Summary
Этот протокол описывает выделение и культуру смешанных мышиных клеток тонкого кишечника. Эти первичные культуры кишечника позволяют исследование сигнальных путей, лежащих в основе секреции пептида кишечника с использованием ряда методов.
Abstract
Кишка является самым большим эндокринным органом тела, с энтероэндокринные клеток, секретирующих гормон-расположенных вдоль длины желудочно-кишечного эпителия. Несмотря на их физиологическое значение, энтероэндокринные клетки представляют собой лишь небольшую часть населения эпителиальных клеток и в прошлом, их характеристика представила значительные трудности в результате в зависимости от модели клеточных линий. Здесь мы приводим подробный протокол для выделения и культуры смешанных мышиных клеток тонкого кишечника. Эти первичные культуры были использованы для идентификации сигнальных путей, лежащих в основе стимуляции и ингибирование секреции пептида кишечника в ответ на ряд питательных веществ и нейропептиды, а также в качестве фармакологических агентов. Кроме того, в сочетании с использованием трансгенных флуоресцентных мышей репортера, мы показали, что эти первичные культуры стали мощным инструментом для исследования флуоресцентно меченного энтероэндокринных клеток в инtracellular уровень, используя методы, такие как патч зажима и одноклеточного кальция и визуализации цАМФ-FRET.
Introduction
Общая цель этого метода заключается в изоляции и культуры смешанных мышиные клеток кишечника для того, чтобы исследования секреции кишечника пептидов и клеточной визуализации энтероэндокринных клеток живой. Ранняя версия этой процедуры была впервые опубликована в 2008 году Рейман и др. 1 и с тех пор легли в основу еще 20 публикаций из нашей группы. Для этой рукописи, мы решили сосредоточиться на небольших кишечных культурах, поскольку они являются более сложными, чтобы установить, чем ободочная культур.
Энтероэндокринные клетки секретируют множество кишечных пептидов , включая глюкагон-подобный пептид 1 (GLP-1), глюкозо-инсулинотропный пептид (GIP), холецистокинин (CCK) и пептида YY (PYY) 2. Эти кишечные пептиды играют важную физиологическую роль в организуя постпрандиальную реакцию, такие как замедление транзита кишечника, потенцирование глюкозо-стимулированной секреции инсулина и индукции сытости. GLP-1 миметики ай препараты , которые ингибируют его деградацию в настоящее время лицензированы для лечения сахарного диабета 2 -го типа и существует постоянная оценка терапевтического потенциала стимулировать секрецию эндогенной этого пептида 3. Лучшее понимание энтероэндокринных физиологий и механизмы, с помощью которых секреция либо стимулируется или подавляется, таким образом, решающее значение.
Gut секреции пептида может быть изучена с помощью различных в пробирке и бывших естественных экспериментальных моделей, каждая имеет свои преимущества и недостатки (для всестороннего недавнего обзора также охватывающее использование моделей в естественных условиях см Свендсен и др. 4). Ex естественных условий методы , такие как изолированная перфузия кишечника 5 и Ussing камеры 6 в настоящее время используется для изучения секреции пептида кишечника в ответ на различные вещества. Главное преимущество этих методов, так какпо сравнению с первичными культурами, является то, что непосредственное окружение из энтероэндокринных клеток остается в значительной степени нетронутого и, что важно, сохраняется полярность клеток. Таким образом, можно вызвать информацию о том, какие клетки поверхность а секрецию действует на 6. Однако, эти методы, как правило, низкой пропускной способности, а качество данных, полученных из них в значительной степени зависит от целостности и жизнеспособности ткани кишечника, что неизбежно снижаться с течением времени.
Кишечные органоиды теперь все чаще используются в качестве моделей в пробирке для исследования функции и развития 7 энтероэндокринных клеток. Органоиды, которые могут быть получены как из мышиных и человеческих тканей, имеют преимущество формирования 3D «крипт-подобный» структур, которые поддерживают полярность клеток в культуре. Тем не менее, органоидные полученные энтероэндокринные клетки до сих пор не полностью охарактеризованы, и их сходство с нативным L CELLs остается в значительной степени неизвестны. Первичные культуры имеют преимущество быть на шаг ближе к физиологическому установке, поскольку энтероэндокринные клетки не сохраняются и дифференцируются в искусственных условиях в течение длительных периодов времени.
Альтернативный метод первичной культуры , которая была использована для оценки секреции кишечника пептида является выделением кишечных клеток плода крысы (FRICS) 8. Однако культура кишечной ткани взрослого встретился с меньшим успехом , и некоторые различия наблюдались в отзывчивости FRICS против взрослых мышиных клеток кишечника (например , глюкозы 8).
Энтероэндокринные подобные клеточные линии (например , GLUTag, STC-1 и NCI-H716) традиционно используется , чтобы различать прямые против. косвенное воздействие на клетки и энтероэндокринных рассекать основные молекулярные механизмы сцепных стимул секрецию; см Kuhre др 9 для производства и пептида секреции «клеточноподобных L» иммортализованных клеточных линий. Это было необходимо , так как энтероэндокринные клетки, разбросанные вдоль желудочно - кишечного тракта, составляет чуть менее 1% эпителиальных клеток кишечника 10 и отсортированных клеток, в наших руках, не выживают в культуре 1. Клеточные линии остаются полезными инструментами в связи с тем, что они в значительной степени гомогенной клеточной популяции, которая способствует генетическим манипуляциям, таким как ген-глушители. Следовательно, легко исследовать роль белков, которые не могут быть целевыми фармакологический, когда трансгенные мыши не доступны. Однако, клеточные линии, не всегда действующие модели первичных клеток. В то время как есть много общих черт, выводы из первичных культур по поводу определения различий в сигнальных путях , активируемых определенных питательных веществ в первичных L клеток по сравнению с клетками GLUTag, например , (например, пептоны <вир класс = "внешние ссылки"> 11). Важно отметить, что в сочетании с трансгенными флуоресцентными мышами репортера, модель первичной культуры дает детальное изучение отдельных первичному энтероэндокринные клеток на внутриклеточном уровне. Флуоресцентно-меченый L клеток в первичных культурах, были использованы нашей группой для патч зажима 1, 12 исследований, а также для одной ячейки кальция 11, 13 и циклический аденозин монофосфат-FRET изображений 14 исследований, которые были достигнуты значительные успехи в области энтероэндокринные физиология.
Следующий протокол оптимизирован для выполнения экспериментов секреции, с использованием 24-луночного планшета с или для приготовления до 16 блюд изображений, из секции 10 см тонкой кишки от одной взрослой мыши. Протокол может быть легко модифицирован для изучения ободочных клеток путем увеличения времени пищеварения и сотрудничестваllagenase концентрация.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Кембриджского университета защиты животных и этической экспертизы органа и сообразуйтесь с животными (научные процедуры) Закон 1986 Поправки Положение (SI 2012/3039).
1. Подготовка заранее
- Поместите аликвоты базальной мембраны матрицы (BMM) (~ 200 мкл) на льду растаять.
Примечание: БММ затвердевает при комнатной температуре (RT). - Предварительно теплой 50 мл стерильной высокой глюкозы Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), (без добавок) и ~ 40 мл стерильной культуральной среды Игла (DMEM с высоким глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина (P / S) и 2 мМ L-глутамина) в 50 мл центрифужные пробирки на водяной бане при температуре 37 о С.
- Предварительно простуда кальций и магний-содержащие забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
- Взвесить 15 мг коллагеназы (XI сырой), добавляют к 50 мл центрифужную пробирку и держать его на льду.
2. Ткань Коллекция
- Добавить ~ 20 мл L-15 среды в 50 мл центрифужной пробирки и поместить его на льде.
- Эвтаназии мыши по цервикальной дислокации, или другой утвержденный график 1 метод.
Примечание: Кишечные ткани, как правило, получают от мышей на фоне C57BL6. Тем не менее, другие генетические фоны были также использованы , например , 129 / SvEv 15. Обработки изображений эксперименты требуют использования флуоресцентных мышей репортера , например , Glu-Венера 1. Ткань получается из взрослых мышей (2-6 месяцев) обоих полов. Мыши размещены в индивидахLLY вентилируемые клетки при свободном доступе к воде и корму регулярно. Однако эксперименты , чтобы проверить эффект высоких содержания жиров, например, на функции энтероэндокринных ячеек 16 может быть выполнено , если поддерживается лицензией проекта. - Рассеките и осторожно удалить кишечник мышей (от привратника, чтобы начать прямую кишку) с помощью щипцов и рассечения ножницы. Храните его в L-15 среды на льду до использования.
3. Подготовка ткани
- Поместите ткань кишечника в 10 см чашку Петри, содержащую достаточное количество PBS, чтобы покрыть ткань. Взять 10 см нужной ткани (например , верхней части тонкой кишки, 10 см, верхние дистальнее привратника).
- Промыть содержимое кишечника с помощью пластиковой пипетки Пастера и охлажденной PBS.
- Использование щипцов, осторожно сцепление один конец кишечного сегмента и поместите кончик пипетки Пастера в него. Промыть содержимое с помощью охлажденного PBS. Повторять с обоих концов до Майоrity содержимого был промыт. Переложить в чистую чашку Петри, содержащую свежий охлажденный PBS.
- С помощью пинцета удалите ткани жировой и брыжейки, следя за тем, чтобы не снять мышечный слой одновременно.
- Пил мышечный слой от «как носок» под микроскопом рассекает с помощью двух наборов тонких щипцов.
Примечание: Этот шаг не является обязательным, но настоятельно рекомендуется. Есть альтернативные способы удаления мышечного слоя к описанным здесь. Например, кишечник может быть разрезан в продольном направлении первого, перед удалением мышечного слоя.- Найдите начальную точку на более проксимальном конце ткани, где есть видимый лоскут мышцы. Осторожно отстраниться небольшое количество мышечного слоя весь путь вокруг кишечника.
Примечание: Для того, чтобы избежать разрыва мышечного слоя или кишечного эпителия, уменьшить силу натяжения путем зажима большой площади поверхности, а не с помощью тизобр тонкодисперсных щипцов. - Зажим кишечника и, как большая часть мышечного лоскута, насколько это возможно, аккуратно растащить и начать отслаиваться мышечный слой из вокруг кишечника. Во избежание разрыва как мышечный слой и эпителий, сохранить перенастройки положение щипцов, чтобы держать их близко друг к другу. Таким образом, удалить мышечный слой от всей длины кишечного сегмента и отбрасывать.
- Найдите начальную точку на более проксимальном конце ткани, где есть видимый лоскут мышцы. Осторожно отстраниться небольшое количество мышечного слоя весь путь вокруг кишечника.
- Вырезать кишечник открыт в продольном направлении и мыть с помощью закрученной в чистую чашку Петри со свежей охлажденной PBS. Повторите, если необходимо удалить весь оставшийся химус или слизь.
- Фарш ткани с хирургическим скальпелем , чтобы достичь квадратов ~ 1-2 мм 2 и добавить их в ~ 20 мл охлажденной PBS в центрифужную пробирку на 50 мл с помощью пипетки Пастера. Чтобы избежать кусочков ткани, торчащие на пипетку, отрезать кончик и влажная пипетку путем растирания с PBS.
- Аккуратно встряхните трубку дополнительно промывать кусочки ткани. Дайте ткани отстояться и вылить или рipette от большинства ФБСА и повторить со свежей PBS до тех пор, пока PBS выглядит ясным.
4. Получение БОГО-покрытая пластина / Посуды и сбраживание среды
Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в капоте культуры ткани (с этапами инкубации в 37 ° С на водяной бане).
- Подготовьте 2% -ный раствор BMM в охлажденной среде DMEM (без добавок). Во время работы держите раствор на льду. Для 2% -ного раствора, добавляют 140 мкл оттаивают BMM до 7 мл DMEM (достаточно , чтобы подготовить единый 24-луночного планшета).
- Добавьте 250 мкл 2% раствора BMM на лунку (24-луночного планшета) или за стеклянным дном тарелки формирования изображения.
- Инкубируйте покрытием Тарелки / блюда в течение по крайней мере 30 мин в термостате при температуре 37 ° С для обеспечения адекватной полимеризации СМЛ.
- Добавляют 50 мл предварительно нагретой DMEM (без добавок) в 15 мг коллагеназы (от шагов 1.2 и 1.4) с образованием 0,3 мг / мл раствора и инвертировать , чтобы растворить.
- Насе полного растворения, используя 20 мл шприц, фильтруют раствор коллагеназы через стерильный фильтр 0,2 мкм в новую стерильную 50 мл центрифужную пробирку. Добавьте описание этого в качестве среды пищеварения.
5. Ткань Переваривание
- Удалить кусочки ткани из PBS с помощью 10 мл серологической пипетки и добавить в стерильную 50-мл центрифужную пробирку , содержащую охлажденный стерильный DMEM (без добавок), водоворот , а затем удалить DMEM.
Примечание: Для того, чтобы избежать прилипания ткани к серологической пипетки, смочить его растиранием с DMEM до контакта с тканью. - «Digest» 1 и 2: Удаление остатков клеток и одиночных клеток
- Добавить 7 мл переваривания среды на кусочки ткани и придать трубку вихря.
- Инкубировать в течение 5 мин на водяной бане при температуре 37 ° С.
- Осторожно встряхнуть (не циркулируют) трубку для ~ 3 сек.
- Дайте ткани осесть и выбросьте переваривания среды, оставляя за собойнебольшой объем, чтобы посмотреть под микроскопом.
Примечание: Особенно, когда начинали, настоятельно рекомендуется, чтобы осмотреть небольшой объем каждого «переварить» (~ 30 мкл) под микроскопом, чтобы оценить ход процесса пищеварения. Если многие склепы наблюдаются на данном этапе, встряхивание может быть слишком энергичным. Для репрезентативных образов , что различные «переварить» этапы , как правило , выглядят, обратитесь к рисунку 1. - Повторите шаги 5.2.-5.2.4 (со свежей средой пищеварения).
- 3 до 5 «переваривают»: Сбор фрагментов криптов
- Добавить 7 мл переваривание среды в ткани.
- Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
- Во время инкубации, встряхивают каждые 5 мин в течение 10-12 с.
Примечание: встряхивание более энергично, чем для встряхивания «дайджесты» 1 и 2.
- Во время инкубации, встряхивают каждые 5 мин в течение 10-12 с.
- Разрешить непереваренную ткань осесть и собирает пищеварение среду в 15 мл центрифужной пробирки. Еслиткань случайно собраны вместе со средой, дают ей отстояться, удалить его с помощью серологической пипетки 10 мл и переносят его обратно в центрифужную пробирку на 50 мл, содержащую непереваренной ткани.
- Центрифуга собирали средний / супернатанта при комнатной температуре в течение 3 мин при 100 х г.
- Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить осадок клеток в 5 мл предварительно подогретой культуральной среды при осторожном растирании и отложить.
- Проверьте небольшой объем клеточной суспензии под микроскопом (см Примечание от Step 5.2.4).
Примечание: В идеале, крипты фрагменты начинают появляться в «переварить» 3 вместе с обломками клеток и отдельными клетками. «Дайджесты» 4 и 5 содержат значительно большее количество фрагментов крипт с уменьшенными остатками клеток (рисунок 1). Регулировка встряхивании интенсивности по мере необходимости , например , если ткань не переваривать и фрагменты крипт не появляются, трясти более энергично. - Повторите шаги 5.3.1-5.3.6 до 5 «не переваривает» былизавершено или до тех пор , большинство из ткани не было переваривается (6 - й дайджест может потребоваться).
- После того, как все супернатанты от «переваривает» 3-5 (или 3-6) были собраны, центрифуге дайджеста супернатантов при комнатной температуре в течение 3 мин при 100 х г.
- Для экспериментов секреции, сочетают в себе супернатант от «переваривает» 3-5 (или 3-6) перед центрифугированием.
Примечание: Менее ткани необходима для экспериментов с изображениями, поэтому выбирают супернатант дайджеста, который является чистым (отсутствием остатков клеток и отдельных клеток) с большим числом фрагментов крипт. Как правило, это «переварить» 4 или 5. - Удалите супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок растирания, пока не комочки не видны. Повторное приостановить осадок в предварительно нагретой питательной среде с добавлением 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорида (для предотвращения аноикис 17). Используйте 5 мл для экспериментов секреции и 2 мл культуральной среды для экспериментов с изображениями.
- ФильтрСуспензия клеток через фильтр с размером 100 мкм (для удаления любой непереваренной ткани). Выполнить еще 2 мл подогретой культуральной среды через фильтр, чтобы вымыть (общий объем 7 мл и 4 мл для секреции и обработки изображений, соответственно).
Примечание: Фильтрация не является существенным, однако, более крупные фрагменты ткани, как правило, не прилипать к тарелке / блюд.
Рисунок 1: Типичные изображения «дайджестов» из первичного метода малого кишечника культуры. (А) Типичный материал от «дайджесты» 1 и 2 , содержащий главным образом отдельные клетки и клеточные осколки. (В) В качестве примера изделий из «переварить» 3. Черные стрелок показывают крипты фрагментов , появляющиеся в дайджесте материале. (С) Типичный «переварить» 4 или 5. Панель (D) , представляет собой материал , объедин ли дайджест из«дайджесты» 3-5 пропускают через фильтр с размером 100 мкм , чтобы удалить крупные фрагменты нежелательных тканей видели в (C). Все снимки были сделаны с помощью цифрового инвертированного микроскопа с объективом 20х. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
6. Покрытие Кишечные культуры (Обогащенный для клеток крипт)
- Удалить избыток раствора BMM из пластины или тарелок, и добавьте 250 мкл предварительно подогретой культуральной среды на секрецию хорошо.
Примечание: Воображение блюдо остается без среды, так переходите к следующему шагу быстро, чтобы предотвратить блюдо от высыхания. - Пластина 250 мкл клеточной суспензии на лунку (24-луночного планшета) или на дно стакана блюдо.
- Тарелка по каплям в медленном «зиг-заг» движение через скважину. Разрешить фрагменты крипт отстояться в течение ~ 5 минут, прежде чем перейти пластину йе инкубатор.
Примечание: Это должно стимулировать равномерное распределение склепов / клеток в скважине.
- Тарелка по каплям в медленном «зиг-заг» движение через скважину. Разрешить фрагменты крипт отстояться в течение ~ 5 минут, прежде чем перейти пластину йе инкубатор.
- Инкубируйте пластины или блюда в течение ночи при 37 ° С и 5% CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: «пятнистый» монослой должен сложиться. Для типичного образа культур следующих трех промывок, рис 2А. - блюда визуализации «Потопа» с 2 мл подогретого культуральной среды на чашку.
Примечание: Эти блюда будут пригодны для работы с изображениями до ~ 72 ч после металлизации. Кишечные культуры обычно длятся дольше, до 7 дней. Клетки, которые не прилипшие могут быть удалены с помощью стадии промывки. Первичные культуры теперь готовы быть использованы для экспериментов.
Representative Results
Использование серийных этапов переваривания позволяет собирать относительно чистой подготовки фрагментов крипт, чтобы быть покрыто для экспериментов. Первые два дайджесты удалить , прежде всего , отдельные клетки и клеточные остатки от переваривания материала (рис 1А). В течение третьего дайджеста, крипты фрагменты появляются в переваренном материале (Фиг.). Дайджесты 4 и 5 выхода большего числа крипт фрагментов с меньшим количеством одиночных клетками (рис 1C). Фильтрация объединенного материала из дайджестов 3-5 удаляет крупные куски непереваренной ткани, которые могут быть вредными для культуры, производя чистые подготовки фрагмента крипты (рис 1D).
После 18-24 часов культуры, наблюдаются монослоев первичных мелких клеток кишечника (фиг.2А). Используя культуры, полученные от трансгенных мышей, специфически экспрессирующих калбилирубина флюоресцентный сенсор, GCaMP3, под контролем промотора проглюкагонового 11, L - клетки легко идентифицируются и вкраплены в культуре (фигура 2В). В первичных культурах тонких кишечника, ориентированные на соединения G Q -ca 2+ я и цАМФа я -зависимые пути стимулировали секрецию GLP-1 (для методики эксперимента секреции см Райманна и др. 1). Бомбезин (BBS, 100 нМ) и совместное применение форсколина и 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) (F / I, 10 мкМ каждого) вызвало 2- и 11-кратное, стимуляцию GLP-1, по сравнению с высвобождением Базальный, соответственно (фиг.2С). Конкретное выражение L клетка GCaMP3 позволяет идентифицировать и мониторинг в режиме реального времени мобилизации кальция в отдельных клетках L. Оба 100 нМ бомбезина (BBS) и 30 мМ хлорида калия (KCl) стимулировали кратковременное повышение внутриклеточного кальция , указывающие на известной G д </ суб> - и электрогенные связью пути в первичных L - клетках (фигура 2D).
Рисунок 2: Типичные данные , полученные из первичных культур тонкого кишечника. Пример изображения смешанных первичных культур тонкого кишечника , используемых для (А) секреции и (В) экспериментов визуализации сообщение 24 ч обшивки. (А) Изображение взято из 24-луночного планшета, используя цифровой инвертированный микроскоп с объективом 4X. Шкала бар = 500 мкм. (Б) Использование Glu-Cre х мышей ROSA26 GCamP3, L клеток в поле зрения (зеленые клетки) были идентифицированы с помощью флуоресценции GCaMP3. Шкала бар составляет 50 мкм. Секреции ГПП-1 (С) измеряли в ответ на бомбезина (BBS, 100 нм) и форсколин / 3-изобутил-1-метилксантина (ИБМК) (F / I, 10 мкМ каждого). Процент секреция ГПП-1 была рассчитанапутем измерения уровней GLP-1 в супернатантах и клеточных лизатах. Данные представляют собой средние значения ± SEM, п = 3 для каждого условия. (D) GCaMP3 флуоресценции (отражающий цитозольного кальция) двух клеток , описанных в (B) , мониторинг в реальном времени в ответ на хлористый калий (KCl, 30 мМ) и BBS (100 нМ). визуализация одной клетки была выполнена с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа с объективом масляной иммерсии 40X. GCaMP3 возбуждалась при 475/10 нм, с использованием 75 Вт ксеноновой дуговой лампы и монохроматор, управляемый программным обеспечением флуоресцентной томографии. Излучение регистрировали с помощью цифрового прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры с высоким разрешением, используя дихроичное зеркало и фильтр полосы пропускания в 510-560 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Этот протокол описывает выделение и культуру смешанных мышиных клеток тонкого кишечника, чтобы позволить исследование секреции кишечника пептида и одной клеточной визуализации меченых клеток энтероэндокринные.
Для того, чтобы увеличить вероятность тонкого кишечника культур быть успешным, важно, что протокол осуществляется так же быстро, как это возможно (в идеале, в течение 3 ч уборки ткани), и что ткань хранится в ледяной среде или буфера перед в процессе пищеварения, чтобы ограничить гибель клеток. Хотя это не является существенным, особенно для ободочных культур, удаление мышечного слоя из тонкого кишечника настоятельно рекомендуется. Небольшой протокол кишечной культуры был стандартизирован как можно больше. Тем не менее, важно отметить, что ни один процесс пищеварения не идентичен. Есть много шагов , в ходе этого протокола , где изменчивость может быть введена на основе изо дня в день , например , от степени удаления мышц, размер тон фарш "кусочки ткани, силу встряхивания, потенция конкретной партии коллагеназы и др. Следовательно, чрезвычайно важно, чтобы осмотреть аликвот каждого из различных «переваривает» под микроскопом, чтобы оценить ход процесса пищеварения и в соответствии с ними встряхивания и число «дайджесты» соответственно. Рекомендуется встряхнуть более осторожно, чтобы начать с, и если фрагменты крипт не очевидны из «переварить» 3 года, чтобы начать встряхивая более энергично.
Исходя из нашего опыта, энтероэндокринные клетки не размножаются в культуре и, как правило, теряется из тонкого кишечника культур в течение 4 дней. Тем не менее, это позволяет достаточно времени, чтобы выполнить эксперименты секреции кишечника пептид (обычно проводят в течение 2 ч, 18-24 ч после металлизации), чтобы проверить физиологические стимулы и / или фармакологических агентов. Эксперименты , требующие инкубации в течение ночи перед экспериментом секреции также возможно , например ,в случае предварительной обработки с коклюшного токсина 15.
Методика первичной культуры представлены здесь устоявшийся метод, о чем свидетельствует объем научной продукции она производится на протяжении многих лет. Модель первичной культуры была использована для изучения секреции различных кишечных пептидов, включая GLP-1 1, GIP 18 и PYY 19, в ответ на разнообразные питательные вещества и без питательных веществ 14, 20 стимулов и ингибиторов. Кроме того, тот же метод был успешно применен к культуре клеток кишечника человека 21. Часто, сочетание метода первичной клеточной культуры , наряду с дополнительной экспериментальной модели , например. ех естественных условиях или в естественных условиях может обеспечить наиболее понимание 6. Примечательно, и в отличие от других методов, этот метод имеет внутримышечноВАЖНЫ приложения за пределами измерения кишки пептидного высвобождения. Мы показали , что первичные культуры тонких кишечника , полученные из трансгенных мышей репортера являются мощными инструментами для допроса внутриклеточных сигнальных путей в сочетании кишки секреции пептида, используя, например , Са 2+ и датчики цАМФа, GCaMP3 11, 13 и 14 Epac2camps, соответственно, а также электрофизиологические методы 12.
Как и все модели в пробирке, первичные кишечные культуры имеют определенные ограничения , присущие включая потерю полярности эпителиальных клеток в культуре, а также к потере кровоснабжения и иннервации. Трудно оценить потенциальное влияние этих искусственных условий на функции энтероэндокринных клеток. Однако данные , полученные из первичных культур часто были переводимые в в естественных условиях Settiнг (например , эффекты короткоцепочечных жирных кислот на GLP-1 секреции 15).
Первичные культуры кишечника являются универсальным методом, с большим количеством потенциальных применений. Они уже обеспечили важное механистическое понимание регуляции секреции кишечника пептидов.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
GLP-1, иммуно-анализы проводили с помощью анализа лаборатории биохимического Ядра в больнице Адденбрукса.
Эта работа, на протяжении многих лет, была поддержана Wellcome Trust (в настоящее время активные гранты 106262 / Z / 14 / Z и 106263 / Z / 14 / Z) и Совета по медицинским исследованиям (MRC) (гранты MRC_MC_UU_12012 / 3 и MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
