Summary
Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.
Abstract
Recente ontwikkelingen in de genetica en systemen biologie technologieën hebben ons begrip van de biologie van malariaparasieten op moleculair niveau bevorderd. Effectieve malariaparasiet doelen voor de ontwikkeling van vaccins en chemotherapie zijn echter nog steeds beperkt. Dit is grotendeels te wijten aan de onbeschikbaarheid van relevante en praktische in vivo infectie modellen voor menselijke Plasmodium soorten, met name voor p. falciparum en p. vivax. Daarom zijn knaagdier malaria soorten uitgebreid gebruikt als praktisch alternatief in vivo modellen voor malaria vaccin, drug targeting, immuunrespons, en functionele karakterisering studies van gecondengeerde Plasmodiumspp. genen. Inderdaad, knaagdier malaria modellen zijn van onschatbare waarde gebleken, vooral voor het verkennen van mug transmissie en lever stage biologie, en waren onmisbaar voor immunologische studies. Echter, er zijn verschillen in de methoden die worden gebruikt voor het evalueren van de fenotypes van transgene en wild-type ongeslachtelijke en seksuele bloed-fase parasieten. Voorbeelden van deze verschillen zijn de keuze van een intraveneuze versus intraperitoneale infectie van knaagdieren met bloed-fase parasieten en de evaluatie van mannelijke gameten exflagellatie. Hierin worden gestandaardiseerde experimentele methoden beschreven voor het evalueren van de fenotypes van ongeslachtelijke en seksuele bloed stadia in transgene parasieten die verslag doen van Reporter-gen of wild type knaagdier malariaparasieten. We ook detail de methoden voor het evalueren van de fenotypes van malariaparasiet muggen stadia (gameten, ookinetes, oöcysten, en sporozoites) in Anopheles muggen vectoren. Deze methoden zijn gedetailleerd en vereenvoudigd hier voor de dodelijke en niet-dodelijke stammen van p. berghei en p. yoelii maar kan ook worden toegepast met enkele aanpassingen aan p. chabaudi en p. vinckei knaagdier malaria soorten.
Introduction
Malariaparasieten veroorzaken honderden miljoenen malaria-infecties bij mensenwereld wijd, met meer dan 600.000 sterfgevallen per jaar1. Menselijke infecties worden veroorzaakt door vijf malaria parasitaire soorten, namelijk p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, en p.kennis. De meeste klinische malaria sterfte wordt veroorzaakt door P. falciparum in Afrika ten zuiden van de Sahara1. Een andere menselijke malariaparasiet soorten die grote wereldwijde Morbiditeiten buiten het Afrika bezuiden de Sahara veroorzaakt is P. vivax2. De andere drie soorten zijn allemaal meer geografisch beperkt en veroorzaken goedaardige malaria-infecties, behalve de dodelijke P. Prosi3. De onbeschikbaarheid van relevante en praktische niet-humane in vivo-modellen van infecties is altijd geweest en is nog steeds een belemmering voor malaria vaccin en Geneesmiddelenontwikkeling. Eerdere malaria drugs targeting en metabole studies hebben uitgebreid vertrouwd op aviaire malaria modellen zoals p. gallinaceum en p. lophurae, het infecteren van kippen en eenden, respectievelijk4. Daarna werden knaagdier malaria soorten geleidelijk geïntroduceerd in verschillende vaccins en drugs targeting studies als in vivo modellen. In de loop der jaren, het bewijs van gelijkenissen van de biologie en gastheer-parasiet interacties van de levenscyclus stadia van knaagdieren malaria modellen aan menselijke malaria soorten hebben opgebouwd.
In het bijzonder waren Knaagdieren malaria modellen uiterst belangrijk om de biologie van muggen en pre-erytrocytische stadia5te verkennen en karakteriseren. Er zijn echter vier Knaagdieren malaria soorten (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, en p. vinckei) die verschillende biologische kenmerken hebben, waarvan de meest opvallende in de bloed stadia6. Knaagdier malaria soorten verschillen in de synchroniciteit van bloed stadia, waarbij bloed stadia van p. chabaudi en p. vinckei stammen zijn meestal synchroon, terwijl het bloed stadia van p. berghei en p. yoelii zijn niet6 , 7. een ander opmerkelijk verschil is de zelf klaring van bloed stadia die voorkomt in sommige stammen (bijv. p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65 en P. vinckei lentum), terwijl de bloedinfectie van andere stammen van dezelfde soort kunnen dodelijk zijn indien onbehandeld (P. yoelii 17x-L, p. berghei ANKA, en P. chabaudi as). Bovendien, p. yoelii 17x-nl stam en p. berghei ANKA stam bij voorkeur de reticulocyten8,9,10,11, hoewel deze kenmerken van p. yoelii en P. berghei stammen zijn niet een strikte groei eis12,13,14. Daarom worden muizen behandeld met fenylhydrazine voorafgaand aan een infectie met de bloed stadia van die parasieten om de parasitemie en gametocytemia te verhogen die nodig zijn voor een mug-infectie voor de p. berghei ANKA-stam en voor p. yoelii 17x-nl15,16,17,18,19.
Verschillen in muggen stadia ontwikkeling bestaan ook tussen verschillende Knaagdieren malaria soorten, de meest opvallende is de temperatuur en de tijd die nodig zijn voor optimale muggen stadia ontwikkeling en de sporozoite lengte5,6, 20. In pre-erytrocytische stadia van knaagdier malaria soorten, verschillen omvatten de knaagdieren soorten en stam die het meest vatbaar zijn voor infectieuze sporozoïet inoculatie, het aantal sporozoieten nodig voor de inoculatie in een gevoelige knaagdier stam, de zoogdier celtypen nodig voor in vitro lever fase ontwikkeling testen, en de tijd om te voltooien van de ontwikkeling van de lever fase5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Ondanks deze variabele waren knaagdieren malariaparasieten eerder de gunstige modellen voor de toepassing van omgekeerde genetische benaderingen, omdat ze minder tijd en middelen verbruiken met een grote kans op succes31. In feite, knaagdieren malaria modellen waren de beste modellen, en in veel gevallen de enige modellen, beschikbaar voor vele jaren om functioneel te karakteriseren genen uitgedrukt in muggen en lever stadia.
In het licht van de populariteit en de mogelijkheden van omgekeerde genetische benaderingen in knaagdieren malaria modellen, een aantal verschillende methodologieën zijn gebruikt voor het analyseren van de fenotypes van transgene parasiet levenscyclus stadia, met name bloed stadia. Sommige van deze methoden zijn echter inconsistent; bijvoorbeeld, het vergelijken van infecties van bloed-fase parasieten na een IP-injectie (die mogelijk worden afgevoerd naar de peritoneale lymfeklieren en, vanaf daar, kan de bloedbaan in te voeren; daarom, de geïnjecteerde parasieten eindigen niet in de bloedbaan gelijk) , het vergelijken van de Mosquito transmissie van klonen met een verschillend aantal seriële bloed-fase overdrachten of G-nummer (die invloed kunnen hebben op gametocytogenesis32,33), of het vergelijken van transgene parasieten rechtstreeks naar naïef wild-type (WT) parasieten die nooit werden onderworpen aan elektroporation en positieve drug selectie en de verschillende niet-gestandaardiseerde evaluaties van mannelijke gameten exflagellatie. Daarom is het cruciaal om protocollen te standaardiseren die eenvoudig te volgen zijn voor de fenotypische analyse van elk type transgene of WT knaagdier malariaparasieten in het bloed en in de mug om tegemoet te komen aan de biologische variabele van knaagdieren malaria parasietsoorten.
Hierin rapporteren we over een gestandaardiseerd, gedetailleerd experimenteel protocol voor de fenotypische analyse van het bloed en de levenscyclus van muggen van transgene of wild-type p. yoelii en p. berghei parasieten. Deze protocollen zijn ook van toepassing op p. chabaudi en p. vinckei parasieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven die hier beschreven werden, werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Tulane University en de dierenethiek Commissie van de Bezmialem Vakif Universiteit. Alle andere experimentele protocollen en het gebruik van recombinant DNA werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen van het institutioneel Bioveiligheidscomité (IBC) van Tulane University.
1. infectie van muizen met bloed-fase parasieten voor parasitemie analyse en muggen infectie assays
- Dag-3: optionele injectie van fenylhydrazine in ontvangende muizen
- Injecteer uitgefokte SW of CD1 ontvanger muizen (muizen die zullen worden gebruikt voor muggen infecties en muggen infecties testen) intraperitoneaal (IP) met 100 μL fenylhydrazine (50 mg fenylhydrazine in 5 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)) met een 26 G naald Spuit.
Opmerking: Voor robuuste muggen infecties van p. berghei en p. yoeliiwordt fenylhydrazine gebruikt voor het opwekken van reticulocytose in de ontvangende muizen, wat de parasitemie verhoogt en vervolgens het percentage gametocyten, en aanzienlijk verhoogt de exflagellatie van mannelijke gameten (Figuur 5), die zal leiden tot een betere mug stadia infectie voor zowel p. berghei en p. yoelii stammen15,16,17, 18.
- Injecteer uitgefokte SW of CD1 ontvanger muizen (muizen die zullen worden gebruikt voor muggen infecties en muggen infecties testen) intraperitoneaal (IP) met 100 μL fenylhydrazine (50 mg fenylhydrazine in 5 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)) met een 26 G naald Spuit.
- Dag-2: injectie van bevroren parasiet bestanden in donor muizen
- Ontdooit snel cryopreserved bevroren voorraden en Injecteer onmiddellijk elke donor muis (meestal twee muizen per genotype) IP met ~ 200 μL voorraad met een 26 G naald spuit.
Opmerking: Er worden niet meer dan vijf muizen per kooi ondergebracht binnen gecontroleerde Vivarium-instellingen. - Begin met het controleren van parasitemie onder een 100x Microscoop doelstelling op Giemsa-gebeitst dun bloeduitstrijkje na 24 uur na infectie. Volg paragraaf 2,1 van het protocol voor Giemsa-gekleurd dun bloeduitstrijkjes.
Opmerking: Vanwege het onvermogen om de overlevende levensvatbare bloed stadia nauwkeurig te tellen na het snel ontdooien en injecteren van cryopreserved geïnfecteerd bloed, ontvangen donor muizen het cryopreserved bloed eerst. De geïnfecteerde erytrocyten van de donor muis kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd en vervolgens worden gebruikt.
- Ontdooit snel cryopreserved bevroren voorraden en Injecteer onmiddellijk elke donor muis (meestal twee muizen per genotype) IP met ~ 200 μL voorraad met een 26 G naald spuit.
- Dag 0: bloeding van de donor muizen
- Bloeding van de donor muizen (zie punt 3,1) wanneer hun parasitemie tussen 0,1% en 1% ligt, die gewoonlijk 2-3 dagen na ingevroren-voorraad-infectie wordt verkregen in het geval van p. yoelii 17x-nl en p. berghei ANKA stammen.
- Gebruik de punctie van de gezichts ader (om tussen 200 en 500 μL te komen) of laat de dieren terminaal bloeden door middel van een hart punctie (om tussen 600 μL en 1,2 mL) geïnfecteerd bloed te krijgen. Terminaal bloeden van de muizen door hart punctie zoals beschreven in detail in paragraaf 3,1.
Opmerking: Bloeden in de gezichts ader is geen routinemethode voor het verkrijgen van bloed, omdat het veel moeilijker is om toe te passen en zeer pijnlijk is voor muizen, in vergelijking met terminale bloedingen. De optimale parasitemie voor het bloeden van donor muizen is tussen 0,1%-1% omdat er bij dit parasitemie bereik zeer weinig gametocyten zijn (die niet kunnen repliceren om asexsuele bloed stadia te produceren) en er minder dubbel-of drievoudig geïnfecteerde erytrocyten zijn (die de kwantificering minder nauwkeurig maakt).
- Dag 0: kwantificering van geïnfecteerd bloed om doses van geïnfecteerde erytrocyten te bereiden door seriële verdunningen
- Bereid seriële verdunningen van donorbloed voor door toevoeging van 100 μL bloed aan een micro centrifugebuis (verdunnings buis 1). Voeg 900 μL RPMI-medium toe aan buis 1 en meng goed door pipetteren op en neer met dezelfde pipetpunt, waardoor een 1:10-verdunning ontstaat.
- Neem 100 μL van het verdunde bloed uit buis 1 en voeg het toe aan een nieuwe microcentrifuge buis (verdunnings buis 2). Voeg 900 μL RPMI-medium toe aan buis 2 en meng goed door pipetteren op en neer met dezelfde pipetpunt, waardoor een 1:100-verdunning ontstaat.
- Herhaal de stappen 1.4.1 en 1.4.2 om twee seriële verdunningen te maken, waarbij 1:1000 (verdunnings buis 3) en 1:10000 verdunningen (verdunnings buis 4) worden uitgevoerd.
- Voeg 12 μL verdund bloed uit buis 3 en 12 μL verdund bloed van buis 4 aan verschillende zijden van een hemocytometer toe en bepaal het gemiddelde aantal erytrocyten aan elke kant van de hemocytometer. Vermenigvuldig deze getallen met 10. Vermenigvuldig deze getallen met respectievelijk de verdunningsfactor 1.000 of 10.000 om het aantal erytrocyten in 1 μL van elke verdunning te bepalen.
- Verdeel het gewenste aantal geïnfecteerde erytrocyten dat moet worden geïnjecteerd door het aantal erytrocyten in 1 μL van elke verdunning om het volume verdund donorbloed te bepalen dat nodig is voor injectie. Kies de verdunning met het meest geschikte volume voor injectie, voeg het volume toe aan een nieuwe microcentrifuge buis en vul het aan tot 120 μL met RPMI-medium.
- Dag 0: intraveneuze injectie van de ontvangende muizen
- Plaats de ontvanger muizen onder een hitte rood lampje om hun aderen te verwijden voor injectie. Laad de parasiet doses in een 27 G insulinespuit en plaats de ontvangende muis in een fixator.
- Injecteer 1.000.000 of 10.000 geïnfecteerde erytrocyten intraveneus (IV) met behulp van de 27 G insulinespuit in elke ontvangende muis voor muggen infectie assays of voor ongeslachtelijke en seksuele bloed-fase groei assays, respectievelijk. Blijf de muizen onder de standaard huisvestings condities houden.
Opmerking: Een IP-injectie is een indirecte methode om parasieten in de bloedbaan te introduceren, omdat parastized erytrocyten door de drainerende lymfeklieren van de peritoneale Holte moeten passeren om het bloed te bereiken. Dit maakt een IP-injectie een indirecte levering route voor het injecteren van een nauwkeurig aantal parasieten in de bloedbaan. Daarom heeft de IV-route de voorkeur, omdat het nauwkeurige parasiet doses rechtstreeks in de bloedbaan levert, zoals weergegeven in Figuur 3 en beschreven in de representatieve resultaten.
2. bepaling van de bloed-stage parasiet belasting voor seksuele en ongeslachtelijke stadia
Opmerking: In deze sectie, gestandaardiseerde fenotypische evaluatiemethoden van malariaparasiet bloed stadia worden vermeld. Deze methoden zijn nuttig bij de evaluatie van nieuwe Antimalarial of vaccin kandidaten of zelfs het uitvallen van genen op seksuele en ongeslachtelijke stadia ontwikkeling in dezelfde experimentele muizen. Van Note, p. chabaudi en p. vinckei zijn ook zeer rationele en belangrijke alternatieve opties voor deze types van assays, vooral in de drug screening.
- Bepaling van de parasitemie van ongeslachtelijke stadia en mannelijke versus vrouwelijke gametocyten door Giemsa-gebeitst dun bloeduitstrijkjes voor parasitaire groei testen
- Gebruik een 26 G-of 27-G-naald om de staart van de muis te prikken en de bloed druppel op een Microscoop-dia te verzamelen. Gebruik de korte rand van een andere Microscoop glijbaan om snel het bloed over de glijbaan te smeren.
- Bevestig de dia met 100% methanol gedurende ten minste 1 minuut, pas nadat het bloed volledig op de glijbaan is gedroogd. Vlek in 10% Giemsa voor 10-15 min. was de glijbaan met één of dubbel gedestilleerd water en laat het drogen.
- Lees de dia met een 100x doelstelling en olie onderdompeling onder een lichte Microscoop. Voor een nauwkeurige parasitemie meting, Controleer ten minste een totaal van 6.000 erytrocyten, die kan worden verkregen door het tellen van ten minste 30 of 40 microscopische rasters met een gemiddeld aantal 200 of 150 erytrocyten (Rbc's) per rooster, respectievelijk. Tel het totale aantal Rbc's in de eerste en laatste rasters om het gemiddelde aantal rode bloedcellen voor alle rasters te bepalen.
- Tel het totale aantal geïnfecteerde erytrocyten per rooster. Mannelijke en vrouwelijke gametocyten kunnen afzonderlijk worden geteld om gametocytemie te bepalen, maar moeten ook worden opgenomen in het totale aantal parasitemie.
- Bepaal het totale parasitemie percentage door het totale aantal geparastiseerde erytrocyten te delen door het totale aantal waargenomen Rbc's. Vermenigvuldig dit getal met 100 om het parasitemie percentage te bepalen.
- Bepaal de gametocytemie door het totale aantal gametocyten dat wordt geteld door het totale aantal waargenomen Rbc's te delen. Vermenigvuldig dit getal met 100 om het gametocytemia-percentage per muis te bepalen.
Opmerking: De enige betrouwbare methode van differentiatie tussen verschillende ongeslachtelijke en seksuele bloed stadia is het gebruik van een microscoop om Giemsa-gekleurd dunne bloeduitstrijkjes te evalueren, aangezien elk van de stadia verschillende morfologie heeft, met uitzondering van onvolgroeide gametocyten, die zijn meestal niet te onderscheiden van ongeslachtelijke bloed stadia.
- Bepaling van de bloedstadium parasitemie door Flowcytometrie voor fluorescerende reporter eiwit-uitdrukken van WT-achtige parasitaire stammen
- Label twee micro centrifugebuizen voor elk muis monster, waarbij één buis wordt vermeld voor een verdunning van 1:1000 en de andere voor een verdunning van 1:2000. Voeg 1,5 μL 1x heparine toe aan de 1:1000 verdunnings buis.
- Prik met een naald van 26 G of 27 G de staart van de muis en breng 1,5 μL bloed over in de buis met 1,5 μL 1x heparine (de 1:1000 verdunnings buis). Meng het bloed en 1x heparine zachtjes samen door Pipetteer op en neer.
- Voeg 1.497 μL RPMI-medium toe aan de microcentrifuge buis en Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag om goed te mengen.
- Breng 500 μL van het mengsel van de 1:1000 verdunnings buis over naar de verdunnings buis van 1:2000. Voeg 500 μL RPMI-medium toe aan de 1:2000-buis en meng zachtjes door pipetteren op en neer.
- Volg het juiste opstartprotocol van de fabrikant voor de flow cytometer. Voer de voorbeelden uit met een langzame stroomsnelheid en stel de detectie in voor ten minste 20.000 gebeurtenissen.
Opmerking: Er is een alternatieve praktische assay voor het meten van parasitemie via TRICOLOR FACS sortering, of parasieten Express fluorescerende markers of niet34. De hier beschreven bepaling biedt echter een nauwkeurige meting van parasitemie in levende parasieten zonder toevoeging van DNA-bindende kleurstoffen en het gebruik van FACS sortering.
- Bepaling van het exflagellatie percentage van mannelijke gameten per microliter geïnfecteerd muis bloed
- Bereid een 1:10-verdunnings microcentrifuge buis met 40 μL onvolledig ookinete medium (RPMI + natriumbicarbonaat + Hypoxanthine + xanthurenic acid) en 5 μL 1x heparine.
- Prik met een naald van 26 G of 27 G de staart van de muis en breng 5 μL bloed (met behulp van een micro pipet) snel naar de buis met de onvolledige ookinete media + heparin. Meng zachtjes en breng 12 μL van de 1:10-bloed verdunnings buis op een hemocytometer en laat deze op kamertemperatuur (20-24 °C).
- Begin met het tellen van de exflagellatie gebeurtenissen 9-10 min na het voorbereiden van de 1:10 verdunning. Gebruik een fase contrast licht Microscoop met 40x vergroting.
- Vermenigvuldig het gemiddelde aantal gebeurtenissen met exflagellatie geteld met 10 en vermenigvuldig vervolgens met de verdunningsfactor (10) om het gemiddelde aantal exflagelatie per microliter geïnfecteerd bloed te bepalen.
Opmerking: Deze bepaling meet het aantal bijwerkingen van mannelijke gameten exflagellatie in een volume van 1 μL bloed, dat kan worden gekwantificeerd met behulp van een hemocytometer. Een onvolledige ookinete medium18 wordt gemengd met het bloed om de omstandigheden waarin exflagelatie optreedt in de mug hepatopancreas kort na een bloedmaaltijd, nauw te nabootsen.
3. isolatie en verwerking van bloed-stadia parasieten van besmette erytrocyten en bevroren voorraad preparaat
- Terminale bloeding van geïnfecteerde knaagdieren door hart punctie
- Bereid een naald spuit van 26 G die ongeveer ≤ 20 μL 1x heparine (200 eenheden/mL) bevat om het bloed van de donor muis te verzamelen door middel van een hart punctie.
- Gebruik een langzame stroom van CO2 om de muis te euthaniëren voor de bloeding. Als alternatief, anesthetiseer de muis met Isofluraan (die moet worden gehandhaafd vóór en tijdens de huid incisie om het hart bloot).
- Leg de muis op zijn rug en Speld de aanhangsels vast. Maak een kleine incisie in de huid in de buurt van de basis van het borstbeen door de huid met een tang omhoog te trekken en te knippen met een schaar. Trek de huid uit elkaar op de plaats van de incisie om het diafragma en de bovenkant van de buikholte bloot te leggen.
- Houd de voet van de ribbenkast vast met een tang en snijd door het diafragma om de thoracische holte binnen te gaan; Let op dat u het hart of de longen niet beschadigt. Speld de ribbenkast terug om het hart bloot te leggen.
- Door het hart zachtjes te prikken en langzaam omhoog te trekken op de zuiger van de spuit om ~ 1 mL bloed te verzamelen en over te brengen naar een micro centrifugebuis.
- Bereiding van bevroren voorraden van geïnfecteerd bloed
- Bloeden de muizen (zie punt 3,1) met bloed parasitemias die tussen ongeveer 2% en 5%, met een aanzienlijke hoeveelheid ring stadia en niet zo veel gametocyten.
- Meng het gewenste deel van het bloed met een Vries oplossing (10% glycerol in de oplossing van Alsever) in een verhouding van 1:2 en bewaar in cryogene injectieflacons. Vries in vloeibare stikstof.
- Isolatie en zuivering van bloed-stadia parasieten voor de extractie van DNA, RNA, en eiwitten
- Bloeden muizen (zie punt 3,1) met bloed parasitemias die hoger zijn dan 0,5%.
- Maak een spuit van 10 mL door de zuiger te verwijderen en een klein wattenstaafje in te voegen. Pak het katoen op de onderkant van de spuit. Vul het met cellulose tot het niveau van cellulose het 3 mL-teken bereikt, maar niet hoger is dan het 4 mL-teken op de spuit.
- Bevestig de spuit in een clip op een ring standaard en plaats een afvalinzamel buis eronder. Voeg 5 mL PBS toe aan de spuit en laat deze door de afval buis stromen.
- Bereid bevroren voorraden, indien nodig, met slechts 100-300 μL bloed. Voeg de rest van het geïnfecteerde bloed (400-700 μL) toe aan de kolom. Verzamel stroom door met een afval buis totdat de druppels rood beginnen te draaien. Zodra de druppels rood beginnen te worden, plaatst u een nieuwe opvang buis van 14 mL onder de spuit om de stroom door te halen.
- Zodra de stroom begint te vertragen, voegt u PBS toe aan de spuit en haalt u de stroom door in de buis van 15 mL totdat een totaal volume van 14 mL is bereikt. Verzamel de resterende stroom door met een afval buis.
- Centrifugeer de 14 mL tube met bloed/PBS mengsel gedurende 8 minuten bij 250 x g zonder remmen. Verwijder het supernatant en voeg 14 mL gekoelde saponine (50 mg saponine in 50 mL PBS) toe. Om de pellet te verteren, Inverteer de tube meerdere malen en Vortex indien nodig.
- Centrifugeer de buis gedurende 8 minuten bij 1.217 x g zonder remmen. Verwijder het supernatant en laat ongeveer 0,5 mL van de oplossing boven de pellet.
- Regeer de pellet in de oplossing met behulp van een micropipet en breng het over naar een micro centrifugebuis. Voeg 500 μL PBS toe aan de buis van 14 mL om eventuele overgebleven parasieten in de buis te wassen. Voeg dit toe aan dezelfde microcentrifuge buis.
- Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 6.010 x g. Verwijder het supernatant en hervat 1 mL PBS. Centrifugeer 2 min bij 9.391 x g.
- Ga verder met het extract van genomisch DNA, totaal RNA en eiwitten.
- Voor genomische DNA-extractieverwijdert u het supernatant en rebrengt u de pellet in 200 μL PBS en volgt u een geschikt Protocol van gdna-extractie.
- Voor totale RNA-extractie, verwijder de supernatant, hervat en Vortex de pellet in 1 ml van een fenol-en guanidine isothiocyanaat gebaseerde oplossing of een ander geschikt reagens en volg vervolgens een geschikt Protocol van totale RNA-extractie.
- Voor de totale EiwitExtractie, verwijder het supernatant, hervat de pellet in een geschikt volume van 6x natriumdodecylsulfaat (SDS)-loading Dye of een ander geschikt reagens en volg vervolgens een geschikt Protocol van totale eiwit verwerking.
4. muggen infectie assays
Opmerking: De mug is de primaire gastheer van de malariaparasieten waar seksuele voortplanting plaatsvindt. De infectie van muizen om malariaparasieten door te geven aan muggen wordt uitgevoerd door een I.V.-injectie van ten minste 1.000.000 bloed stadia, gevolgd door het voeden van een geïnfecteerde muis (van elk genotype dat het hoogste mannelijke exflagelings percentage voor mannen weergeeft) om Anopheles muggen in een kooi op dag 3 na muis infectie. De IV injectie met 1.000.000 bloed-fase parasieten in met fenylhydrazine behandelde muizen zorgt voor de ontwikkeling van mannelijke en vrouwelijke gametocyt in een sneller en hoger tempo. Muggen die zijn geïnfecteerd met p. yoelii en p. berghei worden geïnfiltreerd bij respectievelijk 24 °c en 20-21 °c, om de best mogelijke muggen stadia te kunnen ontwikkelen6.
- Muggen voeding en bepaling van het aantal ookinetes per mug
- STARVE volwassen vrouwelijke Anopheles stephensi of A. gambiae muggen (4-7 dagen oud) voor 8-12 h voorafgaand aan het voeden. Laat volwassen muggen gedurende ten minste 15 minuten voeden met de geïnfecteerde verdoofd muizen (geïnjecteerd met een geschikte dosis ketamine/xylazine) met de hoogste exflagelatie snelheid (gemeten in punt 2,3).
Opmerking: De werkoplossing ketamine/xylazine wordt bereid door de 1:5 verdunning van de stamoplossing in zout en IP injectie 100 μL per muis. Bij een stockoplossing van 10 mL wordt 1 mL xylazine (100 mg/mL) toegevoegd aan 9 mL ketamine (100 mg/mL). - Verwijder ongevoederde vrouwelijke muggen en mannelijke muggen met een mond aspirator.
- Op 18-20 h na het voeden, verzamelen 20-30 muggen en plaats ze in de vriezer voor niet minder dan 10 min om de dood te garanderen. Met behulp van een binoculaire dissectie Scope, ontleden 20-30 bloed gevulde midguts met 2 26 G of 27 G naalden of een naald en een tang in RPMI of PBS dissectie medium en breng de midguts over naar een micro centrifugebuis met 200 μL RPMI of PBS (voor dissectie methode Zie paragraaf 4,3).
- Centrifugeer de opvang buis gedurende 1 minuut bij 700 x g. Maal de gepileerde midguts met een vijzel. Herhaal deze stap.
- Breng 50 μL over van de buis van gemalen midguts naar een nieuwe microcentrifuge buis. Voeg 200 μL RPMI of PBS toe om een 1:5 verdunning te creëren.
- Breng 12 μL over naar een hemocytometer en inbroed deze op kamertemperatuur gedurende 5 minuten, zodat de inhoud kan worden vereffend.
- Bepaal het gemiddelde aantal ookinetes met behulp van een lichtmicroscoop met een fase contrast en 40x vergroting.
- Vermenigvuldig het gemiddelde aantal volwassen ookinetes met 10 en vervolgens met de verdunningsfactor van 5 om het gemiddelde totale aantal ookinetes te bepalen.
- Verdeel het gemiddelde aantal ookineten door het aantal door bloed gevoede muggen die zijn ontleed om het aantal ookinetes per bloedvoedende mug te bepalen.
- STARVE volwassen vrouwelijke Anopheles stephensi of A. gambiae muggen (4-7 dagen oud) voor 8-12 h voorafgaand aan het voeden. Laat volwassen muggen gedurende ten minste 15 minuten voeden met de geïnfecteerde verdoofd muizen (geïnjecteerd met een geschikte dosis ketamine/xylazine) met de hoogste exflagelatie snelheid (gemeten in punt 2,3).
- Bepaling van het aantal vroege oöcysten voor fluorescerende reporter eiwit-uitdrukken van WT-achtige parasiet stammen
Opmerking: Het doel van deze test is het bepalen van het aantal levende parasieten die groene fluorescerende eiwitten uitdrukken (GFP) dat een volledige infectie van de muggen midguts tot stand heeft gebracht en vroege sferische oöcysten vormde. Deze bepaling bepaalt of de ookinetes (hun ontwikkeling geschat in de vorige assay) hun functies hebben voltooid door het traversal door de muggen-epitheelcellen en de transformatie naar vroege oöcysten aan de basale lamina-kant van de hepatopancreas epitheelia of niet. Dit is een andere test die veel gebruik maakt van de parasieten die GFP uitdrukken, omdat het tellen van vroege oöcysten in dit stadium bijna onmogelijk zal zijn zonder vervelende immunokleuring.- Ontleden de midguts (zie paragraaf 4,1) van 20-30 bloed gevoede muggen, op dag 3 of 4 post-muggen Voer (PMF) voor p. yoelii 17X-nl, en op dag 6 of 7 PMF voor p. berghei ANKA, met 2 26 g of 27 g naalden of een naald en een tang in rpmi of PBS dissectie m edium (voor dissectie methode zie paragraaf 4,3).
- Verdeel 40-50 μL van het dissectie medium op de horizontale middenlijn van de langere rand van de glazen glijbaan. Breng de midguts naar deze lijn, een voor een, tijdens het dissectie, en voeg meer medium toe aan de midguts, indien nodig, om uitdroging te voorkomen.
- Plaats een dekslip zachtjes op de ontleed midguts en sluit het af met nagellak.
- Met behulp van de 10x of 20x doelstelling van de fluorescentie Microscoop met de groene fluorescentie filter, tellen het aantal vroege oöcysten op elke midgut, in ten minste 20 midguts.
- Bepaling van het aantal oocyste sporozoïeten per mug
- Ontleden de midguts van ten minste 20-30 muggen met 2 26-G of 27-G naalden of een naald en een tang in RPMI of PBS dissectie medium en verzamel de ontleed midguts in 200 μL RPMI.
- Houd de onderbuik segmenten stevig op zijn plaats met één naald (of een tang) en duw de thorax lichtjes in een opwaartse richting met de andere naald op de kruising tussen de thorax en de buik. Doe voorzichtig korte duwt totdat de thorax scheidt van de buik. Zodra de scheiding begint de witte hepatopancreas zal verschijnen uitgerekt, en dan zal de hepatopancreas worden gesneden uit de slokdarm einde met behulp van dezelfde naald die werd gebruikt om de thorax scheiden. Als het nog steeds aan de buik is bevestigd, kan dezelfde naald worden gebruikt om de hepatopancreas weg van de buik te trekken. Breng de midguts van alle muggen over naar de opvang buis door ze te verzamelen van het medium met een naald, een voor een.
- Centrifugeer de opvang buis gedurende 1 minuut op 700x g om de midguts naar de bodem van de opvang buis te wikkelen en ze met een stamper te malen. Herhaal deze stap.
- Breng 12 μL over naar een hemocytometer en inincuberen deze bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, zodat de inhoud kan worden vereffend.
- Tel de oocyste sporozoïeten met behulp van een 40X doelstelling van een lichte Microscoop. Gebruik 1:5 en/of 1:10 verdunningen als muggen puin de precieze telling van de sporozoïeten verhindert of als het aantal sporozoïeten te hoog is om nauwkeurig te tellen.
- Bereken het gemiddelde totale aantal oöcyste-sporozoïeten door het gemiddelde aantal sporozoïeten te vermenigvuldigen met 10 en vervolgens dat getal te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor, indien van belang, en door het totale volume (200 μL).
- Verdeel het gemiddelde totale aantal sporozoïeten door het aantal muggen dat is ontleed om het gemiddelde aantal oöcyste-sporozoïeten per mug te berekenen.
Opmerking: Een veelvoorkomende fout voor het meten van het succes of de productiviteit van muggen stadia infectie is het tellen van het aantal oöcysten in latere stadia van oocyste ontwikkeling. Dit is te wijten aan sommige oöcysten worden gevacuoliseerd op latere tijdstippen van oocyste ontwikkeling, en anderen niet te ontwikkelen sporozoites, zelfs op dezelfde midgut. De beste en meest betrouwbare methode om de productiviteit van muggen stadia infectie te bepalen is het tellen van het gemiddelde aantal hepatopancreas oocyste sporozoieten op dagen 10-12 post-Mosquito-infectie voor P. yoelii en op dagen 12-14 post-mug-infectie voor P. berghei.
- Bepaling van het aantal speekselklier sporozoïeten per mug
Opmerking:De uiteindelijke evaluatie van de volledige voltooiing van de ontwikkeling van de Mosquito stadia wordt bereikt door het inschatten van het aantal sporozoïeten dat de speekselklier binnengevallen, die de overdraagbare en infectieuze stadia tot gewervelde dieren. De invasie van de speekselklier wordt vastgesteld na de voltooiing van de oocyste sporozoite ontwikkeling, uitgaande in de Hemolymfe, gehechtheid aan de basale lamina van de speekselklier acinale cellen, en het doorlopen van de acintische cellen om de speekselklieren te bereiken Leidingen5. Daarom is deze assay ook een evaluatie van het succes van al deze processen of niet. Niettemin, een schatting van de Hemolymfe sporozoite getallen zou toestaan de differentiatie tussen defecten in de uitgaande van oöcysten en gebreken in de invasie van speekselklieren35. De zuivering van speekselklier sporozoïeten maakt het uitvoeren van meerdere functionele testen op sporozoite motiliteit en invasie fenotypes. De speekselklier sporozoïeten kunnen ook worden gebruikt voor de in vivo infectie van muizen en in immunisatie studies36,37. Bovendien zijn de meest reproduceerbare stadia beschikbaar voor het vestigen van een in vitro lever fase invasie of een ontwikkelings test door het gebruik van speekselklier sporozoites.- Dissect de speekselklieren van 50-100 vrouwelijke muggen, op dagen 14-16 PMF voor p. yoelii en op dagen 17-20 PMF voor p. berghei, bij voorkeur met 2 26 g of 27 G naalden, in RPMI of DMEM medium op ijs gehouden en aangevuld met 5% foetaal RUNDERSERUM (FBS) of bovine serumalbumine (BSA) voor p. yoelii sporozoieten of 3% FBS/BSA voor p. berghei sporozoieten. Als de sporozoïeten moeten worden gebruikt in hepatoma in vitro assays, voeg 1% penicillaire/streptomycine toe aan het dissectie medium. Er zijn over het algemeen twee methoden voor de dissectie van de speekselklieren. De eerste methode is tijdrovend, maar leidt tot de dissectie van de speekselklieren met zeer weinig of geen contaminerende weefsels. De tweede methode is minder tijdrovend, maar leidt tot de inzameling van een aanzienlijke hoeveelheid contaminerende weefsels. De eerste methode is hier gedetailleerd.
- Houd de bovenste buik segmenten op zijn plaats met de schuine kant van een naald en duw voorzichtig de kop zeer licht (in zeer korte duwt) op de kruising tussen het hoofd en thorax in een opwaartse richting totdat het hoofd zorgvuldig wordt gescheiden van de thorax zonder scheuren van de gladheid speekselklieren, de blootgestelde speekselklieren worden vervolgens gescheiden van het hoofd met dezelfde naald die het hoofd omhoog geduwd.
- De ontleed speekselklier wordt opgetrokken uit het dissectie medium met behulp van een korte glazen Pasteur pipet.
- Wanneer alle speekselklieren zijn ontleed en geoogst, zal talent de buis met de midguts in de centrifuge plaatsen (1min, 700 x g).
- Count sporozoieten met behulp van een hemocytometer onder een lichte Microscoop ingesteld op fase 2 contrast en 40x vergroting. Als het nummer van de muggen ontleed ≥ 40, Verdun de speekselklieren tot 1:5 of 1:10, afhankelijk van de verwachte infectiviteit opbrengst (bepaald in eerdere testen).
- Vermenigvuldig het gemiddelde aantal sporozoïeten met 10 en de verdunningsfactor (indien van belang). Vermenigvuldig met het totale volume om het gemiddelde aantal van de speekselklier-sporozoïeten te bepalen. Verdeel door het aantal ontleed vrouwelijke muggen om de gemiddelde speekselklier sporozoïeten per mug te bepalen.
Opmerking: Het probleem met de dissectie van de speekselklieren is hun kleine formaat en Glay transparante verschijning. Het is dus zeer moeilijk om de speekselklieren te isoleren en daarom worden ze meestal uitgesneden als een forfaitair bedrag met andere weefsels uit het voorste deel van de thorax, wat ook belangrijk is om de speekselklieren te beschermen tegen scheuren tijdens de verzameling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succes van het toepassen van reverse genetische hulpmiddelen en technieken voor malariaparasieten heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van malaria onderzoek, met de mogelijkheid om toe te voegen, te verwijderen, of te wijzigen specifieke genomische segmenten van verschillende Plasmodium soorten39. Belangrijk is dat de uit te leggen genomische loci is geïdentificeerd en met succes gebruikt om fluorescentie eiwit markers in knaagdieren en menselijke malariaparasieten in te voeren door dubbele homologe recombinatie, om een stabiele uitdrukking te garanderen in alle levenscyclus stadia40 ,41,42. Een voorbeeld van deze WT-achtige transgene parasieten is Py230p (-) parasieten, die zijn gegenereerd in ons laboratorium, en toonde geen schijnbare defect in de ontwikkeling van bloed en Mosquito levenscyclusstadia 15,16, 17. deze transgene reporter parasieten uitgedrukt EGFP, onder de controle van de sterke en constitutieve promotor van PyHSP70, in bloed stadia (Figuur 1a) ookinetes (Figuur 1b), jonge oöcysten (figuur 1c ) op Anopheles stephensi midguts, en in sporozoieten geïsoleerd van de speekselklieren van Anopheles stephensi vrouwtjes (figuur 1d). Zo maakte de EGFP-uitdrukken van bloed parasieten het veel gemakkelijker en minder tijdrovend om bloedtraps parasitemie te evalueren met behulp van Flowcytometrie tussen verschillende genotypen van transgene parasieten of tussen medicamenteuze en-onbehandeld in drugs-targeting assays met behulp van transgene reporter parasieten.
Om te bevestigen dat er geen kwantitatief verschil is tussen het gebruik van Flowcytometrie en de meer saaie schatting van parasitemie door microscopie, werd de eGFP-expressie Pyp230p (-) gebruikt om het percentage van parasitaire erytrocyten te schatten door Flow flowcytometrieonderzoeken en door Giemsa-gekleurd dun bloeduitstrijkje in een groep van Zwitserse Webster muizen IV-geïnfecteerd met 10.000 parastized erytrocyten. De flowcytometerie parasitemie% waarden correspondeerde rechtstreeks met de geschatte parasitemie% door het bewaken van Giemsa-gekleurd dunne bloeduitstrijkjes, die werden geschat door twee deskundige wetenschappers (Figuur 2). Dit is een nauwkeuriger alternatief voor de vervelende en gevoelig-naar-mens-fout methode van microscopie bij de bepaling van de groeisnelheid van bloed-fase parasieten.
Een belangrijke discrepantie in verband met de infectie van knaagdieren met malariaparasieten bloed stadia is de keuze van de route van de infectie, met een sterke voorkeur in de literatuur voor het IP in vergelijking met IV route van de infectie, omdat het minder tijdrovend. Om deze twee routes van infectie te vergelijken, werden twee groepen van vijf BALB/c muizen geïnfecteerd met 1.000 eGFP-uitdrukken van Pyp230p (-) geparastiseerde erytrocyten per muis, hetzij via IV of IP routes. De parasitemie werd dagelijks gecontroleerd met behulp van Flowcytometrie gedurende een periode van 4 dagen. Een statistisch significante afname van de met IP geïnfecteerde groep parasitemie% ten opzichte van de IV-geïnfecteerde groep werd genoteerd op alle dagen getest (Figuur 3). Dit levert bewijs dat de IV infectie route is een meer kwantitatief nauwkeurige route van infectie voor assays met de malariaparasiet bloed stadia.
Niettemin, een beperking aan het gebruik van flow cytometrie om bloed-stage parasitemie te evalueren is de differentiatie tussen seksuele en ongeslachtelijke stadia en tussen mannelijke en vrouwelijke gametocyten. Daarom moet de schatting van de percentages van elk van de verschillende ongeslachtelijke en seksuele stadia (Figuur 4) afhangen van een morfologie beoordeling van Giemsa-gekleurd dun bloeduitstrijkje. Ondanks de schijnbare verschillende morfologie van volwassen mannelijke en vrouwelijke gametocyten (Figuur 4), zijn onrijpe seksuele stadia vaak niet te onderscheiden van ongeslachtelijke stadia.
Een essentiële functie van de mannelijke gameten bij het ontstaan van mannelijke gametocyt in de mug hepatopancreas is de mannelijke gameten exflagellatie, wat een zeer kritieke stap is in de transmissie die binnen een zeer korte tijd moet gebeuren. Variabele methoden die worden gebruikt om dit in veel verschillende systemen te evalueren, zijn beschreven. Hierin tonen we een gestandaardiseerde methode die kan worden herhaald in elke eenvoudige Lab-instelling. We evalueerden mannelijke gameten exflagellatie met of zonder de injectie van fenylhydrazine in ontvangende muizen (Figuur 5). We konden aantonen dat de behandeling met fenylhydrazine significant (vier maal) de snelheid van mannelijke gameten exflagellatie verhoogde, wat op zijn beurt de bevruchting en het aantal daaropvolgende muggen stadia zal verhogen.
Figuur 1 : De ontwikkeling van P. yoelii p230p (-) parasieten constitutief uitdrukken EGFP in bloed en muggen stadia. (A) beeld van gemengde bloed-fase parasieten (1, 000x vergroting). (B) afbeelding van ookinete (vergroting van 400x). (C) afbeelding van een Anopheles stephensi Mosquito hepatopancreas geïnfecteerd met dag 4 PMF vroege oöcysten van levende p230p (-) parasieten uitdrukken EGFP (100x vergroting). (D) dit paneel toont een live beeld van een P. yoelii p230p (-) speekselklier sporozoite, ontleed op dag 15 PMF, uitdrukken EGFP (400x vergroting). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Flowcytometrie en microscopie evaluaties van de gemiddelde bloed-stage parasitemie van P. yoelii p230p (-) parasieten zijn niet significant verschillend. Een groep van vier Zwitserse Webster muizen werd intraveneus geïnfecteerd met 10.000 geparastiseerde erytrocyten van Pyp230p (-) per muis en de gemiddelde bloed-stage parasitemias% werd dagelijks geregistreerd gedurende 7 dagen door Flowcytometrie en door de microscopische evaluatie van Giemsa-gekleurd dun bloeduitstrijkjes van een totaal van 20.000 en ~ 6.000 erytrocyten, respectievelijk. De getoonde microscopisch onderzoekresultaten zijn het gemiddelde van twee lezingen door twee deskundige wetenschappers per dia, en de tijd voor het evalueren van de parasitemie van elke dia was ten minste 10 minuten door elke wetenschapper. Er kunnen geen significante verschillen worden gedetecteerd op een van de dagen die hier worden weergegeven. De gemiddelde waarden voor alle parasietstammen werden geanalyseerd met de tweezijdige t-toets. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Een intraveneuze injectie van P. yoelii p230p (-) parasieten levert significant verschillende bloedtraps parasitemie op uit een intraperitoneale injectie. Twee groepen van vijf BALB/c muizen werden geïnfecteerd met 1.000 parastized erytrocyten van Pyp230p (-) per muis, hetzij via de intraveneuze of intraperitoneale route, en de gemiddelde bloed-stage parasitemias% dagelijks werden geregistreerd voor 4 dagen doorstroming cytometrie uit een totaal van 20.000 erytrocyten. Een statistisch significante reductie (aangeduid met een sterretje) van bloed-stage parasitemie kan worden gedetecteerd voor alle dagen getest in de intraperitoneale routegroep in vergelijking met de intraveneuze routegroep. De gemiddelde waarden voor alle parasietstammen werden geanalyseerd met de tweezijdige t-toets. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Morfologie van P. yoelii gametocyten in een Giemsa-gekleurd dun bloeduitstrijkje. Een beeld van een Giemsa-gekleurd dun bloeduitstrijkje (1, 000x vergroting) van een Zwitserse Webster muis geïnfecteerd met WT P. yoelii 17x-nl stam toont de typische blauwachtig gekleurde vrouwelijke gametocyt aan de linkerzijde (aangeduid met een pijl) en de roze gekleurde man ( aangeduid met een sterretje) gametocyt aan de rechterkant van de afbeelding. De andere stadia die getoond worden zijn ongeslachtelijke bloed stadia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Het effect van fenylhydrazine op mannelijke gameten exflagellatie. Het effect van fenylhydrazine geïnjecteerd in ontvangende muizen 5 dagen voorafgaand aan het mannelijk gameten exflagellatie percentage schatting van P. yoelii. Fenylhydrazine verhoogt significant de snelheid van mannelijke gameten exflagellatie, wat leidt tot een hogere muggen stadia infectie post-muggen voeding. De gemiddelde waarden voor alle parasietstammen werden geanalyseerd met de tweezijdige t-toets. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de gelijkenis in de algemene biologie van hun levenscycli tot die van menselijke malariaparasieten, hebben muizen malaria modellen ook veel gelijkenissen met menselijke Plasmodium soorten die hun gebruik als betrouwbaar in vivo modellen zouden beperken. Bijvoorbeeld, met uitzondering van levende verzwakte parasieten als vaccins, alle vaccin studies met subeenheid en DNA en andere vaccins gaven uitstekende resultaten in het muismodel, maar bij mensen die in endemische gebieden wonen, waren de resultaten verre van bevredigend.
Een ander probleem is het verschil in levenscyclus stadium infectiviteit van de ene muis stam naar de andere, en soms van de ene dierlijke leverancier naar de andere voor dezelfde muis stam. Bovendien, de belangrijkste twee Knaagdieren malaria soorten die op grote schaal worden gebruikt als voorkeur in vivo malaria modellen, p. berghei en p. yoelii, vertonen geen synchrone bloed-fase cyclus, die is volledig verschillend van elke menselijke malaria Parasiet. Echter, de voordelen van het gebruik van muis malariaparasieten als in vivo modellen zwaarder wegen dan veruit deze disgelijkenissen, die ook kan worden overwonnen door meer diepgaande analyses van de moleculaire drives van deze beperkingen. Niettemin, deze beperkingen worden meestal weergegeven door de knaagdieren malaria bloed-fase parasieten, maar niet zo veel voor de andere levenscyclus stadia van de malariaparasiet.
Hoewel bloed stadia belangrijk zijn voor verschillende vaccins, geneesmiddelen targeting, immunologie en functionele genomische studies, is er een schaarste aan gestandaardiseerde methoden en protocollen die zich concentreren op de fenotypische analyse en functionele assays die betrekking hebben op knaagdier malariaparasiet bloed-stage parasieten, met meer aandacht voor Mosquito transmissie en transfectie protocollen. Daarom zullen de methoden in dit artikel helpen om gestandaardiseerde en vereenvoudigde protocollen te bieden voor het bestuderen van de pathogene stadia van de knaagdieren malariaparasieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ahmed Aly wordt gesteund door financiering aan de Bezmialem Vakif Universiteit van het Turkse Ministerie van ontwikkelings subsidie 2015BSV036, en door financiering door de Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, en door financiering van NIH-NIAID voor R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
