Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Résumé

Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l'étude de l'adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l'écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l'étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l'hémostase.

Résumé

Les plaquettes de sang sont des acteurs essentiels de l'hémostase, la formation de thrombi pour sceller les brèches vasculaires. Ils sont également impliqués dans la thrombose, la formation de thrombus qui entouent le système vasculaire et blessent les organes, avec des conséquences potentiellement mortelles. Cela motive la recherche scientifique sur la fonction plaquettaire et le développement de méthodes pour suivre les processus biologiques cellulaires lorsqu'ils se produisent dans des conditions d'écoulement.

Une variété de modèles d'écoulement sont disponibles pour l'étude de l'adhésion et de l'agrégation des plaquettes, deux phénomènes clés de la biologie des plaquettes. Ce travail décrit une méthode pour étudier la dégranulation des plaques en temps réel sous l'écoulement pendant l'activation. La méthode utilise une chambre d'écoulement couplée à une installation de pompe à seringue qui est placée sous un microscope à fluorescence à large spectre à base de LED. La configuration décrite ici permet l'excitation simultanée de multiples fluorophores qui sont délivrés par des anticorps marqués par fluorescence ou fluorescDes colorants. Après les expériences d'imagerie des cellules vivantes, les lunettes de couverture peuvent être traitées et analysées à l'aide d'une microscopie statique (microscopie confocale ou microscopie électronique à balayage).

Introduction

Les plaquettes sont des cellules anucléaires qui circulent dans la circulation sanguine. Leur principale fonction est de sceller les brèches vasculaires sur les sites de blessures et de prévenir la perte de sang. Chez ces sites de blessure, les fibres de collagène sous-endothéliales sont exposées et sont ensuite couvertes par la protéine multimérique, le facteur von Willebrand (VWF). Le VWF interagit avec les plaquettes en circulation dans un mécanisme qui dépend du complexe glycoprotéine Ibα-IX-V sur la surface cellulaire ¹ , ralentissant la vitesse des plaquettes. Ceci est particulièrement important à des taux de cisaillement élevés. Les pla....

Protocole

Le Comité d'éthique médicale local du Centre médical universitaire Utrecht a approuvé le prélèvement de sang à des fins de recherche ex vivo , y compris ceux de cette étude.

1. Préparation de la solution

1. Préparer un tampon de Tyrode d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazine éthanesulfonique (HEPES) en dissolvant de l'HEPES 10 mM, du Na2HPO4 0,5 mM, du NaCl 145 mM, du KCl 5 mM, du MgS04 1 mM et du D- Glucose dans de l'eau distillée.
   1. Faire deux variantes du tampon: régler les niveaux de pH à 6,5 et à 7,4, respectivement. Faire un nouveau tampon pour chaque jour d'expériences.....

Résultats

La figure 1 montre les images de la chambre d'écoulement et la configuration expérimentale; La position et les dimensions de la feuille de silicium; Et les connexions de tubes. La figure 2 fournit des détails sur les dimensions de la chambre d'écoulement. La figure 3 et le film 1 montrent une série temporelle d'images d'adhésion et d'étalement des plaquettes sur .......

Discussion

Dans le monde entier, la thrombose est la principale cause de décès et de morbidité, et les plaquettes jouent un rôle central dans son développement. Ce travail décrit une méthode pour l'imagerie des cellules vivantes de la dégranulation des plaquettes sous l'écoulement. On suppose généralement que, lorsque les plaquettes deviennent activées, tout le contenu granulaire est directement rejeté dans la solution. Les résultats qui l'accompagnent suggèrent que ce n'est pas nécessairement le cas. Pendant l'.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)  ;	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1.05886
D-glucose	Merck KGaA	1.04074
Prostacycline  ;	Cayman Chemical	18220
Citrate tri-sodique	Merck KGaA	1.06448
Acide citrique  ;	Merck KGaA	1.00244
Lunettes de protection	Menzel-Glä ; ser	BBAD02400500#A	24 x 50 mm, n° 1 = 0,13 - 0,16 mm d’épaisseur.
Acide chromosulfurique (2 % CrO3)	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0].
Facteur de von Willebrand (VWF)	Laboratoires de recherche sur
		en interne FIB3L
Plat à 4 puits, non traité	Thermo Scientific	267061
Albumine sérique humaine Fraction V	Haem Technologies Inc.
Tubes de prélèvement sanguin, 9 mL, 9NC Citrate de sodium de coagulation 3,2 %	de cellules 455322		Greiner Bio-One
;	Abbott Diagnostics	CELL-DYN analyseur
Paraformaldéhyde	Sigma	30525-89-4  ;
Pompe à seringue	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
Seringue de 10 mL avec 14,5 mm de diamètre	BD biosciences	305959	Seringue Luer-Lok
Anti-CD63-biotine  ;	Abcam  ;
Anti-CD62P-biotine  ;	R& D Systems	Dy137
4',6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole (DAPI)	Polysciences Inc.  ;	9224
Streptavidine, Alexa Fluor 488 conjugué	Thermo Scientific	S11223  ;
Huile d’immersion	Zeiss	444963-0000-000
Solution détergente	Unilever, Biotex
Glycine	Sigma	56-40-6  ;
Alcool polyvinylique	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88.
Chlorhydrate de Tris	Sigma	1185-53-1  ;
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	Sigma	280-57-9
Mouton Anti-hVWF pAb	Abcam  ;	AB9378
Alexa fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
Glycérol	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Film Parafinn	Bemis	PM-996	Rouleau de 4 po x 125 pi.
Feuille de silicone non renforcée	Nagor	NA 500-1	200 mm x 150 mm x 0,125 mm.
Feuille de silicone découpée sur mesure avec canaux de perfusion et de vide	fabriquée		Fabriqué en feuille de silicone non renforcée (Nagor, NA 500-1)
Tubes de 1,5 mL	Eppendorf AG	T9661-1000AE
Microscope fluorescent	Zeiss Observer Z1  ;		Equipé de lumières d’excitation LED.
Logiciel de microscope	Zeiss ZEN 2	blue edition
18 G aiguille (18 G x 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
Pipette pasteur en plastique	VWR	612-1681	; 7 mL non stérile, gradué jusqu’à 3 mL.
Tube en silicone	VWR	228-0656	Diamètre intérieur. x Diamètre extérieur x Épaisseur de la paroi = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.
Lames de microscope	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 x 26 x 1 mm, bords rectifiés 45 ° ;, extrémité givrée.

l’enzyme de fibrinogène purifié 823022Analyseur d’hématologieAB134331 en interne