Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flash-and-Freeze: en ny teknikk for å fange Membran Dynamics med elektronmikroskopi

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55664
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3
1Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi har utviklet en ny metode i elektronmikroskopi, "flash-og-fryse", som muliggjør visualisering av membran dynamikk med ms tidsoppløsning. Denne teknikken kombinerer optogenetic stimulering av neuroner med høyt trykk frysing. Her viser vi prosedyrene og beskrive protokoller i detalj.

Abstract

Celler stadig endre sin membran arkitektur og protein fordeling, men det er ytterst vanskelig å visualisere disse hendelsene ved et tidsmessig og romlig oppløsning i størrelsesorden ms og nm, respektivt. Vi har utviklet en tidsoppløst elektronmikroskopi teknikk, "flash-og-fryse", som induserer cellulære hendelser med optogenetics og visualiserer de resulterende membran dynamikken ved frysing av celler ved definerte tidspunkter etter stimulering. For å demonstrere denne teknikken, uttrykte vi channelrhodopsin, en lysfølsom kation kanal, i mus hippocampus-neuroner. En lysglimt stimulerer neuronal aktivitet og induserer nevrotransmitter-frigjøring fra synaptiske terminaler via fusjon av synaptiske vesikler. Den optogenetic stimulering av neuroner er kombinert med høyt trykk frysing for å følge morfologiske endringer i løpet av synaptisk transmisjon. Ved hjelp av en kommersiell instrument, fanget vi fusjon av synaptiske vesikler og utvinning av synaptic vesikkelmembranen. For å visualisere den sekvens av hendelser, ble store datasett generert og analysert blindt, ettersom morfologiske endringer ble fulgt i forskjellige celler over tid. Ikke desto mindre gjør det mulig for flash-og-fryse visualisering av membran dynamikk i elektronmikrofotografier med ms tidsoppløsning.

Introduction

Visualisering membran og protein dynamikk innenfor en celle er et viktig skritt i retning av å forstå cellebiologi av bestemte prosesser. hendelser dynamisk menneskehandel kan fanges ved hjelp av lys eller fluorescens mikroskopi. Imidlertid er det subcellulære sammenheng er stort sett fraværende i slike bilder fordi subcellulære strukturer kan ikke fullstendig "malt" av fargestoffer eller fluorescerende prober og løst romlig og spektralt 1, 2. På den annen side, mens elektronmikroskopi kan avgrense subcellulære arkitektur i utsøkt detalj, det kan ikke fange cellulære dynamikk, fordi prøvestykker må festes før avbildning. Således er det vanligvis ikke er tilstrekkelig til fullstendig å forstå cellulære dynamikk ved hjelp av bare ett avbildingsmodalitet.

For å overvinne begrensninger av lys- og elektronmikroskopi, har korrelative mikroskopi-teknikker blitt utviklet. Samsvar Lys og elektronmikroskopi(CLEM) visualiserer intracellulære dynamikk ved hjelp av lysmikroskopi og underliggende subcellulære strukturer med elektronmikroskopi. I CLEM, celler engasjert i ulike prosesser, slik som cytokinese og endocytose 3, 4, 5, 6, er aktive vendt og deretter bearbeidet for elektronmikroskopi. Selv CLEM fanger visse aspekter av intracellulære dynamikk, er det fire faktorer som begrenser nytten av denne fremgangsmåte. Først blir den tidsmessige bestemte oppløsningen er begrenset av hvor hurtig cellene kan immobiliseres, noe som vanligvis tar s - minst på grunn av den langsomme diffusjon og reaksjon av fiksativer 7. For det andre er den subcellulære arkitektur observeres etter facto 8; dermed kan de dynamiske morfologiske endringer ikke fanges opp med denne tilnærmingen. For det tredje, fluorescens og elektronmikroskopibilder kan ikke innrettes nøyaktig på grunn av vev shrinkage forårsaket av dehydrering under prøvepreparering for elektronmikroskopi 9, 10. Fjerde, gjør hendelser som cytokinese og endocytose ikke finne sted på samme tid i hver celle 5, 11, og dermed må en bestemt celle som er engasjert i tilfelle bli identifisert fra en stor populasjon av celler. Denne prosessen er ofte arbeidskrevende. Således er en ny metode er nødvendig for å fremkalle bestemte hendelser i hver celle og for å fange opp de resulterende cellulære dynamikk ved hurtig immobilisering av celler ved definerte tidspunkter.

Nylig har flere verktøy er utviklet for å indusere bestemte cellulære dynamikk ved hjelp av lys (optogenetics). Channelrhodopsin er en lys-sensitive, ikke-selektivt kation kanal isolert fra Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Når channelrhodopsin er uttrykt i neuronal membraner, en kort lysglimt induserer en strøm av natriumioner til neuroner og utløser et aksjonspotensial 14, 15. Aksjonspotensialet deretter forplanter seg inn i de synaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikler som fusjonerer løpet av millisekunder 16, 17, 18. Derfor induserer channelrhodopsin neuronal aktivitet. For å følge membrandynamikk ved synaptiske terminaler, må neuroner være immobilisert ved definerte tidspunkter etter stimulering med ms presisjon.

For å fange membran dynamikk etter fremkallelse neuronal aktivitet, kombinert vi lys stimulering med høyt trykk iskaldt 17, 18, 19. Høytrykks frysing gjør det mulig for den nesten øyeblikkelige immobilisering av celler med redusert iskrystalldannelse 20. Iskrystaller can brudd membraner og forstyrre subcellulær arkitekturen 21. Ved å variere tidsintervallene mellom stimulering og frysing, ble membranen handel innen synaptiske terminaler fanget som følge av induksjon av et aksjonspotensial.

Her viser vi eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av en kommersialisert høytrykksfryseren som kobler en ms tidsmessig styring av lys stimulering med høytrykks frysing. I motsetning til andre instrumenter som krever en ekstern enhet til å styre lys stimulering og frysing, blir lys stimulering fullt integrert i dette systemet, og kan brukes med ms presisjon 19. Denne prosessen involverer flere trinn. 1) Mus hippocampus-neuroner dyrket på safir disker og infisert med lentivirus bærer en ekspresjonsvektor for channelrhodopsin 18. 2) Neurons stimuleres og frosset ved definerte tidspunkter etter stimulering. 3) Det forglassede vann er erstatningd med et organisk oppløsningsmiddel, mens lipider og proteiner er fornettet med fikseringsmidler for å bevare den intracellulære arkitekturen. 4) Prøvene infiltrert og innstøpt i epoksyharpiks. 5) ultratynne snitt ble oppsamlet ved hjelp av en ultramikrotom. 6) Tynne snitt blir avbildet på et transmisjonselektronmikroskop. 7) Bilde innsamling og analyse utføres blindt med hensyn på tidspunkter eller genotyper. Cellular dynamikk kan bestemmes ved rekonstruksjon av tidsoppløst bilder 17, 18. Prøveopparbeidelse (trinn 2-5 ovenfor) krever en uke, men den påfølgende bildeanalyse krever måneder til et år.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i henhold til de regler og forskrifter for bruk av dyr ved National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Johns Hopkins School of Medicine.

1. Isolering og kultur Mouse hippocampalneuroner

  1. Dissekere cortex fra en postnatal dag 0 - dag 2 (P0 - 2) musehjerne 18. Isolere astrocytter fra cortices.
    MERK: musehjerne ble isolert etter halshogging. Astrocytter tjene som et matelag av hippokampale neuroner.
  2. Behandle ble hjernebarkene med 800 ul av 0,05% trypsin-EDTA i 15 min ved 37 ° C for å dissosiere astrocytter.
  3. Kultur astrocyttene i en T-75-kolbe med 13 ml DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 0,2% penicillin-streptomycin i en uke ved 37 ° C og 5% CO2.
  4. Plasser en syre-vaskede og steriliserte 18 mm dekkglass per brønn av en 12-brønners plate.
  5. I korte trekk vaskes to 6 mm karbonbelagt safir-plater i 70% etanol og plassere dem på toppen av hver dekkglass.
  6. Forbered Poly-D-lysin (PDL) løsning ved å blande 3 ml 17 nM eddiksyre med 1 ml av rottehalecollagen og 1 ml av PDL (1 mg / ml). Påfør 200 ul PDL-løsning for å safir disker og dekkglass i 5 min ved RT.
  7. Fjern PDL løsningen og lufttørke. Før bruk sterilisere den plate som fremstilt i trinn 1.4 til 1.6 i 30 minutter under ultrafiolett lys.
  8. Seed astrocyttene fra trinn 1,3 i 2 ml DMEM med en tetthet på 5x10 4 celler / brønn i skålen som ble fremstilt i trinn 1.4 - 1.6. Dyrke dem ved 37 ° C og 5% CO2 i en uke.
  9. Tilsett 20 mL av fluor-deoksyuridin (sluttkonsentrasjon: 80 uM) til hver brønn for minst et par timer før dyrking av nerveceller.
    MERK: fluor-deoxyuridine stopper astrocyte divisjon.
  10. Skift medium til 1,5 ml av neuronale basal medium (se tabell of Materials) inneholdende 1% L-alanyl-L-glutamin (se tabell of Materials), 2% serum-fritt supplement for nevronale celler (se tabell of Materials), og 0,2% penicillin-streptomycin .
  11. Fremstill papain oppløsning ved tilsetning av 20 enheter av papain til 5 ml enzymløsning (1,65 mM cystein, 1 mM CaCl2 og 0,5 mM EDTA i DMEM). Surgjøre løsningen ved å føre CO2-gass i 20 minutter. Filter-sterilisere med et 0,22 um filter.
  12. Høste hjerne fra en P0 - 2 mus 18. Umiddelbart overføre hjernen til iskald Hanks'-balansert saltløsning (HBSS). Skjær hippocampi under et stereomikroskop, holde vevet neddykket i HBSS.
  13. Plasser de to hippocampi i 1 ml papain-oppløsningen fremstilt i trinn 1.11. Inkuber i 1 time på et termomikser ved 37 ° C og 750 rpm.
  14. Sett på papain med 1 ml løsning inneholdende inaktive2,5 mg trypsin-inhibitor og 0,5 mg albumin pr ml DMEM. Inkuber i 5 min ved 37 ° C. Aspirer av inaktive løsning.
  15. Tilsett 200 ul av neuronal basalmedium (se tabell of Materials) til den isolerte hippocampus. Triturer ved hjelp av en 200 ul pipette for å dissosiere cellene. Vent til dissosiert celler bosette nederst. Fjern forsiktig medium med celler fra toppen.
  16. Gjenta trinn 1,15 3x. Pool alle de dissosierte cellene i et nytt 1,5 ml sentrifugerør.
  17. Telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer. Plate neuroner ved en tetthet på 6,5 x 10 4 celler / brønn på toppen av astrocytt sjiktet ble fremstilt i trinn 1.1 - 1.10.
  18. Infisere neuronene med lentivirus uttrykker channelrhodopsin ved DIV 3 (3 d in vitro) 18.
  19. Utføre flash-og-fryse på DIV 14, slik det er beskrevet i trinn 2.1 - 2.5, nedenfor.

2. Flash-enD-Freeze

  1. Fremstilling av Fixative
    1. Under en kjemisk hette, tilsett følgende stoffer til et konisk rør for å fremstille fiksativ: 2,5 ml glutaraldehyd (10% lager i aceton), 0,25 g osmiumtetroxyd, 0,25 ml vann, og 22,25 ml vannfritt aceton.
      NB: Den endelige konsentrasjonen av hver komponent bør være 1% i aceton. Glutaraldehyd ble tilsatt for å bevare proteinstrukturene under fryse substitusjon. ADVARSEL: Den akutte toksisitet av osmiumtetroksyd er høy. Eksponering for damp kan skade hornhinnen i øyet. Det bør håndteres bare i en sertifisert kjemisk hette.
    2. Alikvoter 1 ml fiksativ i nummererte kryogeniske hetteglass (2 ml). Hold fiksativ frosset i flytende nitrogen inntil bruk.
      MERK: osmiumtetroksyd og glutaraldehyd kryssreagerer og bunnfall; således, når blandet, alikvoter straks, Lukk rørene, og senk kryorør i flytende nitrogen for å fryse fiksativ. Bruk en blyant til å nummerere cryofremkallende ampuller, kan ettersom aceton vaske av markører.
  2. Fremstilling av fysiologisk saltvann
    1. Gjør fysiologisk saltoppløsning ved å blande Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) og glukose (10 mM).
      MERK: Disse verdiene er sluttkonsentrasjoner. Cryo-beskyttere brukes ikke for monolagkulturer. Imidlertid er en passende cryo-beskyttelsesmiddel som kreves for prøvene tykkere enn 5 um. Bruken av 20% BSA er vanligvis anbefales. Gjær lim og E. coli OP50 kan også brukes som Cryo-beskyttere for fluelarver eller C. elegans.
    2. Legg CaCI2 ved 4 mM MgCl2 og 1 mM sluttkonsentrasjon.
      MERK: Konsentrasjonene av CaCl2 og MgCl2 varierer avhengig av eksperimenter. For å sikre fangst av exocytic mellomprodukter, 4 mM kalsium anvendes for disse spesielle eksperimenter for å øke frigjøringen sannsynligheten for vesikler 18.
    3. Undersøkosmolaritet ved hjelp av et osmometer. Sørg for at det er 300 ± 5 mOsm.
    4. Legg til en AMPA reseptorantagonist (NBQX) til en sluttkonsentrasjon på 3 uM og GABA-reseptor-antagonist (bicucullin) til en sluttkonsentrasjon på 30 uM.
      MERK: Nevrotransmitter-reseptor-antagonister tilsettes for å unngå tilbakevendende nettverk aktivitet følgende neuronal stimulering 18.
    5. Varm opp den fysiologisk saltvann til 37 ° C for bruk.
  3. Fremstilling av de spesialiserte Høytrykkskombi og en automatisert Freeze Bytte Unit
    1. Forut for høyt trykk frysing, avkjøles en automatisert fryse substitusjon enhet til -90 ° C ved å fylle tanken med flytende nitrogen.
    2. Kjøl ned aceton i en liten kopp til -90 ° C ved å plassere den inne i prøvekammeret.
    3. Fyll den flytende nitrogen Dewar-beholderen og lagring Dewar-beholder av høytrykks fryser (se tabell of Materials) med væske nitrogen.
    4. Sett opp lyset stimulering protokollen ved hjelp av berøringsskjerm.
      1. Navn programmet ved å klikke på "Rediger" ved siden av "Programnavn" på lyset stimulering vinduet. Et annet vindu vil dukke opp.
      2. Sette opp et program ved å skrive "15.000 ms" i "mørke fasen", "100 ms" i "periode", "10 ms" i "puls" og "1" i "antall perioder" for en enkelt stimulus 10 ms. Fryse cellene 90 ms senere (figur 1C).
        NB: "mørke fasen" som gjør at cellene komme fra lyseksponering under prøve lasting. "Periode" definerer stimulering frekvens. For eksempel, hvis den stimulans bør påføres ved 20 Hz, denne kolonnen bør være satt til 50 ms. "Pulse" definerer varigheten av lyset stimulus. Til slutt, den "antall perioder" definerer det totale antall stimuli anvendt. For å sette opp en høyfrekvent stimulering, kan du se
    5. For en "ingen stimulering" kontroll, type "15 s" i "mørk fase", "0 ms" i "periode", "1 ms" i "puls" og "0" i "antall perioder" i lyset stimulering vinduet oppsett som beskrevet i trinn 2.3.4.
      MERK: Som standard er "puls" må være minst 1 ms.
    6. På hovedskjermen, må du sørge for at boksen for lett stimulering er avmerket.
    7. Sett opp lagringsprotokollen ved å klikke på "Specimen Storage" på hovedskjermen. Klikk på "Edit". I det følgende vindu, bruk "+" eller "-", for å velge "2" for å lagre 2 skiver i hver kanal (3 kanaler totalt). Sjekk "Storage LN2 aktivert."
  4. Prøve Lasting og Frysing i Høytrykks Fryser
    MERK: All prøven montering og laste trinnene er gjort under et stereomikroskop med en 7.5-60X forstørrelse. En tweezer anvendt i trinn 2.4.1 - 2.4.4 for å manipulere prøvene. Eksperimenter må utføres ved fysiologisk temperatur.
    1. Plasser en safir disk, celle-side vendt opp, i brønnen av den sorte, midterste platen (figur 1B).
    2. Plasser en 100 pm avstandsring over safir skiven (figur 1B).
    3. Plasser en blank safir plate over avstandsring (figur 1 B) etter dypping ene siden av skiven i den forvarmede saltoppløsning fra trinn 2.2. Sørg for at ingen luftbobler er fanget mellom de to safir disker.
    4. Plasser en annen 100 um avstandsring og en 400 pm avstandsring (figur 1B). Fjerne den ekstra væsken ved hjelp av filterpapir.
    5. Plasser sammenstillingen fra trinn 2.4.3 mellom de to gjennomsiktige halvsylinder (figur 1A). Lukk topp røde dekselet for å starte fryseprosessen.
      NB: Den forhåndsinnstilte protokollen starter automatisk når dekselet er lukket. Prøven forblir i den samme orientering i fryserommet, og et lysglimt tilføres fra toppen av prøven sammenstillingen. Den røde dekselet spretter opp igjen automatisk når fryseprosessen er fullført.
    6. Oppbevar prøven på lagrings Dewar.
      MERK: Etter frysing, blir prøven automatisk slippes inn i et lagrings dewar fylt med flytende nitrogen og lagres der inntil videre behandling. Lagrings Dewar-beholder har tre kamre, og hvert kammer kan inneholde opptil 3 prøver på det meste. Vanligvis blir to prøver frosset under de samme betingelser stimulering, og høytrykks fryser er programmert til å lagre både i det samme kammer.
    7. Gjenta trinn 2.4.1 - 2.4.6 for hver prøve.
    8. Gå videre til trinn 2,5 når alle kamrene er fulle.
      MERK: Enheten ble satt til å lagre opp til 6 prøver i lagrings Dewar-beholderen på en gang. Derfor, etter hvert 6. prøven, trinn 2.5 må utføres. Når losses, gjenta trinn 2.4.1 - 2.4.6.
  5. Prøvetaking og overføring til en Automated Freeze-substitusjon Unit
    1. Åpne døren til lagrings Dewar-beholderen, som er plassert under bordet av høytrykks fryser. Fjern lagrings Dewar og plassere den på den stasjonære.
    2. Ved hjelp av hendene, fjerne prøven kammeret fra Dewar-beholderen og overføre den i spesialiserte prøven brett fylt med flytende nitrogen. Lås knotten for å frigjøre prøvekoppen.
    3. Fjern de gjennomsiktige halvsylinder fra prøver koppen ved hjelp av en pinsett etter forkjøling i tuppen av en pinsett med flytende nitrogen (~ -196 ° C). overføre nøye midten, sort plate til en liten kopp som inneholder flytende nitrogen.
      MERK: Tuppen av pinsett skal forkjøles til temperaturen for flytende nitrogen. Prøven må holdes under flytende nitrogen til enhver tid for å forhindre iskrystalldannelse.

3. Freeze Substitusjon i Automated Freeze-substitusjon Unit

  1. Ved hjelp av nedkjølt pinsett (tips på ~ -196 ° C), raskt overføre den midterste platen fra trinn 2.5.3 til den på forhånd avkjølte aceton (-90 ° C).
  2. Skill safir disken fra midten platen ved forsiktig risting eller tapping.
    MERK: Noen ganger kan det være vanskelig å skille safir disken fra midten plate. I en slik situasjon, lar den midterste platen på forhånd avkjølt aceton (-90 ° C) i noen få minutter. Lett tapping med pinsett bidrar også til å distansere safir fra midten plate.
  3. Plasser en kryogenisk beholder inneholdende bindemiddel (trinn 2.1) inne i et prøvekammer i substitusjon enhet. Overfør safir skiven til den kryogeniske ampullen og plassere et lokk på beholderen.
  4. Sett opp fryse substitusjon program som følger: (i) -90 ° C i 5 - 30 h, (ii) -90 til -20 ° C i 14 timer (5 ° C / h), (iii) -20 ° C i 12 timer, og (iv) -20 ° C - 20 ° C i 4 timer (10 ° C / h).
    MERK: durasjon av det første trinn ved -90 ° C kunne varieres. Den totale varighet av fryse substitusjon er innstilt på en slik måte at programmet avsluttes i morgen (~ 1,5 d postexperiment) rundt 8 am, slik at de etterfølgende trinn kan utføres i løpet av dagtid.

4. Infiltrasjon og plast Inkludering med epoksyharpiks

  1. Når programmet avsluttes, bruk hansker for å overføre kryogeniske beholdere inneholdende safir skivene fra prøvekammeret i substitusjon enhet til en kjemisk hette.
  2. Ved hjelp av en pipette, tilsett aceton (romtemperatur) til hver ampulle kryogen og vask hver safir skive 4 - 6x i 1 - 2 timer.
  3. Eventuelt inkubere prøvene i 0,1% uranylacetat i 1 time, hvis ekstra kontrast er nødvendig. Vask 4 - 6 ganger med aceton i løpet av 1 - 2 timer.
    MERK: FORSIKTIG: Det er risiko forbundet med den interne eksponering etter inhalering av uranylacetat, noe som fører til irritasjon i de øvre luftveier. Høy eksponering kan damage blodlegemer. Arbeid med uranylacetat bør gjøres under avtrekk. Vernetøy anbefales.
  4. Forbered flytende epoksyharpiks medium ved å veie 6,2 g glycerol polyglycidyleter, 4,4 g bisfenol-A-epoksyharpiks, og 12,2 g av dodecenylravsyreanhydrid (DDSA). Bland grundig og tilsett 800 ul av benzyldimethylamin (BDMA) mens det blandes. De-gass i 10 minutter.
  5. Forbered 30, 70, og 90% epoxyharpiks i aceton fra 100% epoksyharpiks fremstilt i trinn 4.4.
  6. Tilsett 30% epoxyharpiks til den kryogeniske beholdere inneholdende safir-plater og inkuberes i 2 - 3 timer ved romtemperatur i en orbitalrister ved 120 rpm.
  7. Sett på 30% epoxyharpiks til 70% epoksyharpiks ved pipettering og inkuber i 3 - 4 timer ved romtemperatur i en orbitalrister.
  8. Ved hjelp av pinsett, overfører hver safir disk, celle-side-opp, til hetten av en kapsel innebygging. Legg 90% epoxyharpiks til hetten. Inkuber O / N ved 4 ° C.
  9. Den neste dag, gjør friskt epoksyharpiks medium, som i trinn 40,4.
  10. Overfør hver safir disk, celle-side vendt opp, til hetten av en kapsel innebygging. Fylle kapselen med nylaget 100% epoksyharpiks. Bytt til friske 100% epoksyharpiks hver 2 timer og gjentatt tre ganger.
  11. Plassere prøvene i en 60 ° C ovn i 48 timer for å polymerisere.

5. Montering Prøver

  1. Plasser prøven opp-ned på det stereomikroskop slik at safir skiven er plassert på toppen av harpiksen blokken. Fjern det tynne laget av epoksyharpiks fra toppen ved å skrape det med et barberblad.
  2. Ved hjelp av et barberblad, skjære et grunt linje langs kanten av safir plate; denne linje bidrar til å skille safir disken fra epoksyharpiksen i trinn 5.3.
  3. Separer den safir disken fra epoksyharpiks ved å dyppe den i flytende nitrogen i omtrent 10 sek.
    MERK: Cellene vil bo i epoxy.
  4. Etter fjerning av safirplate med en dissekere omfang for å finne et område med celler (4-10X forstørrelse). Skjær rundt området av interesse (~ 2 x 2 mm) ved anvendelse av et barberblad (tveegget). For å holde prøven på plass, utføre dette trinnet mens prøven er tapet til overflaten av mikroskopet.
  5. Monter lite stykke av plast (~ 2 x 2 x 5 mm) inneholdende cellene ved hjelp av lim inneholdende etyl-cyanoakrylat på en sylindrisk blindblokk laget av epoksyharpiks. Inkuber blokken ved 60 ° C i 1 time.

6. Seksjonering

  1. Bruk en ultramikrotom § prøven.
    1. Trimme overflaten av plast innleiret prøvestykke med en glasskniv med en hastighet på 3 mm / s og en tykkelse på 200 nm / seksjon. Skjær 4 - 5 seksjoner fra overflaten hvor de astrocytter er plassert.
    2. Bytte til en diamantkniv og seksjonen med en hastighet på 0,8 mm / s og en tykkelse på 40 nm / seksjon. Klipp 20 - 25 seksjoner.
  2. Samle bånd av seksjoner på enkeltsporkobbernett belagt med 0,7% polyvinylacetat (seTable of Materials).

7. avbilding ved å anvende et transmisjonselektronmikroskopi (TEM)

  1. Før TEM-avbildning, beis seksjon med 2,5% uranylacetat i metanol i 5 min.
  2. Vask rutenettet 15x i 50% metanol. Deretter vaskes i ultrarent vann 15x, med hver vask varte i 30 sek.
  3. I korthet luft-tørke seksjonen og plassere risten inn i en prøveholder av TEM.
  4. Image at 93,000X forstørrelse.
  5. Hente bilder.
    MERK: Imaging er vanligvis gjort blind for de tidspunkter eller genotyper, og typisk ~ 200 bilder er samlet / tidspunkt.

8. Bildeanalyse

  1. Analysere bildene ved hjelp av en programvare (f.eks ImageJ) med en tilpasset makro (Watanabe, Davis, og Jørgensen, upublisert).
    MERK: x / y-koordinater blir registrert fra vesikler, plasmamembranen, den aktive sone membranen, og alle andre membranbundne organeller ved synapser. Teksten files som inneholder informasjon blir eksportert til en annen programvare (f.eks Matlab). Dataene blir analysert videre med definerte programmer.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, vi fremførte "flash-og-fryse" eksperimenter i mus hippocampalneuroner uttrykke channelrhodopsin. Disse neuroner ble frosset enten 15 ms eller 100 ms etter lys utbruddet. Vi har tidligere vist at exocytose og endocytose av synaptiske vesikler som forekommer i de synaptiske terminaler på de 15 ms og 100 ms tidspunkter, henholdsvis 18. Disse hendelsene ble vellykket tatt til riktig tid (figur 2), noe som tyder på at flash-og-fryse eksperimenter kan med hell utføres på den valgte spesialisert høytrykks fryser (se tabell for material).

Figur 1
Figur 1. Eksempel Lasting og programmering i Høytrykks fryser. A) Prøve ladebord av en høy-prykk fryser. Den midtre plate, som er vist i den innfelte for konstruksjonsdetalj, plasseres i en holder for CLEM prøve lasting. En av de halvsylinder er plassert ved den nederste delen av prøven ladebordet, og den andre delen er festet med en klemme til toppdekselet. Når prøven er lastet, blir den midterste platen skyves forover til den nedre halvsylinder og dekslet er lukket for å innlede frysing. B) Prøve montering. Safir skive inneholdende neuroner er plassert i brønnen i den midterste platen, med den cellesiden opp. En 100 um ring er plassert direkte over safir skiven inne i brønnen. Deretter blir en tom safir plate dyppet i fysiologisk saltvann plassert med oppløsningen siden ned. Luftbobler må unngås. Til slutt blir en 100 um ring og en 400 pm ring tett plassert ovenfor. Eventuelle ekstra væske fjernes sammen med filterpapir. C) Et tverrsnitt av en kapsel innebygging med den safir skive neddykket i epoksyharpiks. den Sappansette skive er plassert i bunnen av kapselen, med den celle-side vendt opp og dekket med epoksyharpiks for infiltrering og innstøping. D) Programmering av høytrykks fryser for en enkelt, 10 ms stimulus. Prøvene fryses 90 ms etter lyspulsen. E) Programmering av høytrykks fryser i 10 stimuli ved 20 Hz. Prøvene fryses 5 ms etter den siste lyspulsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Visualisering av eksocytose og Endocytose i Mus hippocampalneuroner. Hippocampalneuroner blir stimulert gang og fryses ved de angitte tider. Elektronmikroskopibilder viser exocytose av en synaptisk vesikkel A) og ultrahurtig endocytose Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den "flash-og-frost" tilnærming visualiserer membrandynamikk ved å indusere en spesiell cellulær hendelse med optogenetics og ved frysing av cellene ved definerte tidspunkter etter stimulering 19. I denne demonstrasjonen brukte vi channelrhodopsin, en lysfølsom kation kanal, for å stimulere nerveceller og fanget fusjon og gjenvinning av synaptiske vesikler ved den synaptiske terminaler. I de senere år har mange optogenetic verktøy utviklet 22, 23, som alle er kompatible med flash-og-fryse. For eksempel kan organelle trafikk induseres ved hjelp av lys-indusert heterodimerisering av cryptochrome og CIB1 24. På samme måte kan lipidsammensetningen av plasmamembranen bli endret av lys-indusert translokasjon av fosfoinositid-fosfataser til plasmamembranen 25. Videre er små, lysfølsomme forbindelser som azobenzen change konformasjon avhengig av belysningsbølgelengder. Denne konformasjonsendring kan brukes til å aktivere ligandstyrte kanaler eller for å endre lipidsammensetningen i membranen 26, 27. Bur forbindelser kan også anvendes til å indusere cellulær aktivitet. Imidlertid kan LED brukes i dagens oppsett ikke produsere nok energi til uncaging; således ytterligere optimaliseringer av systemet er sannsynligvis nødvendig. Ikke desto mindre er anvendelser av disse lys-aktiverbare verktøy er fleksible-mange cellulære hendelser, kan induseres ved et lysglimt. "Flash-og-frost" kan fange opp de resulterende membran dynamikk.

Det er to hoved begrensninger i "flash-og-fryse" -metoden. Først fanger det "snapshots" av en bestemt hendelse fra forskjellige celler. Med andre ord, er det ikke mulig å følge membran dynamikk i en celle i løpet av en tidsperiode. Derfor, for gjenoppbyggingen av enhver cellulær selvt, må man skaffe og analysere et stort antall bilder fra hver prøve, og ved hvert tidspunkt. Videre er det i nerveceller, er et enda større antall bilder er nødvendig, fordi sammensmeltingen av synaptiske vesikler bare foregår i 20 - 30% av synapsen i mus hippocampalneuroner 18, 28. Analysen av et slikt stort datasett krever enorme mengder av gangen. I fremtiden bilde innsamling og analyse må bli automatisert for å gjøre den mer effektiv tilnærming 29, 30.

Den annen begrensning er satt med arten av høytrykksfryseteknikk. Når celler fryse, omleires cellulær vann for å danne iskrystaller hvis frysehastighet er lavere enn 100 K / s 21. Disse iskrystaller kan trenge gjennom membraner eller konsentrere oppløsninger for å endre lokal osmotisk trykk, noe som resulterer i brudd av membranene. For å unngå iskrystaller, high trykk (~ 2000 atmosfærer) påføres på prøvene. På grunn av den superkjølende effekt, er tilstrekkelig til å hindre vann fra å danne iskrystaller ved dette trykk 21 en frysehastighet på 100 K / sek. I teorien prøver som så tykt som 500 mikrometer kan fryses uten iskrystaller, men ca 200 pm er sannsynligvis den praktiske grense, som kubeformede former av is en tendens til å danne seg i tykt vev, noe som påvirker morfologi. Ved behandling av eksemplarer som er tykkere enn 5 um, er det nødvendig med anvendelsen av et passende cryo-beskyttelsesmiddel, slik som BSA. Imidlertid vil BSA endre oppløsningens osmolaritet, og kan påvirke den fysiologiske responsen av celler. Derfor er omfattende kontrollforsøk som kreves for å validere bruk av BSA i bestemte systemer. Iskrystaller kan også dannes etter høytrykks frysing dersom prøvene uhell fjernes fra det flytende nitrogenbad. Dermed er det viktig å holde prøvestykkene i den flytende nitrogen til enhver tid og til å bruke på forhånd avkjølt til tangmanipulere dem.

Ved planlegging av eksperimenter, bør følgende tre punkter vurderes. For det første er den maksimale intensitet av lys (460 nm-linjen) 5,5 til 8,0 mW / mm2. Hvorvidt denne intensitet er tilstrekkelig til å indusere aktivitet må verifiseres med levende celle-avbildning på et fluorescens mikroskop før flash-og-fryse-eksperimenter. For det andre må eksperimenter utføres ved fysiologisk temperatur. Scenen av høytrykks fryser er varmet opp til 37 ° C i forsøkene med mus hippocampalneuroner 31. Til slutt må de tidspunkter være nøye utvalgt for å fange de membran dynamikk. Innledende studier indikerte at endocytose er avsluttet etter 100 ms av stimulering. Således er tre ytterligere tidspunkter (15, 30, og 50 ms) ble også undersøkt for å følge membran dynamikk 17, 18. Disse tidspunkter var nødvendige for å visualisere membranen trafikk arrangements i løpet av synaptisk transmisjon. Men kravet til antall tidspunkter er forskjellige i hver celle hendelse. Derfor bør noen tidspunkter prøves før oppstart av store datasett samling.

Disclosures

Open Access publisering av denne artikkelen ble sponset av Leica Mikrosysteme GmbH.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Johns Hopkins University (SW). Vi takker Johns Hopkins School of Medicine mikroskop Facility for deres tekniske support. Vi takker Erik Jorgensen og Christian Rosenmund og medlemmer av deres laboratorier for utvikling av teknikken. Vi takker M. Wayne Davis for utformingen av den første enheten. Vi takker Paul Wurzinger, Cveta Tomova, og Delgermaa Luvsanjav for deres teknisk assistanse. Vi takker også Natalie R. Hamilton og Grant F. Kusick for deres kritisk lesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System  for Light and Electron Microscopy -AFS II Leica 
High Pressure Freezer - EM-ICE Leica  EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.
Osmometer Gonotec
Ultramicrotome UC7 Leica 
Oven Blue M
Razor blade Personna
Glutaraldehyde EMS 16530
Osmium tetroxide EMS RT19132 Toxic, open only under certified chemical hood
Acetone EMS RT10016
HEPES Emdmillipore 391340-250GM
Glucose Sigma 49159-1KG
KCl Sigma 746436-1KG
NaCl Sigma S7653-1KG
CaCl2 Sigma 21115-250ML
MgCl2 J.T.Baker 2444-01
Liquid epoxy resin Eponate 12 Ted Pella 18028
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 Ted Pella 18028
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) Ted Pella 18028
Benzyl dimethyl amine (BDMA) Ted Pella 18241
Special embedding (BEEM) capsule EMS 70021
Copper Grid Ted Pella 1GC12H
Polyvinyl acetate (Pioloform F) Ted Pella 19244
Uranyl acetate Polysciences 21447-25
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) Scotch 170497
Trypsin-EDTA Themo scientific 25300-120
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Thermo scientific 10569-044 Should be warmed to 37 °C before use
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo scientific 26140-079
Pen-Strep Thermo scientific 15140-122
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503
Glass cover slip Fisher S175223 Should be acid-washed
Sapphire disc Technotrade 616-100
Acetic acid Emdmillipore 1000631011
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma P6407
Rat tail collagen Thermo scientific A10483-01
Neurobasal A Fisher 10888022 Should be warmed to 37 °C before use
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Fisher 35050-079
Seraum free supplement  (B-27)  Fisher 17504044
Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific 24020117
Papain Worthington LS003126 Active Unit should be calculated for each batch
Thermomixer Eppendorf  Thermomixer C
Trypsin inhibitor Sigma T9253
NBQX Tocris 03-731-0
Bicculine Tocris 01-091-0
Whatman I filter paper GE
Transmission Electron Microscope Philips CM20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
  2. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
  4. Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
  5. Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
  6. Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
  7. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
  8. Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
  9. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
  10. Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
  11. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  12. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  13. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  14. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  15. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  16. Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
  17. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
  18. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  19. Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
  20. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
  21. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  22. Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
  23. Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
  24. van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
  25. Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
  26. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
  27. Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
  28. Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
  29. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
  30. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  31. Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).

Tags

Cellular Biology utgave 123 elektronmikroskopi optogenetics synapse membran dynamikk fryse substitusjon channelrhodopsin høytrykks-frysing exocytose endocytose tidsoppløst elektronmikroskopi flash-og-fryse
Flash-and-Freeze: en ny teknikk for å fange Membran Dynamics med elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe,… More

Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe, S. Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55664, doi:10.3791/55664 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter