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Developmental Biology

स्तनधारी बेसल एपिथेलियल सेल और एक्सट्रासेल्युलर विसल्स / एक्स्सोमों के माध्यम से स्तनपायी कोशिकाओं के बीच स्तन-ग्रंथ बनाने की योग्यता का स्थानांतरण

Published: June 3, 2017 doi: 10.3791/55736
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Cellular and System Medicine, National Health Research Institutes
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल गैर-पक्षपाती / मेसेनचिमल स्तनपेशी कोशिकाओं से बाह्य कोशिकाओं (ईवीएस) / एक्सओसोम को शुद्धि, मात्रात्मक और वर्णित करने के तरीकों के लिए विधियों का वर्णन करता है और उन्हें लाइमनल स्तन संबंधी उपकला कोशिकाओं के लिए स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता का हस्तांतरण करने के लिए उपयोग किया जाता है। स्टेम-जैसे स्तन उपकला कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस / एक्ज़ोसोम इस सेल प्रॉपर्टी को कोशिकाओं में स्थानांतरित कर सकते हैं जो ईवी / एक्ज़ोमोस को ग्रहण करते हैं।

Abstract

कोशिका एक्सओसोम्स के माध्यम से संवाद कर सकती है, ~ 100 एनएम बाह्य कोशिकाएं (ईवीएस) जिसमें प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड होते हैं। गैर-पक्षपाती / मेसेनचिमल स्तन संबंधी उपकला कोशिका (NAMEC) -निर्धारित बाह्य कोशिकाएं NAMEC माध्यम से अलग-अलग अल्ट्रैंट्रीफ्यूगेशन के माध्यम से अलग की जा सकती हैं। उनके घनत्व के आधार पर, ईयूवी को अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन के माध्यम से 110,000 x ग्रा पर शुद्ध किया जा सकता है। घुलनशील प्रोटीन के साथ प्रदूषण को रोकने के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन से EV तैयारी को एक सतत घनत्व ढाल का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। शुद्ध ईवीएस को नैनोपेचरल-ट्रैकिंग विश्लेषण का उपयोग करके इसके आगे मूल्यांकन किया जा सकता है, जो तैयारी में आकार और पुतली की संख्या को मापता है। 50 से 150 एनएम तक के आकार के बाह्य कोशिकाएं एक्सोसोम हैं। NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोजोम को स्तन उपकला कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है, जिसे प्रवाह कोशिकामितीय और confocal microscopy द्वारा मापा जा सकता है। कुछ स्तन स्टेम सेल गुण ( जैसे, स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता) कर सकते हैंNAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसोम के माध्यम से स्टेम-जैसे NAMEC से स्तन उपकला कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। पृथक प्राथमिक EpCAM हाय / सीडी 4 9 एफ ओ लोमिनल स्तन उपकला कोशिकाएं माउस वेट पैड में प्रत्यारोपित होने के बाद स्तन ग्रंथियों का निर्माण नहीं कर सकती हैं, जबकि एपिकाम लो / सीडी 4 9 एफ हाय बेसल स्तन उपकला कोशिकाएं प्रत्यारोपण के बाद स्तन ग्रंथियों का निर्माण करती हैं। एपीसीएएम हाई / सीडी 4 9 एफ ओ लूमिनल स्तन उपकला कोशिकाओं के द्वारा NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सओसोम का उपयोग करने से उन्हें वसा पैड में प्रत्यारोपित होने के बाद स्तन ग्रंथियां उत्पन्न करने की अनुमति मिलती है। स्टेम-जैसी स्तन उत्थान कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस / एक्सोसोम एपैकैम हाय / सीडी 4 9 एफ एल लाइमनल स्तन उपकला कोशिकाओं को स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता को हस्तांतरित करते हैं।

Introduction

एक्सओसोम कोशिकाओं 1 के बीच झिल्ली और साइटोसोलिक प्रोटीन, लिपिड, और आरएनए स्थानांतरित करके सेलुलर संचार की मध्यस्थता कर सकते हैं एक्सोसोम-मध्यस्थता संचार कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं ( यानी, प्रतिजन प्रस्तुति, सहिष्णुता 2 के विकास , और ट्यूमर प्रगति 3 ) में शामिल होने का प्रदर्शन किया गया है। एक्सओसोम अक्सर उन स्रोत कोशिकाओं के समान सामग्री होते हैं जो उन्हें रिहा कर देते हैं। इस प्रकार, एक्सओसोम स्रोत कोशिकाओं से विशिष्ट कोशिका गुण ले सकते हैं और इन गुणों को उन कोशिकाओं को स्थानांतरित कर सकते हैं जो उन्हें 4 सेवन करते हैं।

Exosomes हैं 50- 150 एनएम डबल परत झिल्ली vesicles और वर्तमान विशिष्ट मार्करों ( उदाहरण के लिए , सीडी 9, सीडी 81, सीडी 63, एचएसपी70, एलिकिक्स, और टीएसजी 101)। इस प्रकार, अलग-अलग पहलुओं के लिए एक्सोसोम विभिन्न तरीकों से विशेषता होना चाहिए। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी झिल्ली vesicles कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैजैसे एक्सओसोम 4 , 5 नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) और गतिशील प्रकाश बिखरने विश्लेषण (डीएलएस) आकार और शुद्ध एक्सओसोम 4 की संख्या को मापने के लिए उपयोग किया जाता है। एक्ससोमों की लिपिड झिल्ली सामग्री को घनत्व ढाल द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। Exosomal मार्करों, जैसे सीडी 9, सीडी 81, सीडी 63, एचएसपी70, एलिकिक्स, और टीएसजी 1 99 6 , 7 , पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा मापा जा सकता है।

स्तनधारी बेसल कोशिकाओं में वसा पैड में प्रत्यारोपित होने पर स्तन ग्रंथियों को उत्पन्न करने की क्षमता होती है, जबकि ल्यूमनल कोशिका 8 , 9 , 10 नहीं हो सकती । इस प्रकार, स्तनधारी बेसल कोशिकाओं को स्तन पुनर्स्थापना इकाइयों के रूप में भी जाना जाता है। स्तनधारी बेसल और ल्यूमिनिकल कोशिकाओं के मॉडल का उपयोग करके, विभिन्न सेल आबादी के बीच कोशिका विशेषताओं को स्थानांतरित करने के लिए ईवीएस / एक्स्सोम की क्षमता की जांच की जा सकती है। इस कामस्तनधारी बेसल उपकला कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस / एक्सोसॉम्स का उपयोग करके स्तनल बेसल उपकला कोशिकाओं से स्तनमय ल्यूमनल उपकला कोशिकाओं में ग्रंथि बनाने की क्षमता को स्थानांतरित करने की विधि को दर्शाता है। फुफ्फुस स्तन उपकला कोशिकाओं ने मूल कोशिकाओं से गुप्त ईसी / एक्ज़ोमोम्स के घूस के बाद मूल कोशिका गुणों को प्राप्त किया और फिर स्तन ग्रंथि 4 बना सकते हैं ।

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Protocol

जानवरों की देखभाल पर संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ पालन किए गए सभी शोध

1. बाह्य कोशिका / एक्सओसोम अलगाव और मान्यता

  1. संस्कृति स्तन उपकला बेसल कोशिकाओं, नाम 4 सीसीएम, 500 एमएल एमसीडीबी 170, पीएच 7.4 + 500 एमएल डीएमईएम / एफ 12 से सोडियम बाइकार्बोनेट (0.2438%) के साथ ताजा, सीरम मुक्त माध्यम से बनाया गया; ईजीएफ (5 एनजी / एमएल); हाइड्रोकार्सिटोन (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल); इंसुलिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल); बोवाइन पिट्यूटरी निकालने (बीपीई; 35 μg / एमएल); और 15 सेमी बर्तन में जीडब्ल्यू 627368 एक्स (1 माइक्रोग्राम / एमएल)।
  2. एक हेमोसाइटेटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गिनती के बाद, 12 दिनों में 12 मिलीलीटर प्रति बीज 15 सेंटीमीटर डिश में 4 दिन 4 के लिए 1.2 x 10 6 कोशिकाओं।
  3. संस्कृति में 4 दिनों के बाद, संस्कृति के माध्यम से 300 मील की दूरी पर संस्कृति के माध्यम से 5 मिनट के लिए एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करें। एक शंक्वाकार ट्यूब ( चित्रा 1 ) पर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  4. सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्रटेबल टॉप अपकेंद्रित्र में 20 मिनट के लिए 2,000 xg सतह पर तैरनेवाला को एक अल्ट्रासेंट्र्यूज ट्यूब में ट्रांसफर कर दें और मृत कोशिकाओं और सेल मलबे को छोड़ दें ( चित्रा 1 )।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 xg पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला को एक नया अल्ट्रेंट्रिव्यूज ट्यूब ( चित्रा 1 ) में स्थानांतरित करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला को 110,000 xg पर 60 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस तक अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस ( चित्रा 1 ) में EV / एक्सओसोम गोली resuspend।
  7. सतह पर तैरनेवाला को 110,000 xg पर 60 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस तक अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें पीबीएस ( चित्रा 1 ) में ईवी / एक्स्सोम गोली को फिर से खोलें। 100 μL में 240-480 एमएल के नाइटसी-कंडीशियल माध्यम से पृथक गोली को फिर से खोलें।
  8. BCA प्रोटीन परख के साथ EV निलंबन के प्रोटीन एकाग्रता को मापें सुनिश्चित करें कि एकाग्रता लगभग 20-40 μg / 100 μL है। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करेंआगे के विश्लेषण।
  9. नैनोपैतिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) द्वारा ईवीएस / एक्सओसोम्स की एकाग्रता और आकार को मापें, जैसा कि गार्डिनर एट अल द्वारा पहले वर्णित है 11 पीबीएस के साथ एनटीए विश्लेषण के लिए 10,000 गुना ईवी / एक्सोजोम (20 माइक्रोग्राम / 100 μL) पतला।
    नोट: एनटीए विश्लेषण का परिणाम विश्लेषित vesicles की संख्या और आकार को दर्शाता है।
  10. इमेज प्रोसेसइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के साथ ईवीएस / एक्सओसोम, जैसा कि लिन एट अल 4 द्वारा पहले वर्णित है।

2. घनत्व ढाल का प्रयोग करके एक्सोसोम शुद्धि

  1. पीबीएस (2 एमएल) में 40% (डब्ल्यू / वी) आयोडिक्सानॉल में स्टेप 1.7 से 110,000 ग्राम गोली को फिर से खोलें। अतिव्यापी ट्यूब में घनत्व ढाल बनाने के लिए पीबीएस (2 एमएल प्रत्येक) में 30%, 20%, 10%, और 5% (डब्ल्यू / वी) आयोडिक्सानॉल के अनुक्रम में मिश्रण को ओवरले मिलाएं।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए 200,000 xg पर मिश्रण को अपकेंद्रित्र
  3. प्रत्येक ढाल अंश को जमा करें (10 फ्रेक्टिऑन; 1 एमएल / अंश) ट्यूब के शीर्ष से एक विंदुक के साथ।
  4. एसडीएस पृष्ठ 12 और पश्चिमी ब्लॉट द्वारा प्रत्येक अंश में एक्सओसोम मार्कर्स ( जैसे, सीडी 81, सीडी 9, सीडी 663 और टीएसएस -101) की उपस्थिति का विश्लेषण करें। प्रत्येक अंश के 50-μL निलंबन को 0.1% (डब्लू / वी) एसडीएस युक्त 10% जेल पर और जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ भिन्न भागों में प्रोटीन को अलग करें।
  5. एक जेल से पीवीडीएफ झिल्ली तक प्रोटीन ट्रांसफर करें और एक्सोसोम मार्कर ( उदाहरण के लिए, सीडी 81, सीडी 9, सीडी 663, और टीएसएस -101) और एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (सामग्री की सारणी ) पर घर की देखभाल प्रोटीन जीएपीडीएच से बचा लें ।
    नोट: परिणाम एक्सओसमों वाले अंश की पहचान करता है।

3. बाह्य कोशिका / एक्सज़ोम लेबलिंग

  1. 20 माइक्रोग्राम एक्ससोमल प्रोटीन / 100 μL में 10 माइक्रोग्राम कार्बोक्सीफ्लोरेससेन सुक्विनिमिडिल डायसेटेट एस्टर (सीएफएसई) में कदम 1.7 में प्राप्त ईवीएस / एक्सोसॉम्स को निलंबित करें। एक समानांतर नमूना सह तैयार करेंकेवल सीएफएसई और पीबीएस, उसी तरीके से संसाधित, बाद में ईवी / एक्सओसोम एटटेक एशेज के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण छोड़ दें
  2. पीबीएस के 50x मात्रा में ईवीएस / एक्सओसोम्स को निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 110,000 xg पर निलंबन को अपकेंद्रित करें सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस में ईवी / एक्ससोम गोली resuspend। चरण 3.2 को एक बार दोहराएं।
  3. पीबीएस में एक्ससीओमल प्रोटीन / 100 μL की एकाग्रता में ईबीएस / एक्सओसोम्स को निलंबित करना और फिर कोशिकाओं को ईवीएस / एक्ज़ोमोम जोड़ने से पहले ईवीएस / एक्सओसोम को 0.22 माइक्रमेन्ट मेम्ब्रेन के माध्यम से फिल्टर करना चाहिए।

4. एक्स्टोम्युलर फोंसिक / एक्सोसोम अपटेक परख

  1. संस्कृति माध्यम बनाने के लिए, 500 एमएल एमसीडीबी 170, पीएच 7.4 + 500 एमएल डीएमईएम / एफ 12 को सोडियम बाइकार्बोनेट (0.2438%) के साथ मिलाएं; ईजीएफ (5 एनजी / एमएल); हाइड्रोकार्सिटोन (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल); इंसुलिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल); और बीपीई (35 μg / एमएल) 4 6-अच्छी तरह से व्यंजनों में मानव स्तन उपकला एचएमएलई कोशिकाओं को प्लेट (1 x 10 6 </ Sup> कोशिकाओं / अच्छी तरह से) EV / exosome उपचार से एक दिन पहले चरण 2 में प्राप्त 2 μg / mL सीएफएसई प्रतिदीप्ति-लेबल ईवीएस / एक्सओसोम, 2-6 घंटे के लिए एचएमएलई कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम के लिए जोड़ें। समान नियंत्रण के साथ नकारात्मक नियंत्रण समूह के एचएमएलई कोशिकाओं का इलाज, चरण 3.1 में वर्णित है।
  2. 2 से 6 घंटे के ऊष्मायन के बाद, कमरे के तापमान पर पीबीएस के 4 एमएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  3. 10 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करें और पीबीएस में कोशिकाओं को 0.2% FBS युक्त निलंबन दें। एक प्रतिदीप्ति सेल विश्लेषक 4 का उपयोग करके कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता से ईवी / एक्सओसोम तेज उपाय इमेज / एक्सोसॉम्स या कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रण वाली कोशिकाओं की छवि।
    नोट: कोशिकाओं में हरे रंग की प्रतिदीप्ति EV / एक्सओसोम तेज की वजह से होती है सूक्ष्मदर्शी सेटिंग्स के लिए चित्रा 6 की कथा देखें।

5. प्राथमिक माउस स्तन उपकला कोशिकाओं के अलगाव

  1. 12 सप्ताह की कुंवारी महिला सी 57 बीएल / 6 चूहों की संख्या 2, 3, 4, और 5 स्तन ग्रंथियों ( चित्रा 2 ) को कांच का उपयोग करके और एक रेजर का उपयोग करके छोटे टुकड़ों (2 मिमी 2 ) में ग्रंथियों का काट लें।
  2. इसके अलावा स्तन कैंसर (10 चूहों से) 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए, 50 एमएल डीएमईएम / एफ 12 युक्त 0.2% कोलेजनज़ प्रकार IV, 0.2% ट्रिप्सिन, 5% एफबीएस, 5 माइक्रोग्राम / एमएल गेरमाइसीन के साथ घूमना। , और 1x पेन- strep
  3. 10 मिनट के लिए 350 xg पर सेंटीफ्यूगेशन द्वारा मिश्रण से उपकलागत आर्गोगोइड नीचे गोली।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1 एमजी / एमएल डीएनस आई के साथ 4 एमएल डीएमईएम / एफ 12 में एपिथेलियल ऑ organoids निलंबित करें। फाइनल में 6 एमएल का डीएमईएम / एफ 12 जोड़ें10 एमएल की मात्रा
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 400 एक्सजी पर निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. 10 एमएल डीएमईएम / एफ 12 में गोली को फिर से खोलें निलंबन अपकेंद्रित्र, लेकिन जब गति 400 एक्स जी तक पहुंच जाता है तो ब्रेक को हिला सतह पर तैरनेवाला त्यागें
    नोट: ब्रेक को मारकर, उपकलागत आर्गोइड्स को जल्दी से पेलेट किया जाता है, जबकि फाइब्रोब्लास्ट्स, एकल कोशिकाओं के रूप में, फिर भी सतह पर तैरने वाले में रहते हैं।
  7. चरण 5.6 और 5.7 5-7 बार दोहराएं। एक हेमोसिटामीटर के लिए निलंबन की एक बूंद जोड़ें और फिर केंद्र के प्रत्येक दौर के बाद ( चित्रा 3 ) माइक्रोस्कोपी के तहत organoid मिश्रण से फाइब्रोब्लास्टों की निकासी की जांच करें।
  8. डीएमईएम / एफ 12 युक्त 1x आईटीएस, 5% एफबीएस, 50 माइक्रोग्राम / एमएल लैजमेंसीन, 10 एनजी / एमएल ईजीएफ, और 1 एक्स पेन-एसआरपी युक्त 48 घंटे के लिए जेलेटिन-लेपित डिश में गैलेटीन-लेपित डिश में प्लेट को मिला।
  9. 48 घंटे के बाद, एफबीएस के बिना ताजी संस्कृति के माध्यम के माध्यम से मध्यम स्थानांतरित करके संस्कृति में फ्लोटिंग सेल हटा दें (डीएमईएम / एफ 12 युक्त 1x आईटीएस, 50 माइग्राम / एमएल जेनामाइसीन, 10 एनजी / एमएल ईजीएफ, और 1x पेन-एसआरपी)।
  10. पुष्टि करें कि स्तन उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलाययर 3 दिनों में जुड़ा हुआ उपकला प्राणियों से बाहर निकलता है और बढ़ता है।

6. प्राथमिक माउस बेसल / ल्यूमनल स्तन उपकला कोशिकाओं का पृथक्करण

  1. 3-दिवसीय संस्कृति के बाद, 20 मिनट के लिए प्रोटीयोलायटिक और कोलेजनोलिटिक एंजाइम गतिविधि के साथ एक प्राकृतिक एंजाइम मिश्रण के साथ माउस प्राथमिक स्तन कोशिकाओं को अलग करें पीबीएस में 5% एफबीएस के साथ एंजाइम गतिविधि को बेअसर करना
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 एक्सजी पर निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 20 मिनट के लिए 5 मिलीग्राम / एमएल डिस्पले में सेल गोली को फिर से खोलें पीबीएस में 5% एफबीएस के साथ एंजाइम गतिविधि को बेअसर करना
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 एक्सजी पर निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. 100 μL पीबीएस में 0.2% FBS के साथ 10 7 सेल / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं को दुबारा निलंबित कर दिया गयाअंधेरे में 1 घंटे के लिए बर्फ पर एंटी-सीडी 4 9 एफ और एंटी-एपीसीएएम एंटीबॉडी।
  5. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी वाली कोशिकाओं को सेते हैं।
  6. 0.2% एफबीएस के साथ पीबीएस में कोशिकाओं को धोएं और पुनः निलंबित करें।
  7. सेल सेलर 4 पर EpCAM hi / CD49f लो लोमिकल स्तन उपकला कोशिकाओं को सॉर्ट करें।

7. बाह्य कोशिका / एक्ससोम उपचार

  1. जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी तरह से व्यंजन (2 x 10 5 कोशिका / अच्छी तरह से) पर कदम 6.7 से सॉर्ट किए गए एपकाम हाय / सीडी 4 9 एफ लोमनल स्तन उपकला कोशिकाओं को बीज दें और फिर उन्हें पीबीएस या 2 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ इलाज करें NAMEC-derived EV / exosomes चरण 1.7 में प्राप्त
  2. लंबे समय तक संस्कृति के उपचार में ईवी / एक्सओसम के जैविक प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, सेल संस्कृति माध्यम को पीबीएस युक्त ताजा मध्यम या 2 μg / mL NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोजोम हर दो दिन के साथ बदलें। माउस प्राइमा को विभाजित न करें10-दिवसीय उपचार के दौरान रेमी ल्यूमिनिक कोशिकाएं।

8. स्तन उपकला कोशिकाओं के फैट पैड इंजेक्शन

  1. आइसोफ़्लोरन के साथ 3-सप्ताह की महिला सी 57 बीएल / 6 चूहों को एनेस्थेटेज़ करें, 2-3% इन्हेलेंट।
  2. अपने पीठ पर anesthetized माउस प्लेस रेजर / बाल क्रीम के साथ मध्य पेट पर फर निकालें और सर्जरी साइट को 70% शराब और पॉवीडोन-आयोडीन के तीन वैकल्पिक चक्रों के साथ साफ़ करें।
  3. कैंची के साथ वेंट्रल थोरैसिक-इनग्रेनल क्षेत्र में त्वचा के माध्यम से एक 1.5 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं और उसके बाद बारी-बारी से दाएं और बाएं 4 वें स्तन वसा वाले पैड का पर्दाफाश करें।
  4. कैंची के साथ ग्रंथि पैरेन्काइमा को हटाने के द्वारा प्रत्येक वसा पैड को साफ़ करें। लसीका नोड को वसा पैड में खोजें और फिर लिम्फ नोड के नीचे पूरे ग्रंथि पैरेन्काइमा को हटा दें।
    नोट: वसा पैड के दो-तिहाई जगह पर बने रहना चाहिए।
  5. चरण 7 से एक प्राकृतिक एंजाइम मिश्रण (सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्राप्त कोशिकाओं को अलग करें, जिसमें एक प्रोटियोलेटीक ए के साथ होता है10 मिनट के लिए एनडी कोलेजनोलिटिक एंजाइम गतिविधि पीबीएस में 5% एफबीएस के साथ एंजाइम गतिविधि को बेअसर करना
  6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 450 एक्सजी पर निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एक हेमोसाइटेटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें और पीबीएस में एक एकाग्रता में कोशिकाओं को निलंबित करें जैसे कि 15 μL में वांछित सेल खुराक (10 4 -10 2 सेल / पैड) होता है।
  7. एक 27 जी सुई से जुड़ी 100 μL कांच सिरिंज का उपयोग करके वसा पैड में स्तन उपकला सेल निलंबन के 15 μL इंजेक्षन करें।
  8. दूसरी तरफ वसा पैड के लिए चरण 8.4-8.7 दोहराएं।
  9. घाव क्लिप के साथ त्वचा को बंद करें

9. स्तन ग्रैंड पूरे माउंट

  1. सेल इंजेक्शन (चरण 8.7) के बाद 8 सप्ताह में सीओ 2 प्लस ग्रीवा अव्यवस्था के साथ माउस को कुचलना।
  2. छाती का उपयोग करके छाती के क्षेत्र से त्वचा की परत के माध्यम से ऊर्ध्वाधर चीरा करें और कैंची का उपयोग करते हुए फिर दायें और बाएं दोनों का खुलासा करें।एमीरी वसा पैड 4 वें स्तन ग्रंथि निकालें ( चित्रा 2 )।
  3. गिलास सूक्ष्मदर्शी स्लाइड्स पर वसा पैरों को फैलाने और रात भर में कमरे के तापमान पर केहेल के लगाने वाले (4% फॉर्मलाडिहाइड, 30% एटॉह और 2% ग्लैसियल एसिटिक एसिड) के साथ वसा पैड को ठीक करें।
    सावधानी: कहेल का लगानेवाला एक परेशानी है एक रासायनिक हुड में यह कदम निष्पादित करें
  4. 15 मिनट के लिए 250 एमएल 70% एटोओएच और फिर 5 मिनट में 250 एमएल डीएच 2 ओ में वसा पैड धो लें। कमरे के तापमान पर रात भर में कारमेन एलियम (कारमिन की 1 ग्राम और 500 एमएल डीएच 2 ओ में एल्यूमीनियम पोटेशियम सल्फेट की 2.5 ग्राम) के साथ वसा पैड दाग़ें।
  5. 15 मिनट के लिए 250 एमएल 70% एटोओएच, 15 मिनट के लिए 250 एमएल का 95% एटओएच, और 15 मिनट के लिए 250 एमएल का 100% एटओएच धो लें।
  6. दिन के लिए एक्सलीन में वसा पैड को साफ करें और जब वसा पैड पारदर्शी हो जाते हैं, तब एक्सलीन के ऊष्मायन को रोकें।
    सावधानी: ज़ीलीन एक अड़चन है एक रासायनिक हुड में यह कदम निष्पादित करें
  7. स्लाइड्स वाई माउंट करेंवें बढ़ते हुए माध्यम और एक डिजिटल स्लाइड स्कैनर का प्रयोग करके वसा पैड के चित्र (2,400 डीपीआई) लेते हैं।

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Representative Results

चूंकि यह दिखाया गया है कि पीजीई 2 / ईपी 4 सिग्नल को अवरुद्ध करने से स्तनधारी बेसल जैसी स्टेम कोशिकाओं 4 से ईवी / एक्सओमोम रिलीज हो जाती है, यह काम स्तन उपकला बेसल सेल (एनआईडीसी) संस्कृति से प्रेरित ईवीएस / एक्सोसॉम्स को अलग करने की एक विधि प्रस्तुत करता है। चूंकि NAMECs सीरम-मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत हैं, इसलिए सीरम 13 से प्राप्त कोई पूर्व-मौजूद ईवीएस / एक्सोसॉम्स नहीं हैं। सीरम युक्त माध्यमों में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए मध्यम में पहले से मौजूद एक्सोसोम को पूर्व में 110,000 XG पर पूर्व में साफ किया जाना चाहिए, इससे पहले कि ईवीएस / एक्सोसोम्स 5 के संग्रह के लिए माध्यम के उपयोग के लिए स्रोत का प्रयोग किया जाता है। 4 दिवसीय प्रेरित NAMEC- वातानुकूलित माध्यम से ईवीएस / एक्ज़ोमोम्स को 1, 110,000 xg गोली से अलग-अलग अंतरण द्वारा पृथक किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है । 110,000 xg पेल में अलग-अलग vesicles की संख्या और आकारए और नैनोपैर्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग करके मापा जा सकता है। 110,000-जी गोली अंश विभेदकारी अल्ट्रेंट्रिफ्यूजेशन द्वारा अलग-अलग होता है जिसमें मुख्य रूप से ~ 100 एनएम vesicles ( चित्रा 4 ए ) शामिल हैं; यह साहित्य में रिपोर्ट किए गए एक्सओसोम्स (50 - 150 एनएम) के आकार से मेल खाती है। इसके अलावा, मंदिर विश्लेषण से पता चला है कि NAMEC- वातानुकूलित माध्यम के 110,000 जी अंशों में प्रचुर मात्रा में झिल्ली वाले vesicles ( चित्रा 4 बी ) होते हैं हालांकि अंतर अल्ट्रेंटर्रिफ्यूजेशन यथोचित शुद्ध exosomes उत्पन्न कर सकते हैं, एक घनत्व ढाल का उपयोग कर निम्नलिखित शुद्धिकरण कदम आगे contaminants ( जैसे, प्रोटीन समुच्चय) 5 समाप्त । घनत्व ढाल में, पुंजिका में लिपिड सामग्री की वजह से एक्सओसोम ढाल में तैरता है, जबकि प्रोटीन समुच्चय, यदि कोई हो, तो ढाल के नीचे रहें। एक्सोसोम निर्माताओं ( जैसे, सीडी 81, सीडी 663, सीडी 9 और टीएसजी 101) की पहचान के लिए ढाल का प्रत्येक अंश एकत्र किया जाता है , 7 ) पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा एक्ज़ोमोम मार्कर को ~ 20% आयोडिक्सानॉल ( चित्रा 5 ) के साथ अंश में पता लगाया जा सकता है। एक्सओसम्स युक्त अंश को पीबीएस के साथ पतला किया जा सकता है और एक्सोजोम को अलग करने के लिए 200,000 XG ultracentrifugation के अधीन किया जा सकता है। पृथक एक्सओसोम गोली पीबीएस में एक बार धोया जाती है और फिर पीबीएस में पुन: पेश की जाती है और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

स्तन उपकला कोशिकाओं- एचएमएलई कोशिकाओं के गैर-स्टेम समकक्ष द्वारा NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सओसोम की तेजता को मापने से पहले- ईवीएस / एक्सोसॉम्स को फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया जाना चाहिए ( जैसे, कार्बोक्सीफ्लोरेससेसेन सुक्किनिमिड एस्टर (सीएफएसई))। एक समानांतर नमूना जिसमें केवल सीएफएसई है लेकिन कोई भी EV / एक्सओसोम एक ही लेबलिंग प्रक्रिया में संसाधित नहीं है यह नमूना एक निगमित नियंत्रण है जिसे निम्नलिखित ईवी / एक्सओसोम अपटैक परख में प्रयोग किया जाता है ताकि अवशिष्ट मुक्त सीएफएसई डाई एचएमएलई कोशिकाओं को सीएफएसई लेबल वाले, एनओएससी-व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसोम या 2-6 घंटे के लिए नकारात्मक नियंत्रण के साथ सुसंस्कृत किया जाता है और तब प्रवाह कोशिकामीमिति के अधीन होता है। अनुपचारित एचएमएलई कोशिकाओं की तुलना में, एचएमएलई कोशिकाओं ने नकारात्मक नियंत्रण से सुसंस्कृत CFSE सिग्नल ( चित्रा 6 ए , लाल रेखा बनाम नारंगी रेखा) का एक थोड़ा उच्च स्तर व्यक्त किया है, जो सीएफएसई संकेत के पृष्ठभूमि स्तर को अवशिष्ट मुक्त CFSE की वजह से बचाता है। ईवी / एक्सओसोम लेबलिंग प्रक्रिया इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण-एचएमईएल कोशिकाओं की तुलना में, एचएमएलई कोशिकाओं को सीएफएसई-लेबल के साथ सुसंस्कृत किया जाता है, NAMEC- व्युत्पन्न एक्सोसोम एक 10-गुना उच्च CFSE सिग्नल ( चित्रा 6 ए , लाल रेखा बनाम लाल रेखा) को व्यक्त करता है, जो विशिष्ट तेज से निकलता है सीएफएसई-लेबल ईवीएस / एक्सोसोम का एचएमएलई कोशिकाओं द्वारा सीएफएसई-लेबल किए गए, एनओडीसी-व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसॉम्स की तेजता को confocal microscopy द्वारा भी देखा जा सकता है। जबकि नकारात्मक नियंत्रण-इलाज एचएमएलई कोशिकाओं ने एक सीएफएसई संकेत प्रदर्शित नहीं किया, एनए की तेजताएचएमएलई कोशिकाओं द्वारा एमईसी-व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसोम सीएफएसई-लेबल ईवी / एक्ससोम-ट्रीटिंग सेल ( चित्रा 6 बी ) में confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत CFSE संकेत के साथ मनाया जा सकता है।

यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या NAMEC- व्युत्पन्न ईवी / एक्सोसोम स्टेम-जैसी स्तनधारी बेसल कोशिकाओं से स्तनमय ल्यूमिनल कोशिकाओं में स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता को स्थानांतरित कर सकते हैं, चूहे में स्तन ग्रंथि के गठन के विश्लेषण के लिए माउथ माउस लैमिनल कोशिका पहले पृथक हैं। माउस स्तन उपकला कोशिकाओं 12 सप्ताह पुराने चूहों से अलग कर रहे हैं। स्तन ग्रंथियों को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है और कोलेजनज़ और ट्रिप्सिन के साथ अलग हो जाते हैं। अलग-अलग उपकलागत आयोजोइड्स और फाइब्रोब्लास्ट्स को अलग-अलग अंतर से अलग किया जा सकता है, जैसा कि 5.7 और 5.8 के चरणों में वर्णित है। सेंट्रीफ्यूगेशन के प्रत्येक दौर में, ट्यूबों के नीचे स्थित गोली में मुख्य रूप से उपकलागत आर्गोइड्स होते हैं, और फाइब्रोब्लास्ट्स और एकल कोशिकाओं को सुपरनेटैन में फ्लोट करना चाहिएटी। विभेदक केन्द्रापूर्णता ( चित्रा 3 , ऊपरी पैनल) से पहले उपकलागत इनोगोइड्स और फाइब्रोब्लास्ट दोनों युक्त मिश्रण के मुकाबले, केन्द्रापसारक के छह दौर में मिश्रण में सबसे अधिक फाइब्रोब्लास्ट्स और एकल कोशिकाओं को स्पष्ट किया गया है ( चित्रा 3 , नीचे पैनल)।

उपकलागत आर्गोएड के स्तन उपकला कोशिकाओं ( चित्रा 7 ) को एक प्राकृतिक एंजाइम मिश्रण का उपयोग करके प्रोटीलाइटीक और कोलेजनोलिटिक एंजाइम गतिविधि के साथ अलग कर दिया जाता है और निलंबन में एकल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रेषित किया जाता है। कोशिका की सतह सीडी 4 9 एफ और एपीसीएएम की अभिव्यक्ति द्वारा सिंगल सेल निलंबन को सॉर्ट करना, स्तनमय ल्यूमनल कोशिकाओं (एपीसीएएम हाय / सीडी 4 9 एफ लो ), स्तनधारी बेसल कोशिकाएं (एपीसीएएम लो / सीडी 4 9 एफ हाय ), और गैर-उपकला कोशिकाओं (एपीसीएएम - ) ( चित्रा 8 )

वें स्तन वसा पैड ( चित्रा 2 ) में प्रत्यारोपित की जाती हैं। 8 सप्ताह के बाद, स्तन ग्रंथि गठन ( चित्रा 9 ) के विश्लेषण के लिए वसा पैड अलग और दाग रहे हैं। प्रेरित NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसोम के साथ इलाज, फुफ्फुसीय कोशिकाओं को स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता 4 प्राप्त करने की अनुमति देता है NAMEC- व्युत्पन्न, ईवी / एक्सओसोम-चिकित्सीय स्तनमय ल्यूमनल कोशिकाएं माउस वेट पैड ( चित्रा 9 ) में स्तन ग्रंथियों का निर्माण करती हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: एक्स्ट्रासेलुला का चित्रणआर वैसिकिकल / एक्सोसोम पुरी फासिशन विधि सेल सेल के माध्यम से अलग-अलग अल्ट्रासेन्ट्र्यूफ्यूजेशन द्वारा। प्रत्येक केंद्रोत्पादन की गति और लंबाई दर्शायी जाती है। पहले प्रत्येक चरण के तीन केन्द्रों के बाद, सतह पर तैरनेवाला अगले चरण के लिए रखा जाता है। 110,000 × जी केन्द्रोत्पादन के बाद, छर्रों को रखा जाता है और सतह पर तैरने वालों को त्याग दिया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: माउस स्तन ग्रंथ एनाटॉमी। चूहों में स्तनधारी ग्रंथियों के पांच जोड़े हैं, जो संख्या 1-5 से संकेतित हैं, त्वचा के नीचे सीधे वसा पैड (लाल) में स्थित है। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करेंआंकड़ा है

चित्र तीन
चित्रा 3: उपकलासंवादाओं के मिश्रण की छवियां और विभेदक centrifugation के पहले और बाद में वसा पैरों की कोशिकाओं। हिमासैटमीटर से ली गई विभेदक केन्द्रण से पहले और बाद में पृथक वसा-पैड सेल मिश्रण की उज्ज्वल छवियां। तीरहेड: उपकलागत आर्गोइड्स तीर: फाइब्रोब्लैस्ट्स और एकल कोशिकाएं स्केल बार = 0.5 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: NAMEC110, 000 xg गोली भाषण का पोषण आकार और एकाग्रता विश्लेषण। NAMEC माध्यम के 110,000 ग्राम गोली अंश का रंग है लेक्टेड और ( ए ) नैनो कण ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) और ( बी ) ट्रांसमिलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) के अधीन। स्केल बार = 1 सुक्ष्ममापी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: घनत्व ढाल के अंश में एक्सओसोम का पता लगा रहा है। एक्सडोमो मार्कर सीडी 81, सीडी 9, सीडी 63 और टीएसजी 101 और हाउसकीपिंग जीन जीएपीडीएच के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का पता चलता है कि एक्सोडोम युक्त 20% आयोडिक्सानॉल अंश। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

55736fig6.jpg "/>
चित्रा 6: एक्स्ट्रासेल्युलर फोंक्सिक / एक्सोसोम फ्लो साइटोमैट्री और कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अपटैक्स का पता लगा रहा है। ईवी / एक्सओसोम एक्स्टटेक को एचएमएलई कोशिकाओं में मापा गया था। सीएफएसई लेबल वाले, एनआईसी-डीइएडीड ईवीएस / एक्सोसॉम्स और नेगेटिव कंट्रोल को 6 घंटे के संकेतग्रस्त संस्कृतियों में जोड़ा जाता है। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं के अधीन हैं ( ए ) प्रवाह cytometry और ( बी ) confocal माइक्रोस्कोपी सीएफएसई (हरा; उत्तेजना / उत्सर्जन (एनएम): 492/517; माइक्रोस्कोप लेजर लाइन: 488) फ्लोरोसेंस तीव्रताएं ईवी / एक्सओसोम एक्स्ट एक्ट सेल नाभिक डीएपीआई (नीला; उत्तेजना / उत्सर्जन (एनएम): 358/461; माइक्रोस्कोप लेजर लाइन: 405) के साथ दाग रहे हैं और प्लाज्मा झिल्ली प्लाज्मा झिल्ली के दाग (लाल, उत्तेजना / उत्सर्जन (एनएम): 64 9/666; माइक्रोस्कोप लेजर लाइन: 633; ​​सामग्री की तालिका देखें) Confocal उद्देश्य लेंस: एचसीएक्स पीएल एपीओ 63x / 1.40-0.60 तेल। स्केल बार = 20 माइक्रोनविज्ञापन / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: संलग्न एपिथेलियल ऑर्गोइड्स की छवियां स्तन उपकला कोशिकाओं की उज्ज्वल छवियाँ जो कि कोशिकाओं द्वारा गठित होती हैं और जुड़ी हुई उपकलागत आयोजोइड्स से बाहर निकलती हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

आंकड़ा 8
चित्रा 8: सतह ईपीसीएएम और सीडी 4 9 एफ द्वारा प्राथमिक माउस स्तन उपकला कोशिकाओं को छंटनी 12-सप्ताहीय चूहों के वसा पैड से अलग माउस स्तन उपकला कोशिकाओं सेल प्रकार के अधीन हैंआईएनजी। एपकाम हाय / सीडी 4 9 एफ ओ आबादी में नीले सर्कल के साथ चिह्नित माउस स्तनमय ऊतक कोशिकाओं को समृद्ध किया जाता है; बेसल कोशिकाओं को एपैकोम लो / सीडी 4 9 एफ हाय आबादी में समृद्ध किया गया था, जो लाल वृत्त के साथ चिह्नित था। गैर उपकला कोशिकाओं को साजिश में ब्लैक बॉक्स के साथ चिह्नित किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

9 चित्र
9 चित्रा: प्राथमिक माउस लोमिक स्तन कोशिकाओं द्वारा स्तन ग्रंथि संरचना। प्राइमरी माउस एपीसीएएम हाई / सीडी 4 9 एफओ लोमोनियल कोशिकाओं का इलाज पीबीएस या डीएनसी से प्राप्त ईवीएस / एक्सओसोम्स को 10 दिनों के लिए किया जाता है और 3 सप्ताह के चूहों के साफ वेट पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है। स्तन ग्रंथि फार्म का विश्लेषण करने के लिए चूहों को euthanized और 8 सप्ताह के बाद necropsied हैंसमझना। स्केल बार = 0.75 सेमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

प्रतिशत एपीसीएएम के एमएफआई सीडी 4 9 एफ के एमएफआई
स्तन लूमिनल सेल 0.437 4.57 x 10 4 8183
(एपकाम हाय / सीडी 4 9 एफ लो )
स्तनधारी बेसल सेल 0.09 5452 2.23 x 10 4
(एपीसीएएम लो / सीडी 4 9 एफ हाय )
गैर उपकलासेल (एपकाम - ) 0.309 53 4619

सारणी 1: आंकड़ों में वर्णित जनसंख्या के प्रतिशत और मीन प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई)

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Discussion

एक्सओसोम अक्सर उन कोशिकाओं की विशेषताओं को ले जाते हैं जो उन्हें रिहा कर देते हैं, और रिलीज़ किए गए एक्सओसोम की मात्रा उत्तेजनाओं 4 द्वारा प्रेरित हो सकती है। कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम को एकत्र किया जा सकता है और ईवी / एक्सोसोम संकलन ( चित्रा 1 ) के लिए विभेदक अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन के अधीन किया जा सकता है। ईवीएस / एक्सोसोम को अलग करने के लिए वर्तमान में कोई आदर्श समझौता नहीं है। यहां इस्तेमाल की जाने वाली इष्टतम विधि को डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन 14 द्वारा निर्धारित किया गया है। अल्ट्रिकट्रिफ्यूजिंग ईवी / एक्सोसोम के अलगाव के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से विधि है, जो ईवी / एक्सोसॉम की जैविक गतिविधि को संरक्षित कर सकती है। हालांकि, अल्ट्रेंट्रिफ्यूजेशन द्वारा अलग-थलग विसिकाएं आम तौर पर ईवीएस का मिश्रण होता है, जिसमें एन्डोसॉमल डिब्बों और / या कोशिका झिल्ली से उभरने के माध्यम से पेश किए गए vesicles के माध्यम से उत्पन्न एक्सोसोम होते हैं।

एनटीए के साथ vesicles के आकार का विश्लेषण करके ( चित्रा 4 ए 15 का विश्लेषण और छंटाई करने के लिए फ्लो साइतोमीटर का उपयोग करने के तरीकों को विकसित करना शुरू कर दिया है।

हालांकि एक्सट्रोमस को शुद्ध करने के लिए विभेदक अल्ट्रेंट्रिफ्यूजेशन का उपयोग किया जा सकता है, तो 110,000 xg पृथक अंश 5 में एक्सओसोम फेशल्स से प्रोटीन समुच्चय के प्रदूषण को दूर करने के लिए एक घनत्व ढाल का उपयोग किया जाना चाहिए उदाहरण के लिए, CD81, CD63, CD9, और TSG101 6 , 7 ) को व्यक्त करते हैं। घनत्व ढाल के अंशों में एक्सओसोम मार्कर की उपस्थिति का विश्लेषण करके, यह ~ 20% आयोडिक्सानॉल ( चित्रा 5 ) के साथ अंश में एक्सओसोम की पहचान करना संभव है। घनत्व ढाल में एक्सओसोम मार्करों को एक्सओसोम की पहचान करने के लिए कई एक्सओसोम की जांच की जानी चाहिए, क्योंकि एक्सओसोम की प्रत्येक आबादी अलग एक्सओसोम मार्कर 16 को दिखा सकती है।

कोशिकाओं द्वारा ईवी / एक्सओसोम की तेजता को फ्लोरोसेंट डाई-लेबल ईवीएस / एक्सोसोम्स द्वारा मापा जा सकता है। लेबल वाले ईवी / एक्ज़ोसोम सेवन करने वाली कोशिकाओं की संख्या को फ्लो साइटोमेट्री ( चित्रा 6 ए ) से मापा जा सकता है। पुष्टि करने के लिए कि फ्लोकोशिकाओं से पुनर्रचना लेबल ईवीएस / एक्सओसोम्स की तेजता से निकलती है, लेकिन मुक्त डाई से नहीं, माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति के पैटर्न की जांच की गई कन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि ईवी / एक्सओसोम-ट्रीटिंग सेल में प्रतिदीप्ति का पैटर्न टरबाट ( चित्रा 6 बी दाएं पैनल) है। निरोधक संकेतों का परिणाम EV / exosomes लेबल से परिणामस्वरूप, मुक्त प्रतिदीप्ति से नहीं कक्षों में विराम चिह्नों का विश्लेषण किया जा सकता है जो संरचित रोशनी सुपर-रिज़ोल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ आगे विश्लेषण किया जा सकता है, जिसकी अधिकतम संकल्प 85 एनएम 4 , 17 है । सुपर-रेज़ोल्यूशन माइक्रोस्कोपी यह पुष्टि कर सकता है कि विखंडन संकेत ~ 100 एनएम खोखले vesicles से होते हैं, जो एक्सओसोम 4 के समान होते हैं। ये परिणाम बताते हैं कि संस्कृति में स्तन उपकला कोशिकाओं द्वारा NAMEC- व्युत्पन्न exosomes को लिया जा सकता है

NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसोम अक्सर अणुओं को ले जाते हैं ( जैसे, प्रोटीन और मीलकुछ कोशिकाओं की विशेषताओं के लिए आवश्यक आरएनए 1) यह पता चलता है कि NAMEC- व्युत्पन्न ईवी / एक्सोसोम उनके उपकला सेल समकक्षों को NAMECs ( जैसे स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता) के गुणों को स्थानांतरित कर सकते हैं। चूंकि मानव स्तन उपकला कोशिकाएं माउस वसा पैड 18 , 1 9 में जीनजीनेटिक रूप से स्तन ग्रंथियों का निर्माण नहीं कर सकती हैं, इसलिए ग्रंथि बनाने की क्षमता का स्थानांतरण माउस प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं का उपयोग करके जांच की जा सकती है। माउस प्राथमिक स्तन EpCAM हाय / सीडी 4 9 एफ लोमनल कोशिकाएं, जो स्तन ग्रंथियों का निर्माण नहीं करती हैं, उन्हें 6-सप्ताहीय चूहों ( चित्रा 7 और चित्रा 8 ) से अलग किया जा सकता है। माउस वेट पैड से पृथक कोशिकाओं को तीन समूहों में विभाजित किया जा सकता है ( यानी, एपकाम हैई / सीडी 4 9 एफ ओ लूमिनल कोशिकाएं, एपकाम लो / सीडी 4 9 एफ हाय बेसल कोशिकाएं, और एपीसीएएम - गैर-उपकला कोशिकाएं)सतह EPCAM और CD49f के vels ( चित्रा 8 )। एपीसीएएम लो / सीडी 4 9 एफ हाय बेसल कोशिकाएं वसा वाले फैड में स्तन ग्रंथियों का निर्माण कर सकती हैं, जब वसा पैड में प्रत्यारोपित होता है, लेकिन एपकाम हाय / सीडी 4 9 एफ एल लाइमिन कोशिकाओं 4 नहीं कर सकती हैं। इस प्रकार, एपकाम हाय / सीडी 4 9 एफ एल लाइमनल सेल आबादी का उपयोग स्तनधारी ग्रंथि बनाने की क्षमता को हस्तांतरित करने के लिए प्रेरक NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सोसोम की क्षमता की जांच के लिए किया जा सकता है। पृथक एपीसीएएम हाई / सीडी 4 9 एफ एल लाइमिन कोशिका संस्कृति में 7-10 दिनों के लिए EV / बाह्य उपचार 4 में रखी जा सकती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लंबे समय तक इन विट्रो में प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं को रखने से कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो सकती है।

स्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए ईवी / एक्ससोम-चिकित्सीय स्तनमय ल्यूमिनियल कोशिकाओं को साफ वेट पैड में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। आरोपण के लिए इस्तेमाल की जाने वाली चूहों का वसा पैड 3 सप्ताह की उम्र में साफ़ होना चाहिए। एटी 3 सप्ताह की उम्र, स्तन उपकला कोशिकाओं निप्पल और एक वसा पैड के लिम्फ के बीच के क्षेत्र में ही सीमित हैं। एक वसा पैड में स्तन उपकला को 3 सप्ताह की उम्र में निप्पल और लिम्फ के बीच के क्षेत्र को हटाकर साफ़ किया जा सकता है। वसा पैड को साफ करने के बाद स्तनपायी लाइमिनल कोशिकाओं को सही तरीके से प्रत्यारोपित किया जाता है, और प्रत्यारोपण के बाद 8 सप्ताह में प्रत्यारोपित कोशिकाओं द्वारा ग्रंथि का विश्लेषण किया जा सकता है। स्तन कैंसर के लिए स्तन ग्रंथि-गठन की क्षमता को स्थानांतरित करने पर NAMEC- व्युत्पन्न ईवीएस / एक्सओसोम का असर लोम्नल कोशिकाओं के ग्रंथि गठन और ईवी / एक्सओसोम-लेमिनाल कोशिकाओं ( चित्रा 9 ) द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रेरित सीवी / एक्स्टोसोम ने स्तनधारी बेसल उपकला कोशिकाओं की संपत्ति - ग्रंथि बनाने की क्षमता - और नामक कोशिकाओं से प्रेरित ईवीएस / एक्सोसोम्स को ग्रहण करने वाले ल्यूमनल कोशिकाओं को ईवीएस / एक्सोसॉम के माध्यम से NAMEC से संपत्ति प्राप्त कर सकती है। यह कार्य इस सबूत को दर्शाता है कि EV / exosome-media के लिए जिम्मेदार अणुओंस्तन ग्रंथि बनाने की क्षमता के टेड स्थानांतरण ईवीएस / एक्सोसॉम्स 4 के लिपिड राफ्ट्स में मौजूद हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (05 ए 1-सीएसपीपी 16-014, एचजेएल) से अनुदान और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (मोस्ट 103-2320-बी -400-015-एम 3, एचजेएल) से समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCDB 170  USBiological M2162
DMEM/F12 Thermo 1250062
Optima L-100K ultracentrifuge Beckman 393253
SW28 Ti Rotor Beckman 342204
SW41 Rotor Beckman 331306
NANOSIGHT LM10 Malvern NANOSIGHT LM10 for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep  Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody GeneTex GTX101766 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CD9 antibody GeneTex GTX100912 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CD63 antibody Abcam Ab59479 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
TSG101 antibody GeneTex GTX118736 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
GAPDH GeneTex GTX100118 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight 
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) Thermo V12883
FACSCalibur BD Biosciences fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV  Thermo 17104019
trypsin Thermo 27250018
 ITS Sigma-Aldrich I3146 a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase ebioscience 00-4555-56 a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase  STEMCELL 7913 5 mg/mL = 5 U/mL
anti-CD49f antibody Biolegend 313611 1:50
anti-EpCAM antibody Biolegend 118213 1:200
FACSAria BD Biosciences cell sorter
carmine alum Sigma-Aldrich C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) gifts from Dr. Robert Weinberg
permount Thermo Fisher Scientific  SP15-500
sodium bicarbonate Zymeset  BSB101
EGF Peprotech AF-100-015
Hydrocoritisone Sigma-Aldrich SI-H0888
Insulin  Sigma-Aldrich SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract) Hammod Cell Tech  1078-NZ
GW627368X  Cayman 10009162
15 cm culture dish Falcon  353025
table-top centrifuge Eppendrof  Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube Beckman 344058
PBS (Phosphate-buffered saline)  Corning 46-013-CM
BCA Protein Assay Thermo Fisher Scientific  23228
Transmission Electron Microscopy Hitachi HT7700
gelatin  STEMCELL 7903
10 cm culture dish Falcon  353003
6-well culture dish Corning 3516
female C57BL/6 mice NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum) BioWest  S01520
gentamycin Thermo Fisher Scientific  15710072
Pen/Strep Corning 30-002-Cl
DNase I 5PRIMER 2500120
isofluorane  Halocarbon NPC12164-002-25
formaldehyde MACRON H121-08
EtOH (Ethanol) J.T. Baker 800605
glacial acetic acid Panreac 131008.1611
aluminum potassium sulfate Sigma-Aldrich 12625
Xylene  Leica 3803665
0.22 μm membranes Merck Millipore Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm BD Biosciences 427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier BD Biosciences 427630
CellMask™ Deep Red Thermo Fisher Scientific  C10046 plasma membrane stain

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References

  1. Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
  2. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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Lin, M. C., Chen, S. Y., He, P. L., Luo, W. T., Li, H. J. Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes. J. Vis. Exp. (124), e55736, doi:10.3791/55736 (2017).

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