Summary
Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.
Abstract
Hücreler, ekzozomlar, proteinler, lipidler ve nükleik asitler içeren ~ 100 nm'lik ekstraselüler veziküllerle (EV'ler) iletişim kurabilir. Yapışık olmayan / mezenkimal meme epitel hücresi (NAMEC) kaynaklı ekstrasellüler veziküller, NAMEC ortamından diferansiyel ultra-santrifüj ile izole edilebilir. Yoğunluklarına bağlı olarak EV'ler 110.000 x g'de ultra-santrifüjleme yoluyla saflaştırılabilir. Ultra-santrifüjden elde edilen EV preparatı, çözünebilir proteinlerle kontaminasyonu önlemek için sürekli bir yoğunluk gradyanı kullanılarak daha da ayrılabilir. Ardından, saflaştırılmış EV'ler, müstahzar içindeki veziküllerin sayısını ve sayısını ölçen nanopartikül izleme analizi kullanılarak daha da değerlendirilebilir. 50 ila 150 nm arasında değişen boyuttaki hücre dışı veziküller eksozomlardır. NAMEC türevli EV'ler / eksozomlar, flow sitometri ve konfokal mikroskopi ile ölçülebilen meme epitel hücreleri tarafından alınabilir. Bazı meme kök hücre özellikleri ( örneğin, meme bezi oluşturma yeteneği) canGövde benzeri NAMEC'lerden NAMEC türevi EVs / eksozomlar yoluyla meme epitel hücrelerine aktarılmalıdır. EpCAM lo / CD49f yüksek bazal meme epitel hücreleri transplantasyondan sonra meme bezlerini oluştururken, izole primer EpCAM merhaba / CD49f luminal meme epitel hücreleri fare yağ pedlerine nakledildikten sonra meme bezleri oluşturamazlar. EpCAM hi / CD49f luminal meme epitel hücreleri tarafından NAMEC türevi EVs / ekzozomların alınması, yağ pedlerine nakledildikten sonra meme bezleri üretmelerine izin verir. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilen EVs / eksozomlar meme bezi oluşturma yeteneğini EpCAM hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerine aktarır.
Introduction
Eksozomlar, hücreler arasında membran ve sitozolik proteinler, lipidler ve RNA'lar aktararak hücresel iletişimi arabuluculuk edebilir 1 . Eksozom aracılı iletişimin pek çok fizyolojik ve patolojik sürece dahil olduğu gösterilmiştir ( örn., Antijen sunumu, tolerans 2 gelişimi ve tümör ilerlemesi 3 ). Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan kaynak hücrelerinkine benzer içerikler içerir. Böylece, eksozomlar, kaynak hücrelerden spesifik hücre özelliklerini taşıyabilir ve bu özellikleri, hücreleri sindiren hücrelere aktarabilir 4 .
Ekzozomlar, 50 ila 150 nm çift katmanlı veziküllü ve mevcut spesifik belirteçlerdir ( örn., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix ve TSG101). Bu nedenle, eksosomlar farklı yönler için çeşitli yöntemlerle karakterize edilmelidir. İletim elektron mikroskobu, zar vezikülleri görselleştirmek için kullanılabilirEksosomlar 4 , 5 gibi . Saflaştırılmış eksosomların boyut ve sayısını ölçmek için nanopartikül izleme analizi (NTA) ve dinamik ışık saçılım analizi (DLS) kullanılmaktadır. Ekzozomların lipid zar içeriği yoğunluk gradyanı ile doğrulanabilir. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix ve TSG101 6 , 7 gibi ekzozom belirteçleri Western blot ile ölçülebilir.
Laminal hücreler 8 , 9 , 10 olamazken, meme bazal hücreleri yağ bezlerine implante ederken meme bezleri üretme özelliğine sahiptir. Böylece, meme bazal hücreleri aynı zamanda meme yeniden nüfuz üniteleri olarak da adlandırılır. Meme bazal ve luminal hücrelerin modelini kullanarak EV / eksosomların farklı hücre popülasyonları arasında hücre özelliklerini aktarma yeteneği incelenebilir. Bu işMeme bazal epitel hücrelerinden meme luminal epitel hücrelerine gland oluşturma yeteneğini, meme bazal epitelyal hücrelerden türetilen EVs / eksozomları kullanarak aktarma yöntemini göstermektedir. Luminal meme epitel hücreleri, bazal hücrelerden salınan EV / ekzosomların alımını takiben bazal hücre özelliklerini kazanmış ve daha sonra meme bezlerini oluşturabilir 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları ilgilendiren tüm araştırmalar, Hayvan Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere uymaktadır.
1. Ekstraselüler Vesikül / Ekzoz İzolasyonu ve Validasyonu
- 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12'den sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile yapılmış taze, serum içermeyen ortam ile kültür meme epitelyal bazal hücreleri, NAMEC'ler 4 ; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Sığır hipofiz hulasası (BPE; 35 μg / mL); Ve GW627368X (1 μg / mL) ile 15 cm bulaşık yıkayın.
- Hücreleri bir hemocytometer ile saydıktan sonra, 4 gün süreyle 0 günde 15 cm'lik tabaka başına 12 mL ortamda 1.2 x 106 hücre tohumlayın.
- Kültürde 4 gün sonra, bir masa üstü santrifüj kullanarak 5 dakika 300 xg'de kültür ortamı santrifüjleyin. Süpernatantı konik bir boruya aktarın ( Şekil 1 ).
- Süpernatantı santrifüjleyinBir masa üstü santrifüjünde 2,000 xg'de 20 dakika. Süpernatantı bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ve ölü hücreleri ve hücre pisliğini bırakın ( Şekil 1 ).
- Süpernatantı 10,000 xg'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ( Şekil 1 ).
- Süpernatantı 110,000 xg'de, 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve EV / exosome peletini PBS'de tekrar süspanse edin ( Şekil 1 ).
- Süpernatantı 110,000 xg'de, 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. EV / exosome peletini PBS'ye tekrar süspanse edin ( Şekil 1 ). 240 uM-80 mL NAMEC klimatlı ortamdan izole edilen pelleti 100 uL'de tekrar süspanse edin.
- EV süspansiyonunun protein konsantrasyonunu BCA protein deneyi ile ölçün. Konsantrasyonun 20-40 μg / 100 μL civarında olduğundan emin olun. Için -20 ° C'de muhafaza edinIleri analiz.
- Daha önce Gardiner ve ark. Tarafından anlatıldığı gibi nanopartikül izleme analizi (NTA) ile EV'lerin / eksosomların konsantrasyonunu ve boyutunu ölçün . 11 . EVs / ekzozomları (20 μg / 100 μL) PBS ile NTA analizi için 10.000 katına kadar sulandırın.
NOT: NTA analizinin sonucu analiz edilen veziküllerin sayısını ve boyutunu yansıtır. - Daha önce Lin ve ark . Tarafından açıklandığı üzere transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile EV / eksosomları görüntüleme 4 .
2. Bir Yoğunluk Degradesi Kullanılarak Exosome Arıtma
- PBS (2 mL) içinde% 40'lık (w / v) iyodixanol içinde adım 1.7'den elde edilen 110.000 g peleti tekrar süspansiyon haline getirin. Bir ultra-santrifüj tüpünde bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için karışımı sırayla PBS'de (her biri 2 mL)% 30,% 20,% 10 ve% 5 (w / v) iyodiksanol bölümleriyle örtün.
- Karışımı 200 ° C'de 8 saat boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Her gradyan fraksiyonunu toplayın (10 çarpıons; 1 mL / fraksiyon) tüpün üstünden bir pipet ile kondu.
- SDS-PAGE 12 ve Western leke ile her bir fraksiyonda exozom belirteçlerinin ( örneğin, CD81, CD9, CD63 ve Tsg101) varlığını analiz edin. Her fraksiyonun 50 μL'lik süspansiyonlarını% 0.1 (w / v) SDS içeren% 10'luk bir jel üzerine yükleyin ve fraksiyonlarda proteinleri jel elektroforeziyle ayırın.
- Proteinleri bir jelden bir PVDF zarına aktarın ve membranı, exozom belirteçlerine ( örn., CD81, CD9, CD63 ve Tsg101) karşı antikorlar ve gece boyunca oda ısısı proteini GAPDH'yi ( Tablolar Tablosu ) 4 ° C'de inkübe edin .
NOT: Sonuç, eksosom içeren fraksiyonu tanımlar.
3. Ekstrasellüler Vesikül / Exposome Etiketleme
- Adım 1.7'de elde edilen EVs / ekzosomları 10 μM karboksi floresein sukkinimidil diasetat ester (CFSE) 20 μg exozomal protein / 100 μL'de askıya alınız. Paralel bir örnek hazırlayınSadece CFSE'ye ve PBS'e sahip olmak, daha sonra EV / eksozom alım testleri için negatif bir kontrol olarak işlendi. Karışımları 37 ° C'de 30 dakika bekletin.
- EVs / ekzosomları 50x hacim PBS'de askıya alın ve süspansiyonu 110,000 xg'de 4 ° C'de 60 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve EV / exosome peletini PBS'de tekrar süspanse edin. Adım 3.2'yi bir kez tekrarlayın.
- EVs / ekzosomları PBS'de 20 μg exozomal protein / 100 μL konsantrasyonda askıya alın ve sonra EV / eksosomları hücrelere eklemeden önce EV / exosomes'ı 0.22 μm membranlar yoluyla filtreleyin.
4. Ekstrasellüler Vesikül / Exposome Alım Testi
- Kültür ortamı yapmak için, 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12, sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile karıştırılır; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Ve BPE (35 μg / mL) 4'tür . İnsan meme epitel HMLE hücrelerini 6 oyuklu tabaklarda (1 x 10 6 </ Sup> hücreler / kuyu) EV / eksozom tedavisinden bir gün önce. 2-6 saat boyunca HMLE hücrelerinin kültür ortamına adım 3.3'te elde edilen 2 μg / mL CFSE floresan etiketli EVs / exosome ekleyin. Negatif kontrol grubunun HMLE hücrelerini 3. adımda anlatılan paralel hazırlık ile tedavi edin.
- 2-6 saatlik inkübasyondan sonra hücreleri oda sıcaklığında 4 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- 10 dakika% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve% 0.2 FBS içeren PBS hücrelerini yeniden askıya alın. Bir flüoresan hücre analizörü 4 kullanarak hücrelerdeki floresans yoğunluğundan EV / exosome alımını ölçün. EVs / eksosomlarla tedavi edilen hücreleri veya konfokal mikroskobu kullanarak negatif kontrol edin.
NOT: Hücrelerdeki yeşil flüoresans EV / eksosom tutulumundan kaynaklanır. Mikroskop ayarları için Şekil 6'daki efsaneye bakın.
5. Primer Fare Memeli Epitelyal Hücrelerinin İzolasyonu
- Makas kullanarak 12 haftalık bakire diş C57BL / 6 farelerinden 2, 3, 4 ve 5 numaralı meme bezlerini ( Şekil 2 ) parçalayın ve bezleri küçük parçalar halinde (2 mm2) bir ustura ile kesip kesin.
- Daha sonra 37 ° C'de 60 dakika boyunca meme bezlerinin bulamaçını (10 fareden) ayrıştırın,% 0.2 kolajenaz IV,% 0.2 tripsin,% 5 FBS, 5 μg / mL gentamisin içeren 50 mL DMEM / F12 ile 120 rpm karıştırma , Ve 1x kalem strep.
- 10 dakika süreyle 350 xg'da santrifüje ederek karışımdaki epitelyal organoidleri peletleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 mg / mL DNase I ile 4 mL DMEM / F12'deki epitelyal organoidleri askıya alın. Final'e 6 mL DMEM / F12 ekleyin.Hacmi 10 mL.
- Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Peleti 10 mL DMEM / F12 içinde tekrar süspanse edin. Süspansiyonu santrifüjleyin, ancak hız 400 x g'ye ulaştığında frene basın. Süpernatanı atın.
NOT: Fren isabet ederek, epitel organoitleri çabucak peletlenirken fibroblastlar tek hücreler olarak hala süpernatantta kalırlar. - 5.6 ve 5.7 adımlarını 5-7 kere tekrarlayın. Süspansiyonu bir hemositometreye bir damla ilave edin ve sonra her santrifüj işleminden sonra mikroskopik olarak organoid karışımdan fibroblastların temizlenmesini kontrol edin ( Şekil 3 ).
- Adım 5.1'de elde edilen jelatin kaplı çanak içerisindeki organoidleri 1x ITS,% 5 FBS, 50 ug / mL gentamisin, 10 ng / mL EGF ve 1x kalem strep içeren DMEM / F12 ile 48 saat plaka haline getirin.
- 48 saat sonra, kültür ortamındaki yüzen hücreleri ortamı, FBS içermeyen taze kültür ortamı ile değiştirerek çıkarın (1x ITS, 50 ug / mL gentamisin, 10 ng / mL EGF ve 1x kalem strepten oluşan DMEM / F12).
- Memedeki epitel hücrelerinin tek tabaka- sının 3 gün içinde bağlı epitel organoidlerinden göç ettiğini ve büyüdüğünü doğrulayın.
6. Primer Fare Bazal / Luminal Memeli Epitelyal Hücrelerin Ayrılması
- 3 günlük kültürden sonra fare birincil meme hücrelerini proteolitik ve kolajenolitik enzim aktivitesi olan doğal bir enzim karışımı ile 20 dakika ayırın. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
- Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre pelletini 5 mg / mL dispazda 20 dakika boyunca tekrar süspanse edin. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
- Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Seyreltilmiş 10 7 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda% 0.2 FBS ile 100 uL PBS'de hücrelerin yeniden askıya alındıAnti-CD49f ve anti-EpCAM antikorlarının buz üzerinde 1 saat karanlıkta tutulması.
- PBS ile hücreleri yıkayın ve daha sonra karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde fluorofor-konjuge sekonder antikor ile hücreleri inkübe edin.
- Yıkayın ve% 0.2 FBS ile PBS içinde hücreleri askıya alınız.
- EpCAM hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerini bir hücre sıralayıcı 4 üzerinde sıralayın.
7. Ekstrasellüler Vesikül / Exozom Tedavisi
- Sıralanmış EpCAM hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerini jelatin kaplı 6-iyi kaplar (2 x 10 5 hücre / oyuk) üzerinde adım 6.7'den tohumlayın ve daha sonra bunlara PBS veya 2 ug / mL NAMEC türevi EVs / ekzozomlar ile muamele edin Adım 1.7'de elde edilmiştir.
- Uzun süreli kültür tedavisinde EVs / eksosomların biyolojik etkinliğini sağlamak için, hücre kültürü ortamını her iki günde PBS veya 2 ug / mL NAMEC türevli EV / eksosom içeren taze ortam ile değiştirin. Fare primasını bölme.Ry luminal hücrelerinde 10 gün süreyle tedavi edildi.
8. Memeli Epitelyal Hücrelerin Yağ Pad Enjeksiyonu
- İzoflüoran 2-3% inhalant içeren 3 haftalık bir kadın C57BL / 6 fareyi anestezi altına alın.
- Anestezi uygulanmış fareyi sırtına yerleştirin. Karın ortasındaki kürkü bir ustura / saç kremi kullanarak çıkarın ve cerrahi alanı% 70 alkol ve povidon iyot içeren üç dönüşüm döngüsü ile temizleyin.
- Makaslarla ventral torasik-inguinal bölge boyunca cilt boyunca 1.5 cm dikey kesi yapın ve ardından dönüşümlü olarak sağ ve sol 4. meme yağ pedlerini gösterin.
- Her yağ yastığını, bez parankimi makasla çıkartarak temizleyin. Yağ pedindeki lenf düğümünü bulun ve lenf düğümünün altındaki tüm bez parankimini çıkarın.
NOT: Yağ yastığının üçte ikisi yerde kalmalıdır. - Adım 7.2'den elde edilen hücreleri , doğal bir enzim karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız ) ile proteolitik a10 dakika boyunca kolajenolitik enzim aktivitesi. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
- Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bir hemositometre ile hücreleri sayın ve 15 μL istenen hücre dozu (10 4 -10 2 hücre / ped) içeren bir konsantrasyonda PBS hücreleri askıya alın.
- Bir meme epitel hücre süspansiyonu 15 mcL bir yağ yastığı içine bir 27G iğne bağlı bir 100 uL cam şırınga kullanarak enjekte edin.
- Diğer taraftaki yağ yastığı için 8.4-8.7 adımlarını tekrarlayın.
- Yara klipleri ile deriyi kapatın.
9. Meme Bezi Tüm Montaj
- Fareyi, hücre enjeksiyonundan 8 hafta sonra CO 2 artı servikal çıkığı ile euthanize edin (Adım 8.7).
- Göğüs bölgesinden kasık bölgesine makas kullanarak cilt katmanı üzerinden dikey bir kesi yapın ve ardından sağ ve sol 4. mAmmary yağ pedleri. 4. meme bezlerini çıkartın ( Şekil 2 ).
- Yağlı pedleri cam mikroskop lamları üzerine yayın ve gece boyunca oda sıcaklığında Kahle fiksatif (% 4 formaldehit,% 30 EtOH ve% 2 buzlu asetik asit) ile yağ yastıklarını sabitleyin.
Dikkat: Kahle fiksatif maddesi tahriş edicidir. Bu adımı kimyasal bir kaputta uygulayın. - Yağ pedlerini 250 mL% 70 EtOH içinde 15 dakika yıkayın ve sonra 250 mL dH20 ile 5 dakika yıkayın. Yağ pedlerini gece boyunca oda sıcaklığında karmine şapla (1 g araba atığı ve 2.5 g alüminyum potasyum sülfat içinde 500 mL dH20) lekeleyin.
- Yağ pedlerini 250 mL% 70 EtOH ile 15 dakika yıkayın, 250 mL 95% EtOH 15 dakika ve 250 mL% 100 EtOH ile 15 dakika yıkayın.
- Yağlı pedler gün boyunca ksilen içinde temizlenir ve yağ pedleri saydam hale geldiğinde ksilen inkübasyonunu durdururlar.
Dikkat: Ksilen tahriş edicidir. Bu adımı kimyasal bir kaputta uygulayın. - Slaytları monte edin(2,400 dpi) dijital bir slayt tarayıcısı kullanarak yağ yastıklarının alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PGE 2 / EP 4 sinyallemesinin engellenmesinin, meme bazal benzeri kök hücrelerden EV / exosome salınımını tetiklediği gösterildiğinden, bu çalışma, meme epitelyal bazal hücre (NAMEC) kültüründen indüklenen EV / eksosomların izole edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. NAMEC'ler serum içermeyen ortamda kültürlendiğinden, serum 13'den türetilmiş önceden EV / ekzosom bulunmamaktadır. Serum içeren ortamda kültürlenen hücreler için, EVs / eksosomların toplanması için kaynak hücrelerin kültürü için ortam kullanılmadan önce, ortamdaki önceden mevcut eksosomlar 110.000 xg'de ultra-santrifüj ile önceden temizlenmelidir. Şekil 1 ' de gösterildiği gibi, 4 günlük indüklenen NAMEC kıvamlandırmalı ortamdan EVs / eksosomlar, 110,000 xg peletten diferansiyel ultra-santrifüj ile izole edilebilir. 110.000 xg'lik pellin içindeki izole veziküllerin sayısı ve büyüklüğüNanopartikül izleme analizi (NTA) kullanılarak ölçülebilir. Diferansiyel ultrasantrifüj ile izole edilen 110.000 g pelet fraksiyonu esas olarak ~ 100 nm vesiküller içerir ( Şekil 4A ); Bu, literatürde bildirilen eksozomların (50 - 150 nm) boyutu ile uyumludur. Buna ek olarak, TEM analizi, 110.000 g NAMEC kıvamlandırılmış ortam fraksiyonlarının bol zar vesikülleri içerdiğini gösterdi ( Şekil 4B ). Diferansiyel ultrasantrifügasyon makul derecede saf eksosomlar üretse de, aşağıdaki yoğunlaştırma gradyan saflaştırma basamağı , kirletici maddeleri ( örneğin, protein agregaları) elimine eder. Yoğunluk gradyanında, ekzosomlar vesiküldeki lipid içeriğinden dolayı gradyanda yüzerlerken, protein agregaları, eğer varsa, degradenin altında kalır. Gradiyentin her fraksiyonu, eksozom üreticilerinin ( örn., CD81, CD63, CD9 ve TSG101) tespiti için toplanır , 7 ) Western blot ile belirlenir. Eksozom belirteçleri fraksiyonda ~% 20 iodiksanol ile tespit edilebilir ( Şekil 5 ). Eksozomları içeren fraksiyon PBS ile seyreltilebilir ve eksozomları izole etmek için 200,000 xg ultra-santrifüjleme tabi tutulabilir. İzole edilen exozom pelet bir kez PBS içinde yıkanır ve daha sonra PBS içerisinde yeniden süspanse edilir ve ileri analiz için -20 ° C'de saklanır.
NAMEC türevi EV'lerin / eksosomların, meme epitel hücrelerinin-HMLE hücrelerinin sap olmayan karşılığı olan parçası tarafından alınmasını ölçmeden önce, EVs / eksozomlar bir flüoresan boya ile ( örn., Karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE)) etiketlenmelidir. Sadece CFSE'yi içermekle birlikte EV / exosome içermeyen paralel bir örnek aynı etiketleme prosedüründe işlenir. Bu numune, aşağıdaki EV / eksosom toplama testinde kullanılan, negatif bir kontrol olup, iz kalmayan serbest CFS'nin etkisini yansıtmaktadırE boya. HMLE hücreleri, CFSE ile işaretlenmiş, NAMEC'den türetilmiş EVs / eksozomlar veya negatif kontrol ile 2-6 saat kültürlenir ve daha sonra akış sitometrisine tabi tutulur. Muamele edilmemiş HMLE hücreleriyle karşılaştırıldığında, negatif kontrol ile kültürlenen HMLE hücreleri, CFSE sinyalinin biraz daha yüksek bir seviyesini ifade eder ( Şekil 6A , kırmızı çizgi / turuncu çizgi), bu, CFSE sinyalinin arka plan seviyesini, EV / exosome etiketleme süreci. Dahası, negatif kontrol ile tedavi edilen HMLE hücreleriyle karşılaştırıldığında, CFSE etiketli NAMEC türevi eksozomlar ile kültürlenen HMLE hücreleri, özgül alımdan kaynaklanan, 10 kat daha yüksek bir CFSE sinyalini ( Şekil 6A , mavi çizgi ile kırmızı çizgi) ifade eder CFSE etiketli EV'lerin / eksosomların. CFSE etiketli NAMEC türevli EV'lerin / eksosomların HMLE hücreleri tarafından alınması konfokal mikroskopi ile de gözlemlenebilir. Negatif kontrol ile tedavi edilen HMLE hücreleri bir CFSE sinyali göstermezken, NA'nın alınmasıHMLE hücreleri tarafından MEC türevi EVs / eksozomlar, CFSE etiketli EV / exozome ile işlem gören hücrelerdeki konfokal mikroskop altında CFSE sinyali ile gözlemlenebilir ( Şekil 6B ).
NAMEC'den türeyen EV'lerin / eksozomların göğüs benzeri meme bazal hücrelerden meme luminal hücrelerine meme bezi oluşturma yeteneğini aktarabildiğini değerlendirmek için fare meme lüminal hücreleri farelerde meme bezi oluşumunun analizi için ilk izole edilir. Farenin meme epitel hücreleri, 12 haftalık farelerden izole edilmiştir. Meme bezleri küçük parçalara ayrılır ve ayrıca kollajenaz ve tripsin ile ayrılır. Ayrışmış epitel organoidleri ve fibroblastlar, 5.7 ve 5.8. Adımlarda anlatıldığı gibi diferansiyel santrifüj ile ayrılabilir. Santrifüjün her turunda, tüplerin altındaki pelet esas olarak epitelyal organoidler içermeli ve fibroblastlar ve tek hücreler süpernatanda yüzmelidirt. Diferansiyel santrifüj işleminden önce hem epitel organoitleri hem de fibroblastlar içeren karışım ( Şekil 3 , üst paneller) ile karşılaştırıldığında altı turlu santrifüjleme, karışımdaki fibroblastların ve tekli hücrelerin hepsini temizler ( Şekil 3 , alt panel).
Epitelyal organoidlerin meme epitel hücreleri ( Şekil 7 ), proteolitik ve kollajenolitik enzim aktivitesi olan doğal bir enzim karışımı kullanılarak daha da ayrılır ve süspansiyon halinde tek hücreler üretmek için disperse edilir. Tek hücreli süspansiyonun hücre yüzeyi CD49f ve EpCAM ile sınıflandırılması, meme lüminal hücrelerini (EpCAM hi / CD49f lo ), meme bazal hücrelerinden (EpCAM lo / CD49f hi ) ve epitel dışı hücreleri (EpCAM - ) ( Şek. 8 ).
hi / CD49f luminal meme epitel hücreleri, NAMEC türevli EV'ler / eksozomlarla 10 gün boyunca kültürlenir ve taze EV'ler / eksozomlar ve ortam her iki günde bir değiştirilir. EV / ekzosom tedavisinden sonra, meme luminal hücreleri farelerin 4. meme yastığı yastıklarına ( Şekil 2 ) implante edilir. 8 hafta sonra, yağ bezleri izole edilir ve meme bezi oluşumunun analizi için lekelenir ( Şekil 9 ). İndüklenmiş NAMEC türevli EV / ekzozomlarla yapılan muamele, luminal hücrelerin meme bezi oluşturma yeteneğini kazanmasına olanak tanır 4 . NAMEC'den türeyen, EV / exozom ile tedavi edilen meme luminal hücreleri, fare yağ yastıklarında meme bezlerini oluşturur ( Şekil 9 ).
Şekil 1: Ekstraselluların İllüstrasyonuDiferansiyel Ultrasantrifüjleme ile Hücre Kültürü Ortamından Vesikül / Eksozom Pürfiye Yöntemi. Her bir santrifüjün hızı ve uzunluğu gösterilir. İlk üç santrifüjden her birinden sonra, süpernatan bir sonraki aşamada tutulur. 110.000 × g santrifüje edildikten sonra, topaklar muhafaza edilir ve süpernatanlar atılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Fare Meme Bezi Anatomisi. Fare, derinin hemen altındaki yağ yastıklarında (kırmızı) bulunan 1-5 rakamlarıyla gösterilen beş çift meme bezine sahiptir. Th daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınızŞekildir.
Şekil 3: Diferansiyel santrifüj işleminden önce ve sonra epitel organoitleri ve yağ yastıkları hücrelerinin bir karışımının görüntüleri. Ayrık santrifüj işleminden önce ve sonra, izole edilmiş yağ-pedi hücre karışımlarının parlaklık görüntüleri hemositometreden alınmıştır. Ok uçları: epitelyal organoidler. Ok: fibroblastlar ve tek hücreler. Ölçek çubuğu = 0.5 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: NAMEC110,000 xg Pelet Fraksiyonunun Vesikül Boyutu ve Konsantrasyon Analizi. NAMEC ortamının 110.000 g pelet fraksiyonu kolon ( A ) nano parçacık izleme analizi (NTA) ve ( B ) transmisyon elektron mikroskobisine (TEM) tabi tutuldu. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Yoğunluk Derecesinin Kesirlerinde Eksozomların Saptanması. Ekzozom belirteçleri CD81, CD9, CD63 ve Tsg101 ve kat hizmetleri geni GAPDH'nin Western blot analizi, eksozomları içeren% 20 iodiksanol fraksiyonunu ortaya koymaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
55736fig6.jpg "/>
Şekil 6: Akış Sitometri ve Konfokal Mikroskopi ile Ekstraselüler Vesikül / Eksozom Alma Tespiti. EV / eksozom alımı HMLE hücrelerinde ölçülmüştür. Belirtilen kültürlere CFSE etiketli NAMEC türevli EVs / ekzozomlar ve negatif kontrol, 6 saat boyunca eklenir. İnkübasyondan sonra hücreler, ( A ) akış sitometrisi ve ( B ) konfokal mikroskopi. CFSE (yeşil; uyarılma / emisyon (nm): 492/517; mikroskop lazer çizgisi: 488) floresan yoğunlukları, EV / ekzozom alımı yansıtmaktadır. Hücre çekirdeği, DAPI (mavi; uyarılma / emisyon (nm): 358/461; mikroskop lazer hattı: 405) ile lekelenir ve plazma membranları, plazma membranı lekesi ile boyanır (kırmızı; uyarma / emisyon (nm): 649/666; Mikroskop lazer çizgisi: 633 , Malzeme Tablosuna bakınız ). Konfokal objektif lens: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Yağ. Ölçek çubuğu = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Ekli Epitelyal Organoidlerin Görüntüleri. Bağlanmış epitel organoidlerine göç eden ve büyüyen hücreler tarafından oluşturulan meme epitel hücrelerinin parlak görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 8: Yüzey EpCAM ve CD49f ile Birincil Fare Meme Epitelyal Hücrelerinin Sınıflandırılması. 12 haftalık farelerin yağ yastıklarından izole edilen fare meme epitel hücreleri, hücre sıralamasına tabi tutuluring. Fare meme luminal hücreleri, mavi daire ile işaretlenmiş EpCAM hi / CD49f popülasyonunda zenginleştirilmiştir; Bazal hücreler, kırmızı daire ile işaretlenmiş EpCAM lo / CD49f hizasında zenginleştirildi. Epitel dışı hücreler arsa içinde siyah kutu ile işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 9: Primer Fare Luminal Membran Hücreleri Tarafından Yapılan Meme Bezi Oluşumu. Birincil fare EpCAM hi / CD49f luminal hücreler 10 gün süreyle hücre kültüründe PBS veya NAMEC türevli EVs / ekzozomlar ile muamele edilir ve 3 haftalık farelerin temizlenmiş yağ pedlerine implante edilir. Fareler östrüs haline getirildi ve 8 hafta sonra nekropsiyone edilerek meme bezi formunun analizi yapıldıtirme. Ölçek çubuğu = 0.75 cm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Yüzde | EpCAM'ın MFI'si | CD49f'nin MFI | |
| Meme luminal hücresi | 0.437 | 4.57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| Meme bazal hücre | 0.09 | 5452 | 2.23 x 104 |
| (EpCAM lo / CD49f merhaba ) | |||
| Sigara epitelHücre (EpCAM - ) | 0.309 | 53 | 4619 |
Tablo 1: Şekil 8'de Açıklanan Nüfusların Yüzdesi ve Ortalama Floresans Yoğunluğu (MFI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan hücrelerin özelliklerini taşır ve salınan eksosom miktarı uyaranlar 4 tarafından indüklenebilir. Hücrelerin kültür ortamı toplanabilir ve EV / ekzosom toplamak için diferansiyel ultrasantrifüj işlemine tabi tutulur ( Şekil 1 ). Şu anda EV'leri / eksosomları izole etmek için ideal bir yöntem hakkında genel bir mutabakat yok. Burada kullanılan en uygun yöntem, aşağı yönlü uygulama 14 tarafından belirlenmiştir. Ultra santrifüj, EV'lerin / eksosomların biyolojik aktivitesini koruyabilen EV'lerin / eksosomların izolasyonu için oldukça hızlı bir yöntemdir. Bununla birlikte, ultra-santrifüj ile izole edilen veziküller, genellikle, endozomal kompartmanlar yoluyla üretilen eksozomları ve / veya hücre zarından tomurcuklanma yoluyla üretilen vezikülleri içeren bir EV karışımı içermektedir.
NTA ile vezikül boyutlarını analiz ederek ( Şekil 4A 15 .
Ayrı ultra-santrifüj, eksosomların saflaştırılması için kullanılabilmesine rağmen, 110.000 xg izole fraksiyon 5'deki ekzozom veziküllerden protein agregalarının kontaminasyonunu daha da kaldırmak için bir yoğunluk gradyanı kullanılmalıdır örn., CD81, CD63, CD9 ve TSG101 6 , 7 ). Derişim gradyanının fraksiyonlarında eksozom belirteçlerinin varlığını analiz ederek, fraksiyondaki eksozomları ~% 20 iodiksanol ile tanımlamak mümkündür ( Şekil 5 ). Her bir eksozom popülasyonu farklı eksozom belirteçleri 16 gösterebileceğinden yoğunluk gradyanındaki eksozomları belirlemek için çoklu eksosom belirteçleri incelenmelidir.
EVs / eksosomların hücreler tarafından alımı, flüoresan boya etiketli EV / eksosomlar kullanılarak ölçülebilir. Etiketli EV / ekzosomları yutan hücre sayısı, akış sitometrisi ile ölçülebilir ( Şekil 6A ). Fluo'nunHücrelerden gelen resensiyon, etiketli EV / eksosomların alınmasından kaynaklanır, ancak serbest boyadan kaynaklanmaz; floresan modeli mikroskopi kullanılarak hücrelerde incelenmiştir. Konfokal mikroskopi, EV / exosome ile muamele gören hücrelerdeki floresans modelinin punktat olduğunu gösterir ( Şekil 6B sağ panel). Noktalı sinyaller muhtemelen serbest flüoresandan değil etiketli EV / eksozomlardan kaynaklanır. Hücrelerdeki punktat sinyalleri, 85 nm 4 , 17'de en yüksek çözünürlüğe sahip yapılandırılmış aydınlatma süper-çözünürlük mikroskobu ile daha da analiz edilebilir. Süper-çözünürlüklü mikroskopi punktat sinyallerin ~ 100 nm'lik içi boş veziküllerden olup exozomes 4'e benzediğini doğrulayabilir. Bu sonuçlar, NAMEC türevi eksozomların kültürdeki meme epitel hücreleri tarafından emilebileceğini göstermektedir.
NAMEC'den türeyen EV / eksosomlar genellikle molekülleri taşır ( örn., Proteinler ve miRNA'lar) belirli hücrelerin özellikleri için gereklidir 1 . Bu, NAMEC'den türeyen EV'lerin / eksozomların NAMEC'lerin özelliklerini ( örneğin meme bezi oluşturma yeteneği) epitel hücre meslektaşlarına aktarabileceğini gösterir. İnsan meme epitel hücreleri, fare yağ pedleri 18 , 19'da xenogenically olarak meme bezleri oluşturamadığından, beze oluşturma yeteneğinin transferi fare primer meme epitel hücreleri kullanılarak incelenebilir. Memede bezleri oluşturmayan lomber hücreler olan fare primer meme EpCAM hi / CD49f, 6 haftalık farelerden izole edilebilir ( Şekil 7 ve Şekil 8 ). Fare yağ yastıklarından izole edilen hücreler, le (leptin hücrelerini inceleyerek) üç gruba ayrılabilir (EpCAM hi / CD49f lüminal hücreler, EpCAM lo / CD49f hi bazal hücreler ve EpCAM - epitelyal olmayan hücreler)Yüzey EpCAM ve CD49f ( Şekil 8 ). EpCAM lo / CD49f hi bazal hücreler, yağ yastıklarına nakledildiğinde yağ fadsında meme bezleri oluşturabilirler, ancak EpCAM hi / CD49f lüminal hücreler 4 olamaz. Dolayısıyla, EpCAM hi / CD49f luminal hücre popülasyonu, indüklenen NAMEC türevi EV / eksozomların meme bezi oluşturma yeteneğini aktarma yeteneğini incelemek için kullanılabilir. İzole edilmiş EpCAM hi / CD49f luminal hücreler, EV / exozom tedavisi için 7-10 gün süreyle kültürde muhafaza edilebilir. Primer meme epitel hücrelerinin daha uzun süre in vitro tutulmasının hücrelerin canlılığını zayıflatabileceği unutulmamalıdır.
EV / exozomayla tedavi edilen meme luminal hücreleri, meme bezi oluşturma yeteneğini analiz etmek için temizlenmiş yağ pedlerine implante edilebilir. İmplantasyon için kullanılan farelerin yağ yastıkları 3 haftalık yaşta temizlenmelidir. bir3 haftalıkken, meme epitel hücreleri bir yağ yastığının meme başı ve lenf bölgesi arasındaki bölgede tutulur. Bir yağ yastığındaki meme epiteli, 3 haftalıkken meme başı ve lenf arasındaki bölgeyi kaldırarak temizlenebilir. Memedeki luminal hücreler yağ pedini temizledikten hemen sonra implante edilir ve implante edilen hücrelerin bez oluşumu implantasyondan 8 hafta sonra analiz edilebilir. NAMEC türevli EV'lerin / eksozomların, meme lümen hücrelerine meme bezi oluşturma yeteneğini aktarma üzerindeki etkisi, luminal hücrelerin bezi oluşumu ve EV / exozom ile tedavi edilen lüminal hücreler tarafından değerlendirilebilir ( Şekil 9 ). NAMEC'lerden kaynaklanan EV / eksosomlar, meme bazal epitelyal hücrelerin özelliklerini taşırlar - bez oluşturma yeteneği - ve NAMEC'lerden indüklenen EV / ekzozomları yutan lüminal hücreler EV / exozomlar yoluyla NAMEC'lerden mülk elde edebilir. Bu çalışma, EV / eksozom-medyadan sorumlu moleküllerinEV / eksosomların lipid sallarında meme bezi oluşturma yeteneğinin tedir transferi mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Araştırma Enstitülerinden (05A1-CSPP16-014, HJL) ve Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL) hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
