Denne protokol beskriver isolering og dyrkning af blandede murine små intestinale celler. Disse primære intestinale kulturer muliggør undersøgelse af signalveje underliggende gut peptidudskillelse under anvendelse af en række teknikker.
Tarmen er det største endokrine organ i kroppen, med hormonsecernerende enteroendocrine celler placeret langs længden af det gastrointestinale epitel. På trods af deres fysiologiske betydning, enteroendokrine celler kun udgør en lille brøkdel af epitelcelle befolkning og i fortiden, har deres karakterisering præsenteret en betydelig udfordring, hvilket resulterer i en afhængighed af cellelinje modeller. Her, giver vi en detaljeret protokol til isolering og dyrkning af blandede murine små intestinale celler. Disse primære kulturer er blevet anvendt til at identificere de signalveje ligger til grund for stimulering og inhibering af tarmen peptidudskillelse som svar på en række næringsstoffer og neuropeptider samt farmakologiske midler. Endvidere i kombination med anvendelsen af transgene fluorescerende reporter mus, har vi vist, at disse primære kulturer blevet et stærkt værktøj til undersøgelse af fluorescens-mærkede enteroendocrine celler på itracellular niveau, ved anvendelse af fremgangsmåder, såsom patch damping og encellede calcium og cAMP-FRET billeddannelse.
Det overordnede mål med denne fremgangsmåde er at isolere og kultur blandet murine tarmcellerne at muliggøre studiet af tarmen peptidudskillelse og levende celler af enteroendocrine celler. En tidlig version af denne procedure blev oprindeligt udgivet i 2008 af Reimann et al. 1 og har siden dannet grundlag for yderligere 20 publikationer fra vores gruppe. Til dette manuskript, vi valgte at fokusere på små tarm kulturer, da de er mere udfordrende at etablere end colon kulturer.
Enteroendokrine celler udskiller en række gut peptider, herunder glucagon-lignende peptid 1 (GLP-1), glucose-insulinotropt peptid (GIP), cholecystokinin (CCK) og peptid YY (PYY) 2. Disse tarmpeptider har vigtige fysiologiske roller i orkestrere postprandiale reaktioner såsom opbremsning af tarmen transit, potensering af glucose insulinfrigivelse og induktion af mæthed. GLP-1 mimetika etnd lægemidler, der hæmmer dens nedbrydning i øjeblikket godkendt til behandling af type 2-diabetes, og der er løbende vurdering af det terapeutiske potentiale til at stimulere den endogene sekretion af dette peptid 3. En bedre forståelse af enteroendokrine fysiologi og de mekanismer, hvormed sekretion enten stimulerede eller inhiberede er derfor af afgørende betydning.
Gut peptidudskillelse kan undersøges ved anvendelse af forskellige in vitro- og ex vivo eksperimentelle modeller, hver med fordele og ulemper (for en omfattende nylig gennemgang også dækker anvendelsen af in vivo-modeller se Svendsen et al. 4). Ex vivo teknikker såsom de isolerede perfunderede tarm- 5 og Ussing-kamre 6 anvendes for tiden til at udforske gut peptidudskillelse som reaktion på forskellige stoffer. Den væsentligste fordel ved disse metoder, somsammenlignet med primære kulturer, er, at den umiddelbare miljø i enteroendokrine celler forbliver stort set intakt og vigtigere, er polariteten af cellerne bevares. Derfor er det muligt at fremkalde information om hvilke celleoverfladen et sekretionsfremmende handler den 6. Disse er imidlertid typisk lav-throughput teknikker og kvaliteten af de data, der er afledt af dem er stærkt afhængig af integritet og levedygtighed tarmvævet, som uundgåeligt falde over tid.
Intestinale organoider bliver nu i stigende grad som in vitro-modeller til undersøgelse af enteroendokrine cellefunktion og udvikling 7. Organoider, som kan afledes fra både murine og humane væv, har fordelen af at danne 3D 'krypt-lignende' strukturer, der opretholder cellepolaritet i kultur. Dog organoide-afledte enteroendocrine celler har endnu ikke fuldt karakteriseret, og deres lighed med nativt L cells stadig stort set ukendt. Primære kulturer har den fordel at være et skridt tættere på den fysiologiske omgivelser, som enteroendocrine celler ikke vedligeholdes og differentieres i kunstige omgivelser i længere perioder.
En alternativ primær kultur, som har været anvendt til vurdering af tarmen peptidudskillelse er isoleringen af føtale rotte intestinale celler (FRICs) 8. Imidlertid har kulturen i voksne tarmvæv mødt med mindre succes og er blevet observeret nogle forskelle i reaktionsevne FRICs vs. voksne murine intestinale celler (fx glucose 8).
Enteroendocrine-lignende cellelinier (f.eks GLUTag, STC-1 og NCI-H716) traditionelt er blevet anvendt til at skelne direkte vs. indirekte virkninger på enteroendokrine celler og til at dissekere underliggende molekylære mekanismer kobling stimulus til sekretion; se Kuhre et al </em>. 9 for peptid produktion og sekretion ved 'L cellelignende' udødeliggjorte cellelinier. Dette har været nødvendigt, da enteroendokrine celler, spredt langs mavetarmkanalen, udgør knap 1% af intestinale epitelceller 10 og sorterede celler, i vores hænder, ikke overlever i kultur 1. Cellelinier forbliver nyttige værktøjer som beror på, at de er en stort set homogen cellepopulation, der er befordrende for genetiske manipulationer såsom gendæmpning. Følgelig er det let at undersøge rollen af proteiner, som ikke kan målrettes farmakologisk, når transgene mus er ikke tilgængelige. Men cellelinjer er ikke altid gyldige modeller af primære celler. Mens der er mange ligheder, fund fra primære kulturer har til tider fremhævet forskelle i signalveje aktiveret af visse næringsstoffer i primære L-celler sammenlignet med GLUTag celler, for eksempel (f.eks. Peptoner <sup class = "xref"> 11). Afgørende, i kombination med transgene fluorescerende reporter mus, den primære kultur model muliggør detaljeret undersøgelse af individuelle primære enteroendocrine celler ved det intracellulære niveau. Fluorescens-mærkede L-celler inden primære kulturer er blevet anvendt af vores gruppe for patch fastspænding 1, 12 undersøgelser, og encellede calcium 11, 13 og cyklisk adenosinmonophosphat-FRET billeddannelse 14 studier, som har udløst betydelige fremskridt inden for enteroendokrine fysiologi.
Den følgende protokol er optimeret til udførelse sekretionssignaler eksperimenter under anvendelse af en plade med 24 brønde eller til fremstilling af op til 16 billeddannende retter, fra en 10 cm sektion af tyndtarmen fra en enkelt voksen mus. Protokollen kan let modificeres til undersøgelse af colon celler ved at øge fordøjelsesperiode og collagenase koncentration.
Denne protokol beskriver isolering og dyrkning af blandede murine små tarmcellerne at muliggøre studiet af tarmen peptidudskillelse og enkelt celle billeddannelse af mærkede enteroendocrine celler.
For at øge sandsynligheden af de små intestinale kulturer bliver vellykket, er det vigtigt, at protokollen udføres så hurtigt som muligt (ideelt inden for 3 timer af høst af væv), og at vævet holdes i iskoldt medium eller puffer forud til fordøjelsesprocessen, at begrænse celledød. Mens det ikke er væsentligt, især for colon kulturer er fjernelse af musklen lag fra tyndtarmen opfordres kraftigt. Tyndtarmens kultur protokol er blevet standardiseret så meget som muligt. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at ingen fordøjelsesprocessen er identiske. Der er mange trin i løbet af denne protokol, hvor variabilitet kan indføres på en dag-til-dag basis fx graden af muskel fjernelse, størrelsen af than 'hakket' væv stykker, styrken af rysten, styrken af et bestemt parti collagenase osv. Det er derfor, af afgørende betydning for at inspicere portioner af hver af de forskellige 'fordøjer' under mikroskop for at vurdere fremskridtene i fordøjelsesprocessen og skræddersy ryste, og antallet af 'fordøjer' i overensstemmelse hermed. Det anbefales at ryste mere forsigtigt til at begynde med, og hvis krypt fragmenter er ikke indlysende fra 'fordøje' 3 og fremefter, til at begynde at ryste mere energisk.
Fra vores erfaring, behøver enteroendokrine cellerne ikke formere sig i kulturen og er som regel tabt fra små tarm kulturer inden for 4 dage. Men ikke desto mindre tillader, rigelig tid til at udføre gut peptidudskillelse eksperimenter (typisk udføres over 2 timer, 18-24 timer efter plating) for at teste fysiologiske stimuli og / eller farmakologiske midler. Eksperimenter, der kræver en inkubation natten over forud for sekretion eksperiment er også mulige for eksempeli tilfælde af forbehandling med pertussistoxin 15.
Den primære kultur teknik præsenteres her, er en veletableret fremgangsmåde, som det fremgår af omfanget af forskning output det har produceret gennem årene. Den primære kultur model er blevet anvendt til at undersøge udskillelsen af en række forskellige tarmpeptider, herunder GLP-1 1, GIP 18 og PYY 19, som reaktion på forskellige næringsstoffer og ikke-næringsstoffer 14, 20 stimuli og inhibitorer. Endvidere har den samme teknik med held været anvendt til dyrkning af humane tarmceller 21. Ofte en kombination af den primære cellekultur metode sammen med en ekstra forsøgsmodel f.eks. ex vivo eller in vivo kan tilvejebringe den mest indsigt 6. Navnlig og i modsætning til andre metoder har denne teknik important anvendelsesområder ud over målingen af tarmen peptidfrigivelse. Vi har vist, at primære små intestinale kulturer afledt fra transgene reporter mus er stærke værktøjer til forhør af intracellulære signalveje koblet til gut peptidudskillelse anvendelse af for eksempel Ca2 + og cAMP sensorer, GCaMP3 11, 13 og Epac2camps 14 henholdsvis samt elektrofysiologiske teknikker 12.
Som med alle in vitro-modeller, de primære intestinale kulturer har visse iboende begrænsninger, herunder tab af polariteten af de epiteliale celler i kultur, såvel som nedsat blodtilførsel og innervation. Det er vanskeligt at vurdere de potentielle virkninger af disse kunstige forhold på enteroendokrin celle funktion. Imidlertid har data fra primære kulturer ofte været translaterbar i in vivo Setting (f.eks virkninger af kortkædede fedtsyrer på GLP-1-sekretion 15).
De primære intestinale kulturer er en alsidig teknik med mange potentielle anvendelser. De har allerede tilvejebragt vigtig mekanistisk indsigt i reguleringen af tarmen peptid sekretion.
The authors have nothing to disclose.
GLP-1 immunologiske assays blev udført af Core Biochemical Assay Laboratory ved Addenbrooke Hospital.
Dette arbejde har i årenes løb, blevet støttet af Wellcome Trust (aktuelt aktive tilskud 106.262 / Z / 14 / Z og 106263 / Z / 14 / Z) og Medical Research Council (MRC) (tilskud MRC_MC_UU_12012 / 3 og MRC_MC_UU_12012 / 5).
24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |