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Immunology and Infection

Rodent मलेरिया परजीवी अलैंगिक और यौन रक्त चरणों और मच्छर चरणों का फेनोटाइपिक विश्लेषण

Published: May 30, 2019 doi: 10.3791/55688
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 2, 2
1Beykoz Institute of Life Sciences and Biotechnology, Bezmialem Vakif University, Istanbul, Turkey, 2School of Public Health and Tropical Medicine, Department of Tropical Medicine, Tulane University

Summary

मानव मलेरिया परजीवी के लिए जीवन चक्र और कृंतक मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हड़ताली समानताके कारण, कृंतक मलेरिया मॉडल मलेरिया अनुसंधान के लिए अपरिहार्य हो गए हैं। इसमें, हमने जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक कृंतक मलेरिया प्रजातियों के फीनोटाइपिक विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली कुछ सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों को मानकीकृत किया है।

Abstract

आनुवंशिकी और प्रणाली जीव विज्ञान प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति आणविक स्तर पर मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हमारी समझ को बढ़ावा दिया है. तथापि, वैक्सीन और कीमोथेरेपी विकास के लिए प्रभावी मलेरिया परजीवी लक्ष्य अभी भी सीमित हैं। यह मुख्य रूप से मानव प्लाज्मोडियम प्रजातियों के लिए विवो संक्रमण मॉडल में प्रासंगिक और व्यावहारिक की अनुपलब्धता के कारण है, सबसे विशेष रूप से पी फाल्सीपेरम और पी वाइवैक्सके लिए . इसलिए, कृंतक मलेरिया प्रजातियों बड़े पैमाने पर मलेरिया टीका के लिए vivo मॉडल में व्यावहारिक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया गया है, दवा लक्ष्यीकरण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और संरक्षित Plasmodiumspp. जीन के कार्यात्मक लक्षण अध्ययन. दरअसल, कृंतक मलेरिया मॉडल अमूल्य साबित हो गया है, विशेष रूप से मच्छर संचरण और जिगर चरण जीव विज्ञान की खोज के लिए, और प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए अपरिहार्य थे. हालांकि, ट्रांसजेनिक और जंगली प्रकार अलैंगिक और यौन रक्त अवस्था परजीवी के phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में विसंगतियां हैं। इन विसंगतियों के उदाहरण रक्त-चरण परजीवी के साथ कृन्तकों के अंतःशिरा बनाम इंट्रापेरिटोनल संक्रमण और पुरुष युग्मक के मूल्यांकन का विकल्प हैं। इसमें, हम रिपोर्टर-जीन या जंगली प्रकार कृंतक मलेरिया परजीवी प्रजातियों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक परजीवी में अलैंगिक और यौन रक्त चरणों के फीनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए मानकीकृत प्रयोगात्मक विधियों का विस्तार करते हैं। हम एनोफील्स मच्छर के वैक्टर के अंदर मलेरिया परजीवी मच्छर चरणों (गेमेट, ओकिनेट्स, ओसिस्ट, और स्पोरोजोइट्स) के फीनोटाइपकाज का मूल्यांकन करने के तरीकों का भी विस्तार से विस्तार करते हैं। इन तरीकों का विस्तृत और सरलीकृत कर रहे हैं यहाँ पी berghei और पी yoelii के घातक और गैर घातक उपभेदों के लिए, लेकिन यह भी पी Chabaudi और पी vinckei कृंतक मलेरिया प्रजातियों के लिए कुछ समायोजन के साथ लागू किया जा सकता है.

Introduction

मलेरिया परजीवी दुनिया भर में मनुष्यों में मलेरिया के संक्रमण के लाखों लोगों के कारण, 600,000 से अधिक हर साल1मृत्यु के साथ . मानव संक्रमण पांच मलेरिया परजीवी प्रजातियों के कारण होते हैं, जैसे पी फाल्सीपेरम, पी वाइवैक्स, पी ओवले, पी मलेरिया,और पी. अधिकांश नैदानिक मलेरिया नश्वरता उप-सहारा अफ्रीका1में पी फाल्सीपेरम के कारण होती है। एक अन्य मानव मलेरिया परजीवी प्रजाति है कि उप सहारा अफ्रीका के बाहर व्यापक दुनिया भर में रुग्णता का कारण बनता है पी vivax2है. अन्य तीन प्रजातियां सभी अधिक भौगोलिक रूप से प्रतिबंधित हैं और घातक पी नोल्सी3को छोड़कर सौम्य मलेरिया संक्रमण का कारण बनती हैं। संक्रमण के विवो मॉडल में प्रासंगिक और व्यावहारिक गैर मानव की अनुपलब्धता हमेशा से रही है और अभी भी मलेरिया वैक्सीन और दवा के विकास के लिए एक बाधा है। इससे पहले मलेरिया दवा लक्ष्यीकरण और चयापचय अध्ययन ों ने क्रमशः4मुर्गियों और बतखों को संक्रमित करने वाले पी गैलिनोसेसम और पी लोफोरेजैसे एवियन मलेरिया मॉडलों पर व्यापक रूप से भरोसा किया है . इसके बाद, विवो मॉडलों के रूप में विभिन्न टीकों और औषध लक्ष्यीकरण अध्ययनों में कृंतक मलेरिया प्रजातियों को धीरे-धीरे शुरू किया गया। इन वर्षों में, जीव विज्ञान और मानव मलेरिया प्रजातियों के लिए कृंतक मलेरिया मॉडल के जीवन चक्र चरणों के मेजबान परजीवी बातचीत की समानता के सबूत जमा हो गया है.

विशेष रूप से, कृंतक मलेरिया मॉडल का पता लगाने और मच्छर और पूर्व एरिथ्रोसाइटिक चरणों5के जीव विज्ञान की विशेषता के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण थे। तथापि, चार कृंतक मलेरिया प्रजातियां हैं (पी. बरघेई, पी. रक्त की प्रजातियों में रक्त चरणों के तुल्यकालन में अंतर है, जहां पी Chabaudi और पी vinckei उपभेदों के रक्त चरणों ज्यादातर तुल्यकालिक हैं, जबकि पी berghei और पी yoelii के रक्त चरणों6 नहीं कर रहे हैं , 7. एक और उल्लेखनीय अंतर रक्त चरणों है कि कुछ उपभेदों में होता है की आत्म मंजूरी है(उदा. पी yoelii 17X-NL , पी berghei NK65 , और पी vinckei lentum), जबकि अन्य के रक्त संक्रमण एक ही प्रजाति के उपभेदों घातक हो सकता है अगर अनुपचारित छोड़ दिया (पीyoelii 17X-L, पी berghei ANKA, और पी Chabaudi AS). इसके अलावा, पी yoelii 17X-NL तनाव और पी berghei ANKA तनाव अधिमानी रूप से reticulocytesआक्रमण 8,9,10,11, हालांकि पी की इन सुविधाओं. योलाई और पी बर्गेई उपभेदों एक सख्त विकास की आवश्यकता नहीं हैं12,13,14. इसलिए, चूहों उन परजीवी के रक्त चरणों के साथ एक संक्रमण से पहले फेनिलहाइड्रेज़ीन के साथ इलाज कर रहे हैं परजीवी और gametocytemia पी berghei ANKA तनाव के लिए एक मच्छर संक्रमण के लिए आवश्यक बढ़ाने के लिए और पी yoelii के लिए 17X-NL15,16,17,18,19.

मच्छर चरणों के विकास में अंतर भी विभिन्न कृंतक मलेरिया प्रजातियों के बीच मौजूद हैं, सबसे उल्लेखनीय तापमान और इष्टतम मच्छर चरणों के विकास के लिए आवश्यक समय जा रहा है और sporozoite लंबाई5,6, 20| कृंतक मलेरिया प्रजातियों के पूर्व एरिथ्रोसाइटिक चरणों में, मतभेदों में कृंतक प्रजातियां और तनाव शामिल हैं जो संक्रामक स्पोरोज़ोइट टीका के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं, अतिसंवेदनशील कृंतक तनाव में टीका लगाने के लिए आवश्यक स्पोरोजोइट्स की संख्या, इन विट्रो यकृत अवस्था विकास परख के लिए आवश्यक स्तनधारी कोशिका प्रकार , और जिगर चरण विकासकोपूरा करने के लिए समय 5 ,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

इन विभिन्नक्षमताओं के बावजूद, कृंतक मलेरिया परजीवी रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण के आवेदन के लिए जल्दी अनुकूल मॉडल थे, क्योंकि वे कम समय और संसाधन की सफलता की एक उच्च संभावना के साथ लेने वालीथी 31. वास्तव में, कृंतक मलेरिया मॉडल सबसे अच्छा मॉडल थे, और कई मामलों में केवल मॉडल, कई वर्षों के लिए उपलब्ध कार्यात्मक मच्छर और जिगर के चरणों में व्यक्त जीन की विशेषता.

लोकप्रियता और कृंतक मलेरिया मॉडल में रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण की सुविधा के प्रकाश में, विभिन्न तरीकों की एक संख्या transgenic परजीवी जीवन चक्र चरणों, विशेष रूप से रक्त चरणों के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है. हालांकि, इन तरीकों में से कुछ असंगत हैं; उदाहरण के लिए, एक आईपी इंजेक्शन के बाद रक्त-चरण परजीवी के संक्रमण की तुलना (जो संभवतः peritoneal लिम्फ नोड्स के लिए सूखा रहे हैं और, वहाँ से, खून में प्रवेश कर सकते हैं; इसलिए, इंजेक्शन परजीवी खून में समान रूप से अंत नहीं है) , सीरियल रक्त चरण स्थानान्तरण या जी संख्या की एक अलग संख्या के साथ क्लोन के मच्छर संचरण की तुलना (जो gametocytogenesis को प्रभावित कर सकता है32,33), या ट्रांसजेनिक परजीवी की तुलना सीधे भोले जंगली प्रकार (WT) के लिए परजीवी है कि इलेक्ट्रोपोरेशन और सकारात्मक दवा चयन और पुरुष gamete exflagellation के विभिन्न अमानकीकृत मूल्यांकन के अधीन कभी नहीं थे. इसलिए, यह प्रोटोकॉल है कि रक्त में ट्रांसजेनिक या WT कृंतक मलेरिया परजीवी के किसी भी प्रकार के phenotypic विश्लेषण के लिए पालन करने के लिए सरल कर रहे हैं मानकीकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है और मच्छर में कृंतक मलेरिया की जैविक variabilities के लिए समायोजित करने के लिए परजीवी प्रजातियों.

इसमें, हम ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार के रक्त और मच्छर जीवन चक्र चरणों के phenotypic विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत, विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर रिपोर्ट पी yoelii और पी berghei परजीवी. ये प्रोटोकॉल पी चबौडी और पी विन्केई परजीवी पर भी लागू होते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रयोगों को टूलेन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और बेज़ियालम वाकिफ विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति के अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया। अन्य सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और रिकॉमबिनेंट डीएनए का उपयोग Tulane विश्वविद्यालय के संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (IBC) के अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया.

1. परजीवी विश्लेषण और मच्छर संक्रमण परख के लिए रक्त चरण परजीवी के साथ चूहे का संक्रमण

  1. दिन -3: प्राप्तकर्ता चूहों में फेनिलहाइड्रेज़ीन का वैकल्पिक इंजेक्शन
    1. इंजेक्शन outbred SW या CD1 प्राप्तकर्ता चूहों (चूहों कि मच्छर संक्रमण और मच्छर संक्रमण परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) intraperitoneally (आईपी) के साथ 100 $L फेनिलहाइड्रेज़ीन (50 मिलीग्राम फेनिलहाइड्रेज़ीन के 5 एमएल में 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस)) एक 26 जी सुई का उपयोग कर सिरिंज.
      नोट: पी berghei और पी yoeliiके मजबूत मच्छर संक्रमण के लिए, फेनिलहाइड्रेजीन प्राप्तकर्ता चूहों में reticulocytosis प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो परजीवी बढ़ जाती है और, बाद में, gametocytes का प्रतिशत, और काफी नर युग्मकों के उद्भेदन में वृद्धि (चित्र 5) जो पी बर्गेई और पी योलीई दोनों के लिए मच्छर के चरण संक्रमण का कारण बन सकता है15,16,17, 18.
  2. दिन -2: दाता चूहों में जमे हुए परजीवी शेयरों का इंजेक्शन
    1. जल्दी से thaw cryopreserved जमे हुए शेयरों और तुरंत प्रत्येक दाता माउस सुई (आमतौर पर दो चूहों प्रति जीनोटाइप) एक 26 जी सुई सिरिंज का उपयोग कर स्टॉक के $ 200 $L के साथ आईपी.
      नोट: कोई अधिक से अधिक पांच चूहों नियंत्रित vivarium सेटिंग्स के भीतर पिंजरे प्रति रखे जाते हैं.
    2. 24 एच पोस्टसंक्रमण के बाद Giemsa-सना हुआ पतली रक्त धब्बा पर एक 100x माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत परजीवी की जाँच शुरू करें। Giemsa के लिए प्रोटोकॉल की धारा 2.1 का पालन करें पतली रक्त स्मीयर.
      नोट: जल्दी से thwing और इंजेक्शन cryopreserved संक्रमित रक्त इंजेक्शन के बाद जीवित व्यवहार्य रक्त चरणों की गणना करने में असमर्थता के कारण, दाता चूहों cryopreserved रक्त पहले प्राप्त करते हैं. दाता माउस के संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स को ठीक से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और बाद में इसका उपयोग किया जा सकता है।
  3. दिन 0: दाता चूहों का खून बह रहा है
    1. दाता चूहों खून (अनुभाग 3.1 देखें) जब उनके परजीवी 0.1% और 1% के बीच है, जो आम तौर पर प्राप्त किया जाता है 2-3 दिन के बाद जमे हुए स्टॉक संक्रमण पी yoelii 17X-NL और पी berghei ANKA उपभेदों के मामले में.
    2. चेहरे की नस पंचर का प्रयोग करें (200 और 500 डिग्री सेल्सियस के बीच पाने के लिए), या अंत में संक्रमित रक्त के दिल पंचर (600 डिग्री सेल्सियस और 1.2 एमएल के बीच पाने के लिए) द्वारा जानवरों को खून बह रहा है। खंड 3.1 में विस्तार से वर्णित के रूप में दिल पंचर द्वारा चूहों खून.
      नोट: चेहरे की नस खून बह रहा रक्त प्राप्त करने की एक नियमित विधि नहीं है क्योंकि इसे लागू करना बहुत अधिक कठिन है और टर्मिनल रक्तस्राव की तुलना में चूहों के लिए बहुत परेशान है। दाता चूहों के रक्तस्राव के लिए इष्टतम परजीवीता 0.1%-1% के बीच है क्योंकि, इस परजीवी सीमा पर, बहुत कम युग्मक साइटें हैं (जो अलैंगिक रक्त चरणों का उत्पादन करने के लिए प्रतिकृति नहीं कर सकते हैं) और कम डबल या ट्रिपल संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स (जो) परिमाणीकरण कम सटीक बनाता है).
  4. दिन 0: सीरियल कमजोर पड़ने से संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की खुराक तैयार करने के लिए संक्रमित रक्त की मात्रा निर्धारण
    1. एक microcentrifuge ट्यूब (डिल्यूशन ट्यूब 1) के लिए रक्त के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़कर दाता रक्त के सीरियल कमजोर पड़ने तैयार करें। ट्यूब 1 के लिए RPMI मध्यम के 900 $L जोड़ें और एक ही पिपेट टिप के साथ ऊपर और नीचे pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाने.
    2. ट्यूब 1 से पतला रक्त के 100 डिग्री सेल्सियस ले लो और यह एक नया microcentrifuge ट्यूब (dilution ट्यूब 2) में जोड़ें. आरपीएमआई मध्यम के 900 डिग्री एल को ट्यूब 2 में जोड़ें और एक ही पिपेट टिप के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, जिससे 1:100 कमजोर पड़ने का निर्माण होता है।
    3. दोहराएँ कदम 1.4.1 और 1.4.2 दो और धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के लिए, बनाने 1:1,000 (dilution ट्यूब 3) और 1:10,000 कमजोर पड़ने (dilution ट्यूब 4).
    4. ट्यूब से पतला रक्त के 12 डिग्री सेल्सियस जोड़ें 3 और ट्यूब से पतला रक्त के 12 डिग्री एल एक हीमोसाइटोमीटर के विभिन्न पक्षों में 4 और हेमोसाइटोमीटर के प्रत्येक पक्ष पर एरिथ्रोसाइट की औसत संख्या का निर्धारण. इन संख्याओं को 10 से गुणा करें. प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1 डिग्री एल में एरिथ्रोसाइट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए क्रमशः, कमजोर पड़ने वाले कारक, 1,000 या 10,000 द्वारा इन संख्याओं को गुणा करें।
    5. इंजेक्शन के लिए आवश्यक पतला दाता रक्त की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1 डिग्री एल में एरिथ्रोसाइट्स की संख्या द्वारा इंजेक्शन किया जा करने के लिए संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की वांछित संख्या विभाजित करें। इंजेक्शन के लिए सबसे उपयुक्त मात्रा के साथ कमजोर पड़ने चुनें, एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए मात्रा जोड़ने के लिए, और RPMI माध्यम के साथ 120 डिग्री सेल्सियस करने के लिए इसे पूरा.
  5. दिन 0: प्राप्तकर्ता चूहों के अंतःशिरा इंजेक्शन
    1. इंजेक्शन के लिए उनकी नसों को फैलाने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों को एक गर्मी लाल लैंप के नीचे रखें। परजीवी खुराक को 27 जी इंसुलिन सिरिंज में लोड करें और प्राप्तकर्ता माउस को निरोधक में रखें।
    2. मच्छर संक्रमण assays के लिए या अलैंगिक और यौन रक्त चरण विकास assays के लिए प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस में 27 जी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर 1 लाख या 10,000 संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स अंतःशिरा (IV) इंजेक्शन। मानक आवास की स्थिति के तहत चूहों को बनाए रखने के लिए जारी रखें।
      नोट: एक आईपी इंजेक्शन खून में परजीवी शुरू करने की एक अप्रत्यक्ष विधि है, के रूप में परजीवी एरिथ्रोसाइट्स रक्त तक पहुँचने के लिए peritoneal गुहा के draining लिम्फ नोड्स के माध्यम से पारित करने के लिए है। यह एक आईपी इंजेक्शन खून में परजीवी की एक सटीक संख्या इंजेक्शन के लिए एक अप्रत्यक्ष वितरण मार्ग बनाता है. इसलिए, चतुर्थ मार्ग पसंद किया जाता है, क्योंकि यह सीधे खून में सटीक परजीवी खुराक बचाता है, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है और प्रतिनिधि परिणामोंमें वर्णित है।

2. यौन और अलैंगिक चरणों के लिए रक्त चरण परजीवी लोड का निर्धारण

नोट: इस खंड में मलेरिया परजीवी रक्त चरणों के मानकीकृत फीनोटाइपिक मूल्यांकन विधियों को सूचीबद्ध किया गया है। इन तरीकों उपन्यास antimalarial या टीका उम्मीदवारों या यहां तक कि एक ही प्रयोगात्मक चूहों में यौन और अलैंगिक चरणों के विकास पर जीन नॉकआउट के मूल्यांकन में उपयोगी होते हैं. ध्यान दें, पी Chabaudi और पी vinckei भी बहुत तर्कसंगत और assays के इन प्रकार के लिए महत्वपूर्ण वैकल्पिक विकल्प हैं, विशेष रूप से दवा स्क्रीनिंग में.

  1. परजीवी विकास परख के लिए Giemsa-सना हुआ पतली रक्त स्मीयर द्वारा अलैंगिक चरणों और पुरुष बनाम महिला gametocytes के परजीवी का निर्धारण
    1. 26 जी या 27-जी सुई का उपयोग करके, माउस की पूंछ को चुभने दें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रक्त की बूंद को एकत्र करें। जल्दी से स्लाइड भर में रक्त धब्बा करने के लिए एक और माइक्रोस्कोप स्लाइड के छोटे किनारे का प्रयोग करें।
    2. कम से कम 1 मिनट के लिए 100% मेथनॉल के साथ स्लाइड को ठीक करें, केवल बाद रक्त पूरी तरह से स्लाइड पर सूख गया है। 10-15 मिनट के लिए 10% गीमसा में दाग। स्लाइड को सिंगल या डबल-डिस्टिल्ड पानी से धोएं और इसे सूखने दें।
    3. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एक 100x उद्देश्य और तेल विसर्जन का उपयोग कर स्लाइड पढ़ें. एक सटीक परजीवी माप के लिए, कम से कम 6,000 एरिथ्रोसाइट्स की कुल जांच करें, जो क्रमशः 200 या 150 एरिथ्रोसाइट्स (आरबीसी) प्रति ग्रिड की औसत संख्या के साथ कम से कम 30 या 40 सूक्ष्म ग्रिड की गिनती करके प्राप्त किया जा सकता है। सभी ग्रिडों के लिए लाल रक्त कोशिकाओं की औसत संख्या निर्धारित करने के लिए पहले और अंतिम ग्रिड में आरबीसी की कुल संख्या की गणना करें।
    4. प्रति ग्रिड संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की कुल संख्या की गणना करें। पुरुष और महिला gametocytes अलग से gametocytemia निर्धारित करने के लिए गिना जा सकता है, लेकिन यह भी कुल परजीवीकी गिनती में शामिल किया जाना चाहिए.
    5. पाए गए RBCs की कुल संख्या से परजीवी एरिथ्रोसाइट्स की कुल संख्या को विभाजित करके कुल परजीवीता प्रतिशत निर्धारित करें। परजीवीता प्रतिशत निर्धारित करने के लिए इस संख्या को 100 से गुणा करें।
    6. मनाया RBCs की कुल संख्या द्वारा गिना gametocytes की कुल संख्या को विभाजित करके gametocytemia निर्धारित करते हैं. माउस प्रति gametocytemia प्रतिशत निर्धारित करने के लिए 100 से इस संख्या गुणा.
      नोट: विभिन्न अलैंगिक और यौन रक्त चरणों के बीच भेदभाव की एकमात्र विश्वसनीय विधि Giemsa-सना हुआ पतली रक्त स्मीयर का मूल्यांकन करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग है, के रूप में चरणों में से प्रत्येक अपरिपक्व gametocytes के अपवाद के साथ, अलग आकारिकी है, जो ज्यादातर अलैंगिक रक्त चरणों से अभेद्य हैं।
  2. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा रक्त-चरण परजीवीका निर्धारण-डब्ल्यूटी की तरह परजीवी उपभेदों
    1. लेबल प्रत्येक माउस नमूने के लिए दो microcentrifuge ट्यूबों, एक 1:1,000 कमजोर पड़ने के लिए एक ट्यूब डिजाइन और एक 1:2,000 कमजोर पड़ने के लिए अन्य. 1:1,000 कमजोर पड़ने ट्यूब के लिए 1x हेपरिन के 1.5 डिग्री एल जोड़ें।
    2. एक 26 जी या 27 जी सुई का उपयोग करना, माउस की पूंछ चुभन और 1x हेपरिन के 1.5 डिग्री एल युक्त ट्यूब के लिए रक्त की 1.5 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण (1:1,000 कमजोर पड़ने ट्यूब). ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा रक्त और 1x हेपरिन धीरे से एक साथ मिलाएं।
    3. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में आरपीएमआई माध्यम का 1,497 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, और धीरे से पिपेट को अच्छी तरह से मिला लें।
    4. 1:1,000 कमजोर पड़ने ट्यूब से मिश्रण के 500 $L स्थानांतरण 1:2,000 कमजोर पड़ने ट्यूब के लिए. 1:2,000 ट्यूब के लिए RPMI माध्यम के 500 $L जोड़ें और धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण.
    5. प्रवाह cytometer के लिए निर्माता के उपयुक्त स्टार्ट-अप प्रोटोकॉल का पालन करें। एक धीमी प्रवाह दर पर नमूने चलाने के लिए और कम से कम 20,000 घटनाओं के लिए पता लगाने सेट.
      नोट: वहाँ एक वैकल्पिक व्यावहारिक परख के लिए तिरंगे FACS छँटाई के माध्यम से परजीवी को मापने के लिए है, चाहे परजीवी फ्लोरोसेंट मार्करों या नहीं34व्यक्त करते हैं. हालांकि, यहाँ वर्णित परख किसी भी डीएनए बाध्यकारी रंगों और FACS छँटाई के उपयोग के अलावा बिना जीवित परजीवी में परजीवी का एक सटीक उपाय प्रदान करता है.
  3. संक्रमित माउस रक्त के प्रति माइक्रोलीटर पुरुष युग्मकों की जलवृद्धि दर का निर्धारण
    1. अपूर्ण ऊकीनेट माध्यम के 40 डिग्री सेल्सियस (आरपीएमआई + सोडियम बाइकार्बोनेट + हाइपोक्सैन्थीन + जैनथुरेनिक एसिड) और 1x हेपारिन के 5 डिग्री एल के साथ एक 1:10 कमजोर पड़ने microcentrifuge ट्यूब तैयार करें।
    2. एक 26 जी या 27 जी सुई का उपयोग करना, माउस की पूंछ चुभन और रक्त के 5 डिग्री एल हस्तांतरण (एक micropipette का उपयोग करके) जल्दी से अधूरा ookinete मीडिया + heparin युक्त ट्यूब के लिए. धीरे से मिलाएं और एक हेमोसाइटोमीटर पर 1:10 रक्त कमजोर पड़ने ट्यूब के 12 डिग्री सेल्सियस लोड और कमरे के तापमान पर छोड़ (20-24 डिग्री सेल्सियस).
    3. 1:10 कमजोर पड़ने की तैयारी के बाद 9-10 मिनट exflagellation घटनाओं की गिनती शुरू करो. 40x आवर्धन के साथ एक चरण विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें.
    4. 10 द्वारा गिना exflagellation घटनाओं की औसत संख्या गुणा और फिर कमजोर पड़ने कारक (10) से गुणा संक्रमित रक्त के प्रति microliter exflagellation की औसत संख्या निर्धारित करने के लिए.
      नोट: यह परख रक्त की 1 डिग्री सेल्सियस मात्रा में पुरुष युग्मक के बाहर निकालने की घटनाओं की संख्या को मापता है, जिसे हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एक अधूरा ookinete मध्यम18 रक्त के साथ मिलाया जाता है बारीकी से स्थितियों के दौरान जो एक रक्त भोजन के बाद मच्छर midgut के अंदर exflagellation होता है नकल करने के लिए.

3. संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स और जमे हुए स्टॉक तैयारी से रक्त-चरण परजीवी का अलगाव और प्रसंस्करण

  1. दिल पंचर द्वारा संक्रमित कृन्तकों के टर्मिनल रक्तस्राव
    1. दिल पंचर द्वारा दाता माउस के रक्त को इकट्ठा करने के लिए एक 26 जी सुई सिरिंज तैयार करें जिसमें 1x हेपरिन (200 यूनिट/एमएल) का लगभग 20 डिग्री सेल्सियस होता है।
    2. रक्तस्राव से पहले माउस को इच्छामृत्यु देने के लिए सीओ2 के धीमे प्रवाह का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें (जो दिल को बेनकाब करने के लिए त्वचा चीरा से पहले और दौरान बनाए रखा जाना है)।
    3. माउस को अपनी पीठ पर रखें और इसके उपांगों को पिन करें। स्टर्नम के आधार के पास त्वचा में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए forceps के साथ त्वचा को खींच और यह कैंची से काटने. डायाफ्राम और पेट की गुहा के शीर्ष को बेनकाब करने के लिए चीरा के स्थल पर त्वचा को अलग करें।
    4. संदंश के साथ रिब पिंजरे का आधार पकड़ो और वक्ष गुहा में प्रवेश करने के लिए डायाफ्राम के माध्यम से काट; दिल या फेफड़ों को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहना होगा। दिल को बेनकाब करने के लिए रिब पिंजरे को वापस पिन करें।
    5. धीरे से दिल पंचर और धीरे धीरे सिरिंज प्लंजर पर खींच करने के लिए रक्त की $ 1 एमएल इकट्ठा करने और यह एक microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरित.
  2. संक्रमित रक्त से जमे हुए स्टॉक की तैयारी
    1. चूहों खून (अनुभाग 3.1 देखें) रक्त parasitemias के साथ कि के बारे में 2% और 5% के बीच हैं, अंगूठी चरणों की एक महत्वपूर्ण राशि के साथ और नहीं के रूप में कई gametocytes.
    2. ठंड समाधान के साथ रक्त के वांछित भाग मिक्स (10% Alsever समाधान में ग्लिसरोल) एक 1:2 अनुपात में और क्रायोजेनिक शीशियों में स्टोर. तरल नाइट्रोजन में फ्रीज.
  3. डीएनए, आरएनए, और प्रोटीन की निकासी के लिए रक्त-स्तर परजीवी का अलगाव और शुद्धि
    1. खून चूहों (अनुभाग 3.1 देखें) रक्त parasitemias कि 0.5% से अधिक कर रहे हैं के साथ.
    2. प्लंजर को हटाने और एक छोटे से कपास झाड़ू डालने से एक 10 एमएल सिरिंज तैयार करें। कपास को सिरिंज के नीचे पैक करें। इसे सेलूलोज़ के साथ तब तक भरें जब तक सेलूलोज़ का स्तर 3 एमएल मार्क तक न पहुंच जाए लेकिन सिरिंज पर 4 एमएल निशान से अधिक नहीं है।
    3. एक अंगूठी स्टैंड पर एक क्लिप में सिरिंज सुरक्षित और यह नीचे एक अपशिष्ट संग्रह ट्यूब जगह है. सिरिंज में 5 एमएल पीबीएस जोड़ें और इसे अपशिष्ट ट्यूब में प्रवाह करने की अनुमति दें।
    4. जमे हुए स्टॉक तैयार अगर जरूरत है, रक्त के केवल 100-300 $L का उपयोग कर. स्तंभ में संक्रमित रक्त (400-700 $L) के बाकी जोड़ें. बूंदों लाल बारी करने के लिए शुरू जब तक एक अपशिष्ट ट्यूब के साथ के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए। एक बार बूंदों लाल बारी करने के लिए शुरू, के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा करने के लिए सिरिंज के नीचे एक नया 14-एमएल संग्रह ट्यूब जगह है।
    5. एक बार प्रवाह धीमी गति से शुरू होता है, सिरिंज करने के लिए पीबीएस जोड़ने और 14 एमएल की कुल मात्रा तक पहुँच गया है जब तक 15 एमएल ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा. एक अपशिष्ट ट्यूब के साथ के माध्यम से शेष प्रवाह ले लीजिए.
    6. कोई ब्रेक के साथ 250 x ग्राम पर 8 मिनट के लिए रक्त / पीबीएस मिश्रण के साथ 14 एमएल ट्यूब सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट निकालें और 14 एमएल ठंडा सैपोनिन जोड़ें (50 मिलीग्राम पीबीएस के 50 एमएल में सैपोनिन)। गोली उखाड़ना करने के लिए, ट्यूब कई बार और भंवर यदि आवश्यक हो तो उलटा.
    7. कोई ब्रेक के साथ 1,217 x ग्राम पर 8 मिनट के लिए ट्यूब सेंट्रीफ्यूज। अतिनैंट निकालें, गोली के ऊपर समाधान के बारे में 0.5 एमएल छोड़ने.
    8. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके समाधान में गोली को पुन: निलंबित करें और इसे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में छोड़ दिया जाता है कि किसी भी अवशिष्ट परजीवी धोने के लिए 14 एमएल ट्यूब के लिए पीबीएस के 500 डिग्री एल जोड़ें। इसे एक ही माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें।
    9. 6,010 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट निकालें और पीबीएस के 1 एमएल को पुन: निलंबित करें। 9,391 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
    10. जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए आगे बढ़ें, कुल आरएनए, और प्रोटीन.
      1. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षणके लिए, supernatant को हटाने और पीबीएस के 200 डिग्री एल में गोली resuspend, और फिर gDNA निष्कर्षण के किसी भी उपयुक्त प्रोटोकॉल का पालन करें।
      2. कुल आरएनए निष्कर्षणके लिए, supernatant निकालें, resuspend और भंवर किसी भी phenol के 1 एमएल में गोली- और ग्वानिडाइन आइसोथियोसाइनेट आधारित समाधान या किसी भी अन्य उपयुक्त अभिकर्मक और, तो, कुल आरएनए निष्कर्षण के किसी भी उपयुक्त प्रोटोकॉल का पालन करें।
      3. कुल प्रोटीन निष्कर्षणके लिए, supernatant को दूर, 6x सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) लोड डाई या किसी अन्य उपयुक्त अभिकर्मक की एक उचित मात्रा में गोली resuspend और, तो, कुल प्रोटीन प्रसंस्करण के किसी भी उपयुक्त प्रोटोकॉल का पालन करें.

4. मच्छर संक्रमण परख

नोट: मच्छर मलेरिया परजीवी जहां यौन प्रजनन होता है की प्राथमिक मेजबान है. मच्छरों को मलेरिया परजीवी संचारित करने के लिए चूहों के संक्रमण कम से कम 1 लाख रक्त चरणों के एक चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा आयोजित किया जाता है, एक संक्रमित माउस खिलाने के बाद (प्रत्येक जीनोटाइप से जो उच्चतम पुरुष युग्मन exflagellation दर प्रदर्शित करता है) के लिए मूस संक्रमण के बाद दिन 3 में एक पिंजरे में Anopheles मच्छरों. फेनिलहाइड्रेज़ीन-उपचारित चूहों में 1 मिलियन रक्त-स्तर परजीवी के साथ चतुर्थ इंजेक्शन एक तेज और उच्च दर पर पुरुष और महिला युग्मक कोशिका के विकास को सुनिश्चित करेगा। पी योएलीई और पी बर्गेई से संक्रमित मच्छरों को क्रमशः 24 डिग्री सेल्सियस और 20-21 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है, ताकि सर्वोत्तम संभव मच्छर चरणों के विकास6के लिए अनुमति दी जा सके।

  1. मच्छर खिला और प्रति मच्छर ookinetes की संख्या का निर्धारण
    1. भोजन करने से पहले 8-12 एच के लिए वयस्क मादा एनोफील्स स्टीफेन्सी या ए गाम्बिया मच्छर (4-7 दिन पुराने) को भूखा रखना। वयस्क मच्छरों को संक्रमित एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर कम से कम 15 मिनट के लिए भोजन करने की अनुमति दें (केटामाइन/xylazine की उचित खुराक के साथ इंजेक्शन) उच्चतम जलन दर के साथ (खंड 2.3 में मापा गया)।
      नोट: Ketamine/xylazine काम कर समाधान नमकीन में शेयर समाधान के 1:5 कमजोर पड़ने और आईपी इंजेक्शन द्वारा तैयार किया जाता है 100 $L प्रति माउस. 10 एमएल स्टॉक समाधान के लिए 1 एमएल xylazine (100 मिलीग्राम/एमएल) को 9 एमएल केटामाइन (100 मिलीग्राम/एमएल) में जोड़ा जाता है।
    2. एक मुंह aspirator के साथ खिलाया महिला मच्छरों और पुरुष मच्छरों निकालें.
    3. 18-20 एच पोस्टफीडिंग पर, 20-30 मच्छरों को इकट्ठा करें और उन्हें मौत सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए फ्रीजर में रखें। एक दूरबीन विच्छेदन क्षेत्र का उपयोग करना, दो 26 जी या 27 जी सुइयों या RPMI या PBS विच्छेदन माध्यम में एक सुई और बल के साथ 20-30 रक्त से भरे midguts बाहर विच्छेदन और एक microcentrifuge ट्यूब आरपीएमआई या पीबीएस के 200 $L युक्त midguts हस्तांतरण (विच्छेदन विधि के लिए) कृपया अनुभाग 4.3 देखें).
    4. 700 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए संग्रह ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें . एक मूसल का उपयोग कर गोलीदार midguts पीस. इस चरण को दोहराएँ.
    5. 50 डिग्री सेल्सियस को भू-गर्भकी ट्यूब से एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक 1:5 कमजोर पड़ने बनाने के लिए RPMI या PBS के 200 $L जोड़ें.
    6. एक हेमोसाइटोमीटर के लिए 12 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण और सामग्री को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर यह इनक्यूबेट।
    7. प्रावस्था कंट्रास्ट तथा 40x आवर्धन के साथ प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके ऊकिनेतों की औसत संख्या निर्धारित की जा सकने वाली.
    8. 10 से परिपक्व ookinetes की औसत संख्या गुणा और फिर 5 के कमजोर पड़ने कारक द्वारा ookinetes की औसत कुल संख्या निर्धारित करने के लिए.
    9. रक्त पोषित मच्छर प्रति ओकिनेट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए विभाजित रक्त-पोषित मच्छरों की संख्या से ओकिनेटियों की औसत संख्या को विभाजित करें।
  2. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए जल्दी oocysts की संख्या का निर्धारण WT की तरह परजीवी उपभेदों
    नोट: इस परख का उद्देश्य हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले जीवित परजीवी की संख्या निर्धारित करना है जो मच्छर midguts का एक पूर्ण संक्रमण स्थापित किया और जल्दी गोलाकार oocysts का गठन किया। यह परख निर्धारित करता है अगर ookinetes (उनके विकास पिछले परख में अनुमानित) मच्छर midgut उपकला कोशिकाओं और midgut के बेसल पटल पक्ष पर जल्दी oocysts के लिए परिवर्तन के माध्यम से traversal द्वारा अपने कार्यों को पूरा एपिथेलिया या नहीं। यह एक और परख है जो GFP व्यक्त परजीवी के महान उपयोग करता है, के रूप में इस स्तर पर जल्दी oocysts गिनती थकाऊ इम्यूनोस्टेनिंग के बिना लगभग असंभव हो जाएगा.
    1. मिडगुट (धारा 4.1 देखें) 20-30 रक्त-पोषित मच्छरों के, दिन 3 या 4 के बाद मच्छर-फीडिंग (पीएमएफ) के लिए पी योलीई 17X-NL, और पी berghei ANKA के लिए दिन में 6 या 7 बजे, दो 26 जी या 27 जी सुई या एक सुई और RPMI या PBS विच्छेदन एम के साथ edium (विच्छेदन विधि के लिए कृपया अनुभाग 4.3) देखें.
    2. कांच स्लाइड के लंबे किनारे की क्षैतिज मिडलाइन पर विच्छेदन माध्यम का 40-50 डिग्री सेल्सियस फैलाएं। इस लाइन के लिए midguts स्थानांतरण, एक समय में एक, विच्छेदन के दौरान, और midguts के लिए और अधिक माध्यम जोड़ने, यदि आवश्यक हो, बाहर सुखाने से बचने के लिए.
    3. विच्छेदित midguts पर धीरे से एक coverslip प्लेस, और यह नेल पॉलिश के साथ सील.
    4. हरे रंग की फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग करना, कम से कम 20 midguts में, प्रत्येक midgut पर जल्दी oocysts की संख्या गिनती।
  3. प्रति मच्छर ओसिस्ट स्पोरोजोइट्स की संख्या का निर्धारण
    1. दो 26-G या 27-G सुइयों या एक सुई और RPMI या पीबीएस विच्छेदन माध्यम में बलकेप के साथ कम से कम 20-30 मच्छरों के midguts विच्छेदन और आरपीएमआई के 200 $L में विच्छेदन midguts इकट्ठा.
    2. निचले पेट खंडों को एक सुई (या संद) के साथ मजबूती से रखें और छाती और पेट के बीच के जंक्शन पर दूसरी सुई के साथ छाती को ऊपर की ओर धकेलें। छाती पेट से अलग जब तक ध्यान से कम धक्का मत करो. जैसे ही जुदाई शुरू होता है सफेद midgut फैला दिखाई देगा, और फिर midgut एक ही सुई है कि छाती को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था का उपयोग कर घेघा अंत से काट दिया जाएगा। यदि अभी भी पेट से जुड़ा हुआ है, तो उसी सुई का उपयोग पेट से दूर midgut खींचने के लिए किया जा सकता है। सभी मच्छरों के midguts एक समय में एक सुई के साथ माध्यम से इकट्ठा करके संग्रह ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    3. संग्रह ट्यूब के नीचे करने के लिए midguts व्यवस्थित और उन्हें एक मूसल के साथ पीसने के लिए 700x ग्राम पर 1 मिनट के लिए संग्रह ट्यूब centrifuge. इस चरण को दोहराएँ.
    4. एक हेमोसाइटोमीटर के लिए 12 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण और इसकी सामग्री को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर यह इनक्यूबेट।
    5. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के 40X उद्देश्य का उपयोग कर oocyst sporozoites गिनती. 1:5 और/या 1:10 कमजोर पड़ने का प्रयोग करें यदि मच्छर का मलबा स्पोरोजोइट्स की सटीक गिनती को रोकता है या यदि स्पोरोजोइट्स की संख्या सही गणना करने के लिए बहुत अधिक है।
    6. ओसिस्ट स्पोरोजोइट्स की औसत कुल संख्या की गणना 10 से sporozoites की औसत संख्या गुणा और, फिर, कमजोर पड़ने कारक द्वारा उस संख्या गुणा, यदि कोई हो, और कुल मात्रा (200 डिग्री सेल्सियस) द्वारा।
    7. प्रति मच्छर ओसिस्ट स्पोरोजोइट्स की औसत संख्या की गणना करने के लिए विच्छेदित मच्छरों की संख्या से स्पोरोजोइट्स की औसत कुल संख्या को विभाजित करें।
      नोट: मच्छर चरणों के संक्रमण की सफलता या उत्पादकता को मापने के लिए एक आम गलती oocyst विकास के बाद के चरणों में oocysts की संख्या की गिनती है। यह कुछ oocysts oocyst विकास के बाद के समय अंक पर धानी होने के कारण है, और दूसरों को sporozoites विकसित करने में विफल, यहां तक कि एक ही midgut पर. मच्छर चरणों संक्रमण की उत्पादकता निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा और सबसे विश्वसनीय तरीका दिन 10-12 के बाद मच्छर संक्रमण के दिनों में midgut oocyst sporozoites की औसत संख्या की गिनती है पी yoelii के लिए और दिन 12-14 दिन में पी bergheiके लिए मच्छर के बाद संक्रमण |
  4. प्रति मच्छर लार ग्रंथि स्पोरोजोइट्स की संख्या का निर्धारण
    नोट:मच्छर चरणों के विकास के पूर्ण पूरा होने का अंतिम मूल्यांकन लार ग्रंथि पर आक्रमण करने वाले स्पोरोजोइट्स की संख्या का आकलन करके पूरा किया जाता है, जो कशेरुकियों के लिए संक्रामक और संक्रामक चरण हैं। लार ग्रंथि के आक्रमण oocyst sporozoite विकास के पूरा होने के बाद स्थापित किया गया है, हेमोलिम्फ में प्रवेश, लार ग्रंथि acinar कोशिकाओं के बेसल पटल के लिए लगाव, और लार ग्रंथियों तक पहुँचने के लिए acinar कोशिकाओं के ट्रैवर्सल नलिकाओं5. इसलिए, इस परख भी इन प्रक्रियाओं या नहीं के सभी की सफलता का एक मूल्यांकन है. फिर भी, हेमोलिम्फ स्पोरोज़ोइट संख्या का एक अनुमान oocysts और लार ग्रंथियों के आक्रमण में दोषों से प्रवेश में दोषों के बीच भेदभाव की अनुमति होगी35. लार ग्रंथि sporozoites की शुद्धि sporozoite गतिशीलता और आक्रमण phenotypes पर कई कार्यात्मक परख आयोजित करने की अनुमति देता है. लार ग्रंथि sporozoites भी चूहों के इन विवो संक्रमण के लिए और टीकाकरण अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है36,37. इसके अलावा, इन विट्रो यकृत चरण आक्रमण या विकास परख स्थापित करने के लिए उपलब्ध सबसे पुन: उत्पादनयोग्य चरणों में लार ग्रंथि स्पोरोजोइट्स का उपयोग किया जाता है।
    1. 50-100 मादा मच्छरों की लार ग्रंथियों को अलग करें, दिन में 14-16 पी एफ पी yoelii के लिए और दिन में 17-20 pmf पी bergheiके लिए, अधिमानतः दो 26 जी या 27 जी सुइयों के साथ, RPMI या DMEM मध्यम में बर्फ पर रखा और 5% भ्रूण बोविन (FBS) के साथ पूरक या /बोवाइन सीरम एल्बुमिन (BSA) के लिए P. yoelii sporozoites या 3% FBS/ यदि स्पोरोजोइट्स को विट्रो परख में हेपेटोमा में उपयोग किया जाना है, तो विच्छेदन माध्यम में 1% पेनिसिलिन/ वहाँ आम तौर पर लार ग्रंथियों के विच्छेदन के लिए दो तरीके हैं. पहली विधि समय लेने वाली है, लेकिन बहुत कम या कोई contaminating ऊतकों के साथ लार ग्रंथियों के विच्छेदन की ओर जाता है. दूसरी विधि कम समय लेने वाली है, लेकिन ऊतकों को दूषित करने की एक महत्वपूर्ण राशि के संग्रह की ओर जाता है। पहली विधि यहाँ विस्तृत है.
    2. ऊपरी पेट के खंडों को एक सुई के बीवले हुए पक्ष के साथ रखें और ध्यान से सिर को बहुत हल्के से (बहुत कम धक्का में) सिर और छाती के बीच के जंक्शन पर ऊपर की ओर दिशा में तब तक धकेलें जब तक कि सिर को बिना छाती से सावधानी से अलग न किया जाए। कांच की लार ग्रंथियों को फाड़, उजागर लार ग्रंथियों तो एक ही सुई है कि सिर को ऊपर की ओर धकेल दिया के साथ सिर से अलग कर रहे हैं.
    3. विचरित लार ग्रंथि को विच्छेदन माध्यम से एक लघु कांच पेस्टर पिपेट का उपयोग करके उठाया जाएगा।
    4. जब सभी लार ग्रंथियों को काट दिया गया है और काटा गया है, तो प्रतिभा ट्यूब को अपकेंद्रण (1min, 700 x g) में मध्यभागी युक्त रखेगी।
    5. चरण 2 इसके विपरीत और 40x आवर्धन के लिए सेट एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर sporozoites गणना। यदि मच्छरों की संख्या ने $40 को अलग कर दिया, तो लार ग्रंथियों को 1:5 या 1:10 तक पतला कर दें, जो अपेक्षित संक्रमितता उपज (पहले की परखों में निर्धारित) के आधार पर होती है।
    6. 10 से sporozoites की औसत संख्या गुणा और कमजोर पड़ने कारक (यदि कोई हो). लार ग्रंथि sporozoites की औसत संख्या निर्धारित करने के लिए कुल मात्रा से गुणा. प्रति मच्छर औसत लार ग्रंथि स्पोरोजोइट्स का निर्धारण करने के लिए विच्छेदित मादा मच्छरों की संख्या से विभाजित करें।
      नोट: लार ग्रंथियों के विच्छेदन के साथ समस्या उनके छोटे आकार और कांच पारदर्शी उपस्थिति है। इस प्रकार, लार ग्रंथियों को अलग करना बहुत मुश्किल है और, इसलिए, वे आमतौर पर छाती के ललाट भाग से अन्य ऊतकों के साथ एक मुश्त के रूप में अलग हो जाते हैं, जो संग्रह के दौरान लार ग्रंथियों को टूटने से बचाने के लिए भी महत्वपूर्ण है।

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Representative Results

मलेरिया परजीवी के लिए रिवर्स आनुवंशिक उपकरण और तकनीक लागू करने की सफलता ने मलेरिया अनुसंधान के क्षेत्र में क्रांति ला दी है, जिसमें कई प्लाज्मोडियम प्रजातियों39के विशिष्ट जीनोमिक खंडों को जोड़ने, हटाने या संशोधित करने की क्षमता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि वितरणीय जीनोमिक लोकी की पहचान की गई है और सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है ताकि सभी जीवन चक्र चरणों में एक स्थिर अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, डबल होमोलॉगस पुनर्संयोजन द्वारा कृंतक और मानव मलेरिया परजीवी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर ों को पेश किया जा सके। ,41,42. इन WT की तरह ट्रांसजेनिक परजीवी का एक उदाहरण Py230p(-) परजीवी है, जो हमारी प्रयोगशाला में उत्पन्न किया गया है, और रक्त और मच्छर जीवन चक्र चरणों के विकास में कोई स्पष्ट दोष दिखाया15,16, 17. ये ट्रांसजेनिक रिपोर्टर परजीवी पीएचएसपी 70के मजबूत और संरचक प्रवर्तक के नियंत्रण में, रक्त अवस्थाओं में व्यक्त किए गए हैं (चित्र 1क) ओकिनेट्स (चित्र 1ख) युवा ओसिस्ट (चित्र 1C ) ) Anopheles stephensi midguts पर , और sporozoites में Anopheles stephensi महिलाओं की लार ग्रंथियों से अलग (चित्र 1D) . इस प्रकार, eGFP-expressing रक्त परजीवी यह बहुत आसान और कम समय लेने वाली ट्रांसजेनिकिक्स के विभिन्न जीनोटाइप के बीच या दवा का इलाज और दवा-लक्ष्यीकरण में untreated के बीच प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर रक्त चरण परजीवी विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए बनाया ट्रांसजेनिक रिपोर्टर परजीवी का उपयोग कर assays.

यह पुष्टि करने के लिए कि प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग और माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिक थकाऊ परजीवी आकलन के बीच कोई मात्रात्मक अंतर नहीं है, ईजीएफपी-सब्स्वेशन Pyp230p(--) का उपयोग परजीवी एरिथ्रोसाइट्स के प्रतिशत का अनुमान लगाने के लिए किया गया था प्रवाह साइटोमेट्री और Giemsa द्वारा स्विस वेबस्टर चूहों चतुर्थ के एक समूह में पतली रक्त धब्बा 10,000 parasitized एरिथ्रोसाइट्स के साथ संक्रमित. प्रवाह साइटोमेट्री परजीवीमिया% मान Giemsa-सना हुआ पतली रक्त स्मीयर, जो दो विशेषज्ञ वैज्ञानिकों द्वारा अनुमान लगाया गया था की निगरानी द्वारा अनुमानित परजीवी% के लिए सीधे मेल खाती है (चित्र2) . यह रक्त-चरण परजीवी की विकास दर के निर्धारण में माइक्रोस्कोपी की थकाऊ और प्रवण-से-मानव-त्रुटि विधि के लिए एक अधिक सटीक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।

मलेरिया परजीवी रक्त चरणों के साथ कृन्तकों के संक्रमण के साथ जुड़े एक महत्वपूर्ण विसंगति संक्रमण के चतुर्थ मार्ग की तुलना में आईपी के लिए साहित्य में एक मजबूत प्राथमिकता के साथ संक्रमण के मार्ग का विकल्प है, क्योंकि यह कम समय लेने वाली है। संक्रमण के इन दो मार्गों की तुलना करने के लिए, पांच BALB/c चूहों के दो समूहों को 1,000 eGFP-expressing Pyp230p(-) parasitized एरिथ्रोसाइट्स प्रति माउस से संक्रमित थे, या तो IV या आईपी मार्गों के माध्यम से. परजीवीता 4 दिनों की अवधि के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर दैनिक निगरानी की गई थी। IV-संक्रमित समूह की तुलना में आईपी-संक्रमित समूह परजीवीमिया% में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी का परीक्षण किए गए सभी दिनों पर नोट किया गया था (चित्र 3)। यह सबूत है कि चतुर्थ संक्रमण मार्ग मलेरिया परजीवी रक्त चरणों के साथ assays के लिए संक्रमण का एक अधिक मात्रात्मक सटीक मार्ग है प्रदान करता है.

फिर भी, रक्त-चरण परजीवी का मूल्यांकन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग के लिए एक सीमा यौन और अलैंगिक चरणों के बीच और पुरुष और महिला युग्मकों के बीच भेदभाव है। इसलिए, विभिन्न अलैंगिक और यौन अवस्थाओं में से प्रत्येक के प्रतिशत का अनुमान (चित्र 4) को गिमसा से सना हुआ पतला रक्त स्मीयर के आकारिकी मूल्यांकन पर निर्भर करना पड़ता है। परिपक्व पुरुष और महिला युग्मकों की स्पष्ट विभिन्न आकृति विज्ञान के बावजूद (चित्र 4), अपरिपक्व यौन अवस्थाएँ अक्सर अलैंगिक अवस्थाओं से अविवेच्य होती हैं।

मच्छर midgut में पुरुष gametocyte से उद्भव पर पुरुष gametes का एक आवश्यक समारोह पुरुष gamete exflagellation है, जो संचरण में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है कि समय की एक बहुत ही कम अवधि के भीतर होना चाहिए है. कई अलग-अलग प्रणालियों में इसका मूल्यांकन करने के लिए प्रयुक्त परिवर्तनीय विधियों का वर्णन किया गया है। यहाँ, हम एक मानकीकृत विधि है कि किसी भी सरल प्रयोगशाला सेटिंग में दोहराया जा सकता है दिखा. हमने प्राप्तकर्ता चूहों में फेनिलहाइड्रेज़ीन के इंजेक्शन के साथ या उसके बिना पुरुष युग्मक के विस्तार का मूल्यांकन किया (चित्र 5)। हम दिखा सकते हैं कि फेनिलहाइड्रेज़ीन उपचार काफी (चार गुना) पुरुष gamete exflagellation की दर में वृद्धि हुई है, जो बारी में निषेचन दर और सभी बाद मच्छर चरणों की संख्या में वृद्धि होगी.

Figure 1
चित्र 1 : के विकास पी yoelii p230p(-) परजीवी गठन के रूप में रक्त और मच्छर चरणों में eGFP व्यक्त. (क) मिश्रित रक्त-अवस्था परजीवी (1,000X आवर्धन) की छवि। (बी) ऊकीनेट की छवि (400X आवर्धन)। (ग) एक एनोफ़ेल्स स्टीफेन्सी मच्छर मिडगुट की छवि जो दिन 4 बजे से संक्रमित थी , लाइव p230p(-) परजीवी के oocysts eGFP (100X आवर्धन) व्यक्त करते हैं. (डी) यह पैनल एक पी yoelii p230p(-) लार ग्रंथि sporozoite की एक जीवित छवि से पता चलता है, दिन में बाहर विच्छेदित 15 pmf, eGFP व्यक्त (400X आवर्धन). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन के औसत रक्त-स्तर परजीवी पी yoelii p230p(-) परजीवी काफी अलग नहीं हैं. चार स्विस वेबस्टर चूहों के एक समूह को अंतःशिरा Pyp230p(-) प्रति माउस के 10,000 परजीवी एरिथ्रोसाइट्स से संक्रमित किया गया था और औसत रक्त-चरण परजीवी mias% प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा और सूक्ष्म मूल्यांकन द्वारा दैनिक 7 दिनों के लिए दर्ज किए गए थे Giemsa से सना हुआ पतली रक्त स्मीयर की कुल से 20,000 और $ 6000 एरिथ्रोसाइट्स, क्रमशः. सूक्ष्म परीक्षा परिणाम दिखाए गए स्लाइड प्रति दो विशेषज्ञ वैज्ञानिकों द्वारा दो रीडिंग के औसत रहे हैं, और प्रत्येक स्लाइड के परजीवी का मूल्यांकन करने के लिए समय प्रत्येक वैज्ञानिक द्वारा कम से कम 10 मिनट था. यहाँ दिखाए गए किसी भी दिन कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया जा सका। सभी परजीवी उपभेदों के लिए मतलब मूल्यों दो पूंछ टीपरीक्षण के साथ विश्लेषण किया गया. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक अंतःशिरा इंजेक्शन पी yoelii p230p(-) परजीवी एक intraperitoneal इंजेक्शन से काफी अलग रक्त चरण परजीवी पैदावार. पांच BALB/c चूहों के दो समूहों Pyp230p(-) प्रति माउस के 1,000 परजीवी एरिथ्रोसाइट्स से संक्रमित थे, या तो अंतःशिरा या इंट्रापेरिटोनल मार्ग के माध्यम से, और औसत रक्त चरण परजीवी% प्रवाह द्वारा 4 दिनों के लिए दैनिक दर्ज किए गए थे कुल 20,000 एरिथ्रोसाइट्स से साइटोमेट्री। रक्त-अवस्था परजीवीमिया के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी (एक तारांकन द्वारा नोट किया गया) अंतःशिरा मार्ग समूह की तुलना में अंतःपर्णीय मार्ग समूह में परीक्षण किए गए सभी दिनों के लिए पता लगाया जा सकता है। सभी परजीवी उपभेदों के लिए मतलब मूल्यों दो पूंछ टीपरीक्षण के साथ विश्लेषण किया गया. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : Morphology के पी yoelii gametocytes में एक Giemsa-sstained पतली रक्त धब्बा. WT P. yoelii 17X-NL तनाव से संक्रमित एक स्विस वेबस्टर माउस के एक Giemsa से सना हुआ पतली रक्त स्मीयर (1,000X आवर्धन) की एक छवि बाईं ओर ठेठ नीले रंग की महिला gametocyte से पता चलता है (एक तीर से विख्यात) और गुलाबी रंग का पुरुष (एक तीर से विख्यात) और गुलाबी रंग का पुरुष (एक तीर से विख्यात) एक तारांकन द्वारा निरूपित) छवि के दाईं ओर gametocyte. दिखाए गए अन्य चरणों अलैंगिक रक्त चरणों रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : पुरुष युग्मक पर फ़ेनिलहाइड्रेजीन का प्रभाव। पी योलीईके नर युग्मक जलन दर आकलन से 5 दिन पहले प्राप्तकर्ता चूहों में फेनिलहाइड्रेजिन का प्रभाव . Phenylhydrazine काफी पुरुष gamete exflagellation की दर बढ़ जाती है, जो एक उच्च मच्छर चरणों संक्रमण के बाद मच्छर खिला की ओर जाता है. सभी परजीवी उपभेदों के लिए मतलब मूल्यों दो पूंछ टीपरीक्षण के साथ विश्लेषण किया गया. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मानव मलेरिया परजीवी के लिए अपने जीवन चक्र के सामान्य जीव विज्ञान में समानता के बावजूद, माउस मलेरिया मॉडल भी मानव प्लाज्मोडियम प्रजातियों है कि vivo मॉडल में विश्वसनीय के रूप में उनके उपयोग की सीमा होगी करने के लिए कई भिन्नता है. उदाहरण के लिए, टीके के रूप में जीवित-एटेनुआत परजीवी के अपवाद के साथ, सबयूनिट और डीएनए और अन्य टीकों के साथ सभी टीके के अध्ययन ों ने माउस मॉडल में उत्कृष्ट परिणाम दिए, लेकिन स्थानिक क्षेत्रों में रहने वाले मनुष्यों में, परिणाम संतोषजनक से दूर थे।

एक और समस्या जीवन चक्र चरण infectivity के एक माउस तनाव से दूसरे करने के लिए, और कभी कभी एक पशु विक्रेता से दूसरे करने के लिए एक ही माउस तनाव के लिए अंतर है. इसके अलावा, मुख्य दो कृंतक मलेरिया प्रजातियों है कि व्यापक रूप से vivo मलेरिया मॉडल, पी berghei और पी yoeliiमें पसंद के रूप में उपयोग किया जाता है, एक तुल्यकालिक रक्त चरण चक्र है, जो पूरी तरह से किसी भी मानव मलेरिया से अलग है प्रदर्शन नहीं है परजीवी. हालांकि, विवो मॉडल के रूप में माउस मलेरिया परजीवी का उपयोग करने के लाभ अब तक इन असमानताओं से पल्ला झुकना, जो भी इन सीमाओं के आणविक ड्राइव के अधिक गहराई से विश्लेषण से दूर किया जा सकता है. फिर भी, इन सीमाओं ज्यादातर कृंतक मलेरिया रक्त चरण परजीवी द्वारा प्रदर्शित कर रहे हैं, लेकिन मलेरिया परजीवी के अन्य जीवन चक्र चरणों के लिए के रूप में ज्यादा नहीं.

हालांकि रक्त चरणों विभिन्न टीके के लिए महत्वपूर्ण हैं, दवा लक्ष्यीकरण, इम्यूनोलॉजी, और कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन, वहाँ मानकीकृत तरीकों और प्रोटोकॉल है कि phenopical विश्लेषण और कार्यात्मक परख है कि शामिल पर ध्यान केंद्रित की कमी है कृंतक मलेरिया परजीवी रक्त चरण परजीवी, मच्छर संचरण और transfection प्रोटोकॉल पर अधिक ध्यान देने के साथ. इसलिए, इस लेख में विधियां कृंतक मलेरिया परजीवी के रोगजनक चरणों का अध्ययन करने के लिए मानकीकृत और सरलीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करने में मदद करेंगी।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

अहमद आली विकास अनुदान 2015BSV036 से Bezmialem Vakif विश्वविद्यालय के लिए धन द्वारा समर्थित है, और सार्वजनिक स्वास्थ्य और उष्णकटिबंधीय चिकित्सा के Tulane विश्वविद्यालय स्कूल द्वारा प्रदान की धन द्वारा, और R21Grant के लिए NIH-NIAID से धन द्वारा 1R21AI11058-01A1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sigma 375095-100KU
Xanthurenic acid Sigma D120804-5G
Hypoxanthine Sigma H9377-25G
Alsever's solution Sigma A3551-500ML
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Phenylhydrazine Sigma P26252-5G
Glycerol Sigma G5516-500ML
Giemsa Sigma GS1L-1L
26 G x 3/8 Precision Glide Needle,  Becton Dickinson 305110
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 Becton Dickinson 309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G Becton Dickinson 329412
Isoflurane, USB Piramal 2667- 46- 7
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
RPMI Gibco 22400105
DMEM Gibco 11995065
Pencillin/Streptomycin Gibco 10378016
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Fiber Glass Wool Corning 3950

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रोग प्रतिरक्षण और संक्रमण अंक 147 मलेरिया प्लाज्मोडियम berghei, प्लाज्मोडियम yoelii Anopheles रक्त चरणों gametocytes exflagellation ookinetes oocysts sporozoites जिगर चरणों
Rodent मलेरिया परजीवी अलैंगिक और यौन रक्त चरणों और मच्छर चरणों का फेनोटाइपिक विश्लेषण
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Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).

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