubert med DAPI (blå), som flekker polyfosfat i tette granulater 16 . Bemerkelsesverdig, til tross for tydelige tegn på tett granulasjonsfrigjøring (enkeltcellanalyser er vist i figur 4B og film 4 ), blir polyfosfat beholdt innenfor eller på utsiden av disse blodplater. Figur 5 og Film 5 viser tidsavhengig mobilisering (eller rekruttering) av VWF, et trombogent multImerisk protein 17 lagret i a-granuler, til blodplateoverflaten (grønn). I likhet med polyfosfat forblir VWF forbundet med overflaten av de aktiverte blodplater.
Figur 1: Flammekammer og eksperimentell oppsett. ( A ) Bilde av strømkammerdesign med innløp og utløp (1 og 2), en vakuumforbindelse (3) som silikonplaten (4) er plassert på. To ytre utsparinger (5) i silikonplaten danner vakuumkanalene for å feste dekselet (6). En sentral utskjæring (7) danner strømningskanalen ( B ) Bildet av forsøksoppsettet. Innløp og utløp (1 og 2), sprøytepumpe (8) og prøveholder (9). ( C ) Skjematisk oversikt over eksperimentelle oppsett; Tallene er identiske med de i A og B. ( D ) Skjematisk oversikt med dimensjonen Av det tilpassede kutte silikonplaten. ( E ) Generell skjematisk oversikt over poly (metylmetakrylat) strømningskammer . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Detaljert tegning av flytkammer. Strømningskammeret består av en poly (metylmetakrylat) blokk (1) , en rett polyoksymetyleninnsats for vakuuminnløpet (2) og to vinklede polyoksymetyleninnlegg for prøveinnløpet og utløpet (3) . De vinklede polyoksymetyleninnsatsene inneholder metallkapillarrør med diametre på 1,07 mm. Den rette innsatsen inneholder et kapillærrør med en diameter på 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spredning av blodplater og degranulering på immobilisert von Willebrand-faktor. ( A ) Tidsavhengig mobilisering av CD63 og P-selektin på overflaten av spredning og degranulering av blodplater. Den hvite skalaen (øverst til venstre) indikerer 10 μm. ( B ) Representativt konfokal fluorescensmikroskopi bilde i en 45 ° vinkel. Den hvite skalaen (nederst til venstre) indikerer 2 μm. Grønn, CD63; Oransje, P-selektin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Figur 4: Spredning av blodplater, degranulering og mobilitet av tette granuler på immobilisert fibrinogen. ( A ) Tidsavhengig mobilisering av CD63 og polyfosfat på blodplateoverflaten. Den hvite skalaen (øverst til venstre) indikerer 10 μm. ( B ) Tidsserier av en enkelt blodplate (t = 0 representerer den første adhesjonen til overflaten). Den hvite skalaen (nederst til høyre) indikerer 2 μm. Grønn, CD63; Blå, DAPI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Overflateforening av von Willebrand-faktor på blodplateoverflaten av immobilisert fibrinogen. Tidsavhengig mobilisering (eller rekruttering) av VWF til blodplateoverflaten. THan hvitestang (øverst til venstre) indikerer 5 μm. Grønn, VWF. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Innstilling | Verdi |
| Eksponeringstid FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensitet FITC (Alexa488) | 50% |
| Eksponeringstid DIC | 30 ms |
| Spenning halogenlampe | 4,5 Volt |
| Eksponeringstid TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 intensitet FITC (Alexa546) | 50% |
| Eksponeringstid DAPI | 500 ms |
| LED 365 intensitet | 50% |
| Filtersett FITC | Filtersett 10 |
| Filtersett TRITC | Filtersett 20 |
| Filtersett DAPI | Filtersett 01 |
| Objektiv | Alpha Plan-Fluar 100x / 1,45 olje |
| Rammehastighet, opptakstid | 1 ramme / 10 s, 30 min |
| Filkomprimeringsfilmer | MOV (h.264), AVI (ukomprimert) |
| Filkomprimeringsbilder | JPEG, TIF |
Tabell 1: Mikroskopinnstillinger. Innstillinger som brukes for de representative eksperimenter.
| Mål | Antistoff / Fargestoff | Konsentrasjon |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotin *)325 ng / ml | |
| P-selektin | Anti-CD62P-biotin **) | 90 ng / ml |
| DNA | DAPI | 10 μg / ml |
| VWF | Anti-human VWF-FITC | 5 μg / ml |
| *) Anti-CD63-biotin antistoff blandes med streptavidin-Alexa488 i et molforhold på 1: 1 før bruk | ||
| **) anti-CD62P-biotin-antistoff blandes med streptavidin-Alexa546 i et molforhold på 1: 1 før bruk | ||
Tabell 2: Antistoffer og fargestoffer. Anbefalte antistoff- og fargekonsentrasjoner for de viste representative forsøkene.
| Reagens kategori | Eksempel kompounds |
| Blodplate agonister | Trombin, ADP, PAR-1 eller -4 aktiverende peptider, U46619, Thromboxane A2, ADP |
| Enzymhemmere | Hirudin, PPACK, heparinoider (indirekte), mais trypsininhibitor, soyabønne trypsinhemmer |
| Receptor antagonister | Anti-glyprotein 1ba, anti-glykoprotein VI; Klopidogrel, (cykliske) RGD-holdige peptider |
| Aktiveringsinhibitorer | Aspirin forbehandling, fiksering |
Tabell 3: Potensielt nyttige reagenser.
Supplerende filmer: Film 1: Tidsserier av bilder av blodplater (se Figur 1 ), Film 2: Tilt-serier i Figur 3B , Film 3: Tidsmessig mobilisering av CD63 på blodplatenOverflate (se figur 4 ), film 4: tidsserier av enkeltcelleanalyser (se figur 4B ), film 5: tidsavhengig mobilisering av VWF (se figur 5 ).
Vennligst klikk her for å laste ned film 1.
Vennligst klikk her for å laste ned Movie 2.
Vennligst klikk her for å laste ned Movie 3.
Vennligst klikk her for å laste ned Movie 4.
Vennligst klikk her for å laste ned Movie 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Globalt er trombose en ledende dødsårsak og sykelighet, og blodplater spiller en sentral rolle i utviklingen. Dette arbeidet beskriver en metode for levende celledannelse av blodplate-degranulering under strømning. Det antas generelt at når blodplater blir aktivert, slippes alt granulært innhold direkte inn i løsningen. De medfølgende resultatene tyder på at dette ikke nødvendigvis er tilfelle. Under vedheft og degranulasjon beholder blodplater en signifikant mengde polyfosfat ( figur 4 ). I tillegg er det multimere proteinet VWF assosiert med blodplateoverflaten etter degranulering ( Figur 5 ). Dette indikerer at de molekylære mekanismer som styrer graden av blodplategranulat degranulering er subtilere enn generelt antatt.
For å muliggjøre levende celledannelse av blodplate-degranulering under strømning ble eksperimentelle betingelser valgt for å holde blodplateaggregasjon til et minimum. TrombocytterTs på 150.000 blodplater / μl ble brukt. Dette er i den nedre enden av det normale området (150.000-450.000 blodplater / μL). Videre ble trombocytadhesjon og spredning studert på immobilisert VWF eller fibrinogen, noe som førte til mild blodplateaktivering (i motsetning til for eksempel kollagen). I studier med vasket blodplater beveger de økte skjærhastighetene disse cellene til midten av strømmen. Dette forstyrrer vedheft og påfølgende spredning og kompliserer undersøkelsen av degranulering.
I fysiologisk hemostase er blodplate marginering viktig. Denne prosessen er drevet av erytrocytter, og forklarer hvorfor lav anemi i noen tilfeller er ledsaget av en blødende diatese. En begrensning av den presenterte teknikken er at visualiseringen av trombocyttedranulering (med de presenterte materialer og reagensene) forstyrres av røde blodlegemer. Blodplatefunksjon er påvirket av skjærspenning, som er en funksjon av væskens viskositet (μ), så vel somAv skjærhastigheten. Det anbefales derfor å studere blodplatefunksjon i flytmodeller i løsninger med sammenlignbare viskositeter ( dvs. vasket blodplater, rekonstituert blod, PRP eller helblod).
Det er flere praktiske faktorer å ta hensyn til når du utfører disse forsøkene. For det første påvirkes fluorescenssignaler sterkt av fokusområdet. Hvis mikroskopet ikke er i fokus, er signalet lett uskarpt eller til og med tapt. Før ankomsten av blodplater inn i flytkanalen, er det best å fokusere på kanalen i seg selv (begynn ved kanten av silikonplaten / flytkanalveggen). Når blodplater begynner å henges, fokuserer på denne adhesjonshendelsen. Et annet problem er bleking av visse fluorforer ( f.eks. FITC). Gjentatt eksitasjon vil føre til tap av signal, forstyrre undersøkelsen. Disse hindringene kan overvinnes ved å bruke mer stabile fluorofor, redusere intensiteten til det spennende LED-lyset, forkorte expeditenOsure ganger, og / eller senke rammeprosenten.
Modellen beskrevet her er meget nyttig for å utføre en detaljert studie av blodplateresponser på et bredt utvalg av immobiliserte proteiner og ved forskjellige strømningshastigheter. Potensielt kan denne metoden også brukes til å studere deres interaksjon med aktiverte endotelceller 18 . De tekniske fremskrittene som tillater de fleksible designene til de spesielle flytkamrene, åpner nå veier for biokompatibilitetsstudier 19 . Levende cellen avbildning av blodplaterreaktivitet under strømning vil avsløre verdifull innsikt på kompleksiteten av blodplateadhesjonsresponsen. Til syvende og sist bør disse erfaringene føre til utviklingseksperimentelle strømningsmodeller som muliggjør kombinert undersøkelse av blodplatefunksjon og innflytelse på koagulasjonssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
CM anerkjenner økonomisk støtte fra Den internasjonale pasientorganisasjonen for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht og Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
