这个协议描述混合鼠小肠细胞的分离和培养。这些一次肠培养使底层使用多种技术肠肽分泌信号转导途径的研究。
肠道是身体最大的内分泌器官,与沿着胃肠上皮的长度位于激素分泌的肠内分泌细胞。尽管他们的生理意义,内分泌细胞仅代表上皮细胞群的一小部分,在过去,它们的特征已经呈现从而对细胞系模型的依赖相当大的挑战。在这里,我们提供一种用于混合鼠小肠细胞的分离和培养的详细协议。这些原代培养物已被用于识别响应于数营养素和神经肽以及药理学试剂的刺激与肠肽分泌的抑制的基础的信号传导途径。此外,在利用转基因荧光记者小鼠的组合,我们已经证明,这些原代培养成为荧光标记的内分泌细胞的在中考的有力工具细胞外水平,使用诸如膜片钳和单细胞钙和cAMP-FRET成像。
此方法的总的目标是分离和培养混合鼠肠细胞,使肠肽分泌和内分泌细胞的活细胞成像的研究。这个程序的早期版本被莱曼等人最初发表于2008年。 1并从此形成从我们的基团的进一步的出版物20的基础。对于这个手稿中,我们选择把重点放在小肠文化,因为他们更有挑战性的建立比结肠文化。
肠内分泌细胞分泌肠肽,包括胰高血糖素样肽1(GLP-1),葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP),缩胆囊素(CCK)和肽YY(PYY)2的阵列。这些肠肽在组织协调餐后反应,如消化道中转,葡萄糖刺激的胰岛素释放和饱腹感的诱导增强的放缓重要的生理作用。 GLP-1模拟物一第二抑制其降解的药物,目前许可用于2型糖尿病的治疗和有刺激该肽3的内源性分泌的治疗潜力的持续评估。更好地理解肠内分泌生理学的和通过分泌要么刺激或抑制的机制,因此,极为重要的。
肠肽分泌可以使用多种体外和离体实验模型,各有优点和缺点进行研究(为一个综合最近的综述也涵盖使用体内模型的看到斯文森等人 4)。 离体技术,例如离体灌注肠5和尤斯灌流室6当前正在使用的探索响应于各种物质肠肽的分泌。这些方法的主要优点,如相比原代培养物,是肠内分泌细胞的直接环境保持基本完好,并重要的是,细胞的极性被保留。因此,有可能引起关于促分泌作用于6,其细胞表面的信息。然而,这些通常是低通量技术和衍生自它们的数据的质量在很大程度上依赖于肠组织的完整性和存活,这不可避免地随时间降低。
肠类器官,现在越来越多地被用作体外模型肠内分泌细胞的功能和发展7的研究。类器官,它可以从鼠和人体组织中得到,具有形成3D“隐窝样”维持在培养物中的细胞极性结构的益处。然而,类器官衍生的肠内分泌细胞还没有得到充分的表征,并且它们的相似性,以天然I CELLS仍然知之甚少。原代培养物具有作为一个步骤更接近生理的设置的优点,因为肠内分泌细胞不保持并在延长的时间段人工条件区分。
其已经用于肠肽分泌的评估的替代原代培养物的方法是大鼠胎儿肠细胞(FRICS)8的分离。但是,成人肠组织的培养已遇到了以下的成功和一些差异已经在FRICS 对成年鼠肠细胞( 例如,葡萄糖8)的响应性被观察到。
肠内分泌样细胞系( 例如的GLUTag,STC-1和NCI-H716)在传统上被用来直接VS进行区分。上肠内分泌细胞和解剖耦合刺激分泌的分子机制间接影响;看到Kuhre 等 </em>。 9,用于肽的产生和分泌由“L细胞样”永生化细胞系。这一直是必要的,因为内分泌细胞,沿着胃肠道错落,构成略低于肠上皮细胞10和分选细胞的1%,在我们的手中,不要在文化生存1。细胞系留由于事实,他们是一个基本上均一的细胞群这有利于遗传操作,例如基因沉默的有用工具。因此,很容易调查不能药理针对性,在转基因小鼠不可蛋白质的作用。然而,细胞系并不总是原代细胞的有效模式。虽然有许多相似之处,从原代培养物已有时强调了通过在初级L细胞某些营养素相比的GLUTag细胞中激活的信号传导途径的差异的研究结果,例如( 例如 ,蛋白胨<SUP类= “外部参照”> 11)。至关重要的是,在转基因的荧光报告小鼠组合中,原代培养物模型使在细胞内水平各个初级的肠内分泌细胞的详细检查。原代培养物中的荧光标记的L细胞已被用于我们的组补丁夹紧1,12研究,和单细胞钙11,13和环磷酸腺苷-FRET成像14周的研究中,已在肠内分泌领域得到显著进展生理。
以下协议用于执行分泌实验,使用24孔板或用于多达16对成像菜肴的准备进行了优化,从一个单一的成年小鼠的小肠的10厘米的部分。该协议可以通过增加的消化时间和共同被容易地修改为结肠细胞中的研究llagenase浓度。
这个协议描述混合鼠小肠细胞的分离和培养,以使肠肽分泌和标记的肠内分泌细胞的单细胞成像的研究。
为了增加小肠培养物获得成功的可能性,重要的是,该协议被尽可能迅速地进行(理想地,收获的组织的3小时内),并且所述组织保持在冰冷的培养基或前缓冲在消化过程中,限制细胞死亡。虽然它不是必需的,尤其对于结肠文化,切除小肠肌肉层的大力鼓励。小肠文化协议已经标准化,尽可能。然而,需要注意的是没有消化过程是相同的是非常重要的。有此协议期间多的步骤,其中可以在一天到一天的基础上引入例如肌肉去除程度的可变性,T的大小他“切碎”组织片,摇动的强度,特定批次胶原酶等的效力。因此,极为重要的检查每个不同的“消化”的等分试样,在显微镜下评估消化过程和裁缝摇动的进步和“消化”相应的数量。建议更多轻轻摇晃,开始用和,隐窝碎片不会从明显的“消化” 3日起,开始更用力摇晃。
根据我们的经验,内分泌细胞不增殖培养和小肠培养4天之内,通常丢失。尽管如此,这允许执行肠肽分泌实验充裕的时间来测试生理刺激和/或药理学试剂(典型地在2个小时内,18-24小时后镀进行)。之前的分泌实验需要过夜孵育实验也是可行的例如在预治疗与百日咳毒素15的情况。
这里介绍的原代培养技术是一种行之有效的方法,通过研究将其输出多年来产生的体积所证明的。原代培养物模型已被用于研究多种肠肽,包括GLP-1 1,GIP 18和PYY 19的分泌,响应于不同的营养物和非营养14,20刺激和抑制剂。另外,同样的技术已经成功地应用于人体肠道细胞21的培养物。通常,原代细胞培养方法的一个额外的实验模型如沿的组合。 离体或在体内能提供最洞察6。值得注意的是和其他方法相比,该技术具有IMportant应用超出肠肽释放的测量。我们已经证明,从转基因报告小鼠衍生的原发性小肠培养物是用于耦合到肠肽分泌细胞内信号通路的询问有力工具,分别使用例如钙和cAMP传感器,GCaMP3 11,13和Epac2camps 14日 ,以及电生理技术12。
如同所有的体外模型中,主肠培养具有某些固有的局限性,包括培养物中的上皮细胞极性的损失,以及血液供应和神经支配的损失。这是很难估计的肠内分泌细胞的功能,这些人工条件的潜在影响。然而,从原代培养物中获得的数据往往是在体内 setti平移NG(短链脂肪酸对GLP-1分泌15 例如影响)。
主要的肠道文化与许多潜在应用的通用技术。他们已经提供了重要的机械洞察肠肽分泌的调节。
The authors have nothing to disclose.
GLP-1的免疫测定,由核心生化分析实验室的Addenbrooke医院进行。
这项工作,多年来,得到了威康信托基金会的支持(目前活跃的补助106262 / Z / 14 / Z和106263 / Z / 14 / Z)和医学研究理事会(MRC)(赠款MRC_MC_UU_12012 / 3和MRC_MC_UU_12012 / 5)。
24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |