Summary
Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.
Abstract
Bloedplaatjes zijn essentiële spelers in hemostase, de vorming van trombi om vasculaire breuken te verzegelen. Zij zijn ook betrokken bij trombose, de vorming van trombi die de vasculatuur en de verwondende organen afsluiten, met levensbedreigende gevolgen. Dit motivert wetenschappelijk onderzoek naar bloedplaatjesfunctie en de ontwikkeling van methoden om celbiologische processen te volgen als ze zich voordoen onder stromingsomstandigheden.
Er zijn verschillende stromingsmodellen beschikbaar voor het bestuderen van bloedplaatjeshechting en aggregatie, twee belangrijke verschijnselen in de bloedplaatjesbiologie. Dit werk beschrijft een methode om real-time bloedplaatjes degranulatie te bestuderen tijdens de stroom tijdens de activatie. De methode maakt gebruik van een stroomkamer gekoppeld aan een spuitpompinstallatie die onder een brede veld, omgekeerde, LED-gebaseerde fluorescentiemicroscoop wordt geplaatst. De hier beschreven beschrijving zorgt voor de gelijktijdige excitatie van meerdere fluoroforen die worden afgeleverd door fluorescent gelabelde antilichamen of fluorescerenEnt kleurstoffen. Na live-cell imaging experimenten kunnen de dekselglazen verder worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van statische microscopie ( dwz confocale microscopie of scan elektronenmicroscopie).
Introduction
Plateletten zijn anucleate cellen die in de bloedstroom circuleren. Hun belangrijkste functie is om vaatbreuken op plaatsen van letsel te verzegelen en om bloedverlies te voorkomen. Op deze plaatsen van letsel worden subendotheliale collageenvezels blootgesteld en worden ze daarna gedekt door het multimere eiwit, von Willebrand factor (VWF). VWF interactieert met de bloedplaatjes in omloop in een mechanisme dat afhankelijk is van het glycoproteïne Ibα-IX-V complex op het celoppervlak 1 , waardoor de snelheid van de bloedplaatjes wordt vertraagd. Dit is vooral belangrijk bij hoge schuifsnelheden. De bloedplaatjes ondergaan vervolgens morfologische veranderingen terwijl ze activerende impulsen ontvangen van collageen. Dit leidt tot onomkeerbare verspreiding en uiteindelijk tot aggregatie van bloedplaatjes. Beide processen zijn afhankelijk van de afscheiding van de korrelinhoud om transplantatie van bloedplaatjes-bloedplaatjes te vergemakkelijken. Bl.a. bevat plaatjes a-granules fibrinogeen en VWF om de hechting van de bloedplaatjes te ondersteunen en te overbruggenBloedplaatjes samen op integrin-afhankelijke wijze. De bloedplaatjes dichte korrels bevatten anorganische verbindingen 2 , waaronder calcium en adenosine difosfaat (ADP), die bijdragen tot het versterken van de bloedplaatjesactivering. Bovendien bevatten bloedplaatjes mediators van (allergische) ontsteking 3 , complement-controlerende eiwitten 4 en angiogenese factoren 5 , 6 , die de vragen verhogen over of en hoe deze inhoud onder verschillende omstandigheden vrijkomen.
Sinds de jaren tachtig is de studie van bloedplaatjesfunctie in stromingsmodellen waardevol geweest voor het onderzoek van trombotische mechanismen 7 . Sindsdien is veel technische vooruitgang geboekt en stromingsmodellen die fibrinvorming bevatten, worden momenteel ontwikkeld om het hemostatische potentieel van therapeutische bloedplaatjesconcentraten ex vivo 8 te bepalen of omOnderzoek de invloed van verstoringen in schuifsnelheden op trombusmorfologie 9 . De verschillen in de moleculaire en celbiologische mechanismen die stabiele hechting en fysiologische trombusvorming (hemostase) vormen tegen de pathologische trombusvorming (trombose) kunnen zeer subtiel zijn en motiveren de ontwikkeling van stromingsmodellen die de real-time visualisatie van deze subcellulaire processen.
Een voorbeeld van een proces waarvoor een dergelijke opstelling waardevol zou zijn, is de (her) verdeling van intracellulair polyfosfaat en de aanwerving van stollingsfactoren om de tijdsafhankelijke invloed op dit op fibrine-ultrastructuur 10 te ontdekken. Studies zijn vaak beperkt tot eindpuntanalyses. Het hoofddoel van de beschreven methode is het real-time visuele onderzoek mogelijk maken van dynamische subcellulaire processen die plaatsvinden tijdens de bloedplaatjesactivering onder stroming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het lokale medisch ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht heeft de tekening van bloed voor ex vivo onderzoeksdoeleinden, waaronder die van deze studie, goedgekeurd.
1. Oplossingsvoorbereiding
- Bereid een buffer van 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) Tyrode op door 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2 HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4 en 5,55 mM D- Glucose in gedistilleerd water.
- Maak twee varianten van de buffer: stel de pH niveaus op respectievelijk 6,5 en 7,4 respectievelijk. Maak elke dag een nieuwe buffer voor experimenten. Supplement met 10 ng / mL prostacyclin waar aangegeven.
- Berei TRIS-gebufferde zoutoplossing (TBS) op door 50 mM Tris en 150 mM NaCl in gedestilleerd water op te lossen en de pH aan te passen op 9,0.
- Bereiding van zuurcitraatdextrose (ACD) door het oplossen van 85 mM tri-natriumcitraat, 71 mM citroenzuur en 111 mM D-glucose in disBewerkte water.
- Bereid een fixatieve oplossing door 2% (v / v) paraformaldehyde (PFA) toe te voegen aan de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4. Verhit om te oplossen (50 - 70 ° C) en zet de pH op 7.4. Aliquot en opslaan bij -20 ° C. Ontdooien bij 37 ° C voor gebruik.
- Bereid blokkerende buffer door 1% (m / v) humaan serumalbumine (HSA) in HEPES Tyrode's buffer op te lossen, pH 7,4
- Maak een polyvinylalcoholoplossing door 4,8 g polyvinylalcohol toe te voegen aan 12 g glycerol en meng goed. Voeg 12 ml gedestilleerd water toe en laat het gedurende een nacht op een rotator staan bij kamertemperatuur.
- Voeg 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5 toe. Verhit tot 50 ° C tijdens 30 minuten mengen. Voeg 1,25 g 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) toe en meng goed. Centrifugeer bij 1.500 xg gedurende 5 minuten. Aliquot het supernatant (1 ml is voldoende voor 15-20 glijbanen) en opslaan bij -20 ° C. Gebruik de porties een keer.
2. Voorbereiding van de glasplaat
- Ontvetten dekselGlazen (25 x 50 mm 2 ) door in de nacht in onverdund chromosulfurzuur te incuberen. Spoel de dekselglazen af met gedistilleerd water en droog ze nachtelijk bij 60 ° C in een oven.
- Plak een strip van een paraffine film (10 x 15 cm 2 ) boven op een laboratoriumbank met een druppel water en verwijder de lucht door de paraffinefilm te gladden. Pipet 80 μL druppels 10 μg / ml VWF of 100 μg / ml fibrinogeen op de paraffine film. Breng de bril op de druppels; De eiwitoplossing zal zich verspreiden tussen de twee oppervlakken om de hele achterkant van het glas te bedekken. Incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de paraffinefilm en sluit de afdekbril door ze te plaatsen, met de gecoate zijde in een 4-putjesplaat met blokkerende buffer. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of 's nachts bij 4 ° C. Als een controle blokkeren u een afdekglas dat niet is bekleed met VWF of fibrinogeen.
3. Bereiding van bloedplaatjesrijk plasma (PRP)
OPMERKING: Na centrifugatie kunnen drie lagen waargenomen worden (van boven naar beneden): PRP, witte bloedcellen en rode bloedcellen. Zorg ervoor dat de witte en rode cellen niet worden opgenomen. Typisch kan 3 ml PRP worden verzameld na centrifugeren van een 9 ml bloedbuis.
OPMERKING: Typisch kan 2 ml na deze tweede centrifugeringsstap worden verzameld.
OPMERKING: Het totale volume verdund PRP hangt af van de bloedplaatjesgetal van de donor. De bloedplaatjescijfers variëren sterk tussen donoren, en PRP verdunning vereist individueel evaluatie. De bloedplaatjes tellen worden normaal beschouwd als binnen 150.000 en 450.000 bloedplaatjes / μL.
4. Bereiding van gewassen bloedplaatjes
- Bepaal het gemiddelde bloedplaatvolume (MPV) in de PRP met behulp van een celanalysator.
OPMERKING: Dit is een indicator voor bloedplaatjesvooractivering 11 . Een normale MPV voor rustende bloedplaatjes is 7,5-11,5 fL 11 . De MPV moet niet met meer dan 1,5 fL toenemen tijdens de bloedplaatjeswasprocedure. - Voeg een 1/10 volume ACD toe aan PRP om te voorkomen dat bloedplaatjes vooractiveren en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. Verwijder de suPernatant en zorgvuldig opnieuw pelletten in de buffer van HEPES Tyrode, pH 6,5, op het oorspronkelijke volume PRP.
- Doe een aliquot van prostacyclin op door TBS toe te voegen aan een concentratie van 10 μg / ml; Hou het op ijs.
- Om bloedplaatjesactivering te voorkomen, voeg prostacyclin bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml toe aan de opnieuw gesuspendeerde bloedplaatjes en centrifugeer onmiddellijk gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem. Verwijder de supernatant en verwijder de pellet zorgvuldig in de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4.
- Tel het aantal bloedplaatjes (stap 3.5) en bepaal de verandering in MPV (stap 4.1) (de MPV mag niet meer dan 1,5 fL veranderen).
- Pas het aantal bloedplaatjes aan met de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, tot een concentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL. Laat de bloedplaatjes voor 30 minuten bij RT voor de experimenten herstellen. Gebruik gewassen bloedplaatjes voor experimenten binnen 4 uur na isolatie.
5. Samenstelling van de vloerkamer
12 . Een verscheidenheid van in de handel geproduceerde stroomkamers kunnen gebruikt worden, zolang ze een afdekglas kunnen bevatten, welke bij voorkeur verwijderbaar is voor verdere analyses. De stroomkamer die wordt gebruikt voor de beschreven experimenten is gemaakt van poly (methylmethacrylaat) om precies te passen bij een microscoop-invoegtrap. Het bevat een inlaat en uitlaat ( Figuur 1A - C ; 1, 2), evenals een vacuümverbinding ( Figuur 1A en C ; 3). Een op maat gemaakte siliconenplaat ( Figuur 1A en D ; 4) wordt bovenop geplaatst. Twee uitsnijdingen vormen vacuümkanalen ( Figuur 1A en D ; 5) om het afdekglas ( figuur 1A ; 6) stevig aan de kamer te bevestigen. Een centrale uitsnijding vormt het stroomkanaal ( Figuur 1A D ; 7; 2,0 mm breedte en 0,125 mm hoogte). De inlaat en de uitlaat zijn aangesloten op het stroomkanaal en het vacuüm is verbonden met het vacuümkanaal.
- Bedek de bovenkant van de stroomkamer met gedestilleerd water en plaats de aangepaste siliconenplaat met de gladde kant naar beneden op het water. Vloeien het vel in de positie door het overtollige water te verwijderen, terwijl het vel op zijn plaats blijft.
OPMERKING: Deze siliconenplaat is opnieuw bruikbaar (siliconen staat bekend om zijn inerte eigenschappen); Over het algemeen zijn bloedplaatjes niet waargenomen om eraan te hechten. De lakens kunnen met reinigingsmiddel worden gereinigd en opnieuw gebruikt worden totdat het materiaal beschadigd raakt ( dwz scheuren, vooral in het gebied tussen kanalen). Over het algemeen kan een vel 20 dagen worden gebruikt met meerdere experimenten per dag. - Incubeer de stromingskamer gedurende 1 uur bij 60 ° C om het restwater te verdampen om het siliconenplaat stevig vast te houden aan de stromingskamer.
- Met een plastic Pasteur pipette, voeg een druppel vanHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, op het stroomkanaal. Plaats het afdekglas (zie sectie 2) met de bedekte zijde naar beneden, op de stroomkanaal. Bevestig de vacuümpomp aan de vacuümaansluiting ( figuren 1A en C ; 3). Dien ~ 10 kPa druk toe.
6. Pre-kleuring van de bloedplaatjes en bereiding van de antilichamen
- Bloedplaatjes kleuring
- Incubeer de gewassen bloedplaatjes met 10 μg / ml DAPI gedurende 30 min bij 37 ° C in het donker. Om onbound DAPI te wassen en om bloedplaatjesactivering te voorkomen, voeg prostacyclin toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / mL en onmiddellijk centrifugeer gedurende 15 minuten bij 400 xg en RT zonder rem.
- Herstel de bloedplaatjespelletjes in de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, tot een bloedplaatjesconcentratie van 150.000 bloedplaatjes / μL.
- Bereiding van antilichamen
- Meng biotine-gemerkt antilichaam met Alexa-gelabelde strepTavidin bij een molverhouding van 1: 1. Incubeer gedurende minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik (stap 7.6).
OPMERKING: De efficiëntie van biotine-etiketten kan variëren tussen verschillende partijen. Mochten er problemen zijn met de visualisatie van doelmoleculen, zouden controle experimenten moeten worden uitgevoerd om succesvolle biotinylatie te bevestigen, evenals de doelbindende eigenschappen van het specifieke biotinyleerde antilichaam.
- Meng biotine-gemerkt antilichaam met Alexa-gelabelde strepTavidin bij een molverhouding van 1: 1. Incubeer gedurende minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik (stap 7.6).
7. Perfusie
- Start de fluorescentiemicroscoop, evenals de microscoopsoftware. Gebruik de microscoopinstellingen die in tabel 1 zijn vermeld .
OPMERKING: Start de microscoop- en opname-instellingen voor de live-cel visualisatie en opname van de bloedplaatjes en de gekozen fluorescent gelabelde antilichamen en / of kleurstoffen door een passend experiment in de microscoopsoftware te laden. Voer flow experimenten uit bij RT. - Blok de inlaatbuizen door een 10 ml spuit aan de buis te koppelen en 1% HSA bloeien te aspirerenBuffer in de inlaatbuizen. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Spoel de inlaatbuizen door HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, in de inlaatbuis te suggen.
- Verbind de geblokkeerde inlaatbuizen en de onbehandelde uitlaatpijp, beide met een diameter van 1,02 mm en een lengte van ~ 20-30 cm naar de inlaat en uitlaat van de kamer. Sluit een 10 ml spuit (of lager volume voor meer nauwkeurigheid) aan op de uitlaatpijp. Zet de spuitpomp aan.
OPMERKING: De diameter van de injectiespuit in combinatie met de door de pomp ingestelde stroomsnelheid bepaalt de volumetrische stromingssnelheid. Samen met het oppervlak van het stromingskanaal kan de schuifsnelheid berekend worden volgens de formule 13 hieronder. Het is dus mogelijk om de schuifsnelheid te manipuleren door de stromingssnelheid van de spuitpomp te veranderen of de afmetingen van het stromingskanaal te wijzigen. Een schuifsnelheid van 800-1,600 s -1 typisch modellen voor arteriële bloedstroom, terwijl 25-100 s-1 modellen voor veneuze bloedstroom. Voor deze opstelling resulteert een stromingssnelheid van 7,5 μl / min in een schuifsnelheid van 25 s -1 .
Schuifsnelheid = 6Q / h 2 w in s -1
Waarin: Q = volumetrische stroming (ml / s), h = hoogte kanaal (cm) (0,0125 cm, dit is de dikte van het siliconenblad), w = breedte kanaal (cm) (0,2 cm in deze kamer). - Leg een druppel onderdompelingsolie op een 100x objectief (totale versterking van 1.000X) en plaats de kamer op de microscoop met het glazen oppervlak naar beneden.
- Plaats de toevoerslang in een buis die de buffer van HEPES Tyrode bevat, pH 7,4. Haal de zuiger van de spuit die met de uitlaatpijp is aangesloten, handmatig door en trek de oplossing door de kamer om de lucht van het systeem te verwijderen. Plaats de spuit in de spuitpomp ( Figuur 1B en C ; 8) en draai de pomp kort om de plunjer vast te zetten en stabiliteit te waarborgen.
- Antilichamen en / of kleurstoffen toevoegen aan de bloedplaatjesuspensie of PRP zorgvuldigMeng met een plastic pipet en laat het mengsel overbrengen naar een 1,5 ml buis.
OPMERKING: Voor een typische perfusie van 30 minuten bij schuifsnelheid 25 s-1 (7,5 μl / min) is een minimum van 225 μl bloedplaatjesuspensie nodig. De antilichamen die gebruikt worden voor de representatieve resultaten worden getoond in Tabel 2 . - Verplaats de inlaatbuis, terwijl u uit de buffer van HEPES Tyrode, pH 7,4, drukt, naar een 1,5 ml buis die PRP of de gewassen bloedplaatjes en de antilichamen en / of kleurstoffen bevat ( Figuur 1B en C ; 9).
OPMERKING: Het is belangrijk dat bij het overbrengen van de buis de buis wordt geperst (druk uit de lucht) om te voorkomen dat lucht in de buis komt. Het is mogelijk om hechtende bloedplaatjes te behandelen met een verscheidenheid van reagentia in een volgende stap door de inlaatbuis op een andere buis op een soortgelijke wijze te verplaatsen. Een lijst van potentieel nuttige reagentia is verschaft in tabel 3 . - Selecteer de "live visualizatioN "optie in de software, focus de microscoop op het oppervlak van het gecoate dekselglas en start de pomp met een schuifsnelheid van 1.600 s-1 (484 μL / min) tot de bloedplaatjes de stroomkamer bereiken. Op dit moment, Verminder de afschuifsnelheid tot 25 s-1 door de instellingen van de spuitpomp te veranderen tot een stromingssnelheid van 7,5 μL / min.
- Controleer het oppervlak van de gecoate zijde van het afdekglas, wacht tot het eerste plaatje begint te kleven, focus de microscoop op dit plaatje en start met opname door het experiment in de software te starten. Zie tabel 1 voor de opname instellingen die hier worden gebruikt.
- Volg de live opname visueel. Stop na 30 minuten de spuitpomp.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de bloedplaatjes in de loop van het experiment in focus blijven. Typisch bevestigen 20-30 bloedplaatjes in het zichtveld bij een vergroting van 1000X; Dit is ongeveer 2.000-3.000 bloedplaatjes in het hele stroomkanaal. - Fixatie met behulp vanDe stroomkamer (optioneel).
- Wanneer de stroom is gestopt na het stoppen van de spuitpomp, moet u de inlaatleiding (luchtvrij) overbrengen naar de fixatieoplossing. Start de pomp opnieuw op en voer de fixatiebuffer door het kanaal gedurende tenminste 10 minuten bij dezelfde doorvoersnelheid als vermeld in stap 7.8.
- Verwijder de kamer uit de microscoop, reinig de onderdompelingsolie uit het glas, ontkoppel het vacuüm en verwijder het dekselglas zorgvuldig uit de kamer met een 18 G-naald.
OPMERKING: Voorkom dat het afdekglas het siliconenplaat breekt en beschadigt. - Plaats de afdekplaat (met de cellen naar boven gericht) in een 4-putjesplaat boven op een weefsel, vooraf bevochtigd met gedestilleerd water.
OPMERKING: dit voorkomt dat het afdekglas zich vasthoudt aan het putoppervlak en dat het drogen voorkomt. - Pipetteer 750 μL fixatieve oplossing bovenop het afdekglas en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Indien de monsters niet direct kunnen worden geanalyseerd,Bewaar ze in 0,5% PFA (verdund met HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4) bij 4 ° C om stabiele fixatie te waarborgen. Ga verder naar sectie 8 om het afdekglas te verwerken voor beeldvorming.
- Na gebruik, spoel de kamer, buizen en vel met gedestilleerd water en incubeer de nacht in een wasmiddeloplossing. Vóór het opnieuw gebruiken van de kamer en andere onderdelen, spoelen met gedestilleerd water.
- Bewaar de microscoop ruwe gegevensbestanden die alle metagegevens bevatten. Indien nodig, exporteer de films naar .MOV, h.264 gecomprimeerd of .AVI ongecomprimeerd. Sla afzonderlijke frames op als JPEG- of TIF-bestanden.
8. Voorbeeld Bereiding voor Confocal Fluorescentie Microscopie
- Breng de dekselglazen over naar nieuwe 4-putjesplaten en spoel 5 keer met 3 ml HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Voeg 3 ml / putje blokkerende buffer toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
- Verwijder de blokkerende buffer; Voeg 3 ml / putje van 0,15% glycine (M / V) in HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4; En incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
- Verwijder glycineoplossing en was 5 keer in 3 ml / putje blokkerende buffer. Optioneel voeg fluorofore-geconjugeerde antilichamen toe die verdund zijn in blokkerende buffer voor extra kleuring. Incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.
- Was 5 keer met blokkeerbuffer en 2 keer met gedestilleerd water. Droog het glas door overtollige vloeistof te verwijderen met een weefsel (vanaf de randen naar binnen), zonder de cellen aan te raken.
- Pipet 60 μL polyvinylalcoholoplossing op een microscoopschuif. Leg het dekselglas, met de cellen naar boven, op de druppel en laat de polyvinylalcohol tussen de twee oppervlakken verspreiden. Incubeer 's nachts bij RT in het donker.
- Analyseer de cellen door middel van confocale microscopie 14 .
- Sla de ruwe gegevensbestanden op van de opgenomen stapelgegevens die alle metagegevens bevatten. Indien nodig, verwerk de ruwe gegevensbestanden naar MOV, H.264 gecomprimeerde of .AVI gecomprimeerde bestanden. Sla aparte stapels op als JPEG- of TIF-bestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont afbeeldingen van de stroomkamer en experimentele opstelling; De positie en afmetingen van het siliciumplaat; En buizenverbindingen. Figuur 2 geeft details over de afmetingen van de stroomkamer. Figuur 3 en Film 1 tonen een tijdsreeks beelden van plaatjeshechting en verspreiden op geïmmobiliseerde VWF. CD63 is een transmembraneiwit dat in het membraan van intracellulaire dichte korrels van rustplaten 15 wordt ingebracht. De tijdafhankelijke mobilisatie op het plaatjeoppervlak wordt in groen weergegeven. Op soortgelijke wijze is P-selectine (Psel) een transmembraneiwit in het membraan van intracellulaire a-granules van rustende bloedplaatjes ingebracht. De tijdafhankelijke mobilisatie op het plaatjeoppervlak wordt in oranje weergegeven. Figuur 3B toont een representatief beeld in een hoek van 45 °, Verworven door confocale fluorescentiemicroscopie na een stromingsexperiment. Film 2 toont een kantelreeks van hetzelfde experiment. Merk op dat CD63 hoofdzakelijk in de centrale granulomere ligt, terwijl P-selectine over het hele cellichaam wordt verdeeld en op de randen geconcentreerd wordt. Figuur 4A en Film 3 tonen de tijdafhankelijke mobilisatie van CD63 op het plaatjeoppervlak (groen). In deze experimenten werden bloedplaatjes (die geen nucleair DNA hebben) vooraf geïncubeerd met DAPI (blauw), die polyfosfaat in dichte korrels 16 vlekt. Opmerkelijk, ondanks duidelijke tekenen van dichte granulevrijstelling (enkelcelanalyses worden getoond in Figuur 4B en Film 4 ), wordt polyfosfaat binnen of aan de buitenkant van deze bloedplaatjes bewaard. Figuur 5 en Film 5 tonen tijdafhankelijke mobilisatie (of werving) van VWF, een trombogene multImerisch eiwit 17 opgeslagen in a-granules, naar het bloedplaatjeoppervlak (groen). Net als polyfosfaat blijft VWF geassocieerd met het oppervlak van de geactiveerde bloedplaatjes.
Figuur 1: Flow Chamber en Experimentele Setup. ( A ) Afbeelding van de stroomkamerontwerp met een inlaat en uitlaat (1 en 2), een vacuümverbinding (3) waarop het siliconenplaat (4) is geplaatst. Twee buitenste uitsparingen (5) in het siliconenplaat vormen de vacuümkanalen om het afdekglas (6) te bevestigen. Een centrale uitsnijding (7) vormt het stroomkanaal ( B ) Afbeelding van de experimentele setup. Inlaat en uitlaat (1 en 2), spuitpomp (8), en monsterhouder (9). ( C ) Schematisch overzicht van de experimentele setup; De cijfers zijn identiek aan die in A en B. ( D ) Schematisch overzicht met de afmeting Van het op maat gesneden siliconen vel. ( E ) Algemeen schematisch overzicht van de poly (methylmethacrylaat) stromingskamer . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gedetailleerde blauwdruk van de stroomkamer. De stroomkamer bestaat uit een poly (methylmethacrylaat) blok (1) , een rechte polyoxymethyleeninzet voor de vacuüminlaat (2) en twee hoekige polyoxymethylene inserts voor de monsterinlaat en -uitlaat (3) . De hoekige polyoxymethyleeninzetten bevatten metalen capillaire buizen met een diameter van 1,07 mm. De rechte insert bevat een capillaire buis met een diameter van 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Spleetverdeling en Degranulatie van het bloedplaatje op Immobilized von Willebrand Factor. ( A ) Tijdafhankelijke mobilisatie van CD63 en P-selectine op het oppervlak van verspreidende en degranulerende bloedplaatjes. De witte schaalbalk (linksboven) geeft 10 μm aan. ( B ) Representatieve confocal fluorescentiemicroscopie beeld in een hoek van 45 °. De witte schaalbalk (linksonder) geeft 2 μm aan. Groen, CD63; Oranje, P-selectine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Figuur 4: Spleetplaatjes, Degranulatie en Mobiliteit van Dichte Granules op Geïmmobiliseerd Fibrinogeen. ( A ) Tijdafhankelijke mobilisatie van CD63 en polyfosfaat op het plaatjeoppervlak. De witte schaalbalk (linksboven) geeft 10 μm aan. ( B ) Tijdreeksen van een enkele bloedplaatje (t = 0 staat voor de eerste hechting op het oppervlak). De witte schaalbalk (rechtsonder) geeft 2 μm aan. Groen, CD63; Blauw, DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Oppervlaktevereniging van von Willebrand Factor op de bloedplaatjesoppervlak van geïmmobiliseerd Fibrinogeen. Tijdafhankelijke mobilisatie (of werving) van VWF naar het plaatjeoppervlak. TDe witte schaalbalk (linksboven) geeft 5 μm aan. Groen, VWF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| omgeving | Waarde |
| Blootstellingstijd FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensiteit FITC (Alexa488) | 50% |
| Blootstellingstijd DIC | 30 ms |
| Spannings halogeenlamp | 4,5 Volt |
| Blootstellingstijd TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 intensiteit FITC (Alexa546) | 50% |
| Blootstellingstijd DAPI | 500 ms |
| LED 365 intensiteit | 50% |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Doelstelling | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Olie |
| Frame snelheid, opnametijd | 1 frame / 10 s, 30 min |
| Bestandscompressiefilms | MOV (h.264), AVI (niet gecomprimeerd) |
| Bestandscompressie foto's | JPEG, TIF |
Tabel 1: Microscoop instellingen. Instellingen gebruikt voor de representatieve experimenten.
| Doel | Antilichaam / kleurstof | Concentratie |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotine *)325 ng / ml | |
| P-selectine | Anti-CD62P-biotine **) | 90 ng / ml |
| DNA | DAPI | 10 μg / ml |
| VWF | Anti-menselijk VWF-FITC | 5 μg / ml |
| *) Anti-CD63-biotine antilichaam wordt gemengd met streptavidine-Alexa488 in een molaire verhouding van 1: 1 voor gebruik | ||
| **) anti-CD62P-biotine antilichaam wordt gemengd met streptavidine-Alexa546 in een molaire verhouding van 1: 1 voor gebruik | ||
Tabel 2: Antilichamen en kleurstoffen. Aanbevolen antilichaam- en kleurstofconcentraties voor de weergegeven representatieve experimenten.
| Reagent categorie | Voorbeeldcompounds |
| Bloedplaatjesagonisten | Trombine, ADP, PAR-1 of -4-activerende peptiden, U46619, Thromboxane A2, ADP |
| Enzyme remmers | Hirudin, PPACK, heparinoïden (indirect), maïs trypsine remmer, sojaboon trypsine remmer |
| Receptor antagonisten | Anti-glyproteïne 1ba, anti-glycoproteïne VI; Clopidogrel, (cyclische) RGD-bevattende peptiden |
| Activeringsremmers | Aspirine voorbehandeling, fixatie |
Tabel 3: Potentieel bruikbare reagentia.
Aanvullende films: Film 1: Tijdreeks beelden van bloedplaatjes (zie Figuur 1 ), Film 2: Tiltreeks van Figuur 3B , Film 3: Tijdafhankelijke mobilisatie van CD63 op het bloedplaatjeOppervlak 4 (zie Figuur 4 ), Film 4: Tijdreeksen van eencelanalyses (zie Figuur 4B ), Film 5: Tijdafhankelijke mobilisatie van VWF (zie Figuur 5 ).
Klik hier om film 1 te downloaden.
Klik hier om film 2 te downloaden.
Klik hier om Movie 3 te downloaden.
Klik hier om film 4 te downloaden.
Klik hier om Movie 5 te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wereldwijd is trombose een belangrijke doodsoorzaak en morbiditeit, en bloedplaatjes spelen een centrale rol bij de ontwikkeling ervan. Dit werk beschrijft een methode voor de live-celafbeelding van bloedplaatjes degranulatie onder stroming. Over het algemeen wordt aangenomen dat wanneer de bloedplaatjes geactiveerd worden alle korrelvormige inhoud direct in oplossing worden gebracht. De bijbehorende resultaten suggereren dat dit niet noodzakelijkerwijs het geval is. Tijdens adhesie en degranulatie behouden bloedplaatjes een aanzienlijke hoeveelheid polyfosfaat ( Figuur 4 ). Daarnaast is het multimeer eiwit VWF geassocieerd met het bloedplaatje oppervlak na degranulatie ( Figuur 5 ). Dit wijst erop dat de moleculaire mechanismen die de degranulatie van bloedplaatjes granulaat regelen, subtieler zijn dan in het algemeen verondersteld wordt.
Om de livecellen beeldvorming van bloedplaatjes degranulatie onder stroom te zetten, werden de experimentele condities geselecteerd om de bloedplaatjesaggregatie tot een minimum te houden. BloedplaatjeTs van 150.000 bloedplaatjes / μL werden gebruikt. Dit ligt aan het onderkant van het normale bereik (150.000-450.000 bloedplaatjes / μL). Voorts werd de hechting en verspreiding van plaatjes bestudeerd op geïmmobiliseerd VWF of fibrinogeen, wat leidde tot milde plaatjesactivering (in tegenstelling tot bijvoorbeeld collageen). Bij studies met gewassen bloedplaatjes verplaatsen de verhoogde schuifgraad deze cellen naar het midden van de stroom. Dit interfereert met adhesie en latere verspreiding en compliceert het onderzoek naar degranulatie.
Bij fysiologische hemostase is bloedplaatjesmarginatie belangrijk. Dit proces wordt aangedreven door erythrocyten en verklaart waarom een lage bloedarmoede soms gepaard gaat met een bloeden diathese. Een beperking van de gepresenteerde techniek is dat de visualisatie van bloedplaatjes degranulatie (met de gepresenteerde materialen en reagentia) wordt verstoord door rode bloedcellen. De bloedplaatjesfunctie wordt beïnvloed door schuifspanning, die een functie is van de viscositeit van de vloeistof (μ), evenalsVan de schuifgraad. Daarom wordt aanbevolen om de bloedplaatjesfunctie in stromingsmodellen te bestuderen in oplossingen met vergelijkbare viscositeiten ( dwz gewassen bloedplaatjes, gereconstitueerd bloed, PRP of geheel bloed).
Er zijn verschillende praktische factoren om rekening mee te houden bij het uitvoeren van deze experimenten. Eerst worden fluorescentiesignalen sterk beïnvloed door het focusgebied. Als de microscoop niet in focus staat, is het signaal gemakkelijk vervagen of zelfs verloren. Voorafgaand aan de komst van bloedplaatjes in het stromingskanaal, is het het beste om zich op het kanaal zelf te concentreren (begin bij de rand van de siliconenplaat / stroomkanaalwand). Wanneer de bloedplaatjes beginnen te hechten, focus op dit adhesie evenement. Een tweede punt van bezorgdheid is het bleken van bepaalde fluorophoren ( bijvoorbeeld FITC). Herhaalde excitatie zal leiden tot verlies van signaal, waardoor het onderzoek wordt verstoord. Deze obstakels kunnen worden overwonnen door gebruik te maken van stabiele fluoroforen, waardoor de intensiteit van het opwindende LED-licht wordt verminderd, de expeditie wordt verkortOsure tijden, en / of het verlagen van de beeldsnelheid.
Het hier beschreven model is zeer nuttig voor het uitvoeren van een gedetailleerde studie van bloedplaatjesreacties op een grote verscheidenheid aan geïmmobiliseerde eiwitten en bij verschillende stromingssnelheden. Eventueel kan deze methode ook worden gebruikt om hun interactie met geactiveerde endotheelcellen 18 te bestuderen. De technische vooruitgang die de flexibele ontwerpen van de speciale stroomkamers toelaat, zijn momenteel openingswegen voor biocompatibiliteitsstudies 19 . De live-cel beeldvorming van bloedplaatjesreactiviteit onder stroming zal waardevolle inzichten onthullen over de complexiteit van de bloedplaatjeshechtingsrespons. Uiteindelijk moeten deze ervaringen leiden tot de ontwikkelingsexperimentele stromingsmodellen die het gecombineerde onderzoek van bloedplaatjesfunctie en invloed op het stollingssysteem mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
CM erkent financiële steun van de International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht en de Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
