Summary
Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l'étude de l'adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l'écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l'étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l'hémostase.
Abstract
Les plaquettes de sang sont des acteurs essentiels de l'hémostase, la formation de thrombi pour sceller les brèches vasculaires. Ils sont également impliqués dans la thrombose, la formation de thrombus qui entouent le système vasculaire et blessent les organes, avec des conséquences potentiellement mortelles. Cela motive la recherche scientifique sur la fonction plaquettaire et le développement de méthodes pour suivre les processus biologiques cellulaires lorsqu'ils se produisent dans des conditions d'écoulement.
Une variété de modèles d'écoulement sont disponibles pour l'étude de l'adhésion et de l'agrégation des plaquettes, deux phénomènes clés de la biologie des plaquettes. Ce travail décrit une méthode pour étudier la dégranulation des plaques en temps réel sous l'écoulement pendant l'activation. La méthode utilise une chambre d'écoulement couplée à une installation de pompe à seringue qui est placée sous un microscope à fluorescence à large spectre à base de LED. La configuration décrite ici permet l'excitation simultanée de multiples fluorophores qui sont délivrés par des anticorps marqués par fluorescence ou fluorescDes colorants. Après les expériences d'imagerie des cellules vivantes, les lunettes de couverture peuvent être traitées et analysées à l'aide d'une microscopie statique (microscopie confocale ou microscopie électronique à balayage).
Introduction
Les plaquettes sont des cellules anucléaires qui circulent dans la circulation sanguine. Leur principale fonction est de sceller les brèches vasculaires sur les sites de blessures et de prévenir la perte de sang. Chez ces sites de blessure, les fibres de collagène sous-endothéliales sont exposées et sont ensuite couvertes par la protéine multimérique, le facteur von Willebrand (VWF). Le VWF interagit avec les plaquettes en circulation dans un mécanisme qui dépend du complexe glycoprotéine Ibα-IX-V sur la surface cellulaire 1 , ralentissant la vitesse des plaquettes. Ceci est particulièrement important à des taux de cisaillement élevés. Les plaquettes subissent ensuite des changements morphologiques tout en recevant des impulsions d'activation du collagène. Cela conduit à une propagation irréversible et éventuellement à l'agrégation plaquettaire. Les deux processus dépendent de la sécrétion du contenu en granulés pour faciliter la diaphonie plaquettaire-plaquettaire. Entre autres, les granulés α plaquettaires contiennent du fibrinogène et du VWF pour faciliter l'adhérence plaquettaire et le pontLes plaquettes ensemble d'une manière dépendante de l'intégrine. Les granules plaquettes et denses contiennent des composés inorganiques 2 , y compris le diphosphate de calcium et d'adénosine (ADP), qui contribuent à renforcer l'activation des plaquettes. En outre, les plaquettes contiennent des médiateurs de l'inflammation (allergique) 3 , des protéines 4 du contrôle du complément et des facteurs 5 , 6 de l' angiogenèse, ce qui soulève la question de savoir si ces contenus sont diffusés différemment dans des conditions variables.
Depuis les années 1980, l'étude de la fonction plaquettaire dans les modèles de flux a été précieuse pour l'étude des mécanismes thrombotiques 7 . Depuis lors, de nombreux progrès techniques ont été réalisés, et les modèles de flux qui incluent la formation de fibrine sont actuellement développés pour évaluer le potentiel hémostatique des concentrés thérapeutiques plaquettaires ex vivo 8 ou àÉtudier l'influence des perturbations dans les taux de cisaillement sur la morphologie du thrombus 9 . Les différences dans les mécanismes moléculaires et biologiques cellulaires qui favorisent une adhérence stable et une formation de thrombus physiologique (hémostase) par rapport à la formation de thrombus pathologique (thrombose) peuvent être très subtiles et motiver le développement de modèles d'écoulement permettant la visualisation en temps réel de ces sous-cellulaires Processus.
Un exemple d'un processus pour lequel une telle configuration serait précieuse est la (re) distribution du polyphosphate intracellulaire et le recrutement de facteurs de coagulation pour découvrir l'impact dépendant du temps que cela a sur l'ultrastructure de la fibrine 10 . Les études sont souvent limitées aux analyses finales. L'objectif principal de la méthode décrite est de permettre l'étude visuelle en temps réel des processus subcellulaires dynamiques qui se déroulent lors de l'activation plaquettaire sous flux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le Comité d'éthique médicale local du Centre médical universitaire Utrecht a approuvé le prélèvement de sang à des fins de recherche ex vivo , y compris ceux de cette étude.
1. Préparation de la solution
- Préparer un tampon de Tyrode d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazine éthanesulfonique (HEPES) en dissolvant de l'HEPES 10 mM, du Na2HPO4 0,5 mM, du NaCl 145 mM, du KCl 5 mM, du MgS04 1 mM et du D- Glucose dans de l'eau distillée.
- Faire deux variantes du tampon: régler les niveaux de pH à 6,5 et à 7,4, respectivement. Faire un nouveau tampon pour chaque jour d'expériences. Complément avec 10 ng / mL de prostacycline, le cas échéant.
- Préparer une solution saline tampon TRIS (TBS) en dissolvant 50 mM de Tris et 150 mM de NaCl dans de l'eau distillée et ajuster le pH à 9,0.
- Préparer le citrate de dextrose acide (ACD) en dissolvant 85 mM de citrate de tri-sodium, 71 mM d'acide citrique et 111 mM de D-glucose en disEau distillée.
- Préparez une solution fixative en ajoutant 2% (v / v) de paraformaldéhyde (PFA) au tampon HEPES Tyrode, pH 7,4. Chauffer à dissoudre (50 - 70 ° C) et régler le pH à 7,4. Aliquote et entreposez à -20 ° C. Décongeler à 37 ° C avant utilisation.
- Préparer le tampon de blocage en dissolvant 1% (m / v) d'albumine humaine de sérum (HSA) dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4
- Faire une solution d'alcool polyvinylique en ajoutant 4,8 g d'alcool polyvinylique à 12 g de glycerol et bien mélanger. Ajouter 12 ml d'eau distillée et la laisser sur un rotateur à température ambiante pendant la nuit.
- Ajouter 24 ml de Tris-HCL 0,2 M, pH 8,5. Chauffer à 50 ° C tout en mélangeant pendant 30 min. Ajouter 1,25 g de 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) et bien mélanger. Centrifuger à 1.500 xg pendant 5 min. Aliquoter le surnageant (1 mL est suffisant pour les diapositives 15-20) et stocker à -20 ° C. Utilisez les aliquotes une fois.
2. Préparation du verre de couverture
- Dégraisser le couvercleLunettes (25 x 50 mm 2 ) en incubant pendant une nuit dans de l'acide chromosulfurique non dilué. Rincer les verres de couverture avec de l'eau distillée et les sécher pendant une nuit à 60 ° C dans un four.
- Adhérer une bande de film de paraffine (10 x 15 cm 2 ) sur un banc de laboratoire avec une goutte d'eau et retirer l'air en lissant le film de paraffine. Pipetter 80 μL de 10 μg / mL de VWF ou 100 μg / mL de fibrinogène sur le film de paraffine. Placez les lunettes sur les gouttes; La solution de protéines se répandra entre les deux surfaces pour recouvrir tout le côté arrière du verre. Incuber pendant 1,5 h à température ambiante (RT).
- Retirez le film de paraffine et bloquez les lunettes de recouvrement en les plaçant, avec le côté revêtu vers le haut dans une plaque à 4 puits avec un tampon de blocage. Incuber pendant 1 h à 37 ° C ou pendant une nuit à 4 ° C. En tant que témoin, bloquer un verre de couverture qui n'a pas été revêtu de VWF ou de fibrinogène.
3. Préparation du plasma à forte teneur en plaquettes (PRP)
REMARQUE: après centrifugation, trois couches peuvent être observées (de haut en bas): PRP, globules blancs et globules rouges. Assurez-vous de ne pas inclure les cellules blanches et rouges. Typiquement, 3 mL de PRP peuvent être collectés après centrifugation d'un tube sanguin de 9 ml.
NOTE: Typiquement, 2 mL peuvent être collectés après cette deuxième étape de centrifugation.
NOTE: Le volume total de PRP dilué dépend du nombre de plaquettes du donneur. Le nombre de plaquettes varie considérablement d'un donneur à l'autre et la dilution du PRP nécessite une évaluation individuelle. Les dénombrements de plaquettes sont considérés comme normaux dans les 150 000 et 450 000 plaquettes / μL.
4. Préparation des plaquettes lavées
- Déterminer le volume moyen de plaquettes (MPV) dans le PRP en utilisant un analyseur de cellule.
REMARQUE: il s'agit d'un indicateur de pré-activation plaquettaire 11 . Un MPV normal pour le repos des plaquettes est de 7,5-11,5 fL 11 . Le MPV ne devrait pas augmenter de plus de 1,5 fL pendant la procédure de lavage des plaquettes. - Ajouter un volume de 1/10 d'ACD à PRP pour éviter la pré-activation des plaquettes et centrifuger pendant 15 min à 400 xg et RT sans frein. Supprimer le suPernatant et ré-suspendre le culot soigneusement dans le tampon HEPES Tyrode, pH 6,5, au volume original de PRP.
- Décongeler une aliquote de prostacycline en ajoutant du TBS à une concentration de 10 μg / mL; Gardez-le sur la glace.
- Pour prévenir l'activation des plaquettes, ajouter la prostacycline à une concentration finale de 10 ng / mL aux plaquettes ré-suspendues et centrifuger immédiatement pendant 15 minutes à 400 xg et RT sans frein. Retirer le surnageant et ré-suspendre le culot soigneusement dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4.
- Compter le nombre de plaquettes (étape 3.5) et déterminer le changement de MPV (étape 4.1) (le MPV ne doit pas dépasser 1,5 fL).
- Réglez le nombre de plaquettes avec le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4, à une concentration de 150 000 plaquettes / μL. Laisser les plaquettes récupérer pendant 30 minutes à la RT avant les expériences. Utilisez des plaquettes lavées pour des expériences dans les 4 h après l'isolement.
5. Assemblage de la chambre de débit
12 . Une variété de chambres d'écoulement commercialement produites peuvent être utilisées, pourvu qu'elles puissent contenir un verre de couverture, qui est préférentiellement amovible pour des analyses ultérieures. La chambre d'écoulement utilisée pour les expériences décrites est fabriquée à partir de poly (méthacrylate de méthyle) pour s'adapter précisément à un stade d'insertion de microscope. Il contient une entrée et une sortie ( Figure 1A - C ; 1, 2), ainsi qu'une connexion sous vide ( Figure 1A et C ; 3). Une feuille de silicone personnalisée ( Figure 1A et D ; 4) est placée sur le dessus. Deux découpes forment des canaux sous vide ( Figure 1A et D ; 5) pour attacher le verre de recouvrement ( Figure 1A ; 6) à la chambre. Une découpe centrale forme le canal d'écoulement ( figure 1A D ; 7; 2,0 mm de largeur et 0,125 mm de hauteur). L'entrée et la sortie sont connectées au canal d'écoulement, et le vide est connecté au canal sous vide.
- Couvrir le haut de la chambre d'écoulement avec de l'eau distillée et placer la feuille de silicone personnalisée avec le côté lisse vers le bas sur l'eau. Flottez la feuille en position en enlevant l'excès d'eau tout en conservant la feuille en position.
REMARQUE: Cette feuille de silicone est réutilisable (la silicone est connue pour ses propriétés inertes); En général, les plaquettes n'ont pas été observées pour s'y attacher. Les feuilles peuvent être nettoyées avec du détergent et réutilisées jusqu'à ce que le matériau soit endommagé ( c.-à-d. Déchirure, en particulier dans la zone entre les canaux). Généralement, une feuille peut être utilisée pendant 20 jours avec plusieurs expériences par jour. - Incuber la chambre d'écoulement pendant 1 h à 60 ° C pour évaporer l'eau résiduelle pour adhérer fermement la feuille de silicone à la chambre d'écoulement.
- Avec une pipette Pasteur en plastique, ajoutez une goutte deLe tampon de HEPES Tyrode, pH 7,4, sur le canal d'écoulement. Placez le verre de recouvrement (voir la section 2) avec le côté recouvert vers le bas, sur le canal d'écoulement. Fixez la pompe à vide à la connexion sous vide ( figures 1A et C ; 3). Appliquer une pression de ~ 10 kPa.
6. Pré-coloration des plaquettes et préparation des anticorps
- Coloration des plaquettes
- Incuber les plaquettes lavées avec 10 μg / mL de DAPI pendant 30 minutes à 37 ° C dans l'obscurité. Pour éliminer la DAPI non liée et prévenir l'activation des plaquettes, ajouter une prostacycline à une concentration finale de 10 ng / mL et centrifuger immédiatement pendant 15 minutes à 400 xg et RT sans frein.
- Reconstituer la pastille de plaquettes dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4, à une concentration plaquettaire de 150 000 plaquettes / μL.
- Préparation des anticorps
- Mélanger l'anticorps marqué par la biotine avec une streptococtique AlexaTavidine au rapport molaire de 1: 1. Incuber pendant au moins 10 min à température ambiante avant utilisation (étape 7.6).
REMARQUE: l'efficacité de l'étiquetage de la biotine peut varier entre les différents lots. Devrait-il y avoir des problèmes avec la visualisation des molécules cibles, des expériences de contrôle devraient être effectuées pour confirmer la biotinylation réussie, ainsi que les propriétés liées à la cible de l'anticorps biotinylé spécifique.
- Mélanger l'anticorps marqué par la biotine avec une streptococtique AlexaTavidine au rapport molaire de 1: 1. Incuber pendant au moins 10 min à température ambiante avant utilisation (étape 7.6).
7. Perfusion
- Commencez le microscope à fluorescence, ainsi que le logiciel de microscope. Utilisez les paramètres du microscope indiqués dans le tableau 1 .
REMARQUE: Initier le microscope et les paramètres d'enregistrement pour la visualisation et l'enregistrement des plaquettes et les anticorps et / ou colorants marqués par fluorescence choisis en utilisant une expérience appropriée dans le logiciel du microscope. Effectuer des expériences de flux à la RT. - Bloquez le tube d'entrée en connectant une seringue de 10 ml au tube et en aspirant 1% de HSA bloDans le tube d'entrée. Incuber pendant 15 min à la RT. Rincer le tube d'entrée en aspirant le tampon de HEPES Tyrode, pH 7,4, dans le tube d'entrée.
- Raccorder le tube d'entrée bloqué et le tube de sortie non traité, tous deux avec un diamètre de 1,02 mm et une longueur de ~ 20-30 cm à l'entrée et à la sortie de la chambre. Connectez une seringue de 10 ml (ou un volume inférieur pour plus de précision) au tube de sortie. Allumez la pompe à seringue.
REMARQUE: le diamètre de la seringue, combiné au débit fixé sur la pompe, détermine le débit volumétrique. Ensemble avec la surface du canal d'écoulement, la vitesse de cisaillement peut être calculée selon la formule 13 au dessous de. Par conséquent, il est possible de manipuler le taux de cisaillement en modifiant le débit de la pompe à seringue ou en modifiant les dimensions du canal d'écoulement. Un taux de cisaillement de 800-1 600 s -1 typiquement des modèles pour le débit sanguin artériel, tandis que 25 à 100 modèles s-1 pour le sang veineuxcouler. Pour cette configuration, un débit de 7,5 μL / min donne un taux de cisaillement de 25 s -1 .
Taux de cisaillement = 6Q / h 2 w en s -1
Où: Q = débit volumétrique (mL / s), h = hauteur de canal (cm) (0,0125 cm, c'est l'épaisseur de la feuille de silicone), w = largeur de canal (cm) (0,2 cm dans cette chambre). - Placez une goutte d'huile d'immersion sur un objectif 100X (amplification totale de 1000X) et montez la chambre sur le microscope avec la surface du verre vers le bas.
- Placez le tube d'entrée dans un tube contenant du tampon HEPES Tyrode, pH 7,4. Retirer manuellement le piston de la seringue relié au tube de sortie et tirer la solution à travers la chambre pour enlever l'air du système. Placez la seringue dans la pompe de la seringue ( Figure 1B et C ; 8) et faites fonctionner la pompe brièvement pour serrer le piston et assurer un écoulement stable.
- Ajouter des anticorps et / ou des colorants à la suspension plaquettaire ou au PRP, soigneusementMélanger avec une pipette en plastique et transférer le mélange dans un tube de 1,5 ml.
REMARQUE: Pour une perfusion typique de 30 minutes à une vitesse de cisaillement de 25 s-1 (7,5 μL / min), un minimum de 225 μL de suspension de plaquettes est nécessaire. Les anticorps utilisés pour les résultats représentatifs sont présentés dans le tableau 2 . - Déplacez le tube d'entrée, en pressant, à partir du tampon HEPES Tyrode, pH 7,4, jusqu'à un tube de 1,5 ml contenant du PRP ou des plaquettes lavées et des anticorps et / ou des colorants ( Figure 1B et C ; 9).
REMARQUE: Il est important que, lors du transfert du tube, le tube soit comprimé (presser l'air) pour empêcher l'air d'entrer dans le tube. Il est possible de traiter les plaquettes adhérentes avec une variété de réactifs dans une étape ultérieure en déplaçant le tube d'entrée vers un autre tube d'une manière similaire. Une liste des réactifs potentiellement utiles est fournie dans le tableau 3 . - Sélectionnez la "visualisation en direct"N "dans le logiciel, concentrez le microscope sur la surface du verre de couverture revêtu et démarrez la pompe à une vitesse de cisaillement de 1.600 s-1 (484 μL / min) jusqu'à ce que les plaquettes atteignent la chambre d'écoulement. En ce moment, Réduisez le taux de cisaillement à 25 s-1 en changeant les réglages de la pompe à seringue à un débit de 7,5 μL / min.
- Surveillez la surface du côté recouvert du verre de recouvrement, attendez que la première plaquette commence à adhérer, concentre le microscope sur cette plaquette et commencez à enregistrer en déclenchant l'expérience dans le logiciel. Voir le tableau 1 pour les paramètres d'enregistrement utilisés ici.
- Suivez l'enregistrement en direct visuellement. Après 30 minutes, arrêtez la pompe à seringue.
REMARQUE: Assurez-vous que les plaquettes restent concentrées au cours de l'expérience. Typiquement, 20-30 plaquettes s'attachent dans le champ de vision à un grossissement de 1000X; Il s'agit de 2 000 à 3 000 plaquettes dans l'ensemble du canal d'écoulement. - Fixation en utilisantLa chambre d'écoulement (facultatif).
- Lorsque le débit s'est arrêté après l'arrêt de la pompe de la seringue, transférez le tube d'entrée (sans air) à la solution fixative. Redémarrez la pompe et faites circuler le tampon de fixation dans le canal pendant au moins 10 min au même débit que celui mentionné à l'étape 7.8.
- Retirez la chambre du microscope, nettoyez l'huile d'immersion du verre, débranchez le vide et retirez soigneusement le verre de couverture de la chambre avec une aiguille 18 G.
REMARQUE: Empêcher le verre de couverture de se casser et d'endommager la feuille de silicium. - Placez la glissière de recouvrement (avec les cellules dirigées vers le haut) dans une plaque de 4 puits sur un tissu, préalablement mouillé avec de l'eau distillée.
REMARQUE: ceci empêche le verre de couverture d'adhérer à la surface du puits et empêche le séchage. - Pipetter 750 μL de solution fixante sur le dessus du verre de couverture et incuber pendant 1 h à température ambiante. Dans le cas où les échantillons ne peuvent pas être analysés directement,Les stocker dans 0,5% de PFA (dilué par le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4) à 4 ° C pour assurer une fixation stable. Passez à la section 8 pour traiter le verre de couverture pour l'imagerie.
- Après utilisation, rincer la chambre, le tube et la feuille avec de l'eau distillée et incuber pendant une nuit dans une solution détergente. Avant la réutilisation de la chambre et d'autres composants, rincer à l'eau distillée.
- Enregistrez les fichiers de données brutes du microscope contenant toutes les métadonnées. Au besoin, exportez les films vers .MOV, h.264 compressé ou .AVI non compressé. Enregistrez les images séparées sous forme de fichiers JPEG ou TIF.
8. Préparation d'échantillons pour la microscopie confocale à fluorescence
- Transférez les lunettes de couverture vers de nouvelles plaques à 4 puits et rincez 5 fois avec 3 ml de tampon HEPES Tyrode, pH 7,4. Ajouter 3 ml / puits de tampon bloquant et incuber pendant 1 h à la température ambiante.
- Supprimer le tampon de blocage; Ajouter 3 ml / puits de 0,15% de glycine (M / V) dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4; Et incuber pendant 15 min à RT.
- Enlever la solution de glycine et laver 5 fois dans 3 ml / puits de tampon de blocage. Eventuellement, ajouter des anticorps conjugués au fluorophore dilués dans un tampon de blocage pour une coloration supplémentaire. Incuber pendant 1 h à la température ambiante dans l'obscurité.
- Laver 5 fois avec un tampon de blocage et 2 fois avec de l'eau distillée. Séchez le verre en enlevant l'excès de liquide avec un tissu (des bords vers l'intérieur), sans toucher les cellules.
- Pipeter 60 μL de solution d'alcool polyvinylique sur une lame de microscope. Placez le verre de couverture, avec les cellules vers le bas, en haut de la goutte et laissez l'alcool polyvinylique se propager entre les deux surfaces. Incuber toute la nuit à TA dans l'obscurité.
- Analyser les cellules par microscopie confocale 14 .
- Enregistrez les fichiers de données brutes des données de pile enregistrées contenant toutes les métadonnées. Au besoin, traiter les fichiers de données brutes dans des fichiers MOV, h.264 compressés ou .AVI non compressés. Enregistrez les piles séparées sous forme de fichiers JPEG ou TIF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 montre les images de la chambre d'écoulement et la configuration expérimentale; La position et les dimensions de la feuille de silicium; Et les connexions de tubes. La figure 2 fournit des détails sur les dimensions de la chambre d'écoulement. La figure 3 et le film 1 montrent une série temporelle d'images d'adhésion et d'étalement des plaquettes sur le VWF immobilisé. CD63 est une protéine transmembranaire qui est insérée dans la membrane des granules denses intracellulaires des plaquettes de repos 15 . Sa mobilisation temporelle sur la surface des plaquettes est indiquée en vert. De même, la P-sélectine (Psel) est une protéine transmembranaire insérée dans la membrane des granulés α intracellulaires des plaquettes reposantes. Sa mobilisation dépendant du temps sur la surface des plaquettes est indiquée en orange. La figure 3B montre une image représentative à un angle de 45 °, Acquis par microscopie de fluorescence confocale après une expérience d'écoulement. Le film 2 montre une série d'inclinaison de la même expérience. Notez que CD63 est principalement situé au granulomère central, tandis que la P-sélectine est répartie sur tout le corps de la cellule et apparaît concentrée sur les bords. La figure 4A et le film 3 montrent la mobilisation en fonction du temps de CD63 sur la surface plaquettaire (verte). Dans ces expériences, les plaquettes (qui n'ont pas d'ADN nucléaire) ont été pré-incubées avec DAPI (bleu), qui tache le polyphosphate dans des granules denses 16 . Remarquablement, en dépit des signes clairs de la libération de granules denses (les analyses à une seule cellule sont illustrées à la figure 4B et au film 4 ), le polyphosphate est conservé à l'intérieur ou à l'extérieur de ces plaquettes. La figure 5 et le cinéma 5 montrent une mobilisation (ou un recrutement) dépendante du temps de VWF, un multiple thrombogèneProtéine imérique 17 stockée dans des granules α, à la surface plaquettaire (verte). Comme le polyphosphate, VWF reste associé à la surface des plaquettes activées.
Figure 1: chambre de débit et configuration expérimentale. ( A ) Image de la conception de la chambre d'écoulement avec une entrée et une sortie (1 et 2), une connexion sous vide (3) sur laquelle est placée la feuille de silicone (4). Deux découpes extérieures (5) dans la feuille de silicium forment les canaux sous vide pour fixer le verre de couverture (6). Une découpe centrale (7) forme le canal d'écoulement ( B ) Image de la configuration expérimentale. Entrée et sortie (1 et 2), pompe à seringue (8) et porte-échantillon (9). ( C ) Aperçu schématique de l'installation expérimentale; Les nombres sont identiques à ceux de A et B. ( D ) Aperçu schématique avec la dimension De la feuille de silicone découpée personnalisée. ( E ) Vue d'ensemble schématique générale de la chambre d'écoulement de poly (méthacrylate de méthyle) . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Plan détaillé de la chambre de débit. La chambre d'écoulement se compose d'un bloc de poly (méthacrylate de méthyle) (1) , d'un insert polyoxyméthylène droit pour l'entrée sous vide (2) et de deux inserts en polyoxyméthylène coudés pour l'entrée et la sortie de l'échantillon (3) . Les inserts en polyoxyméthylène inclinés contiennent des tubes capillaires en métal, avec des diamètres de 1,07 mm. L'insert droit contient un tube capillaire d'un diamètre de 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Étalement des plaquettes et dégranulation sur le facteur de von Willebrand immobilisé. ( A ) Mobilisation dépendante du temps de CD63 et de P-sélectine sur la surface de la propagation et de la dégradation des plaquettes. La barre d'échelle blanche (en haut à gauche) indique 10 μm. ( B ) Image de microscopie de fluorescence confocale représentative à angle de 45 °. La barre d'échelle blanche (en bas à gauche) indique 2 μm. Vert, CD63; Orange, P-selectin. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Figure 4: Étalement des plaquettes, dégranulation et mobilité des granules denses sur le fibrinogène immobilisé. ( A ) Mobilisation dépendant du temps du CD63 et du polyphosphate sur la surface des plaquettes. La barre d'échelle blanche (en haut à gauche) indique 10 μm. ( B ) Série chronologique d'une seule plaquette (t = 0 représente la première adhérence sur la surface). La barre d'échelle blanche (en bas à droite) indique 2 μm. Vert, CD63; Bleu, DAPI. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Association de surface du facteur von Willebrand sur la surface plaquettaire du fibrinogène immobilisé. Mobilisation (ou recrutement) du VWF dépendant du temps à la surface des plaquettes. TLa barre d'échelle blanche (en haut à gauche) indique 5 μm. Vert, VWF. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Réglage | Valeur |
| Temps d'exposition FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensité FITC (Alexa488) | 50% |
| Temps d'exposition DIC | 30 ms |
| Lampe halogène de tension | 4,5 volts |
| Temps d'exposition TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 intensité FITC (Alexa546) | 50% |
| Temps d'exposition DAPI | 500 ms |
| Intensité LED 365 | 50% |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Objectif | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Huile |
| Taux d'images, temps d'enregistrement | 1 cadre / 10 s, 30 min |
| Films de compression de fichiers | MOV (h.264), AVI (non compressé) |
| Photos de compression de fichier | JPEG, TIF |
Tableau 1: Paramètres du microscope. Paramètres utilisés pour les expériences représentatives.
| Cible | Anticorps / Dye | Concentration |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotine *)325 ng / mL | |
| P-sélectine | Anti-CD62P-biotine **) | 90 ng / mL |
| L'ADN | DAPI | 10 μg / mL |
| VWF | VWF-FITC anti-humain | 5 μg / mL |
| *) L'anticorps anti-CD63-biotine est mélangé avec la streptavidine-Alexa488 dans un rapport molaire de 1: 1 avant utilisation | ||
| **) l'anticorps anti-CD62P-biotine est mélangé avec la streptavidine-Alexa546 dans un rapport molaire de 1: 1 avant utilisation | ||
Tableau 2: Anticorps et colorants. Des anticorps recommandés et des concentrations de colorants pour les expériences représentatives représentées.
| Catégorie de réactif | Exemple de compositionUnds |
| Agonistes de plaquettes | Thrombine, ADP, peptides activateurs PAR-1 ou -4, U46619, Thromboxane A2, ADP |
| Inhibiteurs enzymatiques | Hirudine, PPACK, héparinoïdes (indirects), inhibiteur de trypsine de maïs, inhibiteur de trypsine de soja |
| Les antagonistes des récepteurs | Anti-Glyprotein 1bα, anti-glycoprotéine VI; Clopidogrel, (cyclique) contenant des peptides RGD |
| Inhibiteurs d'activation | Prétraitement de l'aspirine, fixation |
Tableau 3: Réactifs potentiellement utiles.
Films supplémentaires: film 1: séries chronologiques d'images de plaquettes (voir figure 1 ), film 2: série inclinée de la figure 3B , film 3: mobilisation temporelle de CD63 sur la plaquetteSurface (voir la figure 4 ), film 4: séries chronologiques d'analyses à une seule cellule (voir figure 4B ), film 5: mobilisation dépendante du temps de VWF (voir la figure 5 ).
Cliquez ici pour télécharger le film 1.
Cliquez ici pour télécharger Movie 2.
Cliquez ici pour télécharger Movie 3.
Cliquez ici pour télécharger Movie 4.
Cliquez ici pour télécharger Movie 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans le monde entier, la thrombose est la principale cause de décès et de morbidité, et les plaquettes jouent un rôle central dans son développement. Ce travail décrit une méthode pour l'imagerie des cellules vivantes de la dégranulation des plaquettes sous l'écoulement. On suppose généralement que, lorsque les plaquettes deviennent activées, tout le contenu granulaire est directement rejeté dans la solution. Les résultats qui l'accompagnent suggèrent que ce n'est pas nécessairement le cas. Pendant l'adhérence et la dégranulation, les plaquettes conservent une quantité significative de polyphosphate ( Figure 4 ). En outre, la protéine multimérique VWF est associée à la surface plaquettaire après la dégranulation ( figure 5 ). Ceci indique que les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dégranulation des granules plaquettaires sont plus subtils que ce qui est généralement supposé.
Pour permettre l'imagerie des cellules vivantes de la dégranulation des plaquettes sous l'écoulement, les conditions expérimentales ont été sélectionnées pour maintenir l'agrégation des plaquettes au minimum. Le pays des plaquettesTs de 150 000 plaquettes / μL ont été utilisés. C'est à l'extrémité inférieure de la gamme normale (150,000-450,000 plaquettes / μL). En outre, l'adhésion et l'étalement des plaquettes ont été étudiées sur le VWF ou le fibrinogène immobilisé, ce qui a entraîné une légère activation des plaquettes (contrairement, par exemple, au collagène). Dans les études avec des plaquettes lavées, des taux de cisaillement accrus déplacent ces cellules vers le centre du flux. Cela entrave l'adhérence et la propagation subséquente et complique l'investigation de la dégranulation.
En hémostase physiologique, la margination plaquettaire est importante. Ce processus est conduit par les érythrocytes, expliquant pourquoi la faible anémie est parfois accompagnée d'une diathèse saignante. Une limitation de la technique présentée est que la visualisation de la dégranulation des plaquettes (avec les matériaux présentés et les réactifs) est perturbée par les globules rouges. La fonction plaquettaire est influencée par la contrainte de cisaillement, fonction de la viscosité du fluide (μ), ainsi queDu taux de cisaillement. Par conséquent, il est recommandé d'étudier la fonction plaquettaire dans les modèles de flux dans des solutions avec des viscosités comparables ( c.- à-d. Plaquettes lavées, sang reconstitué, PRP ou sang total).
Il existe plusieurs facteurs pratiques à prendre en compte lors de l'exécution de ces expériences. Tout d'abord, les signaux de fluorescence sont fortement influencés par la zone de focalisation. Si le microscope n'est pas focalisé, le signal est facilement flou ou même perdu. Avant l'arrivée des plaquettes dans le canal d'écoulement, il est préférable de se concentrer sur le canal lui-même (commencer au bord de la paroi du canal de silicium / débit). Lorsque les plaquettes commencent à adhérer, concentrez-vous sur cet événement d'adhérence. Un deuxième point préoccupant est le blanchiment de certains fluorophores ( p. Ex., FITC). L'excitation répétée entraînera une perte de signal, perturbant l'enquête. Ces obstacles peuvent être surmontés en utilisant des fluorophores plus stables, réduisant l'intensité de la lumière LED excitante, raccourcissant l'expLes temps d'oscillation et / ou l'abaissement de la fréquence d'images.
Le modèle décrit ici est très utile pour effectuer une étude détaillée des réponses plaquettes à une grande variété de protéines immobilisées et à différents débits. Potentiellement, cette méthode peut également être utilisée pour étudier leur interaction avec les cellules endothéliales activées 18 . Les progrès techniques qui permettent la conception souple des chambres à flux spécial ouvrent actuellement des avenues pour les études de biocompatibilité 19 . L'imagerie des cellules vivantes de la réactivité plaquettaire sous le flux révélera des informations précieuses sur la complexité de la réponse d'adhésion plaquettaire. En fin de compte, ces expériences devraient conduire à des modèles de flux expérimental de développement qui permettent une étude combinée de la fonction plaquettaire et de l'influence sur le système de coagulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
CM reconnaît le soutien financier de l'Organisation internationale des patients pour les déficiences des inhibiteurs C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht et la Fondation Landsteiner pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
