Summary
ونظرا لأوجه التشابه اللافتة للنظر في دورة الحياة وبيولوجيا طفيليات الملاريا القوارض وطفيليات الملاريا البشرية، أصبحت نماذج الملاريا القوارض لا غنى عنها لبحوث الملاريا. وفي هذا الشأن، قمنا بتوحيد بعض أهم التقنيات المستخدمة في التحليل الفينوتي للأنواع البرية والمعدلة وراثيا من الملاريا القوارض.
Abstract
وقد عززت التطورات الأخيرة في علم الوراثة وتكنولوجيات بيولوجيا النظم فهمنا لبيولوجيا طفيليات الملاريا على المستوى الجزيئي. ومع ذلك، لا تزال الأهداف الفعالة لطفيليات الملاريا لتطوير اللقاحات والعلاج الكيميائي محدودة. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم توافر نماذج العدوى ذات الصلة والعملية في الجسم الحي لأنواع البلازموديوم البشرية، وأبرزها بالنسبة لP. falciparum و P. vivax. ولذلك، استخدمت أنواع الملاريا القوارض على نطاق واسع كبديل عملي في نماذج الجسم الحي للقاح الملاريا، واستهداف الأدوية، والاستجابة المناعية، ودراسات التوصيف الوظيفي للبلازموديومسب المحفوظة. وفي الواقع، أثبتت نماذج الملاريا القوارض أنها لا تقدر بثمن، ولا سيما لاستكشاف انتقال البعوض وبيولوجيا مرحلة الكبد، وكانت لا غنى عنها لإجراء دراسات مناعية. ومع ذلك، هناك اختلافات في الأساليب المستخدمة لتقييم الأنماط الظاهرية للطفيليات غير الجنسية والجنسية في مرحلة الدم. ومن الأمثلة على هذه الاختلافات اختيار العدوى الوريدية مقابل العدوى داخل تبواق القوارض مع طفيليات مرحلة الدم وتقييم الإثارة بين الذكور. هنا، نقوم بتفصيل الطرق التجريبية الموحدة لتقييم الأنماط الظاهرية لمراحل الدم غير الجنسي والجنسي في الطفيليات المعدلة وراثيا التي تعبر عن أنواع طفيليات الملاريا من نوع المراسل أو البرية من نوع القوارض. كما نقوم بتفصيل طرق تقييم الأنماط الظاهرية لمراحل البعوض الطفيلي ة (الجاميتس، أوكينيتس، أوكيستس، وسبوروزويتس) داخل ناقلات البعوض الأنوفيليس. هذه الأساليب مفصلة ومبسطة هنا للسلالات القاتلة وغير الفتاكة من P. berghei و P. yoelii ولكن يمكن أيضا أن تطبق مع بعض التعديلات على P. chabaudi و P. vinckei القوارض الملاريا الأنواع.
Introduction
تسبب طفيليات الملاريا مئات الملايين من الإصابات بالملاريا بين البشر في جميع أنحاء العالم، مع أكثر من 600،000 حالة وفاة كل عام1. تحدث العدوى البشرية من قبل خمسة أنواع طفيلية الملاريا، وهي P. falciparum، P. vivax، P. ovale، P. malariae،و P. knowlesi. معظم الوفيات السريرية الناجمة عن الملاريا سببها P. falciparum في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى1. وهناك نوع آخر من أنواع طفيليات الملاريا البشرية التي تسبب أمراضا واسعة النطاق في جميع أنحاء العالم خارج أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى هو P. vivax2. الأنواع الثلاثة الأخرى كلها مقيدة جغرافيا أكثر وتتسبب في التهابات الملاريا الحميدة، باستثناء P. knowlesiالقاتلة 3. إن عدم توافر نماذج العدوى غير البشرية ذات الصلة والعملية في الجسم الحي كان ولا يزال يشكل عقبة أمام تطوير لقاحات الملاريا والأدوية. وقد اعتمدت في وقت سابق استهداف أدوية الملاريا والدراسات الأيضية على نطاق واسع على نماذج الملاريا الطيور مثل P. gallinaceum و P. lophurae, تصيب الدجاج والبط, على التوالي4. وبعد ذلك، أدخلت أنواع الملاريا القوارض تدريجيا في مختلف اللقاحات والدراسات التي تستهدف المخدرات كما هو الحال في نماذج الجسم الحي. وعلى مر السنين، تراكمت الأدلة على أوجه التشابه بين البيولوجيا والتفاعلات بين الطفيليالمضيف والطفيليات في مراحل دورة حياة نماذج الملاريا القوارض لأنواع الملاريا البشرية.
وعلى وجه الخصوص، كانت نماذج الملاريا القوارض بالغة الأهمية لاستكشاف وتوصيف بيولوجيا البعوض والمراحل السابقة للحريثوسير5. ومع ذلك، هناك أربعة أنواع الملاريا القوارض(P. berghei، P. yoelii، P. chabaudi، و P. vinckei) التي لها سمات بيولوجية مختلفة ، وأبرزها في مراحل الدم6. تختلف أنواع الملاريا القوارض في تزامن مراحل الدم، حيث مراحل الدم من سلالات P. chabaudi و P. vinckei متزامنة في الغالب، في حين أن مراحل الدم من P. berghei و P. yoelii ليست6 , 7.وثمة فرق ملحوظ آخر هو التطهير الذاتي لمراحل الدم التي تحدث في بعض السلالات (علىسبيلالمثال، P. yoelii 17X-NL، P. berghei NK65، و P. vinckei lentum)،في حين أن عدوى الدم من غيرها سلالات من نفس النوع يمكن أن تكون قاتلة إذا تركت دون علاج(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, و P. chabaudi AS). وعلاوة على ذلك، P. yoelii 17X-NL سلالة وP. berghei ANKA سلالة تغزو بشكل تفضيلي reticulocytes8،9،10،11، على الرغم من أن هذه الميزات من P. سلالات يويلي وP. berghei ليست متطلبات النمو الصارمة12،13،14. لذلك، يتم التعامل مع الفئران مع فينيل هيدرازين قبل العدوى مع مراحل الدم من تلك الطفيليات لزيادة الطفيليات وgametocytemia اللازمة لعدوى البعوض لسلالة P. berghei ANKA وP. yoelii 17X-NL15،16،17،18،19.
كما توجد اختلافات في مراحل البعوض بين مختلف أنواع الملاريا القوارض، وأبرزها درجة الحرارة والوقت اللازمين لتطوير مراحل البعوض الأمثل وطول السبوروزويت5و6، 20. في المراحل ما قبل الاريثروسسية من أنواع الملاريا القوارض، وتشمل الاختلافات أنواع القوارض والإجهاد التي هي الأكثر عرضة للتلقيح sporozoite المعدية، وعدد من sporozoites اللازمة للتلقيح في سلالة القوارض عرضة، و أنواع الخلايا الثديية اللازمة لاختبارات تطوير مرحلة الكبد في المختبر، والوقت لإكمال تطور مرحلة الكبد5،21،22،23،24،25 ،26،27،28،29،30.
وعلى الرغم من هذه التقلبات، كانت طفيليات الملاريا القوارض النماذج المواتية في وقت مبكر لتطبيق النهج الوراثية العكسية، لأنها كانت أقل استهلاكا للوقت والموارد مع احتمال كبير للنجاح31. في الواقع، كانت نماذج الملاريا القوارض أفضل النماذج، وفي كثير من الحالات النماذج الوحيدة، المتاحة لسنوات عديدة لتوصيف وظيفيا الجينات المعبر عنها في مراحل البعوض والكبد.
في ضوء شعبية وإمكانية استخدام النهج الوراثية العكسية في نماذج الملاريا القوارض، تم استخدام عدد من المنهجيات المختلفة لتحليل الأنماط الظاهرية لمراحل دورة حياة الطفيليات المعدلة وراثيا، وخاصة مراحل الدم. غير أن بعض هذه المنهجيات غير متسقة؛ على سبيل المثال، مقارنة عدوى الطفيليات في مرحلة الدم بعد حقن IP (والتي من المحتمل أن تستنزف إلى العقد الليمفاوية العبية، ومن هناك، يمكن أن تدخل مجرى الدم؛ وبالتالي، فإن الطفيليات المحقونة لا ينتهي بها المطاف بالتساوي في مجرى الدم) ، مقارنة انتقال البعوض من الحيوانات المستنسخة مع عدد مختلف من عمليات نقل مرحلة الدم التسلسلية أو رقم G (التي يمكن أن تؤثر على تكوين اللطوطوطين32،33)، أو مقارنة الطفيليات المعدلة وراثيا مباشرة إلى النوع البري السذاجة (WT) الطفيليات التي لم تخضع أبدا للكهرباء واختيار الدواء الإيجابي ومختلف التقييمات غير الموحدة من اللجام الذكور exflagellation. لذلك، من الأهمية بمكان توحيد البروتوكولات التي هي بسيطة لمتابعة التحليل الفينوتي لأي نوع من الطفيليات الملاريا القوارض المعدلة وراثيا أو WT في الدم وفي البعوض لاستيعاب التغيرات البيولوجية لملاريا القوارض أنواع الطفيليات.
هنا، نحن تقرير عن موحدة، بروتوكول تجريبي مفصل لتحليل فينوتيبيك من مراحل دورة حياة الدم والبعوض من الطفيليات المعدلة وراثيا أو البرية من نوع P. yoelii و P. berghei . وتنطبق هذه البروتوكولات أيضا على الطفيليات P. chabaudi و P. vinckei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية الموصوفة هنا وفقا للبروتوكولات المعتمدة للجنة الرعاية والاستخدام الحيوانية المؤسسية (IACUC) من جامعة تولين ولجنة أخلاقيات الحيوانات في جامعة بزاميليم فاكيف. وقد أجريت جميع البروتوكولات التجريبية الأخرى واستخدام الحمض النووي المؤتلف وفقا للبروتوكولات المعتمدة للجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية التابعة لجامعة تولين.
1. عدوى الفئران مع الطفيليات في مرحلة الدم لتحليل الطفيليات واختبارات عدوى البعوض
- اليوم -3: الحقن الاختياري للفينيل هيدرازين في الفئران المتلقية
- حقن الفئران المتلقية خارج SW أو CD1 (الفئران التي سيتم استخدامها لعدوى البعوض وتشخيص عدوى البعوض) داخل الصفاق (IP) مع 100 ميكرولتر من فينيل هيدرازين (50 ملغ من فينيل هيدرازين في 5 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)) باستخدام إبرة 26 G حقنه.
ملاحظة: لعدوى البعوض قوية من P. berghei و P. yoelii، يستخدم فينيل هيدرازين للحث على reticulocytosis في الفئران المتلقية ، مما يزيد من الطفيليات ، وبالتالي ، في المئة من gametocytes ، وبشكل ملحوظ يزيد من exflagellation من اللجام الذكور (الشكل5) ، مما سيؤدي إلى أفضل البعوض مراحل العدوى لكل من P. berghei و P. yoelii سلالات15،16،17، 18.
- حقن الفئران المتلقية خارج SW أو CD1 (الفئران التي سيتم استخدامها لعدوى البعوض وتشخيص عدوى البعوض) داخل الصفاق (IP) مع 100 ميكرولتر من فينيل هيدرازين (50 ملغ من فينيل هيدرازين في 5 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)) باستخدام إبرة 26 G حقنه.
- اليوم -2: حقن مخزونات الطفيليالمجمدة في الفئران المانحة
- ذوبان بسرعة المخزونات المجمدة المبردة وحقن على الفور كل فأر المانحة (عادة اثنين من الفئران لكل النمط الجيني) IP مع ~ 200 درجة مئوية من الأرصدة باستخدام حقنة إبرة 26 G.
ملاحظة: لا يوجد أكثر من خمسة فئران لكل قفص ضمن إعدادات vivarium الخاضعة للرقابة. - بدء فحص الطفيليات تحت هدف المجهر 100X على غيمسا ملطخة مسحة الدم رقيقة بعد 24 ساعة بعد العدوى. اتبع القسم 2.1 من البروتوكول لمسحات الدم الرقيقة الملطخة بـ Giemsa.
ملاحظة: بسبب عدم القدرة على حساب مراحل الدم القابلة للحياة على قيد الحياة على وجه التحديد بعد ذوبان بسرعة وحقن الدم المصاب بالتبريد، تتلقى الفئران المانحة الدم المحفوظ بالتبريد أولاً. يمكن تحديد كريات الدم الحمراء المصابة للفأر المانح كمياً على وجه التحديد واستخدامها في وقت لاحق.
- ذوبان بسرعة المخزونات المجمدة المبردة وحقن على الفور كل فأر المانحة (عادة اثنين من الفئران لكل النمط الجيني) IP مع ~ 200 درجة مئوية من الأرصدة باستخدام حقنة إبرة 26 G.
- اليوم 0: نزيف الفئران المانحة
- نزيف الفئران المانحة (انظر القسم 3.1) عندما يكون الطفيليات بين 0.1٪ و 1٪، والتي يتم الحصول عليها عادة 2-3 أيام بعد تجميد الأسهم العدوى في حالة سلالات P. yoelii 17X-NL و P. berghei ANKA.
- استخدام ثقب الوريد الوجه (للحصول على ما بين 200 و 500 درجة مئوية)، أو نزيف نهائي الحيوانات عن طريق ثقب القلب (للحصول على ما بين 600 و 1.2 مل) من الدم المصاب. ينزف الفئران بشكل نهائي عن طريق ثقب القلب كما هو موضح بالتفصيل في القسم 3-1.
ملاحظة: نزيف الوريد الوجه ليست طريقة روتينية للحصول على الدم كما أنه من الصعب جدا لتطبيق ومرهقة جدا للفئران، بالمقارنة مع نزيف المحطة الطرفية. الطفيلية المثلى لنزيف الفئران المانحة بين 0.1٪-1٪ لأنه، في هذا النطاق الطفيلي، هناك عدد قليل جدا من الخلايا اللموبية (التي لا يمكن تكرارها لإنتاج مراحل الدم اللاجنسي) وهناك أقل مزدوجة أو ثلاثية المصابة كريات الدم الحمراء (التي يجعل القياس الكمي أقل دقة).
- اليوم 0: القياس الكمي للدم المصاب لإعداد جرعات من كريات الدم الحمراء المصابة عن طريق التخفيف التسلسلي
- إعداد تخفيفات تسلسلية من دم المتبرعين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق (أنبوب التخفيف 1). إضافة 900 درجة مئوية من RPMI المتوسطة إلى أنبوب 1 ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع نفس طرف ماصة، وخلق تخفيف 1:10.
- خذ 100 ميكرولتر من الدم المخفف من الأنبوب 1 وأضفه إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق (أنبوب التخفيف 2). إضافة 900 درجة مئوية من RPMI المتوسطة إلى أنبوب 2 ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع نفس طرف ماصة، وخلق تخفيف 1:100.
- كرر الخطوتين 1.4.1 و 1.4.2 لجعل اثنين من التخفيفات التسلسلية أكثر، وخلق 1:1000 (تخفيف أنبوب 3) و 1:1000 تخفيف (تخفيف أنبوب 4).
- إضافة 12 ميكرولتر من الدم المخفف من الأنبوب 3 و 12 ميكرولتر من الدم المخفف من الأنبوب 4 إلى جوانب مختلفة من مقياس الهيموكيتومتر وتحديد متوسط عدد كريات الدم الحمراء على كل جانب من مقياس الهيموكيتومتر. ضرب هذه الأرقام بـ 10. ضرب هذه الأرقام بعامل التخفيف، 1000 أو 10،000، على التوالي، لتحديد عدد كريات الدم الحمراء في 1 ميكرولتر من كل تخفيف.
- تقسيم العدد المطلوب من كريات الدم الحمراء المصابة ليتم حقنها من قبل عدد من كريات الدم الحمراء في 1 μL من كل تخفيف لتحديد حجم الدم المانح المخفف اللازمة للحقن. اختيار تخفيف مع حجم الأكثر ملاءمة للحقن، إضافة وحدة التخزين إلى أنبوب microcentrifuge جديد، وإكماله إلى 120 درجة مئوية مع المتوسطة RPMI.
- اليوم 0: الحقن الوريدي للفئران المتلقية
- ضع الفئران المتلقية تحت مصباح أحمر حراري لتمدد عروقها للحقن. تحميل جرعات الطفيلي في حقنة الأنسولين 27 G ووضع الماوس المتلقي في مقيد.
- حقن مليون أو 10,000 كريات الدم الحمراء المصابة عن طريق الوريد (IV) باستخدام حقنة الأنسولين 27 G في كل فأر المتلقي لاختبارات العدوى البعوض أو لاختبارات النمو غير الجنسي والجنسي في مرحلة الدم، على التوالي. الاستمرار في الحفاظ على الفئران في ظل ظروف السكن القياسية.
ملاحظة: حقن IP هو طريقة غير مباشرة لإدخال الطفيليات في مجرى الدم، كما كريات الدم الحمراء الطفيلية يجب أن تمر من خلال العقد الليمفاوية استنزاف التجويف العضدلل للوصول إلى الدم. وهذا يجعل حقن IP طريق تسليم غير مباشر لحقن عدد دقيق من الطفيليات في مجرى الدم. ولذلك، يفضل الطريق الرابع، لأنه يوفر جرعات طفيلية دقيقة مباشرة في مجرى الدم، كما هو مبين في الشكل 3 والموصوف في النتائجالتمثيلية .
2. تحديد الحمل الطفيلي في مرحلة الدم للمراحل الجنسية وغير الجنسية
ملاحظة: في هذا القسم، يتم سرد طرق التقييم الفينوتية الموحدة لمراحل دم طفيلي الملاريا. هذه الأساليب مفيدة في تقييم المرشحين الجديدين لمكافحة الملاريا أو اللقاح أو حتى الجينات بالضربة القاضية على تطور المراحل الجنسية وغير الجنسية في نفس الفئران التجريبية. وتجدر الإشارة إلى أن ب. شابودي وP. vinckei هما أيضا ً خياران بديلان منطقيان ومهمان جداً لهذه الأنواع من الاختبارات، لا سيما في مجال فحص المخدرات.
- تحديد الطفيليات من المراحل غير الجنسية والذكور مقابل الخلايا اللمعة الإناث من قبل مسحات الدم رقيقة ملطخة Giemsa لاختبارات نمو الطفيلي
- باستخدام إبرة 26 G أو 27-G، وخز ذيل الماوس وجمع قطرات الدم على شريحة المجهر. استخدام الحافة القصيرة من شريحة المجهر آخر لتشويه الدم بسرعة عبر الشريحة.
- إصلاح الشريحة مع الميثانول 100٪ لمدة دقيقة واحدة على الأقل، إلا بعد أن يجف الدم تماما على الشريحة. وصمة عار في 10٪ Giemsa لمدة 10-15 دقيقة.
- قراءة الشريحة باستخدام هدف 100X وغمر النفط تحت المجهر الخفيف. لقياس الطفيليات الدقيقة، تحقق ما لا يقل عن 6000 كريات الدم الحمراء، والتي يمكن الحصول عليها عن طريق عد ما لا يقل عن 30 أو 40 شبكة مجهرية مع متوسط عدد 200 أو 150 كريات الدم الحمراء (RBCs) لكل شبكة، على التوالي. حساب العدد الإجمالي للRBCs في الشبكات الأولى والأخيرة لتحديد متوسط عدد خلايا الدم الحمراء لكافة الشبكات.
- عد العدد الإجمالي للكريات الحمراء المصابة لكل شبكة. يمكن حساب الخلايا اللمعة الذكور والإناث بشكل منفصل لتحديد gametocytemia ولكن ينبغي أيضا أن تدرج في العدد الكلي للطفيليات.
- تحديد النسبة المئوية الإجمالية للطفيليات عن طريق قسمة العدد الإجمالي للكريات الحمراء الطفيلية على العدد الإجمالي للRBCs الملاحظ. ضرب هذا العدد ب100 لتحديد نسبة الطفيليات.
- تحديد gametocytemia عن طريق تقسيم العدد الإجمالي للgametocytes تحسب من قبل العدد الإجمالي للRBCs لوحظ. ضرب هذا العدد من قبل 100 لتحديد نسبة gametocytemia لكل ماوس.
ملاحظة: الطريقة الوحيدة الموثوق بها للتمايز بين مختلف مراحل الدم غير الجنسي والجنسي هو استخدام المجهر لتقييم مسحات الدم الرقيقة ملطخة بـ Giemsa، حيث أن كل مرحلة من المراحل لها مورفولوجيا مختلفة، باستثناء الخلايا اللاإخلالية غير الناضجة، والتي هي في الغالب لا يمكن تمييزها عن مراحل الدم غير الجنسي.
- تحديد الطفيليات في مرحلة الدم عن طريق قياس التدفق لسلالات الطفيليات الشبيهة بالبروتين الفلورسنت التي تعبر عن البروتين
- تسمية اثنين من أنابيب الطرد المركزي الصغير لكل عينة الماوس، تعيين أنبوب واحد لتخفيف 1:1000 والآخر لتخفيف 1:2000. إضافة 1.5 درجة مئوية من 1X الهيبارين إلى أنبوب تخفيف 1:1000.
- باستخدام إبرة 26 G أو 27 G، وخز ذيل الماوس ونقل 1.5 ميكرولتر من الدم إلى الأنبوب الذي يحتوي على 1.5 ميكرولتر من 1x الهيبارين (أنبوب التخفيف 1:1000). خلط الدم والهيبارين 1X بلطف معا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
- أضف 1,497 ميكرولتر من الدورة في الدقيقة المتوسطة إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير، وأنبوب الماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط جيدا.
- نقل 500 درجة مئوية من الخليط من أنبوب التخفيف 1:1000 إلى أنبوب التخفيف 1:2000. أضف 500 لتر من الـ RPMI المتوسطة إلى الأنبوب 1:2000 واخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
- اتبع بروتوكول بدء التشغيل المناسب للشركة المصنعة لمقياس التدفق. تشغيل العينات بمعدل تدفق بطيء وتعيين الكشف عن الأحداث 20,000 على الأقل.
ملاحظة: هناك بحث عملي بديل لقياس الطفيليات عن طريق فرز FACS ثلاثي الألوان، سواء كانت الطفيليات تعبر عن علامات الفلورسنت أم لا34. ومع ذلك، فإن القول الموصوف هنا يقدم مقياسا دقيقا للطفيليات في الطفيليات الحية دون إضافة أي أصباغ ملزمة للحمض النووي واستخدام الفرز FACS.
- تحديد معدل الإثارة من الجيمات الذكور لكل ميكرولتر من دم الماوس المصاب
- إعداد أنبوب الطرد المركزي الدقيق التخفيف 1:10 مع 40 درجة مئوية من أوكينيت المتوسطة غير مكتملة (RPMI + بيكربونات الصوديوم + هيبوكسانثين + حمض زانثورينيك) و 5 ميكرولتر من 1X الهيبارين.
- باستخدام إبرة 26 G أو 27 G، وخز ذيل الماوس ونقل 5 ميكرولتر من الدم (باستخدام micropipette) بسرعة إلى الأنبوب الذي يحتوي على وسائل الإعلام ookinete غير مكتملة + الهيبارين. مزيج بلطف وتحميل 12 درجة مئوية من أنبوب تخفيف الدم 1:10 على مقياس الهيموميتومتر وتركها في درجة حرارة الغرفة (20-24 درجة مئوية).
- بدء عد الأحداث exflagellation 9-10 دقيقة بعد إعداد تخفيف 1:10. استخدام مجهر ضوء التباين المرحلة مع التكبير 40X.
- ضرب متوسط عدد الأحداث exflagellation عد هاب10 ومن ثم ضرب من قبل عامل التخفيف (10) لتحديد متوسط عدد exflagellation لكل ميكرولتر من الدم المصاب.
ملاحظة: يقيس هذا الفحص عدد الأحداث التي تحدث عن الإثارة في حجم 1 ميكرولتر من الدم، والتي يمكن قياسها كمياً باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. يتم خلط متوسطة ookinete غير مكتملةمع الدم لتقليد عن كثب الظروف التي يحدث فيها exflagellation داخل ميدغوت البعوض بعد وقت قصير من وجبة الدم.
3. عزل ومعالجة الطفيليات في مرحلة الدم من كريات الدم الحمراء المصابة وإعداد المخزون المجمدة
- نزيف نهائي من القوارض المصابة بثقب القلب
- إعداد حقنة إبرة 26 G التي تحتوي على ما يقرب من ≤ 20 درجة مئوية من 1X الهيبارين (200 وحدة / مل) لجمع دم الماوس المانح عن طريق ثقب القلب.
- استخدام تدفق بطيء من CO2 إلى قتل الماوس قبل النزيف. بدلا من ذلك، التخدير الماوس مع isoflurane (التي يجب الحفاظ عليها قبل وأثناء شق الجلد لفضح القلب).
- وضع الماوس على ظهره ودبوس أسفل الزوائد لها. إجراء شق صغير في الجلد بالقرب من قاعدة القص عن طريق سحب ما يصل الجلد مع ملقط وقطع مع مقص. سحب الجلد بعيدا في موقع الشق لفضح الحجاب الحاجز والجزء العلوي من تجويف البطن.
- عقد قاعدة القفص الصدري مع ملقط وقطع من خلال الحجاب الحاجز لدخول تجويف الصدر. يجب الحرص على عدم تلف القلب أو الرئتين. قم بلصق القفص الصدري لفضح القلب.
- ثقب بلطف القلب وسحب ببطء على الغطاس حقنة لجمع ~ 1 مل من الدم ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.
- إعداد المخزونات المجمدة من الدم المصاب
- نزيف الفئران (انظر القسم 3.1) مع طفيليات الدم التي تتراوح بين حوالي 2٪ و 5٪، مع كمية كبيرة من مراحل حلقة وليس العديد من gametocytes.
- خلط الجزء المطلوب من الدم مع حل التجميد (10٪ الجلسرين في محلول ألسيفير) في نسبة 1:2 وتخزينها في قارورة المبردة. تجميد في النيتروجين السائل.
- عزل وتنقية طفيليات مرحلة الدم لاستخراج الحمض النووي، الحمض النووي الريبي، والبروتينات
- نزيف الفئران (انظر القسم 3.1) مع طفيليات الدم التي هي أعلى من 0.5٪.
- إعداد حقنة 10 مل عن طريق إزالة الغطاس وإدراج مسحة قطنية صغيرة. احزمي الجزء السفلي من القطن إلى أسفل الحقنة. املأه بالسليلوز حتى يصل مستوى السليلوز إلى علامة 3 مل ولكن لا يتجاوز علامة 4 مل على الحقنة.
- تأمين الحقنة في مقطع على موقف حلقة ووضع أنبوب جمع النفايات تحته. إضافة 5 مل من PBS إلى المحاقن والسماح لها أن تتدفق من خلال في أنبوب النفايات.
- إعداد المخزونات المجمدة إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام فقط 100-300 درجة مئوية من الدم. إضافة بقية الدم المصاب (400-700 درجة مئوية) إلى العمود. جمع تدفق من خلال مع أنبوب النفايات حتى قطرات تبدأ في التحول إلى اللون الأحمر. بمجرد أن تبدأ قطرات لتحويل الأحمر، ووضع أنبوب جمع 14 مل جديدة تحت الحقنة لجمع التدفق من خلال.
- بمجرد أن يبدأ التدفق في التباطؤ، إضافة PBS إلى المحاقن وجمع التدفق من خلال في أنبوب 15 مل حتى تم التوصل إلى حجم إجمالي قدره 14 مل. جمع تدفق المتبقية من خلال مع أنبوب النفايات.
- طرد مركزي أنبوب 14 مل مع خليط الدم / PBS لمدة 8 دقائق في 250 × ز مع عدم وجود الفرامل. إزالة supernatant وإضافة 14 مل من الصابونين المبردة (50 ملغ من الصابونين في 50 مل من PBS). لطرد بيليه، عكس الأنبوب عدة مرات ودوامة إذا لزم الأمر.
- الطرد المركزي أنبوب لمدة 8 دقائق في 1217 × ز مع عدم وجود الفرامل. إزالة supernatant، وترك حوالي 0.5 مل من الحل فوق بيليه.
- إعادة تعليق بيليه في الحل باستخدام micropipette ونقله إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 500 درجة مئوية من PBS إلى أنبوب 14 مل لغسل أي طفيليات المتبقية التي تركت في الأنبوب. أضف هذا إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الصغير.
- الطرد المركزي أنبوب لمدة 2 دقيقة في 6010 × ز. إزالة supernatant وإعادة تعليق 1 مل من PBS. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 9391 × ز.
- المضي قدما لاستخراج الحمض النووي الجيني، والحمض النووي الريبي الكلي، والبروتين.
- لاستخراج الحمض النووي الجينومي، قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من PBS، ثم اتبع أي بروتوكول مناسب لاستخراج gDNA.
- لمجموع استخراج الحمض النووي الريبي،وإزالة supernatant، وإعادة تعليق ودوامة بيليه في 1 مل من أي حل الفينول- وguanidine isothiocyanate القائم أو أي كاشف مناسب آخر، وبعد ذلك، اتبع أي بروتوكول مناسب من استخراج الحمض النووي الريبي الكلي.
- لاستخراج البروتينالكلي، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه في حجم مناسب من 6X كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) تحميل صبغ أو أي كاشف مناسب آخر، وبعد ذلك، اتبع أي بروتوكول مناسب لمعالجة البروتين الكلي.
4. اختبار عدوى البعوض
ملاحظة: البعوض هو المضيف الرئيسي لطفيليات الملاريا حيث يحدث الإنجاب الجنسي. يتم إجراء عدوى الفئران لنقل طفيليات الملاريا إلى البعوض عن طريق حقن IV من ما لا يقل عن 1 مليون مرحلة من مراحل الدم، تليها تغذية فأر مصاب (من كل النمط الجيني الذي يعرض أعلى معدل الإثارة الذكور) إلى البعوض الأنوفيليس في قفص في اليوم 3 بعد العدوى الماوس. الحقن الرابع مع 1 مليون طفيليات مرحلة الدم في الفئران المعالجة فينيل هيدرازين سوف تضمن تطوير الخلايا الجيمنتية الذكور والإناث بمعدل أسرع وأعلى. يتم احتضان البعوض المصاب بـ P. yoelii و P. berghei عند 24 درجة مئوية و20-21 درجة مئوية، على التوالي، للسماح بأفضل مراحل البعوض الممكنة للتنمية6.
- تغذية البعوض وتحديد عدد الأوكينات لكل بعوضة
- تجويع الإناث البالغة Anopheles stephensi أو A. غامبيا البعوض (4-7 أيام من العمر) لمدة 8-12 ساعة قبل التغذية. السماح للبعوض البالغ بإطعام الفئران المصابة بالتخدير لمدة 15 دقيقة على الأقل (حقنها بجرعة مناسبة من الكيتامين/إكسيلازين) مع أعلى معدل للاشتعال (يقاس في القسم 2-3).
ملاحظة: يتم إعداد الكيتامين / xylazine حل العمل من قبل تخفيف 1:5 من محلول الأسهم في المالحة وIP حقن 100 درجة مئوية لكل فأر. للحصول على محلول مخزون 10 مل، يتم إضافة 1 مل من إكسلازين (100 ملغ/مل) إلى 9 مل من الكيتامين (100 ملغ/مل). - إزالة البعوض الإناث غير المغذّي والبعوض الذكور مع الأسبرين الفم.
- في 18-20 ساعة ما بعد التغذية، وجمع 20-30 البعوض ووضعها في الثلاجة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة لضمان الوفاة. باستخدام نطاق تشريح مناظير، تشريح 20-30 midguts مليئة بالدم مع اثنين من 26 G أو 27 G الإبر أو إبرة وملقط في RPMI أو PBS تشريح المتوسطة ونقل midguts إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من RPMI أو PBS (لطريقة تشريح يرجى الاطلاع على الفرع 4-3).
- الطرد المركزي أنبوب جمع لمدة 1 دقيقة في 700 × ز. طحن midguts بيليه باستخدام مدقة. كرر هذه الخطوة.
- نقل 50 درجة مئوية من أنبوب midguts الأرض إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير الجديد. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI أو PBS لإنشاء تخفيف 1:5.
- نقل 12 درجة مئوية إلى مقياس الهيموميتومتر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للمحتويات لتسوية.
- تحديد متوسط عدد ookinetes باستخدام المجهر الخفيف مع تباين المرحلة والتكبير 40X.
- ضرب متوسط عدد ookinetes ناضجة من قبل 10 ومن ثم من قبل عامل التخفيف من 5 لتحديد متوسط العدد الإجمالي من ookinetes.
- قسمة متوسط عدد الأوكينيتس على عدد البعوض الذي يتغذى على الدم الذي يتم تشريحه لتحديد عدد الأوكينات لكل بعوضة تغذيها الدم.
- تجويع الإناث البالغة Anopheles stephensi أو A. غامبيا البعوض (4-7 أيام من العمر) لمدة 8-12 ساعة قبل التغذية. السماح للبعوض البالغ بإطعام الفئران المصابة بالتخدير لمدة 15 دقيقة على الأقل (حقنها بجرعة مناسبة من الكيتامين/إكسيلازين) مع أعلى معدل للاشتعال (يقاس في القسم 2-3).
- تحديد عدد الخراجات المبكرة للمراسل الفلورسنت الذي يعبر عن البروتين وسلالات الطفيليات الشبيهة بـ WT
ملاحظة: والهدف من هذا الاختبار هو تحديد عدد الطفيليات الحية التي تعبر عن البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) التي أنشأت عدوى كاملة من midguts البعوض وشكلت أوكيسات كروية في وقت مبكر. يحدد هذا التصنيف ما إذا كانت الأوكينيتس (تطورها المقدر في التصاق سابق) قد أكملت وظائفها بواسطة العبور من خلال الخلايا الظهارية للبعوضة المتوسطة والتحويل إلى الخراجات المبكرة على الجانب اللامينا القاعدي من الجلد الأوسط الظهارة أم لا. هذا هو اختبار آخر الذي يجعل من استخدام كبير من الطفيليات التعبير عن GFP، كما عد oocysts في وقت مبكر في هذه المرحلة سيكون من المستحيل تقريبا دون تلطيخ المناعة مملة.- تشريح الميدغوت (انظر القسم 4.1) من 20-30 البعوض الذي يغذيه الدم، في اليوم 3 أو 4 بعد التغذية بالبعوض (pmf) لP. yoelii 17X-NL، وفي اليوم 6 أو 7 pmf لP. berghei ANKA، مع اثنين 26 G أو 27 G الإبر أو إبرة وملقط في RPMI أو PBS تشريح م edium (للاطلاع على طريقة التشريح يرجى الاطلاع على القسم 4-3).
- نشر 40-50 درجة مئوية من قسم المتوسطة على خط الوسط الأفقي من حافة أطول من الشريحة الزجاجية. نقل midguts إلى هذا الخط، واحد في كل مرة، أثناء تشريح، وإضافة المزيد من المتوسطة إلى midguts، إذا لزم الأمر، لتجنب التجفيف.
- ضع غطاء بلطف على midguts تشريح، وختم مع طلاء الأظافر.
- باستخدام هدف 10x أو 20X من المجهر الفلوري مع مرشح الفلورة الخضراء، عد عدد الخراجات في وقت مبكر على كل ميدغوت، في ما لا يقل عن 20 midguts.
- تحديد عدد السبوروزويت اتسال الكيسة لكل بعوضة
- تشريح midguts من ما لا يقل عن 20-30 البعوض مع اثنين من 26-G أو 27-G الإبر أو إبرة وملقط في RPMI أو PBS تشريح المتوسطة وجمع midguts تشريح في 200 ميكرولتر من RPMI.
- عقد أجزاء أسفل البطن بحزم في مكان مع إبرة واحدة (أو ملقط) ودفع طفيفة الصدر في اتجاه تصاعدي مع إبرة أخرى عند تقاطع بين الصدر والبطن. قم بدفع قصيرة بعناية حتى ينفصل الصدر عن البطن. بمجرد أن يبدأ الفصل سوف تظهر ميدغوت الأبيض امتدت، ومن ثم سيتم قطع midgut من نهاية المريء باستخدام نفس الإبرة التي تم استخدامها لفصل الصدر. إذا كانت لا تزال تعلق على البطن، يمكن استخدام نفس الإبرة لسحب midgut بعيدا عن البطن. نقل midguts من جميع البعوض إلى أنبوب جمع عن طريق جمعها من المتوسط مع إبرة، واحدة في وقت واحد.
- الطرد المركزي أنبوب جمع لمدة 1 دقيقة في 700x ز لتسوية midguts إلى الجزء السفلي من أنبوب جمع وطحن لهم مع الآفات. كرر هذه الخطوة.
- نقل 12 درجة مئوية إلى مقياس الهيموميتومتر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح لمحتوياته لتسوية.
- عد sporozoites oocyst باستخدام هدف 40X من المجهر الخفيف. استخدم 1:5 و/أو 1:10 تخفيفات إذا كان حطام البعوض يمنع العد الدقيق للsporozoites أو إذا كان عدد sporozoites مرتفع جداً بحيث لا يمكن عده بدقة.
- حساب متوسط العدد الإجمالي للsporozoites oocyst عن طريق ضرب متوسط عدد sporozoites بنسبة 10، ومن ثم، ضرب هذا العدد من قبل عامل التخفيف، إن وجدت، والحجم الإجمالي (200 درجة مئوية).
- قسمة متوسط العدد الإجمالي للسبوروزويت اتّبع على عدد البعوض الذي تم تشريحه لحساب متوسط عدد السبوروزويت اتّبع كلّ بعوضة.
ملاحظة: خطأ شائع لقياس نجاح أو إنتاجية العدوى مراحل البعوض هو عد عدد الخراجات في المراحل اللاحقة من تطور الكيسة. ويرجع ذلك إلى بعض الخراجات التي يتم الفراغ في وقت لاحق من تطوير الكيسة، والبعض الآخر تفشل في تطوير sporozoites، حتى على نفس midgut. أفضل الطرق وأكثرها موثوقية لتحديد إنتاجية العدوى في مراحل البعوض هو عد متوسط عدد sporozoites الكيسة المتوسطة في الأيام 10-12 بعد العدوى بالبعوض لP. yoelii وفي الأيام 12-14 بعد العدوى البعوض لP. berghei.
- تحديد عدد الغدد اللعابية sporozoites لكل بعوضة
ملاحظه:يتم إجراء التقييم النهائي للإنجاز الكامل لتطوير مراحل البعوض من خلال تقدير عدد السبوروزويت التي غزت الغدة اللعابية، والتي هي المراحل المنقولة والمعدية إلى الفقاريات. يتم تأسيس غزو الغدة اللعابية بعد الانتهاء من تطوير السبوروزويت الكيسة، والخروج إلى الهيمولمف، والتعلق باللامينا القاعدية من خلايا أسينار الغدة اللعابية، وعبور خلايا الأسينار للوصول إلى الغدد اللعابية القنوات5. ولذلك، فإن هذا التقييم هو أيضا تقييم لنجاح جميع هذه العمليات أم لا. ومع ذلك، فإن تقدير أرقام الهيمولمفي سبوروزويت يسمح بالتمايز بين العيوب في الخروج من الخراجات والعيوب في غزو الغدد اللعابية35. تنقية sporozoites الغدة اللعابية يسمح إجراء اختبارات وظيفية متعددة على حركية sporozoite والأنماط الظاهرية الغزو. ويمكن أيضا أن تستخدم sporozoites الغدة اللعابية للعدوى في الجسم الحي من الفئران وفي دراسات التحصين36,37. وعلاوة على ذلك، فإن المراحل الأكثر استنساخا المتاحة لإنشاء غزو مرحلة الكبد في المختبر أو اختبار التنمية هو عن طريق استخدام sporozoites الغدة اللعابية.- تشريح الغدد اللعابية من 50-100 البعوض الإناث، في أيام 14-16 pmf لP. yoelii وفي الأيام 17-20 pmf لP. berghei،ويفضل مع اثنين 26 G أو 27 G الإبر، في RPMI أو DMEM المتوسطة أبقى على الجليد وتستكمل مع 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) أو/ البقري المصل الزلال (BSA) لP. yoelii sporozoites أو 3٪ FBS / BSA لP. berghei sporozoites. إذا كان sporozoites لاستخدامها في ورم الهيبات في الاختبارات المختبرية، إضافة 1٪ البنسلين / العقديات إلى المتوسطة تشريح. هناك عموما طريقتين لتشريح الغدد اللعابية. الطريقة الأولى تستغرق وقتا طويلا ولكن يؤدي إلى تشريح الغدد اللعابية مع الأنسجة الملوثة قليلة جدا أو معدومة. والطريقة الثانية أقل استهلاكا ً للوقت ولكنها تؤدي إلى جمع كمية كبيرة من الأنسجة الملوثة. الطريقة الأولى مفصلة هنا.
- عقد أجزاء البطن العلوي في مكان مع الجانب المنقطع من إبرة واحدة ودفع بعناية الرأس طفيفة جدا (في دفعات قصيرة جدا) عند تقاطع بين الرأس والصدر في اتجاه تصاعدي حتى يتم فصل الرأس بعناية من الصدر دون تمزيق الغدد اللعابية الزجاجية ، ثم يتم فصل الغدد اللعابية المكشوفة من الرأس بنفس الإبرة التي دفعت الرأس إلى الأعلى.
- سيتم رفع الغدة اللعابية تشريح من المتوسطة تشريح باستخدام ماصة باستور الزجاج القصير.
- عندما يتم تشريح جميع الغدد اللعابية وحصادها، فإن المواهب تضع الأنبوب الذي يحتوي على midguts في الطرد المركزي (1min، 700 × ز).
- عد sporozoites باستخدام مقياس الهيموكسيتومتر تحت المجهر الخفيف تعيين إلى المرحلة 2 التباين والتكبير 40X. إذا كان عدد البعوض تشريح ≥ 40، تخفيف الغدد اللعابية إلى 1:5 أو 1:10، اعتمادا على العائد الموصلية المتوقعة (المحددة في الاختبارات السابقة).
- ضرب متوسط عدد sporozoites بنسبة 10 وعامل التخفيف (إن وجدت). ضرب من قبل الحجم الإجمالي لتحديد متوسط عدد sporozoites الغدة اللعابية. القسمة على عدد البعوض الإناث تشريح لتحديد متوسط sporozoites الغدة اللعابية لكل بعوضة.
ملاحظة: المشكلة مع تشريح الغدد اللعابية هو حجمها الصغير ومظهرها الشفاف زجاجي. وبالتالي ، فمن الصعب جدا عزل الغدد اللعابية ، وبالتالي ، عادة ما يتم تشريحها كمبلغ مقطوع مع أنسجة أخرى من الجزء الأمامي من الصدر ، وهو أمر مهم أيضا لحماية الغدد اللعابية من التمزق أثناء عملية الجمع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد أحدث نجاح تطبيق الأدوات والتقنيات الوراثية العكسية على طفيليات الملاريا ثورة في مجال بحوث الملاريا، مع القدرة على إضافة أو حذف أو تعديل أجزاء جينية محددة من عدة أنواع من البلازموديوم 39. والأهم من ذلك، تم تحديد موضع الجينوم القابل للصرف واستخدامه بنجاح لإدخال علامات بروتين الفلورة في طفيليات القوارض والملاريا البشرية عن طريق إعادة التركيب المتجانس المزدوج، لضمان التعبير المستقر في جميع مراحل دورة الحياة40 ،41،42. مثال على هذه الطفيليات المعدلة وراثيا مثل WT هو Py230p (-) الطفيليات، والتي تم إنشاؤها في مختبرنا، وأظهرت أي عيب واضح في تطوير الدم والبعوض مراحل دورة حياة15،16، 17.أعربت هذه الطفيليات مراسل المعدلة وراثيا eGFP، تحت سيطرة المروج قوية وتأسيسية من PyHSP70، في مراحل الدم (الشكل1A)ookinetes (الشكل1B)،oocysts الشباب (الشكل 1C ) على أنوفيليس ستيفنزي ميدغوتس، وفي sporozoites معزولة عن الغدد اللعابية للإناث أنوفيليس ستيفنزي (الشكل1D). وهكذا، فإن طفيليات الدم التي تعبر عن eGFP جعلت من الأسهل بكثير وأقل استهلاكا للوقت لتقييم الطفيليات في مرحلة الدم باستخدام قياس التدفق بين الأنماط الجينية المختلفة من الطفيليات المعدلة وراثيا أو بين المعالجة بالمخدرات وغير المعالجة في استهداف المخدرات الاختبارات باستخدام الطفيليات مراسل المعدلة وراثيا.
من أجل التأكد من أنه لا يوجد فرق كمي بين استخدام قياس التدفق الخلوي وتقدير الطفيليات الأكثر مملة عن طريق الفحص المجهري، تم استخدام Pyp230p(-) eGFP التعبير عن تقدير النسبة المئوية للكريات الحمراء الطفيلية من قبل تدفق قياس الخلايا والمسح الدم رقيقة ملطخة Giemsa في مجموعة من الفئران السويسرية ويبستر الرابع المصابة مع 10،000 كريات الدم الحمراء الطفيلية. تدفق الطفيليات cytomemia٪ القيم تتوافق مباشرة مع الطفيليات المقدرة٪ من خلال رصد مسحات الدم رقيقةملطخة Giemsa، والتي قدرها اثنين من العلماء الخبراء (الشكل 2). وهذا يمثل بديلا أكثر دقة لطريقة مملة وعرضة للخطأ البشري من الفحص المجهري في تحديد معدل نمو الطفيليات في مرحلة الدم.
ومن الاختلافات الهامة المرتبطة بعدوى القوارض بمراحل دم طفيليات الملاريا اختيار مسار العدوى، مع تفضيل قوي في المؤلفات للملكية الفكرية مقارنة بالطريق الرابع للعدوى، حيث أنها أقل استهلاكا ً للوقت. من أجل مقارنة هذين الطريقين من العدوى، تم إصابة مجموعتين من خمسة الفئران BALB / ج مع 1000 eGFP التعبير عن Pyp230p (-) الطفيليات الكريات الحمر لكل فأر، إما من خلال الطرق الرابعة أو IP. تم رصد الطفيلييوميا باستخدام قياس التدفق للسيتومية لمدة 4 أيام. ولوحظ انخفاض كبير إحصائياً في مجموعة الطفيليات المصابة بالملكية الفكرية مقارنة بالمجموعة المصابة بأربعة أنواع في جميع الأيام التي تم اختبارها (الشكل3). وهذا يوفر دليلا على أن مسار العدوى الرابعة هو طريق أكثر دقة من الناحية الكمية للعدوى للاختبارات مع مراحل دم طفيلي الملاريا.
ومع ذلك، فإن أحد القيود على استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم الطفيليات في مرحلة الدم هو التمييز بين المراحل الجنسية وغير الجنسية وبين الخلايا اللجامية الذكور والإناث. ولذلك، فإن تقدير النسب المئوية لكل من المراحلالمختلفة غير الجنسية والجنسية (الشكل 4) يجب أن يعتمد على تقييم مورفولوجي لمسحة الدم الرقيقة الملطخة بـ Giemsa. على الرغم من مورفولوجيا مختلفة واضحة من الخلايا اللمعة الذكور والإناث ناضجة (الشكل4) ، وغالبا ما لا يمكن تمييزها عن المراحل الجنسية غير ناضجة.
وظيفة أساسية واحدة من gametes الذكور عند ظهور من gametocyte الذكور في midgut البعوض هو exflagellation gamete الذكور، والتي هي خطوة حاسمة جدا في انتقال التي يجب أن يحدث في غضون فترة قصيرة جدا من الزمن. وقد تم وصف الأساليب المتغيرة المستخدمة لتقييم ذلك في العديد من الأنظمة المختلفة. هنا، نعرض طريقة موحدة يمكن تكرارها في أي إعداد مختبر بسيط. قمنا بتقييم الإثارة الذكور مع أو بدون حقن فينيل هيدرازين فيالفئران المتلقية (الشكل 5). يمكننا أن نظهر أن العلاج فينيل هيدرازين بشكل ملحوظ (أربعة أضعاف) زيادة معدل exflagellation الذكور، والتي بدورها سوف تزيد من معدل الإخصاب وعدد جميع مراحل البعوض اللاحقة.
الشكل 1 تطوير: P. yoelii p230p (-) الطفيليات التي تعبر عن eGFP في مراحل الدم والبعوض. (أ) صورة الطفيليات المختلطة في مرحلة الدم (1000 X التكبير). (ب) صورة أوكينيت (400X التكبير). (C) صورة لالبعوض أنوفيليس ستيفنزي ميدغوت المصابة باليوم 4 pmf أوكيسات في وقت مبكر من الطفيليات الحية p230p (-) التعبير عن eGFP (100X التكبير). (D) تظهر هذه اللوحة صورة حية للغدة اللعابية P. yoelii p230p(-) sporozoite، تشريحها في اليوم 15 pmf، معبرا عن eGFP (400X التكبير). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 تقييم قياس التدفق والفحص المجهري لمتوسط الطفيليات في مرحلة الدم: P. yoelii p230p (-) الطفيليات لا تختلف اختلافا كبيرا. تم تسجيل مجموعة من أربعة فئران ويبستر السويسرية عن طريق الوريد مع 10،000 كريات الدم الحمراء الطفيلية من Pyp230p (-) لكل فأر ومتوسط الطفيليات في مرحلة الدم٪ سجلت يوميا لمدة 7 أيام عن طريق قياس التدفق الخلوي وعن طريق التقييم المجهري لل مسحات الدم الرقيقة الملطخة بـ Giemsa من ما مجموعه 20,000 و ~ 6,000 كريات الدم الحمراء، على التوالي. نتائج الفحص المجهري ة هي متوسط قراءتين من قبل اثنين من العلماء الخبراء في كل شريحة، وكان الوقت لتقييم الطفيليات من كل شريحة 10 دقائق على الأقل من قبل كل عالم. لا يمكن الكشف عن اختلافات كبيرة في أي من الأيام المبينة هنا. تم تحليل القيم المتوسطة لجميع سلالات الطفيلي مع اختبار t-tailed اثنين. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 حقن عن طريق الوريد من: P. yoelii p230p (-) الطفيليات تنتج الطفيليات مرحلة الدم مختلفة اختلافا كبيرا من حقن داخل قنافر. تم إصابة مجموعتين من خمسة فئران BALB/c بـ 1000 كريات الدم الحمراء الطفيلية من Pyp230p(-) لكل فأر، إما من خلال الطريق الوريدي أو داخل البرية، وتم تسجيل متوسط الطفيليات في مرحلة الدم يوميا لمدة 4 أيام عن طريق التدفق قياس الخلايا من ما مجموعه 20،000 كريات الدم الحمراء. يمكن الكشف عن انخفاض كبير إحصائيا (المشار إليه بعلامة نجمية) من الطفيليات في مرحلة الدم لجميع الأيام التي تم اختبارها في مجموعة الطريق داخل البريقان مقارنة مع مجموعة الطريق الوريدي. تم تحليل القيم المتوسطة لجميع سلالات الطفيلي مع اختبار t-tailed اثنين. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 مورفولوجيا: ب. يويلي gametocytes في مسحة الدم رقيقة ملطخة Giemsa. صورة لمسحة الدم الرقيقة ملطخة Giemsa (1000X التكبير) من الماوس ويبستر السويسري المصابة WT P. yoelii 17X-NL سلالة يظهر نموذجي اللون الأزرق الإناث gametocyte على الجانب الأيسر (المشار إليها من قبل سهم) والذكور الملونة وردي ( تدل عليها العلامة النجمية) gametocyte على الجانب الأيمن من الصورة. المراحل الأخرى المعروضة هي مراحل الدم غير الجنسي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تأثير فينيل هيدرازين على الذكور gamete exflagellation. تأثير فينيل هيدرازين حقن في الفئران المتلقية 5 أيام قبل تقدير معدل exflagellation الذكور من P. yoelii. فينيل هيدرازين يزيد بشكل كبير من معدل اللاجشّب الجاميت الذكور، مما يؤدي إلى ارتفاع مراحل البعوض العدوى بعد التغذية البعوض. تم تحليل القيم المتوسطة لجميع سلالات الطفيلي مع اختبار t-tailed اثنين. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وعلى الرغم من التشابه في البيولوجيا العامة لدورات حياتها مع الطفيليات البشرية بالملاريا، فإن نماذج الملاريا الفأرة لها أيضا ً العديد من أوجه الاختلاف مع أنواع البلازموديوم البشرية التي من شأنها أن تحد من استخدامها على أنها موثوقة في نماذج الجسم الحي. فعلى سبيل المثال، وباستثناء الطفيليات المُوِّفة الحية كلقاحات، فإن جميع دراسات اللقاحات التي تحتوي على وحدة فرعية والحمض النووي وغيرها من اللقاحات قد أعطت نتائج ممتازة في نموذج الفأر، ولكن في البشر الذين يعيشون في مناطق متوطنة، كانت النتائج بعيدة عن أن تكون مرضية.
مشكلة أخرى هي الفرق في مرحلة دورة الحياة العدوى من سلالة ماوس واحدة إلى أخرى، وأحيانا من بائع حيواني واحد إلى آخر لنفس سلالة الماوس. وعلاوة على ذلك، فإن النوعين الرئيسيين من الملاريا القوارض التي تستخدم على نطاق واسع على أنها مفضلة في نماذج الملاريا في الجسم الحي، P. berghei و P. yoelii،لا تظهر دورة متزامنة في مرحلة الدم، والتي تختلف تماما عن أي الملاريا البشرية الطفيلي. ومع ذلك، فإن فوائد استخدام طفيليات الملاريا الماوس كما هو الحال في نماذج الجسم الحي تفوق إلى حد بعيد هذه أوجه الاختلاف، والتي يمكن التغلب عليها أيضا عن طريق تحليلات أكثر تعمقا من محركات الجزيئية لهذه القيود. ومع ذلك، يتم عرض هذه القيود في الغالب من قبل الطفيليات في مرحلة الدم الملاريا القوارض، ولكن ليس بقدر ما لمراحل دورة حياة أخرى من طفيلي الملاريا.
على الرغم من أن مراحل الدم مهمة لمختلف اللقاحات، واستهداف الأدوية، وعلم المناعة، والدراسات الجينية الوظيفية، هناك ندرة في الأساليب والبروتوكولات الموحدة التي تركز على التحليل الظاهري والاختبارات الوظيفية التي تنطوي على الطفيليات الطفيليات الطفيليات الملاريا في مرحلة الدم، مع مزيد من التركيز على انتقال البعوض وبروتوكولات التغوط. ولذلك، فإن الأساليب في هذه المادة تساعد على توفير بروتوكولات موحدة ومبسطة لدراسة المراحل المسببة للأمراض من طفيليات الملاريا القوارض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
أحمد علي مدعوم بتمويل من جامعة بلمياليم فاكيف من منحة وزارة التنمية التركية 2015BSV036، وبتمويل من كلية الصحة العامة والطب المداري بجامعة تولان، وبتمويل من المعهد الوطني للصحة العامة -NIAID لـ R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
