Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flash-og-Freeze: en ny teknik til Capture Membrane Dynamics med Electron Microscopy

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55664
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3
1Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi udviklet en ny teknik i elektronmikroskopi, "flash-og-freeze", som muliggør visualisering af membran dynamik med ms tidsopløsning. Denne teknik kombinerer optogenetic stimulering af neuroner med højtryks-frysning. Her viser vi de procedurer og beskrive de protokoller, i detaljer.

Abstract

Celler konstant ændre deres membran arkitektur og protein fordeling, men det er yderst vanskeligt at visualisere disse begivenheder på en tidsmæssig og rumlig opløsning af størrelsesordenen ms og nm. Vi har udviklet en tidsopløst elektronmikroskopi teknik, "flash-og-freeze", der inducerer cellulære begivenheder med optogenetics og visualiserer de resulterende membran dynamik ved at fryse cellerne ved definerede tidspunkter efter stimulering. For at demonstrere denne teknik udtrykte vi channelrhodopsin, en lysfølsom kationkanal, i mus hippocampale neuroner. En lysglimt stimulerer neuronal aktivitet og inducerer neurotransmitter-frigivelse fra synaptiske terminaler ved fusion af synaptiske vesikler. Den optogenetic stimulation af neuroner er koblet med højtryks-frysning at følge morfologiske ændringer under synaptisk transmission. Ved hjælp af en kommerciel instrument, vi erobrede fusion af synaptiske vesikler og genopretning af Synaptic vesikelmembranen. At visualisere hændelsesforløbet, blev store datasæt genereres og analyseret blindt, idet morfologiske ændringer blev fulgt i forskellige celler over tid. Alligevel flash-og-freeze tillader visualisering af membran dynamik i elektronmikrografer med ms tidsopløsning.

Introduction

Visualisere membran og protein dynamik i en celle er et vigtigt skridt i retning af at forstå cellebiologi af bestemte processer. Dynamisk menneskehandel hændelser kan registreres ved hjælp af lys eller fluorescens mikroskopi. Men den subcellulære sammenhæng i vid udstrækning mangler i sådanne billeder, fordi subcellulære strukturer kan ikke helt "malet" af farvestoffer eller fluorescerende prober og løses rumligt og spektralt 1, 2. På den anden side, mens elektronmikroskopi kan afgrænse subcellulære arkitektur i udsøgte detaljer, kan det ikke fange cellulære dynamik, fordi prøverne skal fastsættes forud for billeddannelse. Det er således typisk ikke tilstrækkelig til fuldstændigt at forstå cellulære dynamik anvendelse af kun en afbildningsmodalitet.

At overvinde begrænsningerne ved lys- og elektronmikroskopi, har korrelative mikroskopiteknikker blevet udviklet. Korrelativ lys- og elektronmikroskopi(CLEM) visualiserer intracellulære dynamik ved hjælp af lysmikroskopi og underliggende subcellulære strukturer med elektronmikroskopi. I CLEM, celler engageret i forskellige processer, såsom cytokinese og endocytose 3, 4, 5, 6, er levende afbildes og derefter bearbejdet til elektronmikroskopi. Selvom CLEM fanger visse aspekter af intracellulære dynamik, er der fire faktorer, der begrænser nytten af ​​denne tilgang. Første er den tidsmæssige opløsning begrænset af hvor hurtigt cellerne kan immobiliseres, hvilket typisk tager s - min grund af den langsomme diffusion og reaktion af fikseringsmidler 7. For det andet er den subcellulære arkitektur observerede post facto 8; derfor kan de dynamiske morfologiske ændringer ikke taget med denne fremgangsmåde. Tredje, fluorescens og elektronmikrografier kan ikke præcist rettet grund væv shrinkage forårsaget af dehydrering under fremstillingen prøven til elektronmikroskopi 9, 10. For det fjerde vil begivenheder som cytokinese og endocytose ikke finde sted på samme tidspunkt i hver celle 5, 11, og dermed skal en bestemt celle, der er engageret i tilfælde identificeres fra en stor population af celler. Denne proces er ofte besværlig. Således er en ny fremgangsmåde er nødvendig for at inducere bestemte begivenheder i hver celle og til at fange de resulterende cellulære dynamik af den hurtige immobilisering af celler ved definerede tidspunkter.

For nylig har flere redskaber blevet udviklet til at inducere specifikke cellulære dynamik med lette (optogenetics). Channelrhodopsin er en lysfølsom, ikke-selektive kationkanal isoleret fra Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Når channelrhodopsin udtrykkes i neuronal membraner, en kort lysglimt inducerer en tilstrømning af natriumioner i neuroner og udløser et aktionspotentiale 14, 15. Aktionspotentialet derefter udbreder i de synaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikler fusionerer inden for millisekunder 16, 17, 18 Derfor channelrhodopsin inducerer neuronal aktivitet. At følge membran dynamik på synaptiske terminaler, skal neuroner immobiliseres på definerede tidspunkter efter stimulering med ms præcision.

At fange membran dynamik efter induktion neuronal aktivitet, vi koblet lys stimulering med højtryks-frysning 17, 18, 19. Højtryks-frysning muliggør næsten øjeblikkelig immobilisering af celler med reduceret iskrystaldannelse 20. Iskrystaller can briste membraner og forstyrre den subcellulære arkitektur 21. Ved at variere tidsintervallerne mellem stimulering og frysning, blev membranen handel inden synaptiske terminaler fanget efter induktionen af ​​et aktionspotentiale.

Her viser vi eksperimentelle procedurer under anvendelse af en kommercialiseret højtryks-fryser, der kobler en ms tidsmæssig kontrol af lys stimulering med højtryks-frysning. I modsætning til andre instrumenter, som kræver en ekstern enhed til at styre lys stimulation og frysning, er lysstimulering fuldt integreret i dette system og kan anvendes med ms præcision 19. Denne fremgangsmåde involverer flere trin. 1) Mus hippocampale neuroner dyrkes på safir diske og inficeret med lentivirus bærer en ekspressionsvektor til channelrhodopsin 18. 2) Neuroner stimuleres og fryses ved definerede tidspunkter efter stimulering. 3) forglasset vand er erstatningd med et organisk opløsningsmiddel, mens lipider og proteiner er tværbundet ved fikseringsmidler at bevare det intracellulære arkitektur. 4) Prøverne infiltreret og indlejret i epoxyharpiks. 5) Ultratynde snit opsamles under anvendelse af en ultramikrotom. 6) Tyndslib afbildes på en transmissionselektronmikroskop. 7) Billede indsamling og analyse udføres blindt med hensyn til tidspunkter eller genotyper. Cellulære dynamik kan bestemmes ved rekonstruktion af tidsopløste billeder 17, 18. Prøve forberedelse (trin 2 - 5 ovenfor) kræver en uge, men den efterfølgende billedanalyse kræver måneder til et år.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de regler og forskrifter for anvendelsen af ​​dyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Johns Hopkins School of Medicine.

1. Isolering og dyrkning af Mouse hippocampusneuroner

  1. Dissekere cortex fra en postnatal dag 0 - dag 2 (P0 - 2) musehjerne 18. Isoler de astrocytter fra cortex.
    BEMÆRK: musehjerne blev isoleret efter halshugning. Astrocytter tjene som et fødelag for hippocampale neuroner.
  2. Behandle cortex med 800 pi 0,05% trypsin-EDTA i 15 minutter ved 37 ° C for at dissociere astrocytterne.
  3. Kultur astrocytterne i en T-75 kolbe med 13 ml DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 0,2% penicillin-streptomycin i en uge ved 37 ° C og 5% CO2.
  4. Placer en syrevaskede og steriliserede 18 mm dækglaskamre per brønd i en plade med 12 brønde.
  5. Kort fortalt vaskes to 6 mm carboncoatede safir diske i 70% ethanol og placere dem på toppen af ​​hver dækglas.
  6. Forberede Poly-D-Lysin (PDL) opløsning ved at blande 3 ml 17 nM eddikesyre med 1 ml rottehalecollagen og 1 ml PDL (1 mg / ml). Påfør 200 pi af PDL løsning på safir diske og dækglas i 5 minutter ved stuetemperatur.
  7. Fjern PDL løsning og lufttørre. Før anvendelse sterilisere pladen som fremstillet i trin 1,4-1,6 i 30 minutter under ultraviolet lys.
  8. Pode astrocytter fra trin 1.3 i 2 ml DMEM ved en densitet på 5x10 4 celler / brønd i pladen som fremstillet i trin 1.4 - 1.6. Dyrke dem ved 37 ° C og 5% CO2 i en uge.
  9. Tilsæt 20 pi fluor-deoxyuridin (slutkoncentration: 80 pM) til hver brønd i mindst et par timer, før dyrkning af neuroner.
    BEMÆRK: Fluor-deoxyuridin stopper astrocyt division.
  10. Ændre mediet til 1,5 ml af neuronale basal medium (se tabellen of Materials) indeholdende 1% L-alanyl-L-glutamin (se tabellen of Materials), 2% serumfrit supplement for neuronale celler (se tabel of Materials) og 0,2% penicillin-streptomycin .
  11. Forberede papain opløsning ved tilsætning af 20 enheder papain til 5 ml enzymopløsning (1,65 mM cystein, 1 mM CaCl2 og 0,5 mM EDTA i DMEM). Syrne opløsningen ved at lede CO 2-gas i 20 min. Filter-sterilisere med et 0,22 um filter.
  12. Høste hjernen fra en P0 - 2 mus 18. overdrage hjernen til iskold Hanks'-afbalanceret saltopløsning (HBSS). Dissekerer hippocampi under et stereomikroskop, holde vævet nedsænket i HBSS.
  13. Anbring de to hippocampi i 1 ml papain opløsning fremstillet i trin 1.11. Inkuber i 1 h på en termomikser ved 37 ° C og 750 omdr./min.
  14. Erstatte papain med 1 ml inaktivering opløsning indeholdende2,5 mg trypsininhibitor og 0,5 mg albumin pr ml DMEM. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Aspirer off inaktiverende opløsning.
  15. Tilsæt 200 pi neuronal basalmedium (se tabellen of Materials) til det isolerede hippocampus. Udriv anvendelse af en 200 pi pipette tip at dissociere cellerne. Vent til dissocierede celler sig på bunden. Fjern forsigtigt mediet med celler fra toppen.
  16. Gentag trin 1.15 3x. Pool alle de dissocierede celler i en ny 1,5 ml centrifugerør.
  17. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer. Plade neuroner ved en densitet på 6,5 x 10 4 celler / brønd på toppen af astrocyt lag fremstillet i trin 1.1 - 1.10.
  18. Inficere neuroner med lentivirus udtrykker channelrhodopsin ved DIV 3 (3 d in vitro) 18.
  19. Udføre flash-og-fastfrysning af DIV 14, som beskrevet i trin 2.1 - 2.5 nedenfor.

2. Flash-end-Freeze

  1. Fremstilling af fikseringsmiddel
    1. Under en kemisk hætte, tilsæt følgende stoffer til en konisk rør til fremstilling af fiksativ: 2,5 ml glutaraldehyd (10% stamopløsning i acetone), 0,25 g osmiumtetroxid, 0,25 ml vand, og 22,25 ml vandfri acetone.
      BEMÆRK: Slutkoncentrationen af ​​hver komponent bør være 1% i acetone. tilsættes glutaraldehyd at bevare de proteinstrukturer under fryse-substitution. ADVARSEL: Den akutte toksicitet af osmiumtetroxid er høj. Udsættelse for dampe kan beskadige hornhinden i øjet. Det skal håndteres kun i en godkendt kemisk hætte.
    2. Alikvot 1 ml fikseringsopløsning i nummererede kryogene hætteglas (2 ml). Holde fiksativ frosset i flydende nitrogen indtil anvendelse.
      BEMÆRK: Osmiumtetroxid og glutaraldehyd krydsreagerer og udfældes; således er sammenblandet, aliquot straks, cap rørene, og nedsænkes de kryorør i flydende nitrogen for at fryse fiksativ. Brug en blyant til at tælle Cryomed gen-hætteglas, kan da acetone afvaskes markører.
  2. Fremstilling fysiologisk saltvand
    1. Gøre fysiologisk saltopløsning ved blanding Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCI (140 mM), KCI (2,4 mM) og glucose (10 mM).
      BEMÆRK: Disse værdier er endelige koncentrationer. Kryo-beskyttelsesmidler anvendes ikke til monolagskulturer. Imidlertid en ordentlig cryo-beskyttelsesmiddel kræves for prøver tykkere end 5 um. Anvendelsen af ​​20% BSA anbefales typisk. Gær pasta og E. coli OP50 kan også anvendes som cryo-beskyttelsesmidler for fluelarver eller C. elegans.
    2. Tilføj CaCI2 ved 4 mM og MgCI2 ved 1 mM slutkoncentrationer.
      BEMÆRK: Koncentrationerne af CaCl2 og MgCl2 varierer afhængigt af eksperimenter. At sikre indfangning af exocytiske mellemprodukter, er 4 mM calcium anvendt til disse særlige eksperimenter for at øge frigivelsen sandsynligheden for vesikler 18.
    3. Tjekosmolaritet under anvendelse af et osmometer. Sikre, at det er 300 ± 5 mOsm.
    4. Tilføj AMPA-receptorantagonist (NBQX) til en endelig koncentration på 3 uM og GABA antagonist (bicucullin) til en endelig koncentration på 30 uM.
      BEMÆRK: Neurotransmitter receptorantagonister tilsættes for at undgå tilbagevendende netværk aktivitet efter neuronal stimulering 18.
    5. Varme op fysiologisk saltvand til 37 ° C til anvendelse.
  3. Fremstilling af Specialized Højtryks Fryser og en automatiseret Freeze Substitution Unit
    1. Forud for højtryks-frysning, nedkøling en automatiseret fryse substitution enhed til -90 ° C ved at fylde tanken med flydende nitrogen.
    2. Afkøle acetone i en lille kop til -90 ° C ved at anbringe det inde prøvekammeret.
    3. Fyld flydende nitrogen Dewar og opbevaring Dewar af højtryks- fryser (se tabellen of Materials) med flydende nitrogen.
    4. Opsæt lyset stimulation protokol ved hjælp af touch screen skærm.
      1. Navngiv programmet ved at klikke på "Rediger" ud for "Programnavn" på lyset stimulation vinduet. En anden vindue vil poppe op.
      2. Etablere et program ved at skrive "15.000 ms" i "mørk fase", "100 ms" i "periode", "10 ms" i "puls" og "1" i "antal perioder" for en enkelt stimulus på 10 Frk. Fryse cellerne 90 ms senere (figur 1C).
        BEMÆRK: "mørke fase" giver cellerne til at komme sig efter lyseksponering under prøvebelastning. "Periode" definerer stimulering frekvens. For eksempel, hvis stimulus skal anvendes ved 20 Hz, denne kolonne bør fastsættes til 50 ms. "Pulse" definerer varigheden af ​​lyset stimulus. Endelig er "antallet af perioder" definerer det samlede antal stimuli anvendes. For at oprette en højfrekvent stimulering, se venligst
    5. For en "ingen stimulering" kontrol, type "15 s" i "mørk fase," "0 ms" i "periode", "1 ms" i "puls" og "0" i "antal perioder" i lyset stimulering vinduet opsætning som beskrevet i trin 2.3.4.
      BEMÆRK: Som standard "puls" skal være mindst 1 ms.
    6. På hovedskærmen, skal du sørge for, at feltet for lys stimulation er markeret.
    7. Opstil protokol opbevaring ved at klikke på "Prøveopbevaring" på hovedskærmen. Klik på "Rediger". I det følgende vindue, bruge "+" eller "-", for at vælge "2" for at gemme 2 skiver i hver kanal (3 kanaler i alt). Check "Storage LN2 aktiveret."
  4. Sample Loading og Frysning i Højtryks Fryser
    BEMÆRK: Alt prøven montage og lastning trin udføres under et stereomikroskop med en 7.5-60X forstørrelsesområdet. En tweezare anvendes i trin 2.4.1 - 2.4.4 til at manipulere prøver. Eksperimenter skal udføres ved fysiologisk temperatur.
    1. Placere en safir disk, celle-side opad, i brønden af den sorte, midterste plade (figur 1B).
    2. Placer en 100 um spacer ring over safir disk (figur 1B).
    3. Placere en tom safir disken via afstandsring (figur 1B) efter dypning ene side af skiven i foropvarmede saltvandsopløsning fra trin 2.2. Sørg for, at der er fanget luftbobler mellem de to safir diske.
    4. Placer en anden 100 pm afstandsring og en 400 um afstandsring (figur 1B). Fjern den ekstra væske ved hjælp filtrerpapir.
    5. Placer samlingen fra trin 2.4.3 mellem de to transparente halvcylindre (figur 1A). Luk det øverste røde dæksel at indlede fryseprocessen.
      BEMÆRK: Den forudindstillede protokol kører automatisk, når låget er lukket. Prøven forbliver i den samme orientering i fryserummet, og et lysglimt påføres fra toppen af ​​prøven forsamling. Den røde dæksel popper op igen automatisk, når frysningen er fuldført.
    6. Opbevar modellen i lageret Dewar.
      BEMÆRK: Efter frysning bliver prøven automatisk falde ned i et lager Dewar fyldt med flydende nitrogen og opbevaret der, indtil yderligere bearbejdning. Opbevaring Dewar har tre kamre, og hvert kammer kan indeholde op til 3 prøver på mest. Typisk anvendes to eksemplarer nedfrosset under de samme stimuleringsbetingelser, og højtryks-fryser er programmeret til at lagre både i det samme kammer.
    7. Gentag trin 2.4.1 - 2.4.6 til hver prøve.
    8. Fortsæt til trin 2.5, når alle kamrene er fulde.
      BEMÆRK: Enheden blev sat til at lagre op til 6 prøver i opbevaring Dewar ad gangen. Derfor, efter hver 6. prøve, trin 2.5 skal udføres. Når losses Gentag trin 2.4.1 - 2.4.6.
  5. Prøve Indsamling og overførsel til en automatiseret Freeze-substitution Unit
    1. Åbne døren til opbevaring dewarkar, som er placeret under bordet af højtrykssiden fryser. Fjern opbevaring Dewar og placere den på stationære.
    2. Ved hjælp af hænder, fjern prøvekammer fra dewar-karret og overføre den i den specialiserede prøvebakke fyldt med flydende nitrogen. Lås knappen for at frigøre prøven kop.
    3. Fjern de transparente halvcylindre fra prøvekoppen bruger pincet efter forkøling spidserne af pincet med flydende nitrogen (~ -196 ° C). overføre omhyggeligt midten, sort plade til en lille kop indeholdende flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Spidserne af pincetten skal forafkølet til temperaturen for flydende nitrogen. Prøven skal opbevares under flydende nitrogen til altid at forhindre iskrystaldannelse.

3. Freeze Substitution i Automated Freeze-substitution Unit

  1. Anvendelse forkølede pincet (tip på ~ -196 ° C), hurtigt at overføre midterpladen fra trin 2.5.3 til forud afkølet acetone (-90 ° C).
  2. Adskil safir disken fra midten plade ved forsigtigt at ryste eller banke.
    BEMÆRK: Indimellem kan det være svært at adskille safir disken fra midten plade. I en sådan situation, forlade midterpladen i forafkølet acetone (-90 ° C) i nogle få minutter. Blid aflytning med pincet hjælper også at dissociere safir fra midten plade.
  3. Placer en kryogen hætteglas indeholdende fikseringsmidler (trin 2.1) inde i et prøvekammer af substitutionen enhed. Overfør safir disk til den kryogene hætteglas og placere en hætte på hætteglasset.
  4. Opsætte fryse substitution program som følger: (i) -90 ° C i 5 - 30 t, (ii) -90 - -20 ° C i 14 timer (5 ° C / h), (iii) -20 ° C i 12 timer, og (iv) -20 ° C - 20 ° C i 4 timer (10 ° C / time).
    BEMÆRK: duration af det første trin ved -90 ° C kunne varieres. Den samlede varighed af fryse substitution indstilles på en sådan måde, at programmet udløber i morgen (~ 1,5 d postexperiment) omkring 8 am så der kan udføres de efterfølgende trin i dagtimerne.

4. Infiltration og plast Embedding med epoxyharpiks

  1. Når programmet slutter, bruge behandskede hænder til at overføre kryogene hætteglas indeholdende safir skiver fra prøven kammer udskiftningen enhed til en kemisk hætte.
  2. Med pipette tilsættes acetone (stuetemperatur) til hver kryogene hætteglas og vask hver safir skive 4 - 6x i 1 - 2 timer.
  3. Eventuelt inkuber prøverne i 0,1% uranylacetat i 1 time, hvis ekstra kontrast. Vask 4 - 6x med acetone i løbet af 1 - 2 timer.
    BEMÆRK: ADVARSEL: Der er risiko forbundet med intern bestråling følge af inhalation af uranylacetat, som medfører irritation af de øvre luftveje. Høj eksponering kan DAMAGe blodlegemer. Arbejde med uranylacetat bør ske under udsugning. Beskyttelsesdragt anbefales.
  4. Forberede flydende epoxyharpiks medium ved vejning 6,2 g glycerol polyglycidylether, 4,4 g bisphenol-A epoxyharpiks og 12,2 g dodecenylravsyreanhydrid (DDSA). Bland grundigt og tilsæt 800 uL af benzyl dimethylamin (BDMA) under blanding. De-gas i 10 minutter.
  5. Forbered 30, 70, og 90% epoxyharpiks i acetone fra 100% epoxyharpiks fremstillet i trin 4.4.
  6. Tilsæt 30% epoxyharpiks til kryogene hætteglas indeholdende safir diske og der inkuberes i 2 - 3 timer ved stuetemperatur i en orbitalryster ved 120 rpm.
  7. Erstatte 30% epoxyharpiks med 70% epoxyharpiks ved pipettering og inkuberes i 3 - 4 timer ved stuetemperatur i en orbitalryster.
  8. Med en pincet, overføre hver safir disk, celle-side-up, til hætten af ​​en indlejring kapsel. Tilføje 90% epoxyharpiks til hætten. Inkuber O / N ved 4 ° C.
  9. Den næste dag, lave frisk epoxyharpiks medium som i trin 40,4.
  10. Overfør hver safir disk, celle-side opad, til hætten af ​​en indlejring kapsel. Fyld hætten med frisk fremstillet 100% epoxyharpiks. Skift til frisk 100% epoxyharpiks hver 2 timer, gentaget tre gange.
  11. Placere prøverne i en 60 ° C ovn i 48 h for at polymerisere.

5. Montering Prøver

  1. Anbring prøven på hovedet på stereomikroskopet således at safir skive er placeret i toppen af ​​harpiksen blok. Fjern det tynde lag af epoxyharpiks fra toppen ved at ridse det med et barberblad.
  2. Under anvendelse af et barberblad, skære en lavvandet linje langs kanten af ​​safir disk; denne linje er med til at adskille safir disk fra epoxyharpiksen i trin 5.3.
  3. Adskil safir disk fra epoxyharpiksen ved at dyppe det i flydende nitrogen i ca. 10 s.
    BEMÆRK: Cellerne vil forblive i epoxyharpiksen.
  4. Efter fjernelse af safir disk, bruge et dissektionsmikroskop for at finde et område med celler (4-10 x forstørrelse). Skåret omkring regionen af ​​interesse (~ 2 x 2 mm) ved anvendelse af et barberblad (tveægget). At holde prøven på plads, udføre dette trin, mens prøven tapes til overfladen af ​​mikroskopet.
  5. Montere lille stykke plastik (~ 2 x 2 x 5 mm) indeholdende cellerne med lim indeholdende ethylcyanoacrylat på en cylindrisk dummy blok lavet af epoxyharpiks. Inkuber blokken ved 60 ° C i 1 time.

6. Sektionsinddeling

  1. Brug et ultramikrotom til afsnittet prøven.
    1. Trimme overfladen af ​​plast-indlejrede prøve med et glas kniv med en hastighed på 3 mm / s og en tykkelse på 200 nm / sektion. Skær 4 - 5 sektioner fra overfladen, hvor astrocytterne er placeret.
    2. Skifte til en diamant kniv og snit med en hastighed på 0,8 mm / s og en tykkelse på 40 nm / sektion. Skær 20 - 25 sektioner.
  2. Indsamle bånd af afsnittene om single-slot kobbergitre dækket med 0,7% polyvinylacetat (seTable of Materials).

7. Imaging Ved hjælp af en transmission (TEM)

  1. Inden TEM billeddannelse, plette afsnittet med 2,5% uranylacetat i methanol i 5 min.
  2. Vask gitteret 15x i 50% methanol. Derefter vaskes i ultrarent vand 15x, med hver vask varede 30 s.
  3. Kortvarigt lufttørre sektionen og placere risten i en prøveholder af TEM.
  4. Billede på 93,000X forstørrelse.
  5. Acquire billeder.
    BEMÆRK: Billedbehandling sker typisk blind for de tidspunkter eller genotyper, og typisk ~ 200 billeder indsamles / tidspunkt.

8. Billedanalyse

  1. Analyser billeder ved hjælp af en software (f.eks ImageJ) med en brugerdefineret makro (Watanabe, Davis, og Jørgensen, upubliceret).
    BEMÆRK: x / y koordinater registreres fra vesikler, plasmamembranen, den aktive zone membran, og alle andre membranbundne organeller ved synapser. Teksten files der indeholder de oplysninger, der eksporteres til en anden software (fx Matlab). Dataene analyseres yderligere hjælp brugerdefinerede programmer.

Representative Results

Under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, udførte vi "Flash-og-freeze" eksperimenter i mus hippocampale neuroner udtrykker channelrhodopsin. Disse neuroner blev frosset enten 15 ms eller 100 ms efter lys-starttidspunktet. Vi har tidligere vist, at eksocytose og endocytose af synaptiske vesikler forekommer i de synaptiske terminaler ved de 15 ms og 100 ms tidspunkter, henholdsvis 18. Disse hændelser blev korrekt indlæst på passende tidspunkter (figur 2), hvilket antyder, at flash-og-freeze eksperimenter med held kan foretages på det valgte specialiserede højtryks-fryser (se tabellen of Materials).

figur 1
Figur 1. Eksempel på indlæses og programmering i Højtryks Fryser. A) Prøve ladebordet af en høj-pressure fryser. Midterpladen, vist i indsættelsen til strukturel detalje, anbringes i en CLEM holder til prøvepåsætning. En af halvcylindrene er anbragt i den nederste del af prøven ladebordet, og den anden er fastgjort med en klemme til topdækslet. Når prøven er indlæst, er midterpladen skubbet fremad til bunden halvcylinder og låget lukkes at initiere frysning. B) Specimen samling. Safir disk neuroner anbringes i brønden af ​​den midterste plade, med cellen-opad. En 100 um ring er placeret direkte over safir disk inde i brønden. Derefter en tom safir disk dyppet i fysiologisk saltvand placeret med opløsningen nedad. skal undgås luftbobler. Endelig en 100 pm ring og en 400 um ring stramt placeret over. Alle ekstra væske fjernes med filtrerpapir. C) Et tværsnit af en indlejring kapsel med safir disk nedsænket i epoxyharpiks. den sappleje disk er placeret i bunden af ​​kapslen, med cellen-side opad og dækket med epoxyharpiks for infiltration og forankring. D) Programmering af højtryks-fryseren i en enkelt, 10 ms stimulus. Prøverne nedfryses 90 ms efter lyspuls. E) Programmering af højtryks-fryseren i 10 stimuli ved 20 Hz. Prøverne nedfryses 5 ms efter den sidste lyspuls. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2. Visualisering af exocytose og Endocytose i Mouse hippocampale neuroner. Hippocampusneuroner stimuleres en gang og frosset ved de angivne tidspunkter. -Billeder viser den exocytose af en synaptisk vesikel A) og ultrahurtig endocytose Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den "Flash-og-freeze" tilgang visualiserer membran dynamik ved at inducere en særlig cellulær hændelse med optogenetics og ved at fryse cellerne ved definerede tidspunkter efter stimulering 19. I denne demonstration benyttede vi channelrhodopsin, en lysfølsom kationkanal, stimulere neuroner og fanget fusionen og genvinding af synaptiske vesikler i de synaptiske terminaler. I de senere år har mange optogenetic værktøjer der udviklet 22, 23, som alle er kompatible med flash-og-fryse. For eksempel kan organel handel induceres under anvendelse lysinduceret heterodimerisering af cryptochrome og CIB1 24. Tilsvarende kan lipidsammensætningen af plasmamembranen ændres af lysinduceret translokation af phosphoinositid phosphataser til plasmamembranen 25. Desuden er små, lysfølsomme forbindelser som azobenzen lmange konformation afhængigt af illuminationsbølgelængder. Denne konformationelle ændring kan anvendes til aktivering ligandstyrede kanaler eller for at ændre lipidsammensætning i membranen 26, 27. Bur forbindelser kan også anvendes til at inducere cellulær aktivitet. Dog kan LED anvendes i den nuværende opsætning ikke producere nok energi til uncaging; således, yderligere optimeringer af systemet sandsynligvis nødvendigt. Ikke desto mindre er anvendelser af disse lys-aktiverbare værktøjer er fleksible-mange cellulære hændelser kan induceres ved et lysglimt. "Flash-og-freeze" kan fange de resulterende membran dynamik.

Der er to primære begrænsninger for metoden "flash-og-freeze". For det første fanger "snapshots" af en bestemt begivenhed fra forskellige celler. Med andre ord er det ikke muligt at følge membran dynamik i en celle i løbet af en tidsperiode. Således til genopbygning af enhver cellulær selvt, må man erhverve og analysere et stort antal billeder fra hver prøve og på hvert tidspunkt. Endvidere i neuroner, et endnu større antal billeder er nødvendigt, da fusionen af synaptiske vesikler kun finder sted i 20 - 30% af synapserne i muse hippocampale neuroner 18, 28. Analysen af ​​en så stor datasæt kræver enorme mængder af tid. I fremtiden billedet indsamling og analyse skal automatiseres for at gøre tilgangen mere effektiv 29, 30.

Den anden begrænsning pålægges af naturen af ​​højtrykssiden frysning teknik. Når celler fryse, cellulær vand omlejres til dannelse iskrystaller hvis frysehastigheden er under 100 K / s 21. Disse iskrystaller kan trænge membraner eller koncentrat opløste stoffer til at ændre lokal osmotisk tryk, hvilket resulterer i brud på membraner. At undgå iskrystaller, farerneh tryk (~ 2.000 atm) påføres enhederne. På grund af den super-kølende effekt, en frysning på 100 K / s er tilstrækkelig til at forhindre vand i at danne iskrystaller ved dette tryk 21. I teorien prøver så tykke som 500 um kan fryses uden iskrystaller, men ca. 200 um sandsynligvis den praktiske grænse, som kubiske former for is tendens til at danne i tyk væv, kompromittere morfologi. Ved behandling af prøver tykkere end 5 um, anvendelsen af ​​en ordentlig cryo-beskyttelsesmiddel, såsom BSA, er nødvendig. Dog vil BSA ændre osmolariteten af ​​opløsningen og kan påvirke fysiologiske respons af celler. Derfor kræves omfattende forsøg kontrolforanstaltninger for at validere anvendelse af BSA i særlige systemer. Iskrystaller kan også dannes efter højtryks-frysning hvis prøverne uheld fjernes fra den flydende nitrogen-bad. Således er det kritisk at holde prøver i flydende nitrogen ved alle tider og anvende forafkølet pincet tilmanipulere dem.

Når man planlægger eksperimenter, bør overvejes følgende tre punkter. Første, den maksimale intensitet af lys (460 nm linien) er 5,5-8,0 mW / mm2. Hvorvidt denne intensitet er tilstrækkelig til at inducere aktivitet skal verificeres med live-cell imaging på et fluorescensmikroskop før flash-og-freeze eksperimenter. For det andet skal udføres forsøg ved fysiologisk temperatur. Den fase af højtryks-fryser opvarmes til 37 ° C i forsøgene med mus hippocampusneuroner 31. Endelig skal tidspunkter omhyggeligt udvalgt til at fange membran dynamik. Indledende undersøgelser indikerede, at endocytose er fuldstændig efter 100 ms af stimulation. Således blev tre yderligere tidspunkter (15, 30, & 50 ms) også undersøgt for at følge de membran dynamik 17, 18. Disse tidspunkter var nødvendige for at visualisere membran handel begivenhedsek i synaptisk transmission. Men kravet om antallet af tidspunkter er forskellige i hver celle begivenhed. Derfor bør der udtages prøver nogle tidspunkter inden initiering store datasæt samling.

Disclosures

Open Access offentliggørelsen af denne artikel blev sponsoreret af Leica Mikrosysteme GmbH.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra Johns Hopkins University (SW). Vi takker Johns Hopkins School of Medicine Microscope faciliteten for deres tekniske support. Vi takker Erik Jorgensen og Christian Rosenmund og medlemmer af deres laboratorier for udviklingen af ​​teknikken. Vi takker M. Wayne Davis for udformningen af ​​den oprindelige enhed. Vi takker Paul Wurzinger, Cveta Tomova, og Delgermaa Luvsanjav for deres tekniske bistand. Vi takker også Natalie R. Hamilton og Grant F. Kusick for deres kritisk læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System  for Light and Electron Microscopy -AFS II Leica 
High Pressure Freezer - EM-ICE Leica  EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.
Osmometer Gonotec
Ultramicrotome UC7 Leica 
Oven Blue M
Razor blade Personna
Glutaraldehyde EMS 16530
Osmium tetroxide EMS RT19132 Toxic, open only under certified chemical hood
Acetone EMS RT10016
HEPES Emdmillipore 391340-250GM
Glucose Sigma 49159-1KG
KCl Sigma 746436-1KG
NaCl Sigma S7653-1KG
CaCl2 Sigma 21115-250ML
MgCl2 J.T.Baker 2444-01
Liquid epoxy resin Eponate 12 Ted Pella 18028
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 Ted Pella 18028
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) Ted Pella 18028
Benzyl dimethyl amine (BDMA) Ted Pella 18241
Special embedding (BEEM) capsule EMS 70021
Copper Grid Ted Pella 1GC12H
Polyvinyl acetate (Pioloform F) Ted Pella 19244
Uranyl acetate Polysciences 21447-25
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) Scotch 170497
Trypsin-EDTA Themo scientific 25300-120
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Thermo scientific 10569-044 Should be warmed to 37 °C before use
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo scientific 26140-079
Pen-Strep Thermo scientific 15140-122
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503
Glass cover slip Fisher S175223 Should be acid-washed
Sapphire disc Technotrade 616-100
Acetic acid Emdmillipore 1000631011
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma P6407
Rat tail collagen Thermo scientific A10483-01
Neurobasal A Fisher 10888022 Should be warmed to 37 °C before use
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Fisher 35050-079
Seraum free supplement  (B-27)  Fisher 17504044
Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific 24020117
Papain Worthington LS003126 Active Unit should be calculated for each batch
Thermomixer Eppendorf  Thermomixer C
Trypsin inhibitor Sigma T9253
NBQX Tocris 03-731-0
Bicculine Tocris 01-091-0
Whatman I filter paper GE
Transmission Electron Microscope Philips CM20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
  2. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
  4. Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
  5. Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
  6. Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
  7. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
  8. Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
  9. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
  10. Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
  11. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  12. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  13. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  14. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  15. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  16. Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
  17. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
  18. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
  19. Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
  20. Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
  21. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  22. Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
  23. Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
  24. van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
  25. Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
  26. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
  27. Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
  28. Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
  29. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
  30. Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
  31. Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).

Tags

Cellular Biology elektronmikroskopi optogenetics synapse membran dynamik fryse substitution channelrhodopsin højtryks-frysning exocytose endocytose tidsopløst elektronmikroskopi flash-og-freeze
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe,… More

Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe, S. Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55664, doi:10.3791/55664 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter